JP4524418B2 - 独立した認識領域および光学形式を有するバイオチップ、並びにこのバイオチップの浮動読み取り - Google Patents

Description

本発明は、複数の分子認識領域と、どの分子認識領域が実際に読み取られるかを決定するための光学的マークと、を有するバイオチップに関する。

また、本発明は、そのようなバイオチップを読み取るための装置にも関する。

特許文献１は、複数の分子認識領域と、バイオチップ（biochip；生体素子）を読み取るための装置とを有する、そのようなバイオチップとを開示している。詳細には、光学的マークを備えたバイオチップをスキャンするための光学読み取りヘッドを使用する第１の機械システムと、この第１の機械システムまたはさらに特定の第２の機械システムを使用して光学ヘッドを正確な位置で従動させることを開示している。光学的マークに対応する光学ヘッド位置のこの従動は、より一般的には、コンパクトディスク（ＣＤ）のための追跡(トラッキング；tracking)として言及される。蛍光の正確な読み取りは、光学ヘッドの正確な位置を制御するこの従動システムによって可能となる。バイオチップに配置された光学的マーキングパターンは、トラック(track)の形状にあることが可能である。

読み取られた蛍光の位置に関する情報を与えるマーキングパターンからなる光学形式が実行された。この形式は、理想的な軌道上での光学ヘッドの連続的な再配置を可能にする。この光学形式のおかげで、記憶された蛍光情報が特定の認識領域から発生するかどうかを知ることができる。したがって、これは、例えば、１つの認識領域から他の認識領域までの経路を指示するために、特定のパターンを必要とする。また、これは、バイオチップがスキャンされているとき、読み取りトラックの少なくとも一部の番号付け、またはトラックスキップの絶対的な制御をも必要とする。このようにしてこの蛍光情報は直接記憶でき、バイオチップ上に配置された特定の認識領域に関連付けができる

特許文献１は以前使用されていた技術に関する重要な進歩を開示している。しかしながら、認識領域と光学形式を形成するパターンの間のバイオチップ上の相対的な位置決めにおけるいかなる不良もエラーの源である。例えば、全ての認識領域の位置決めエラーは、光学形式の１つのトラックが２つの隣接する認識領域間の境界に位置決めされるようなオフセットを出現させる。このタイプの欠陥は、隣接する生物学的プローブ(probe)の一方または他方に蛍光測定を割り当てることによる読み取りエラーの原因となりうるために、問題を生じさせる。したがって、光学形式を提供された基板上の位置決めの観点から、認識領域を得る技術においては、強い制約が存在する。光学形式内のトラックの追跡(トラッキング；tracking)に使用される軸に垂直な軸に沿った読み取りトラックの半ピッチと等しいか、またはそれより大きな位置決め欠陥は、このようなバイオチップの廃棄が必要となりうるような修正措置を必ず要求する。

しかも、光学ヘッドの位置を従動させるシステムは機械的かつ電子的に複雑となる。また、認識領域のサイズとピッチに応じて特定の光学形式を提供することもしなければならない。

この方法の最終的な不利な点は、トラックジャンプ(track jump)の際にトラックに垂直な方向に沿ってサンプリングする段階の制限である。
フランス特許出願公開第７８４１８９号明細書（米国特許第６５３７８０１号明細書に対応）

本発明は、これらの問題、とりわけ光学形式と認識領域の間のいかなる位置決め欠陥をも克服しようとするものである。

特許文献１で開示されるような、光学形式マークにより供給された情報に起因して光学読み取りヘッドを連続的に従動させることと異なり、本発明ではむしろ、関連するシステムの抑制下でバイオチップ表面上の事前に定義されたスキャン経路に沿って、光学読み取りヘッドが通過することができ、また蛍光情報および光学形式から得られた位置決め情報を同時に記憶することができる。バイオチップの平面内では、光学ヘッドの位置のいかなる従動または修正も行われない。しかしながら、一旦蛍光が完全にまたは部分的に記憶されると、各測定値は、蛍光測定の間に光学形式を使用することで記憶された位置情報を使用して、想定上のバイオチップ上にコンピュータによって再配置される。そして、いかなるスキャン直線性あるいはスキャン規則性の欠陥も補償されて、記憶された蛍光情報（バイオチップ上の）の真の空間的由来が決定される。

本発明により提案された解決手段は、読み取りの光学的部分の位置の従動をすべて排除するので、機械的および電子的システムを簡単化する。

本発明の第１の目的は、分子認識領域の形式を作成するために決定されたレイアウトで分布した複数の有用な分子認識領域と、光学形式を形成するよう決定されたレイアウトで分布し、それぞれの分子認識領域に対する光学位置マークをマーキングする手段と、を有するバイオチップから構成され、その状況において、前記光学形式および認識領域の形式は互いに独立して作られた形式であり、２つの形式の相対位置を決定する手段がバイオチップ上に提供される。これにより、光学形式と分子認識領域は空間的に独立できる。特に、それらがお互いに対応して配置される必要はない。

好都合なことに、前記２つの形式の相対位置を決定する手段は、螢光パターンを得るための特定の生物学的ターゲットを受け取ることを意図された分子認識領域であり、特定の生物学的ターゲットを受け取るように設計されたこれらの分子認識領域は、有用な分子認識領域に完全に対応して位置付けられた位置に配置される。

望ましくは、前記光学マーキング手段は、基板、または複合基板の基板表面層において、一連の彫り込み、および非彫り込み領域から成る。この彫り込み、および非彫り込み領域は市松（チェック）模様を形成できる。この市松模様の領域は分子認識領域に対して斜めにできる。

望ましくは、それぞれの前記認識領域の表面積は、前記光学形式の彫り込み領域または非彫り込み領域の表面積より大きい。例えば、それは彫り込み領域の表面積の数倍に相当しうる。

分子認識領域は前記光学形式上に配置できる。光学形式追跡ビーム（トラッキングビーム）の反射を助ける層または薄い層のスタックが、前記光学形式と前記分子認識領域の間に配置できる。また、この層は、基板平面に垂直な方向における光学ヘッドの位置を従動させることにも関与する。

本発明の第２の目的は、上記で定義されたバイオチップなどを読み取るための装置であって、
−バイオチップ上に第１の入射光を出射可能な第１の光学ヘッドと、
−前記第１の入射光によって前記バイオチップをスキャンする第１の手段と
−前記バイオチップ上に第２の入射光を出射可能な第２の光学ヘッドと、
−前記第２の入射光によって前記バイオチップをスキャンする第２の手段と
−前記バイオチップから発する第１の光を出射するための光学ヘッドに関連付けられ、第１のオプトエレクトロニクス検出器上への前記第１の入射光に対応し、それぞれの分子認識領域における目標分子の有無を明らかにする第１の光学系であって、前記第１のオプトエレクトロニクス検出器が前記第１の光に対応する信号を供給できるようにした第１の光学系と、
−前記バイオチップの光学形式から発する第２の光を出射するための光学ヘッドに関連付けられ、第２のオプトエレクトロニクス検出器上への前記第２の入射光に対応し、前記第２のオプトエレクトロニクス検出器が前記第２の光に対応する信号を供給できるようにした第２の光学系と、
−前記第１の光に対応する信号の少なくとも一部を記憶する第１の手段と、
−前記第２の光に対応する信号の少なくとも一部を記憶する第２の手段と、
−２つの前記形式の相対位置を決定する手段に応じて想定上のバイオチップに基づいて、前記第１の光に対応する信号と前記第２の光に対応する信号とを調整する前記信号を処理する手段と、
を有することを特徴とする装置から構成される。

好都合なことに、前記第１および第２の光学ヘッドは同時発生的としうる。この処理手段は、例えば、前記信号を収集しつつ、または全バイオチップ上での完全な収集の後に、それらの信号を処理するコンピュータ手段とすることができる。

前記バイオチップ表面上の読み取りビームの焦点を維持する機械システムまたは自動焦点システムを有することができる。前記自動焦点システムは圧電アクチュエータ、およびこのアクチュエータを従動させる手段を含むことができる。

本発明は、添付の図面に関連する非限定的な例として与えられた以下の説明を読んだ後に、よりよく理解され、そして、他の利点および特徴が、より明確になるであろう。

図１は本発明によるバイオチップの平面図である。バイオチップは、例えばケイ石（silica；二酸化ケイ素）ウェハ１上に、読み取りビームを透過できる状態で作成することができる。灰色の部分は光学形式を含んだ部分を示す。本発明では多くの光学形式を使用できる。ここで説明された光学形式は単なる有利な一実施例である。光学形式は図１の一部の拡大図である図２を参照して説明される。また、バイオチップをガラスまたは透明なプラスチック上に作成し、読み取りはプレートを通して行うこともできる。また、非透過性の基板上でそれを行い、そして上方から読み取りを行うこと、言い換えれば、基板を通すことなく行うこともできる。

図２においてさらに明確に示されるように、光学形式は、例えばひし形または正方形の形状の、彫り込み領域２および非彫り込み領域３のマトリクスから成ることができる。彫り込み領域および非彫り込み領域の各対角線は、５μｍ長さとすることができる。

光学形式は、生物学的認識領域が作られる部分を示す粗い区切りを与えるために、ひいてはスキャニングが直線性である場合に測定のための出発点を提供するために、中断部分５を有することができる。中断領域によって区切られた領域は、生物学的認識領域を生成するための技術の位置決め誤差にかかわらず、生物学的認識領域を取り囲むことができるくらい大きくなければならない。彫り込み領域または非彫り込み領域の表面積は、概ね読み取りビームスポットの表面積に一致している。

ケイ石、シリコンまたはガラスで作られた基板に対して、彫り込みは微細技術分野でよく知られているＲＩＥ（リアクティブイオンエッチング）食刻技術を使用して行うことができる。読み取りに使用される光学系の設計に応じて、この彫り込みは２０ｎｍから数１００のナノメートルの変更範囲で変更できる。プラスチックで作られた基板に対しては、モールドまたはホットスタンプ（箔押し）の技術を使用できる。

図３は、図１および図２におけるバイオチップの部分的な断面図を示しており、彫り込み領域２と非彫り込み領域３を示している。セクションは連続した彫り込み領域と非彫り込み領域の対角線に一致する軸に沿って作成された。

光学形式位置検出の最適な動作を目的として、光学層６または光学層のスタック(stack；積層)は、入射光の例えば１０％のオーダーの反射率を達成するために、彫り込み表面上に、あるいはより一般的にはプレートの模様付きの(textured)表面上に堆積される。層６は、２に等しい屈折率をもった、８０ｎｍ厚さの窒化シリコン層であることができる。必要な反射性に応じて、例えばＴｉＯ_２、Ｔａ_２Ｏ_５、ＨｆＯ_２、ＺｎＯ、ＭｇＯ、ＳｉＯ_２、ＭｇＦ_２、ＹＦ_３、Ａｌ_２Ｏ_３、ＺｒＯ_４Ｔｉ、Ｙ_２Ｏ_３、ダイヤモンド、および酸窒化物などの、他の屈折率をもった他の材料を使用できる。これは、非常に多くのパラメータ：測定されるべき蛍光レベル、収集光学系の透過性、レーザ出力、バイオチップが位置している基板と媒質の性質など、に応じたシステム最適化である。

ここで選ばれた光学形式は、２軸に関して対称であるという利点を有し、これは２軸上での同等な位置決め精度を保証する。

図３における参照番号７は、光学層６に固定された分子認識領域の生物分子を図式的に示しているが、これらの生物分子はサイズ通りには示されていない。

図４は本発明による読み取り装置の概略図を示している。

この装置は、平行レンズ１２と、アナモルフィック(anamorphic)プリズムおよびモノクロフィルタリングのシステム１３と、によって処理されるビームを放つレーザ１１を有する。

処理されたビームは、分離立方体１４を通過し、ダイクロイックミラー１５によってミラー２６の方に反射される。ミラー２６はレーザビームを反射させ集束レンズ２７に通過させた後に、バイオチップ１０に導く。励起ビームは、バイオチップ１０を通過し、レンズ２７の反対側でバイオチップの表面に焦点合わせされる。

集束レンズ２７は、励起光に反応した生物分子から放たれた蛍光光を集め、また蛍光光が、ハイパスフィルタ１６、集束レンズ１７、および共焦点ダイヤフラム１９を通過した後に、このミラーによってオプトエレクトロニクス検出器１８に反射されるように、ミラー２６に向かって指向される。

集束レンズ２７は光学形式によって返された励起光も集める。この返された光はミラー２６で反射し、そして分離立方体１４に向かってダイクロイックミラー１５で反射する。そして、この光は、フォトダイオード２１へのこの光の一部を反射し、他の一部を集束レンズ２２に通過させた後にフォトダイオード２３に反射する第２の分離立方体２０に返される。

フォトダイオード２１によって提供された情報は蛍光信号と一緒に扱われることになる光学形式に関するデータを含んでいる。

フォトダイオード２３によって提供された情報は、光軸上の集束レンズ２７の位置の従動のために使用されるが、それは、伝統的なＣＤ読み取りに対するのと同様に自動焦点システムが維持されなければならないからである。このシステムは、通常、電磁制御を備えたアクチュエータの従動に基づいている。往復運動によるバイオチップのスキャンに対しては、追加的な問題が起こる。移動方向反転の局面が、利用可能ないかなる反射信号も存在しない領域（例えばバイオチップ上でない場所）に起こる可能性がある。これは伝統的な従動システムでは本質的なことであり、そしてあらゆる移動ライン変更の場合におけるそのラインの開始時点で焦点探索の局面が必要であろう。この時間損失を避けるために提案された自動焦点システムは、前回のラインの終端に対して得られたのと同一の焦点位置で、逆方向に読み取りを再開するために、各ラインの終端位置にアクチュエータを保持することができる。例えば、１つの解決策は、ラインの終端で前回の値を保持することによって位置を保持する圧電アクチュエータを使用することで構成される。

このシステムでは、生物分子蛍光源が励起されるのと同時に、光学形式が照射される。異なった光源または同一の光源を使用して、この形式は照射されることができ、そして蛍光源は励起されることができる。そして、２つのタイプの情報に関する記憶が、このスキャンの間に作成される。蛍光測定情報はこの光学形式からの情報出力と同時に記憶される。

２つの記憶は２つのコンピュータ・ファイルを生成することにつながり、次に、コンピュータ処理が行われ、バイオチップから読み取られる情報につながるすべての動作がそれに続く。とりわけ、この処理はコンボリューション(convolution；畳み込み)法を利用できる。一旦バイオチップが完全に読み取られると、この処理が行われる。また、スキャン時に収集が行われている間にもこれを行うことが可能であり、他の利点のうちで、これは格納されるべき情報量を減少させる。

バイオチップが使用されている状態で、光学形式に対する分子認識領域の相対位置がわかる。マークされた生物学的ターゲットをハイブリダイゼーション(hybridization)している間に、いくつかの特定のターゲットが導かれるであろう。これらの特定のターゲットは、バイオチップ上の特定かつ所定の位置、例えば領域５内に位置する部分の４つの角（図１参照）で、螢光パターンの生成を可能にする。これらの螢光パターンは、マークとして使用され、分子認識領域の位置に対する光学形式の相対位置を知る手段を提供する。この特定位置は、４つの領域掛ける４つの領域のマトリクスであることが可能で、各領域は３０μｍの横方向の規模を有し、２つに１つの領域には、特定のターゲットを受容することができる生物学的プローブ（特定の認識領域）が提供される。明らかに、パターンのサイズは、より大きいか、または、より小さいことが可能である。これらの特定の認識領域は無作為なパターン、または無作為でないパターンで配置できる。また、それらは様々な強度を持つこともできる。

例えばフォトリソグラフィマスクを使用するそれらの生産技術によって、認識領域の位置が信頼性をもって決定される。したがって、認識領域の形式と光学形式の相対位置がわかる。各蛍光測定値が位置情報に関連付けられ、それによって、認識領域の真の位置に対応するこの測定値の再配置をするのにコンピュータ処理が使用できる。

このシステムは、光学形式を形成するパターンに対するバイオチップ上で認識領域の完全な位置決めを必要としない。また、それは、それぞれの分子認識区画の規則的かつ一様な読み取りを必ず課すというわけではない。したがって、規則的かつ一様な読み取りと同一な程度に信頼できる、それぞれの認識領域に対する非常に多くの読み取りを、生物学的プローブの蛍光値の測定をするのに使用できる。

図５は、認識領域上での読み取りビームのスキャンの第１の例に関する線図を示している。図５の線図は６ｘ６の分子認識領域３０のマトリクスを示している。参照番号３１はバイオチップ上の読み取りビームのスキャンを表す。それぞれの分子認識領域の規模は、例えば、３０μｍｘ３０μｍとすることができる。スキャンは往復ラインで行われる。

より良く全表面をカバーする範囲を与えるために、または信頼できる機械システムとのより良い一致を与えるのに、他のスキャン法が使用できる。往復方法は、機械構成における減速と方向の変更の問題を引き起こす。図６は可能なスキャンの第２の例を示している。減速の必要性を回避するスキャン３２は、らせん状に行われる。

図７は、本発明を使用する分子認識領域４０上で得られる読み取りポイント４１の可能な配置を示している。

本発明によるバイオチップの平面図を示す。 図１に示されたバイオチップの一部の拡大図であって、光学形式の構成要素を示す。 本発明によるバイオチップの部分的な断面図であって、光学形式の構成要素を示す。 本発明による読み取り装置の概略図である。 認識領域をスキャンする読み取りビームの第１の例を示す線図である。 認識領域をスキャンする読み取りビームの第２の例を示す線図である。 本発明を利用して認識領域上で得られた読み取りポイントの可能な分布を示す図である

符号の説明

２ 彫り込み領域
３ 非彫り込み領域
５ 中断部分
６ 光学層
７ 生物分子
１０ バイオチップ
１１ レーザ
１８ オプトエレクトロニクス検出器
２１ フォトダイオード
２３ フォトダイオード
３０ 分子認識領域
３１ 読み取りビームのスキャン
３２ 読み取りビームのスキャン
４０ 分子認識領域
４１ 読み取りポイント

Claims (10)

1. 分子認識領域の形式を作成するために決定されたレイアウトで分布した複数の有用な分子認識領域と、光学形式（２，３，５）を形成するよう決定されたレイアウトで分布し、それぞれの分子認識領域（３０）に対する光学位置マークをマーキングする手段と、を有するバイオチップであって、
   有用な分子認識領域が既知の相対位置に従って光学形式（２，３）上に配置され、
   有用な分子認識領域に対応するバイオチップの特定かつ予め定義された位置に配置された特定の生物学的ターゲットを受け取ることを意図された分子認識領域によって構築された、前記既知の相対位置を決定する手段を有し、該手段が、これら特定の生物学的ターゲットの螢光を得ることを可能にすることを特徴とするバイオチップ。
2. 前記光学マーキング手段は一連の彫り込み領域（２）および非彫り込み領域（３）から成ることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
3. 前記彫り込み領域（２）および非彫り込み領域（３）は市松模様を形成することを特徴とする請求項２に記載のバイオチップ。
4. 前記市松模様の領域は分子認識領域に対して斜めであることを特徴とする請求項３に記載のバイオチップ。
5. それぞれの前記認識領域の表面積は、前記光学形式の彫り込み領域または非彫り込み領域の表面積より大きいことを特徴とする請求項２から４のうちいずれか１項に記載のバイオチップ。
6. 光学形式追跡ビームの反射を助ける層または薄い層のスタックが、前記光学形式と前記分子認識領域の間に配置されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
7. 請求項１で定義されたバイオチップ（１０）などを読み取るための装置であって、
   −バイオチップ上に第１の入射光を出射可能な第１の光学ヘッドと、
   −前記第１の入射光によって前記バイオチップをスキャンする第１の手段と
   −前記バイオチップ上に第２の入射光を出射可能な第２の光学ヘッドと、
   −前記第２の入射光によって前記バイオチップをスキャンする第２の手段と
   −前記バイオチップから発する第１の光を出射するための光学ヘッドに関連付けられ、第１のオプトエレクトロニクス検出器上への前記第１の入射光に対応し、それぞれの分子認識領域における目標分子の有無を明らかにする第１の光学系であって、前記第１のオプトエレクトロニクス検出器が前記第１の光に対応する信号を供給できるようにした第１の光学系と、
   −前記バイオチップの光学形式から発する第２の光を出射するための光学ヘッドに関連付けられ、第２のオプトエレクトロニクス検出器上への前記第２の入射光に対応し、前記第２のオプトエレクトロニクス検出器が前記第２の光に対応する信号を供給できるようにした第２の光学系と、
   −前記第１の光に対応する信号の少なくとも一部を記憶する第１の手段と、
   −前記第２の光に対応する信号の少なくとも一部を記憶する第２の手段と、
   −２つの前記形式の相対位置を決定する手段に応じた想定上のバイオチップに基づいて、前記第１の光に対応する信号と前記第２の光に対応する信号とを調整する前記信号を処理する手段と、
   を有することを特徴とする装置。
8. 前記第１および第２の光学ヘッドは同時発生的であることを特徴とする請求項７に記載の装置。
9. 前記バイオチップ表面上の読み取りビームの焦点を維持する機械システムまたは自動焦点システムを有することを特徴とする請求項７または８に記載の装置。
10. 前記自動焦点システムは圧電アクチュエータ、およびこのアクチュエータを従動させる手段を含むことを特徴とする請求項９に記載の装置。

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