ITTO20090259A1 - Composizione per l'igiene intima - Google Patents
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: “Composizione per l’igiene intimaâ€
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda una composizione per l’igiene intima, particolarmente una composizione per l’igiene intima quotidiana di donne soggette a secchezza o facile irritabilità dell’area genitale e con scarsa tolleranza ai convenzionali detergenti per l’igiene intima.
Molte donne lamentano disturbi delle parti intime rappresentati a livello vulvare da secchezza, lievi fenomeni irritativi con prurito, facile esposizione a piccoli traumi e ad infezioni. Questi fenomeni non sono vere e proprie condizioni patologiche, ma fastidiosi disturbi che turbano il benessere dei soggetti interessati.
Tali disturbi sono frequentemente causati da: - igiene intima praticata con detergenti troppo aggressivi per il delicato epitelio vulvare, come il sapone, detergenti alcalini o comunque troppo irritanti e che intaccano anche lo strato lipidico che protegge l’epitelio delle strutture vulvari;
- lavaggi genitali troppo frequenti con conseguente irritazione dell’epitelio vulvare;
- uso di contraccettivi orali che possono comportare un ipoestrogenismo locale con ipotrofia delle strutture cutanee vulvo-vaginali e fastidiosa secchezza delle parti intime;
- uso di biancheria molto aderente, salvaslip, collant, calzoni stretti e aderenti che esercitano un’azione occlusiva e favoriscono condizioni di macerazione, oltre a provocare microtraumi da sfregamento meccanico;
- biancheria intima di materiali sintetici o colorata che può dar luogo a fenomeni di sensibilizzazione ed irritazione.
Per contrastare tali sgradevoli inconvenienti la presente invenzione mette a disposizione una nuova composizione per l’igiene intima, atta a prevenire e/o eliminare in modo specifico i disturbi sopra menzionati.
La composizione dell’invenzione contiene prevalentemente sostanze attive vegetali naturali, che esplicano una delicata azione detergente, idratante, emolliente, dermotrofica, dermoprotettiva, lenitiva, antiossidante, deodorante ed antimicrobica.
Un inconveniente riscontrato nelle composizioni per l’igiene intima della tecnica anteriore à ̈ la facilità con cui le sostanze attive in esse contenute vengono rimosse dalla cute e dalle mucose con il risciacquo.
Onde superare tale inconveniente, la composizione dell’invenzione comprende una o più sostanze attive scelte dal gruppo che consiste di detergenti dermocompatibili, agenti idratanti, agenti emollienti, agenti dermoprotettivi, agenti dermotrofici, agenti lenitivi, agenti antimicrobici, agenti antiossidanti, agenti deodoranti, agenti tamponanti, estratti vegetali e loro combinazioni, unitamente a una gomma naturale bioadesiva, la gomma xantana, atta ad assicurare il mantenimento della/e sostanza/e attiva/e a contatto con cute e mucose, in particolare le superfici vulvari e l’orifizio vaginale, per periodi di tempo prolungati anche dopo l’applicazione e il risciacquo della composizione.
La matrice della composizione di igiene secondo l’invenzione à ̈ una soluzione acquosa di gomma xantana. La gomma xantana à ̈ un polisaccaride di glucosio, mannosio e acido glucuronico ottenuto dalla fermentazione aerobica di un substrato di carboidrati, sostanze azotate e microelementi da parte del batterio Xanthomonas campestris, che si trova naturalmente su molte verdure edibili. In virtù del suo elevato peso molecolare (diversi milioni di dalton) la gomma xantana in soluzione acquosa presenta proprietà colloidali pseudo plastiche e viscose. Grazie alla sua natura di colloide idrofilo, questa sostanza presenta proprietà bioadesive e garantisce una più prolungata permanenza in loco delle sostanze attive durante e dopo la detersione. La concentrazione di gomma xantana nella composizione dell’invenzione à ̈ preferibilmente compresa fra 0,4% e 2,4% in peso riferito al peso totale della composizione, più preferibilmente fra 0,6 e 1,6% in peso, ancor più preferibilmente fra 0,6% e 1,0% in peso.
A concentrazioni superiori a 1,6% in peso la gomma xantana forma un gel.
In una forma di realizzazione preferita, in cui la composizione dell’invenzione à ̈ un detergente per l’igiene intima, la composizione comprende almeno un tensioattivo detergente. Un tensioattivo preferito à ̈ un tenside lipoproteico naturale quale ad esempio la miscela di sodio coccoil aminoacidi da grano nota con il nome INCI come “Sodium Cocoyl Wheat Amino Acids†(SCWAA).
Lo SCWAA à ̈ un tenside naturale dermocompatibile in grado di ripristinare lo strato lipidico protettivo cutaneo. Esso à ̈ derivato dalla condensazione di acidi grassi di olio di cocco e aminoacidi ottenuti dall’idrolisi delle proteine del grano. Questo tenside agisce come detergente senza danneggiare né denaturare le proteine dello strato corneo e senza provocare gli effetti collaterali di molti detergenti, quali irritazione, secchezza, prurito, e simili. Le proteine idrolizzate derivate dal grano sono estremamente ricche di aminoacidi essenziali quali arginina, lisina e cisteina, noti stimolatori del rinnovamento dei cheratinociti epidermici e pertanto in grado di stimolare la cute danneggiata. La condensazione dell’idrolizzato proteico derivato dalle proteine di Triticum vulgare (frumento) e dagli acidi grassi del cocco forma un prodotto antistatico di elevata capacità adesiva alla cute e alla superficie dei peli e dei capelli. Tale tenside à ̈ inoltre in grado di formare un film protettivo capace di trattenere liquidi, di rinforzare le strutture del tessuto cutaneo e di ridurre il potere irritante di altri tensioattivi.
Riassumendo, lo SCWAA presenta le seguenti caratteristiche vantaggiose:
- Ã ̈ un ottimo detergente, delicato, non irritante e adatto alle pelli sensibili;
- Ã ̈ facilmente rimosso mediante risciacquo;
- Ã ̈ incolore e inodore;
- Ã ̈ atto a ridurre il potere irritante degli altri tensidi eventualmente presenti nella composizione.
La concentrazione preferita di SCWAA nella composizione dell’invenzione à ̈ nell’intervallo di 4% a 20% in peso riferito al peso totale della composizione
Ulteriori tensioattivi idonei all’impiego nella composizione dell’invenzione, in alternativa o in combinazione con la miscela di sodio coccoil aminoacidi da grano, sono tensioattivi detergenti dermocompatibili delicati. Fra di essi si citano a titolo illustrativo il cocco-glucoside (nome INCI Coco-Glucoside) e il gliceril oleato (nome INCI Glyceryl oleate), che sono detergenti dermocompatibili, schiumogeni, emulsionanti con azione emolliente; il disodio lauriletere solfosuccinato (nome INCI Disodium Laureth Sulfsuccinate) e il sodio lauril solfoacetato (nome INCI Sodium Lauryl Sulfoacetate), ossia tensidi delicati che consentono una migliore idratazione della cute durante il lavaggio; il decil glucoside (nome INCI Decyl Glucoside), che à ̈ un detergente delicato idratante.
Come menzionato in precedenza, la composizione dell’invenzione comprende una o più sostanze attive, preferibilmente di origine naturale.
Fra le sostanze attive idonee all’impiego nella composizione dell’invenzione si citano a titolo illustrativo:
(i) componenti dermotrofici e dermoprotettivi, fra i quali ad esempio il gliceril isostearato (nome INCI Glyceryl Isostearate), il glicole distearato (nome INCI Glycol Distearate) e/o il potassio palmitoil idrolizzato di proteine di grano (nome INCI Potassium Palmitoyl Hydrolyzed Wheat Protein), che sono sostanze emulsionanti lenitive, emollienti, idratanti ed elasticizzanti, aventi lo scopo di mantenere la fisiologica elasticità della cute; l’estratto di avena sativa (nome INCI Avena Sativa Extract), la proteina di avena idrolizzata (nome INCI Hydrolyzed Oat Protein) e/o la potassio palmitoil proteina di avena (nome INCI Potassium Palmitoyl Oat Protein), che sono tensioattivi delicati ricchi in lipidi, carboidrati e proteine, hanno proprietà lenitive, emollienti, idratanti, filmogene ed elastizzanti e contribuiscono al mantenimento del corretto contenuto in acqua e della fisiologica elasticità cutanea; il caprilil glicole (nome INCI Caprylyl Glycol) e/o la di glicerina (nome INCI Diglycerin), che hanno proprietà emollienti, antimicrobiche ed umettanti; la maltodestrina, un condizionante cutaneo idratante e filmogeno;
(ii) estratti vegetali, fra i quali si citano a titolo illustrativo l’estratto idroglicolico di fiori di Calendula officinalis e l’estratto idroglicolico di Salvia officinalis. L’estratto di calendula à ̈ conosciuto per la sua azione antinfiammatoria, lenitiva, rinfrescante, riepitelizzante e protettiva. Esso agisce grazie ad un’azione sinergica del suo contenuto di alcoli triterpenici, flavonoidi e polisaccaridi ed à ̈ particolarmente indicato per la cura e la ristrutturazione dell’epidermide. L’estratto di salvia contiene principi attivi quali salviolo, pricosalvina e pinene, responsabili dell’attività antibatterica, antimicotica e antiossidante sui radicali liberi.
Ulteriori sostanze attive idonee all’impiego nella composizione dell’invenzione sono l’acido chetoglutarico, che à ̈ in grado di bloccare i radicali amminici (ammoniaca e urea) e quindi di esplicare un’azione deodorante e antiossidante; l’acido lattico, che contribuisce a mantenere il corretto pH fisiologico leggermente acido delle superfici vulvari ed ostacola lo sviluppo di microrganismi patogeni; il siero di latte pastorizzato nebulizzato e disidratato che, insieme all’acido lattico, esercita un potere tampone ed assicura un’acidità prolungata sulle superfici vulvari; il latte di avena che, insieme al diglicerolo e alla maltodestrina, mantiene una corretta idratazione e quindi la fisiologica elasticità cutanea dei genitali esterni.
Opzionalmente, la composizione dell’invenzione comprende inoltre fragranze e/o profumi scelti fra quelli abitualmente impiegati nei detergenti per l’igiene intima, che sono ben tollerati e privi di potere sensibilizzante.
Intervalli di concentrazioni preferite delle sostanze attive sopra menzionate sono i seguenti: - sodio coccoil aminoacidi di grano: 4% a 16% in peso;
- miscela di disodio lauriletere solfosuccinato e sodio lauril solfoacetato: 0,9% a 3,6% in peso;
- miscela di cocco-glucoside e gliceril oleato: 0,2% a 0,7% in peso;
- decil glucoside: 0,2% a 0,7% in peso;
- maltodestrina: 0,2% a 1,0% in peso;
- miscela di gliceril isostearato, glicole distearato, potassio palmitoil proteina idrolizzata di grano: 0,7% a 3,0% in peso;
- miscela di estratto di Avena sativa, proteina idrolizzata di avena e potassio palmitoil proteina di avena: 0,14% a 0,6% in peso;
- miscela di caprilil glicole e diglicerina: 2% a 8% in peso;
- estratto di fiori di Calendula officinalis: 0,25% a 1,0% in peso;
- estratto di Salvia officinalis: 0,1% a 0,4% in peso;
- acido chetoglutarico: 0,025% a 0,10% in peso;
- acido lattico: 0,025% a 0,10% in peso;
- siero di latte: 0,4% a 1,6% in peso.
La composizione dell’invenzione à ̈ idonea ad essere utilizzata in un prodotto detergente, un prodotto cosmetico, un medicinale o un dispositivo medico. In questo contesto l’espressione “dispositivo medico†à ̈ utilizzata con il significato definito nella Direttiva 93/42/CEE concernente i dispositivi medici.
La composizione dell’invenzione à ̈ preparata in qualsiasi forma idonea all’applicazione topica, particolarmente in forma di soluzione, crema o gel. In alternativa, la composizione dell’invenzione à ̈ utilizzata per la preparazione di un articolo di igiene comprendente un supporto, quale ad esempio un panno o una salvietta, impregnato con la composizione preferibilmente in forma liquida. Supporti idonei in questo contesto sono ad esempio supporti in carta, tessuto, tessuto non tessuto o simili materiali soffici in foglio.
La parte sperimentale e gli esempi che seguono sono forniti a puro titolo illustrativo senza l’intento di limitare in alcun modo la portata dell’invenzione come definita nelle annesse rivendicazioni.
PARTE SPERIMENTALE
Bioadesione dei componenti attivi alle parti intime La bioadesione à ̈ definita dalla capacità di una sostanza di aderire a una superficie biologica. Per un preparato per l’igiene intima interessa la capacità delle sostanze ad azioni igienicosalutistiche in esso veicolate di aderire alle superfici cutanee e mucose dei genitali esterni e di permanervi anche durante e dopo il lavaggio.
La gomma xantana à ̈ largamente utilizzata in campo alimentare per conferire una adeguata viscosità e consistenza ad alimenti liquidi o semisolidi. Essa presenta anche interessanti proprietà bioadesive su superfici cutanee e mucose. Si à ̈ voluto verificare se essa favorisse la bioadesione delle sostanze attive contenute nella composizione dell’invenzione sulle superfici cutanee e mucose dei genitali esterni interessati nelle pratiche di igiene intima.
Materiali e metodi
Si à ̈ utilizzato un test in vitro, in ottemperanza alla Direttiva 76/768 CEE relativa ai prodotti cosmetici, che prevede l'abbandono dell'utilizzo di animali per testare prodotti cosmetici, nonché in considerazione del fatto che la realizzazione di un test di bioadesione in vivo su soggetti umani avrebbe incontrato notevoli difficoltà tecniche ed organizzative. Gli esperimenti sono stati perciò condotti sul Modello di Superficie Cutanea – Mucosale (MSCM) messo a punto da Bonferoni et al. 1999 [M.C. Bonferoni, S. Rossi, F. Ferrari e C. Caramella. A modified Franz diffusion cell for simultaneous assessment of drug release and washability of mucoadesive gels. Pharmaceutical Development and Technology, 1999;4:45-53]. Il MSCM à ̈ allestito imbevendo una carta da filtro con una sospensione di mucina al 15% in tampone acetato a pH 4,5 ed essiccandola successivamente in stufa a 60°C. Con questo trattamento la carta da filtro assume caratteristiche di affinità fisica e quindi di capacità di fare aderire le sostanze che vengono al suo contatto, molto simili a quello della pelle vulvare.
Per misurare la capacità di fare aderire le sostanze in esame si à ̈ usato l’apparecchio e il procedimento descritto dagli autori sopra citati. L’apparecchio à ̈ composto da una camera cilindrica del diametro di 20 mm e alta 5 mm (volume 1,6 ml -1,3 ml se la base à ̈ coperta da biadesivo e carta da filtro) munita di due bracci laterali contrapposti per permettere l’entrata (braccio superiore) e l’uscita (braccio inferiore) del liquido utilizzato per il lavaggio e l’asportazione della sostanza di cui si vuole saggiare la bioadesione. Sul fondo della camera viene fatto aderire mediante un biadesivo un cerchio del diametro di 20 mm ritagliato dalla carta da filtro sottoposta al trattamento sopra descritto. Per riprodurre le condizioni termodinamiche della superficie vulvare camera e liquido di lavaggio sono termostatati a 30°C.
Sono stati studiati i seguenti preparati:
Controllo 1: acqua distillata decarbonata contenente fluorescina isotiocianato allo 0,2% (TRACER) utilizzato come sonda per misurare il grado di bioadesione.
Controllo 2: acqua distillata decarbonata contenente fluorescina isotiocianato allo 0,2% (TRACER) e contenente anche 0,4% di gomma xantana.
Controllo 3: acqua distillata decarbonata contenente fluorescina isotiocianato allo 0,2% (TRACER) contenente anche 0,8% di gomma xantana.
Composizione dell’invenzione (cfr. esempio 1), a cui si à ̈ aggiunta fluorescina isotiocianato allo 0,2% (TRACER).
Dopo aver posizionato il cerchio della carta da filtro mucinata sul fondo della camera vi si stratifica sopra un’aliquota di 100 mg di liquido in esame che à ̈ ivi lasciato per 30 minuti. Poi la cella à ̈ riempita con il liquido di lavaggio (acqua decarbonata) e si inizia la perfusione della cella con acqua decarbonata mantenuta a 30°C. La perfusione à ̈ effettuata mediante una pompa per HPLC a un flusso costante di 0,3 ml/minuto. Il liquido di lavaggio refluo dalla camera à ̈ raccolto in un bicchiere graduato e mantenuto sotto agitazione per mezzo di un’ancoretta magnetica. Dopo 5 minuti di perfusione si misura il volume raccolto, si prelevano 0,2 ml di liquido, si misura con un fluorimetro la concentrazione della fluorescina e si calcola la quantità di fluorescina eluita (lavata via), esprimendola in percentuale della fluorescina tiocianato totale apposta nella camera (0,2 mg). Questa operazione à ̈ ripetuta ai tempi 10, 20, 30, 45, 60, 120 e 180 minuti. Dopo ogni misurazione il liquido prelevato à ̈ rimesso nel bicchiere.
Risultati
Per ognuno dei preparati in esame si sono fatte 4 determinazioni. In base al TRACER eluito si à ̈ calcolata la percentuale di TRACER rimasta adesa sulla carta da filtro mucinata ai diversi tempi (TA%) e messa in relazione ai tempi di eluizione. Si à ̈ trovata una buona relazione lineare tra log(TA%) e tempo di eluizione.
Con il metodo dei minimi quadrati si sono calcolate le costanti dell’equazione:
log(TA%) = k x min C (equazione 1) dove k rappresenta la costante di eluizione e C l’intercetta con l’asse TA% (in scala logaritmica). In generale si à ̈ trovata una buona relazione lineare tra i valori successivi a 5 minuti (tempo necessario per raggiungere lo stato stazionario) e TA% > 10.
I valori di k ottenuti con i preparati in esame con i relativi errori standard sono riportati nella sottostante tabella 1.
Tabella 1
Valori di k con i relativi errori standard. t1/2con limiti al 95% Preparato k (ES) R<2>t1/2min (limiti 95%) Controllo 1 -0,074 (0,007) 0,9966 4,07 (3,72-4,49) Controllo 2 -0,0031 (0,0005) 0,9769 97 (84-116) Controllo 3 -0,0021 (0,0003) 0,9646 143 (125-165) Composizione -0,0017 (0,0007) 0,9711 177 (151-215) I risultati mostrano un’ottima relazione lineare tra log(TA%) e tempo, come dimostrato dai valori di R<2>(coefficiente di correlazione<2>) molto vicini a 1,00.
Con i preparati in esame si sono ottenuti i seguenti risultati.
Controllo 1 (acqua con TRACER)
Il TRACER sciolto in acqua à ̈ rapidamente eluito dal MSCM, con un t1/2di eluizione di soli 4,07 minuti.
Controllo 2 (soluzione con 0,4% di gomma xantana e TRACER)
Il TRACER Ã ̈ eluito lentamente (t1/2di eluizione = 97 minuti). Lo 0,4% di gomma xantana aumenta quindi di 24 volte la ritenzione del TRACER sul MSCM.
Questo à ̈ un risultato imprevisto e sorprendente. Se infatti sono ben note le proprietà bioadesive della gomma xantana, non era invece nota la sua capacità di promuovere la bioadesione di sostanze in essa veicolate su un MSCM.
Controllo 3 (soluzione con 0,8% di gomma xantana e TRACER)
Molto sorprendente à ̈ l’aumento di bioadesione del TRACER promossa dalla gomma xantana allo 0,8%, con un t1/2di eluizione di 143 minuti, significativamente superiore del 51% rispetto al t1/2di 97 minuti ottenuto con la gomma xantana allo 0,4% e 35 volte superiore al t1/2di eluizione del TRACER sciolto in acqua.
Composizione dell’invenzione (cfr. esempio 1) con TRACER
Ancora più sorprendente à ̈ che l’eluizione del TRACER dal MSCM à ̈ ulteriormente rallentata dalla Composizione. Il t1/2di eluizione à ̈ infatti di 177 minuti e cioà ̈ del 24% superiore al tempo di eluizione del TRACER dalla soluzione acquosa allo 0,8% di gomma xantana. È quindi evidente e sorprendente che gli attivi presenti nella composizione rallentino ulteriormente l’eluizione del TRACER.
Conclusioni
La gomma xantana sorprendentemente promuove la bioadesione del TRACER (fluorescina isotiocianato allo 0,2%) al MSCM, sia che si trovi in soluzione acquosa, sia che si trovi mescolata ad altri attivi come nella composizione.
Poiché la bioadesione del TRACER può essere considerata un indicatore dei parametri quantitativi di bioadesione degli altri componenti della composizione dell’invenzione, si può concludere che la gomma xantana ne favorisca la bioadesione alle superfici vulvari e ne prolunghi attività ed efficacia.
Test epicutaneo per valutare il potenziale irritante (Patch Test)
Metodo
Sulla cute del dorso di 30 volontari adulti sani e con cute perfettamente integra si sono applicati mediante una camera di Finn 20Î1⁄4l di composizione dell’invenzione (cfr. esempio 1) diluita 1:10 in acqua. La camera di Finn assicura un’applicazione occlusiva e consiste di una celletta di alluminio di 7 mm di diametro, contenente un dischetto di carta assorbente imbevuta con il campione in esame. Essa viene fissata alla cute dei soggetti mediante un cerotto già testato per la sua innocuità cutanea. Le reazioni cutanee sono valutate dopo 15 minuti, 1 ora e 24 ore di applicazione e sono classificate nel modo seguente.
Eritema
Intensità Punteggio Assente 0 Leggero (appena visibile) 1 Ben visibile 2 Moderato 3 Grave (rosso barbabietola con eventuale formazione di lievi escare)
4 Edema
Intensità Punteggio Assente 0 Molto leggero (appena visibile) 1
Leggero 2 Moderato (bordi sollevati di circa 1 mm) 3
Forte (tumefazione estesa oltre l'area di applicazione) 4
In base al punteggio medio ottenuto nei soggetti sottoposti al test, il prodotto in esame à ̈ classificato nel modo seguente:
Classificazione di tollerabilità nel Patch test Punteggio medio Classificazione
0,0 - 0,5 Non irritante (Buona tollerabilità )
0,5 – 2,0 Leggermente irritante 2,0 – 5,0 Moderatamente irritante >5,0 Fortemente irritante
Risultati
La tabella 2 riporta i punteggi medi e i relativi errori standard rilevati su 30 volontari sani.
Tabella 2. Punteggi di eritema ed edema dopo applicazione della composizione.
Medie e (ES) di 30 soggetti
Soggetti (30) Eritema 15' Edema 15' Eritema 1 h Edema 1 h Eritema 24 h Edema 24 h 3M;27F 0,20 (0,07) 0,00 (0,00) 0,17 (0,07) 0,00 (0,00) 0,00 (0,00) 0,00 (0,00)
Media e ES generale (180 rilevazioni): 0,055 (0,0041).
Conclusioni
La tollerabilità cutanea della composizione dell’invenzione saggiata con il Patch Test su 30 volontari sani (3 maschi e 27 femmine) à ̈ risultata buona (molto inferiore alla soglia irritante).
Test di pro-sensibilizzazione
Si à ̈ adottato un test in vitro, in ottemperanza alla Direttiva 76/768 CEE che per i prodotti cosmetici prevede l'abbandono dell'utilizzo di animali per testare prodotti cosmetici. D’altra parte non à ̈ eticamente ammissibile condurre un test di sensibilizzazione per un cosmetico su soggetti umani.
Il test in vitro utilizzato valuta la presenza o l'assenza di effetti pro-sensibilizzanti da parte di prodotti destinati ad essere applicati sulla pelle utilizzando un modello cellulare per valutare la reattività immunologica di tipiche cellule immunitarie (monociti) esposte a contatto prolungato (48 ore) con i prodotti in esame.
Il test à ̈ stato condotto sulla linea cellulare di monociti THP-1 perché questo tipo cellulare à ̈ fortemente coinvolto nelle risposte immunitarie della cute. Su queste cellule si à ̈ valutata la modulazione dell'espressione di due molecole costimolatorie CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2) utilizzando come controlli positivi tipiche sostanze sensibilizzanti da contatto e cioà ̈ il nichel solfato (NiSO4•6H2O) e il Kathon CG. Il nichel à ̈ capace di suscitare in vivo reazioni immunitarie di tipo allergizzante ed à ̈ stato largamente utilizzato in vitro per studiare la modulazione della risposta immune. Il Kathon CG à ̈ un conservante ed à ̈ classificato dal punto di vista tossicologico come irritante primario e potenzialmente sensibilizzante.
Il riconoscimento dell'antigene da parte del TCR (T Cell Receptor) dei linfociti T (segnale 1) non à ̈ funzionale alla maturazione di una risposta immune efficiente se non avviene a livello della membrana di una cellula presentante l'antigene stesso e in grado di fornire un ulteriore segnale (segnale 2 o co-stimolo) qualitativamente fondamentale per la definizione del tipo di risposta (umorale, cellulare, ecc.). Sia B7.1 che B7.2 (collettivamente definiti B7) sono glicoproteine di membrana della superficie di numerose cellule che presentano l'antigene (cellule dendritiche, cellule di Langerhans, monociti/macrofagi, linee cellulari diverse tra cui cheratinociti) e agiscono come co-stimoli. Infatti, entrambe le molecole sono ligandi di una glicoproteina denominata CD28, presente sulla membrana del linfocita T. L'innesco del sistema ligando/recettore CD28/B7 previene l'apoptosi (morte cellulare programmata) delle cellule T e coopera nel sostenere la loro proliferazione e differenziazione.
Nelle prime fasi "fisiologiche" della risposta immune, B7.2 à ̈ espresso costitutivamente e modula sia le risposte Th1 che Th2. Con il progredire della risposta immune, anche B7.1 viene up-regolata e incrementa l'intensità del segnale costimolatorio, con espansione delle cellule T e produzione di varie citochine. B7.1, inoltre, à ̈ preferenzialmente up-regolato durante la fase acuta delle risposte autoimmuni.
L'aumento dell'espressione di queste molecole co-stimolatorie sul monocita à ̈ quindi segno di attivazione di una risposta immunitaria in seguito ad esposizione ad un antigene potenzialmente allergizzante. Funzionalmente, infatti, l'espressione di molecole co-stimolatorie su questo tipo cellulare corrisponde all'acquisizione di competenza per la presentazione dell'antigene nella tipica sede (la cute nel nostro caso) in cui in vivo si manifesta la sensibilizzazione da contatto.
Procedimento
Il campione (composizione preparata come nell’Esempio 1) à ̈ stato disciolto in etanolo, diluito direttamente a diverse concentrazioni nel medium di coltura delle cellule e sottoposto a test preliminare di citotossicità su cellule THP-1 per valutare a quale concentrazione la sostanza poteva essere impiegata in vitro senza causare mortalità cellulare, evento che provoca alterazione dei risultati. Come controllo negativo à ̈ stato considerato il terreno di crescita delle cellule lasciato nelle stesse condizioni sperimentali.
Esecuzione del test preliminare MTT
Il reagente chiave à ̈ il 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio bromuro o MTT, sostanza che dà un colore giallo in soluzione acquosa. La deidrogenasi mitocondriale delle cellule vitali taglia l’anello tetrazolico, portando alla formazione di cristalli di formazano color viola porpora insolubili in acqua. I cristalli vengono sciolti in isopropanolo acidificato e la soluzione viola risultante viene misurata allo spettrofotometro. Un aumento o diminuzione delle cellule vitali ha per risultato un cambiamento concomitante nella quantità di formazano che si forma e che può essere considerato come un indicatore del grado di citotossicità causato dall’esposizione alle sostanze testate. Dopo il trattamento le cellule vengono lavate con PBS e la soluzione MTT viene aggiunta ad ogni pozzetto, con successiva incubazione a 37°C. Alla fine del periodo di incubazione, il terreno-MTT viene rimosso e in ogni pozzetto viene aggiunta la soluzione solubilizzante MTT. La piastra viene agitata su un agitatore a piastra per 20-30 minuti, assicurando che tutti i cristalli siano sciolti ed abbiano formato una soluzione omogenea. Il risultato à ̈ espresso come:
% sopravvivenza cellulare = 100 x (OD cellule trattate)/(OD cellule non trattate)
Esecuzione del test di sensibilizzazione Dopo l’esposizione le cellule sono state esaminate per la vitalità con colorazione di Tripan Blue e osservazione microscopica in camera contaglobuli. Le cellule sono state raccolte, lavate in un tampone isotonico (PBS) e marcate con un anticorpo fluoresceinato diretto contro B7.1 o B7.2. Dopo ulteriori lavaggi per asportare l'anticorpo in eccesso, le cellule sono state immesse in un citofluorimetro di flusso per la valutazione della MFI (Mean Fluorescence Intensity), che à ̈ proporzionale al numero di molecole marcate per cellula, e quindi rappresentativa del livello di espressione delle molecole costimolatorie indagate.
Si sono inoltre rilevati parametri qualitativi morfologici (alterazione del volume delle cellule, modificazioni delle granulazioni cellulari, ecc.) legati a necrosi cellulare e apoptosi, eventi strettamente connessi al processo di elicitazione allergica.
I controlli positivi sono rappresentati da colture THP-1 esposte a nichel solfato e Kathon CG. Le concentrazioni dei due pro-sensibilizzanti utilizzati come riferimento sono state scelte tra quelle che sono risultate “non citotossiche†nel test MTT preliminare. Come controllo negativo (fluorescenza di base) à ̈ stata valutata la MFI delle cellule THP-1 non trattate e la MFI delle cellule THP-1 fatte reagire con un anticorpo monoclonale fluoresceinato di specificità irrilevante.
Risultati
In tabella 3 sono riportati i risultati dell'analisi della linea di monociti THP-1 per espressione di molecole costimolatorie al citofluorimetro di flusso dopo 48 ore di reazione con il campione alle due concentrazioni testate e con i controlli, corretti per il controllo negativo.
Tabella 2. Espressione di molecole prosensibilizzanti
Campioni CD80 (MFI*) CD86 (MFI*) 20 Î1⁄4g/ml nichel solfato 24,08 61,92
10 Î1⁄4g/ml nichel solfato 16,45 28,75
4 Î1⁄4g/ml nichel solfato 3,22 3,69
15 Î1⁄4g/ml Kathon CG 18,7 18,88
3 Î1⁄4g/ml Kathon CG 2,93 4,99 Composizione 0,2 Î1⁄4l/ml -0,02 -0,13 Composizione 0,04 Î1⁄4l/ml -0,06 0,13
*MFI = Mean Fluorescence Intensità : media geometrica dell'intensità di fluorescenza delle cellule decorate con l'anticorpo fluoresceinato che à ̈ proporzionale al numero di molecole decorate per cellula.
Osservando il comportamento della coltura di THP-1 a contatto con il nichel, tipica sostanza allergizzante, si può rilevare che questo provoca:
- un incremento elevato di entrambi i marcatori;
- una correlazione diretta dell'incremento dell'intensità della risposta con la concentrazione;
- un effetto rilevabile anche a dosi molto basse (4 Î1⁄4g/ml).
La dose bassa testata di nichel solfato (4 Î1⁄4g/ml) corrisponde a circa 1 ppm di nichel, valore che si colloca intorno alla dose soglia allergizzante nei soggetti già sensibilizzati e su cute irritata. Nell’esperimento si à ̈ verificato come questa concentrazione sia in grado di causare un aumento rilevabile di CD80, rispetto ai controlli non trattati (dati non mostrati).
La concentrazione in grado di causare una reazione allergica nella maggior parte dei soggetti sensibili si colloca tuttavia intorno a valori ben più alti, oltre le 100 ppm di nichel a contatto con la cute integra e sana.
La coltura di THP-1 a contatto con Kathon CG ha evidenziato:
- un incremento di entrambi i marcatori;
- una correlazione diretta tra la concentrazione e l'incremento dell'intensità della risposta;
- un effetto rilevabile anche a concentrazioni molto basse (3 Î1⁄4g/ml).
In sintesi, alle concentrazioni saggiate la composizione dell’invenzione non ha evidenziato una modulazione dei marcatori indagati, non ha mostrato effetti citotossici sulla coltura cellulare utilizzata, non ha provocato effetti apoptotici sulle cellule in esame, non ha aumentato in vitro l'espressione dei due marcatori indagati nei monociti neppure a concentrazioni di 0,2 Î1⁄4g/ml, mostrando quindi di non possedere un potenziale di stimolo del sistema immunitario mediato dal monocita macrofago.
Si può quindi concludere che nel test di prosensibilizzazione la composizione non mostra attività pro-sensibilizzanti rilevabili.
Esempi
Le preparazioni qui di seguito riportate illustrano forme di realizzazione della presente invenzione e come tali non devono essere ritenute in alcun modo limitative dell'invenzione stessa.
Si menziona in particolare la possibilità di utilizzare attrezzature, quantità ed eccipienti alternativi rispetto a quelli esplicitamente menzionati negli esempi di preparazione qui di seguito illustrati, in dipendenza delle esigenze formulative e tecnologiche. La scelta delle attrezzature, degli eccipienti e delle quantità idonei rientra nelle capacità del tecnico medio del settore delle preparazioni cosmetiche e di tecnica farmaceutica e non richiede l’esercizio di attività inventiva.
Va precisato inoltre che il dosaggio degli attivi esplicitato negli esempi à ̈ puramente illustrativo e può essere variato in base alle specifiche esigenze del caso.
L’inclusione nella composizione dell’invenzione di ulteriori sostanze complementari atte a contribuire ad un ulteriore miglioramento degli effetti salutistici e cosmetici degli attivi menzionati rientra nell’ambito della presente invenzione. Il tecnico medio del settore à ̈ in grado di identificare caso per caso le necessarie modifiche formulative, tenendo conto di svariati fattori quali la qualità , quantità e le caratteristiche reologiche delle sostanze complementari.
Esempio 1. Preparazione di un lotto di 4 kg di composizione secondo l’invenzione
1. Preparazione della fase acquosa
Disperdere in un turboemulsore con agitazione a pale in 3098 g di acqua a 50°C:
g 2,00* acido chetoglutarico
g 32,00* acido lattico
g 36,00* siero di latte pastorizzato nebulizzato e disidratato
g 20,00* Estratto idroglicolico di fiore di Calendula officinalis
g 8,00* Estratto idroglicolico di Salvia officinalis
fino a completa dissoluzione.
2. Aggiungere:
g 32,00* Gomma xantana
3. Aggiunta dei tensidi detergenti dermotrofici Con agitazione a pale, sotto vuoto, a 30°C g 26,80* miscela di Cocco-glucoside e Gliceril Oleato
g 14,80* Decil Glucoside
g 72,00* miscela di disodio lauriletere solfosuccinato e sodio lauril solfoacetato
g 320,00* Sodio coccoil aminoacidi di grano al 30%
4. Aggiunta dei componenti dermotrofici e dermoprotettivi
Con agitazione a pale, sotto vuoto e a 30°C , aggiungere:
g 20,00* Maltodestrina
g 58,40* miscela di Gliceril Isostearato, Glicole Distearato, Potassio Palmitoil proteina idrolizzata di grano (1,5:1,5:1)
g 11,20* miscela di Estratto di Avena Sativa, Proteina di avena idrolizzata, Potassio Palmitoil Proteina di Avena (4:1:1)
g 160,00* miscela di Caprilil Glicole e Diglicerina (1:7)
5. Aggiunta di g 88,00 di fragranze
6. Scaricare dal turboemulsore in adatti contenitori.
La sequenza e il tipo delle operazioni rispecchiano le condizioni adottate per preparare la composizione descritta nell’esempio 1. Sono concepibili loro modificazioni in funzione dell’attrezzatura a disposizione, delle dimensioni del lotto e delle consuetudini produttive.
I dosaggi marcati con * sono quelli utilizzati nell’esempio e sono da considerare puramente indicativi sia per quanto riguarda la preparazione di lotti di 4 kg, sia per quanto riguarda le proporzioni da utilizzare in lotti di altre dimensioni.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Composizione per l’igiene intima, comprendente una o più sostanze attive scelte dal gruppo che consiste di detergenti dermocompatibili, agenti idratanti, agenti emollienti, agenti dermoprotettivi, agenti dermotrofici, agenti lenitivi, agenti antimicrobici, agenti antiossidanti, agenti deodoranti, agenti tamponanti, estratti vegetali e loro combinazioni, unitamente a gomma xantana in qualità di agente atto a favorire la bioadesione delle sostanze attive a cute e mucose.
- 2. Composizione secondo la rivendicazione 1, comprendente gomma xantana in concentrazione da 0,4% a 2,4% in peso riferito al peso totale della composizione.
- 3. Composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, comprendente almeno un tensioattivo lipoproteico naturale.
- 4. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui l’almeno un tensioattivo lipoproteico naturale à ̈ una miscela di sodio coccoil aminoacidi di grano.
- 5. Composizione secondo la rivendicazione 4, comprendente la miscela di sodio coccoil aminoacidi di grano ad una concentrazione di 4% a 20% in peso riferito al peso totale della composizione.
- 6. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, comprendente almeno un ulteriore detergente dermocompatibile scelto dal gruppo che consiste di disodio lauriletere solfosuccinato, sodio lauril solfoacetato, coccoglucoside, gliceril oleato, decil glucoside e loro combinazioni.
- 7. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, comprendente almeno un agente dermotrofico scelto dal gruppo che consiste di maltodestrina, gliceril isostearato, glicole distearato, potassio palmitoil idrolizzato di proteine di grano, estratto di avena sativa, proteina di avena idrolizzata, potassio palmitoil proteina di avena, caprilil glicole, diglicerina e loro combinazioni.
- 8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, comprendente estratto di fiori di Calendula officinalis e/o estratto di Salvia officinalis.
- 9. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 8, comprendente acido chetoglutarico quale antiossidante e deodorante.
- 10. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9, comprendente acido lattico in combinazione con siero di latte quali agenti tamponanti.
- 11. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 10, ad uso detergente, cosmetico, di medicamento o di dispositivo medico.
- 12. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 11, in una forma idonea all’applicazione topica, preferibilmente in forma di soluzione, crema o gel.
- 13. Prodotto di igiene, comprendente un supporto, quale un panno o una salvietta, impregnato con una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 12.
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