JP4498649B2

JP4498649B2 - Industrial production method of cyanohydrin

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Publication number: JP4498649B2
Application number: JP2001363840A
Authority: JP
Inventors: 尚仙波; 幸生 ▲土▼▲橋▼
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2010-07-07
Anticipated expiration: 2021-11-29
Also published as: JP2002355085A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シアノヒドリンの工業的製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シアノヒドリンは、ピレスロイド農薬製造や医薬合成の中間体として有用な化合物である。カルボニル化合物及びシアニドドナーを原料とし、実質的に水と混和しない有機溶媒を反応溶媒として、ヒドロキシニトリルリアーゼ等の酵素を触媒に用い、シアノヒドリンを合成する反応については多くの報告がある。このような酵素反応によって生成したシアノヒドリンは溶媒である有機溶媒に溶解している。この有機溶媒中のシアノヒドリンは、通常、シアノヒドリンを含む反応生成液を蒸留して、低沸点の溶媒を留去するという公知の方法により回収される。しかし、このとき留出した有機溶媒を含む溶液の回収及び/又はリサイクル方法については全く注意が払われておらず、地球環境問題の観点と、コスト低減の観点から問題がある。
従って、留出した溶液を有効利用し、シアノヒドリンを工業上有利に合成するための方法が上記問題を解決する上で重要であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、反応溶媒及び未反応のシアニドドナーを有効利用し、シアノヒドリンの工業上有利な製造方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、酵素反応終了後の反応液を蒸留し、未反応のシアニドドナー及び有機溶媒を回収する際、有機溶媒が存在することによってシアニドドナー、例えば、低沸点のため回収困難な青酸等でさえ、ほとんどロスなく回収が可能で容易に再利用できる方法を確立し、本発明を完成させるに至った。
【０００５】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）カルボニル化合物を基質として有機溶媒を含む溶媒中で、シアニドドナーの存在下、酵素反応によりシアノヒドリンを製造する方法において、酵素反応終了後の反応液を蒸留することにより得られる、未反応のシアニドドナー及び有機溶媒を含む回収液を、少なくとも１回以上、繰り返し使用することを特徴とするシアノヒドリンの製造方法。
（２）前記回収液に含まれる水を分離除去することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（３）蒸留の際の温度が０℃〜１００℃、減圧度が１〜６００torrである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記回収液から、相分離した水相を分離し、残った有機相を回収して次の反応に用いる、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法により製造されるシアノヒドリンには、光学活性なシアノヒドリンも含まれる。光学活性な物質とは、一方の鏡像異性体が他方の鏡像異性体より多く含まれている物質のこと、又は、いずれか一方の鏡像異性体のみからなる物質のことをいう。
【０００７】
本発明における、カルボニル化合物を基質としてシアノヒドリンを合成する反応を触媒する酵素としては、ヒドロキシニトリルリアーゼが挙げられる。本発明に用いるヒドロキシニトリルリアーゼとは、シアニドドナーの存在下、カルボニル化合物からシアノヒドリンを合成する活性を有するものを意味し、Ｒ体のシアノヒドリンを合成するヒドロキシニトリルリアーゼ（（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、アーモンド(Prunus amygdalus)などのバラ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、アマ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、Ｓ体のシアノヒドリンを合成するヒドロキシニトリルリアーゼ（（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、モロコシ(Sorghum bicolor)などのイネ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キャッサバ(Manihot esculenta)、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)などのトウダイグサ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キシメニア(Ximenia americana)などのボロボロノキ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼなどが例示できる。
【０００８】
前記酵素は酵素を含む生物組織からの抽出によって調製することができるが、前記酵素の遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作成した遺伝子組換え生物によっても生産することができる。また、天然型のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を改変し、酵素機能を改変したヒドロキシニトリルリアーゼについても、上記の活性を有するものであれば本発明に用いることができる。抽出は常法によって実施すればよく、調製物にはヒドロキシニトリルリアーゼ以外の成分が含まれていても反応に悪影響を与えなければ特に精製する必要はない。
【０００９】
更に、前記酵素は、粉末状酵素、緩衝液等に溶解した酵素液、適当な担体に固定化してなる固定化酵素などの状態のものを使用することができる。反応終了後の反応液からの酵素の回収及び再利用が容易となることから、固定化酵素を使用するのが好ましい。
本発明においては、シアノヒドリンを製造するための基質としてカルボニル化合物を用いる。
【００１０】
ここでカルボニル化合物とは、アルデヒド又はケトンをいい、具体的には、次式（Ｉ）：
Ｒ¹−ＣＯ−Ｒ² （Ｉ）
（式中、Ｒ¹及びＲ²は、互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子又は炭素数２２以下の１価の炭化水素基を表し、前記炭化水素基中、−ＣＨ₂−並びに−ＣＨ₃のＣＨ₂はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく、＝ＣＨ₂は＝Ｏ又は＝Ｓで置き換えられていてもよく、また−ＣＨ₂−のＣ−Ｈ、−ＣＨ₃のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ並びに＝ＣＨ₂のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置き換えられていてもよく、また、Ｒ¹及びＲ²は、共同して２価の基を表してもよい。）
で示される。
【００１１】
前記式（Ｉ）において、炭素数２２以下の１価の炭化水素基とは、直鎖状又は分岐状の鎖状炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある単環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある多環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のあるスピロ炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある環集合構造の炭化水素基、あるいは、前記の環式炭化水素基が置換した鎖状炭化水素基のいずれをも含む。また、飽和な炭化水素基並びに不飽和な炭化水素基のいずれをも含むが、不飽和な炭化水素基において、Ｃ＝Ｃ＝Ｃのアレン構造を含む基は除く。
【００１２】
なお、以下においては、側鎖のない芳香族基、側鎖のある芳香族基、並びに、フェニルフェニル基又は側鎖のあるフェニルフェニル基などを併せて、アリール基といい、このアリール基で置換された直鎖状又は分岐状のアルキル基をアラルキル基という。他の環式炭化水素基に関しても、特に明記しない場合、環上に側鎖のないものとあるものを併せて指す場合には、単にシクロアルキル基等の名称を用いる。鎖状炭化水素基についても、直鎖状のものと分岐状のものを併せて指す場合には、単にアルキル基等の名称を用いる。
【００１３】
前記炭化水素基中、−ＣＨ₂−がカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられると、それぞれケトン、スルホン、エーテル又はチオエーテルの構造が導入され、−ＣＨ₃の−ＣＨ₂−がカルボニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換わると、それぞれホルミル基（アルデヒド）、水酸基又はメルカプト基に変わり、あるいは、末端の＝ＣＨ₂が＝Ｏ又は＝Ｓに置き換わると、ケトン、チオケトンの構造が導入されることを意味し、また、−ＣＨ₂−のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ−となり、＞ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＞Ｎ−となり、＝ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＝Ｎ−となり、末端の−ＣＨ₃のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ₂が導入され、＝ＣＨ₂のＣ−ＨがＮに変わると、＝ＮＨとなる。また、−ＣＨ₃、−ＣＨ₂−、＝ＣＨ−、≡ＣＨ又は＞ＣＨ−のＣ−ＨがＣ−ハロゲンで置き換えられると、当該炭素上へハロゲン原子を置換することになる。なお、炭素鎖中における−Ｏ−、−Ｓ−、Ｎへの置き換えは、当該炭化水素基に対する、それぞれオキサ置換、チア置換、アザ置換に当たり、例えば、炭化水素環の環の骨格炭素で起こると、炭化水素環のそれぞれ含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環への変換となる。該炭化水素基中、ＣＨ₂並びにＣ−Ｈにおける置き換えは、それぞれ独立に行われてよく、加えて、前記の置き換えを行った後、なお当該炭素上にＣＨ₂又はＣ−Ｈが残存する際には、更に置き換えがなされてもよい。更には、前記の置き換えにより、−ＣＨ₂−ＣＨ₃の−ＣＯ−Ｏ−Ｈ；カルボン酸構造への変換などもなされる。
【００１４】
本明細書において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を指すが、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。
従って、前記炭化水素基としては、鎖状炭化水素基並びに環式炭化水素基など環構造を有する炭化水素基のいずれをも選択でき、例えば、飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルキル基、不飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルケニル基、直鎖状又は分岐状のアルキニル基、直鎖状又は分岐状のアルカジエニル基など、飽和な環式炭化水素基であるシクロアルキル基、不飽和な環式炭化水素基であるシクロアルケニル基、シクロアルキニル基、シクロアルカジエニル基など、芳香族炭化水素基であるアリール基、アラルキル基、アリールアルケニル基などが挙げられる。
【００１５】
更に詳しくいえば、直鎖状又は分岐状のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、１−エチルペンチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、２−メチルプロピル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、メチルヘキシル基、メチルヘプチル基、メチルオクチル基、メチルノニル基、１，１−ジメチルエチル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，６−ジメチルヘプチル基、３，７−ジメチルオクチル基、２−エチルヘキシル基など、シクロアルキルアルキル基としては、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基など、シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基など、ビシクロアルキル基としては、ノルボルニル基、ビシクロ［２．２．２］オクチル基、アダマンチル基などが挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、クロチル基（２−ブテニル基）、イソプロペニル基（１−メチルビニル基）など、シクロアルケニル基又はシクロアルカジエニル基としては、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサンジエニル基などが挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−フェニルフェニル基、３−フェニルフェニル基、４−フェニルフェニル基、９−アントリル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、エチルフェニル基、メチルエチルフェニル基、ジエチルフェニル基、プロピルフェニル基、ブチルフェニル基などが挙げられる。アラルキル基としては、例えばベンジル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、フェネチル基（２−フェニルエチル基）、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルベンジル基、ジメチルフェネチル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、ジエチルベンジル基などが挙げられる。アリールアルケニル基としては、例えばスチリル基、メチルスチリル基、エチルスチリル基、ジメチルスチリル基、３−フェニル−２−プロペニル基などが挙げられる。
【００１６】
前記炭化水素基中のＣＨ₂がカルボニル基、スルホニル基、Ｏ又はＳで、又はＣ−ＨがＮ又はＣ−ハロゲンで置き換えられた基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、スルホン、エーテル、チオエーテル、アミン、アルコール、チオール、ハロゲン、複素環（例えば、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環）などの構造を一つ以上含む基が挙げられる。なお、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環とは、環式炭化水素基の環骨格の炭素がそれぞれ酸素、硫黄、窒素で置き換わるものを意味し、更には、これらヘテロ原子置換が二種以上ある複素環であってもよい。前記の置換を有する炭化水素基としては、例えば、ケトン構造のアセチルメチル基、アセチルフェニル基；スルホン構造のメタンスルホニルメチル基；エーテル構造のメトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、メトキシプロピル基、ブトキシエチル基、エトキシエトキシエチル基、メトキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、フェノキシメチル基；チオエーテル構造のメチルチオメチル基、メチルチオフェニル基；アミン構造のアミノメチル基、２−アミノエチル基、２−アミノプロピル基、３−アミノプロピル基、２，３−ジアミノプロピル基、２−アミノブチル基、３−アミノブチル基、４−アミノブチル基、２，３−ジアミノブチル基、２，４−ジアミノブチル基、３，４−ジアミノブチル基、２，３，４−トリアミノブチル基、メチルアミノメチル基、ジメチルアミノメチル基、メチルアミノエチル基、プロピルアミノメチル基、シクロペンチルアミノメチル基、アミノフェニル基、ジアミノフェニル基、アミノメチルフェニル基；含酸素複素環のテトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリルエチル基；含酸素複素芳香環のフリル基、フルフリル基、ベンゾフリル基、ベンゾフルフリル基；含硫黄複素芳香環のチエニル基；含窒素複素芳香環のピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、テトラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、ピリジルメチル基；アルコール構造の２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基、２，３−ジヒドロキシブチル基、２，４−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジヒドロキシブチル基、２，３，４−トリヒドロキシブチル基、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、ヒドロキシメチルフェニル基、ヒドロキシエチルフェニル基；チオール構造の２−メルカプトエチル基、２−メルカプトプロピル基、３−メルカプトプロピル基、２，３−ジメルカプトプロピル基、２−メルカプトブチル基、３−メルカプトブチル基、４−メルカプトブチル基、メルカプトフェニル基；ハロゲン化炭化水素基である２−クロロエチル基、２−クロロプロピル基、３−クロロプロピル基、２−クロロブチル基、３−クロロブチル基、４−クロロブチル基、フルオロフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、ジフルオロフェニル基、ジクロロフェニル基、ジブロモフェニル基、クロロフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基、トリクロロフェニル基、フルオロメチルフェニル基、トリフルオロメチルフェニル基；アミン構造とアルコール構造を有する２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル基、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基、２−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、２，４−ジアミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２，４−ジヒドロキシブチル基、２，３−ジアミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２，３−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジアミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−３，４−ジヒドロキシブチル基、アミノヒドロキシフェニル基；ハロゲンと水酸基で置換された炭化水素基であるフルオロヒドロキシフェニル基、クロロヒドロキシフェニル基；カルボン構造のカルボキシフェニル基などが挙げられる。
Ｒ¹及びＲ²で表される非対称の２価の基としては、特に制限はなく、例えば、ノルボルナン−２−イリデン、２−ノルボルネン−５−イリデンが挙げられる。
【００１７】
前記式（Ｉ）で示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。
【００１８】
本発明において、基質としてのカルボニル化合物をシアノヒドリンに変換するためには、シアニドドナーの存在下で酵素反応を実施する。本明細書中、シアニドドナーとは、反応系へ添加することによって、シアニド、すなわちシアン化物イオン（ＣＮ^-）を生じる物質を意味し、例えば、シアン化水素、青酸（シアン化水素酸）、シアン化ナトリウムやシアン化カリウムなどのシアン化水素の塩、又は、アセトンシアノヒドリン等のシアノヒドリン類が挙げられる。特に回収リサイクルが容易な青酸（シアン化水素酸）を用いるのが好ましい。シアニドドナーの供給方法としては常法により液体として供給する方法、又は常法により気体として供給する方法のいずれをも採用することができる。
【００１９】
本発明においては、反応原料の濃度を高め、生産性を高めるために、反応溶媒として、水と実質的に混和しない有機溶媒を用いる。ここで、「水と実質的に混和しない有機溶媒」とは、水に任意の割合で溶解する溶媒を除く有機溶媒を意味する。有機溶媒としては、水と実質的に混和せず、基質及び生成物を充分に溶解し、酵素反応に悪影響を与えないものであれば特に制限なく用いることができる。このような有機溶媒は、原料のアルデヒド又はケトンの物性、生成物であるシアノヒドリンの物性に応じて適宜選択することができる。
【００２０】
水と実質的に混和しない有機溶媒としては、具体的には、ハロゲン化されていてもよい炭化水素系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素）、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルムなど；ハロゲン化されていてもよいアルコール系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族アルコール、アラルキルアルコール）、例えば、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコールなど；ハロゲン化されていてもよいエーテル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エーテル、芳香族エーテル）、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど；ハロゲン化されていてもよいエステル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エステル、芳香族エステル）、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等が挙げられ、これらを単独で用いてもまた２種以上を混合して用いてもよい。特に、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ-ブチルメチルエーテル、酢酸エチルを用いるのが好ましい。
【００２１】
前記有機溶媒は、水又は水性緩衝液で飽和されているのが好ましい。ここで水性緩衝液としては、特に制限はないが、酵素活性の最適ｐＨ(ｐＨ４〜７)の付近において緩衝能を発揮する緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸などの塩等によって構成される緩衝液等が好ましく用いられる。
本発明において、シアノヒドリンを合成する酵素反応の形態については制限しない。即ち、酵素反応は、水・有機溶媒混合系、有機溶媒系、有機溶媒水二相系、固定化酵素を使う反応系などのいずれの反応系においても効果的に実施することができる。
【００２２】
本発明において、酵素、基質及びシアニドドナーの使用量、反応温度は、用いる基質に応じて適宜決定される。通常、酵素の使用量は基質であるカルボニル化合物５０mmolに対して２５０〜１００，０００単位、好ましくは５００〜５０，０００単位である。カルボニル化合物の濃度は通常０.１〜１０mol/Lの範囲に設定し、シアニドドナーは用いるカルボニル化合物に対して１〜５倍モル、好ましくは１.１〜３倍モルの濃度で添加する。本反応は基質濃度によって酵素活性及び反応速度が変化するので、用いるカルボニル化合物の種類に応じて基質濃度を適宜決定する。反応時間は、基質であるカルボニル化合物の転換率が８０％以上、好ましくは９０％以上に達するまでの時間が適当であるが、これに限定されない。反応温度は酵素の活性が十分発揮される温度であればよく、通常０〜４０℃、好ましくは４〜３０℃である。
【００２３】
反応系において、回分式で反応を行う場合には、撹拌などにより、酵素が反応系内に分散するようにする。カラムなどに固定化酵素を充填して反応を行う場合には、基質を含む溶液を適当な流速でカラムに流入させ、流出液を採取することで実施できる。回分反応の場合には、反応が完結した時点で混合を止め、生産物が溶解している有機相を常法により取り出すことで生産物を回収できる。これらの酵素は初回と同じ方法で調製した基質を含む溶液と混合することによって再使用することができる。
【００２４】
本発明において、酵素反応終了後のシアノヒドリンを含む反応液からの反応溶媒及び未反応のシアニドドナーの回収は、蒸留することにより行う。蒸留は、シアノヒドリンが高温では不安定であるため、常圧高温下で実施するよりも、比較的低い温度で減圧下で実施することが好ましい。また、この蒸留操作においては、公知のシアノヒドリンの安定化剤を添加することもできる。安定化剤としては蒸留ボトムを酸性に維持できるものであればよく、ｐ-トルエンスルホン酸、酢酸などの有機酸、硫酸などの無機酸などをシアノヒドリンに対して１／２００〜１／１０モル添加することで実施できる。
【００２５】
減圧度及び温度は用いる有機溶媒の種類に応じて適宜決定することができる。通常、ｔ−ブチルメチルエーテルやジイソプロピルエーテルなどの沸点がおよそ３０〜１００℃付近の溶媒を用いる場合には、蒸留温度を好ましくは０〜１００℃、より好ましくは２０〜７０℃、さらにより好ましくは２０〜６０℃にし、減圧度は１〜６００torr、好ましくは５〜４００torrとするが、これらに限定されるものではない。留出した溶媒及びシアニドドナーは、溶媒及びシアニドドナーを捕集するのに十分な温度、例えば、１０℃以下に冷却された冷却管を使い効率よく捕集することができる。この操作で反応液に含まれている水も共沸して留出してくる。従って、蒸留によって得られた回収液には共沸して留出した水が含まれている。水と実質的に混和しない有機溶媒を主な反応溶媒とする場合、過剰に分離した水相を残したまま次の反応にリサイクル使用すると、基質濃度、反応液量等の制御が難しくなる。従って、反応溶媒とシアニドドナーをリサイクルするためには、上記の蒸留操作を終えた後、相分離した水相を分離し、残った有機相を回収して次の反応に用いるのが好ましい。回収した有機相には反応混合物に含まれていたシアニドドナーの大部分が含まれている。こうして回収した未反応のシアニドドナーを含む有機溶媒は、次の酵素反応の溶媒として用いることができる。
【００２６】
シアニドドナーとして青酸を使用する場合、このようにして回収された未反応の青酸は、通常、工業的に生産された青酸に含まれる安定剤などを含まないため、酵素の失活等が生じず、工業上有利である。
本発明の方法によって蒸留回収した有機溶媒及びシアニドドナーは、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）などによって測定、定量できる。一方、生成されたシアノヒドリンは、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）などによって測定、定量することができる。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
（調製例１）（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
（１）アーモンド種子粉砕物１００ｇにアセトン２００ｍｌを混合し、２時間攪拌した後、濾過し、固形分を回収した。この固形分を乾燥したものに水６００ｇを加え、アンモニア水でｐＨ７．５に調整した後、攪拌混合を一晩行った。次いで、このスラリーを遠心分離し、上澄液を回収した。この上澄液のｐＨを５．５に調整した後、遠心分離し、不溶分を除去した液を回収した。
【００２８】
（２）前記（１）で調製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液の活性を測定した。酵素活性はＤＬ−マンデロニトリルを基質として基質が酵素によって分解されベンズアルデヒドが生成される速度を２４９．６ｎｍの吸光度変化を測定することによって測定し、活性を算出した。ここで、１単位（Ｕ；unit）は１分間にベンズアルデヒド１μｍｏｌを生成する活性と定義した。この方法で前記（１）で調製した酵素液の酵素活性を測定したところ、６０．５７Ｕ／ｍｌの活性で酵素を２．５万単位回収することができたことがわかった。
【００２９】
（調製例２）（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
（１）（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、酵母サッカロマイセス・セレビシエを宿主として、キャッサバ由来の当該遺伝子をクローニングしたものを当該酵母へ遺伝子組換えして得た遺伝子組換え酵母を培養することによって調製した。当該遺伝子組換え酵母をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）１Ｌで２４時間当該遺伝子組換え酵母を培養し、回収した菌体を破砕して不溶分を除去した液を回収した。
（２）前記（１）で調製した（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液の活性を調製例１（２）と同様の方法で測定したところ、４０Ｕ／ｍｌの活性があることがわかり、９０００単位の酵素を回収することができた。
【００３０】
（調製例３）固定化（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
調製例１の方法で調製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液を硫安沈澱処理し、酵素を濃縮し、１０００Ｕ／ｍｌの酵素液を調製した。この酵素液１ｍｌに対して１ｇの固定化担体（多孔性シリカゲル、microbead silicagel 300A、富士シリシア化学(Fuji Silysia Chemical Ltd.)製）を混合した。これをこのまま合成反応に用いることにした。
【００３１】
（調製例４）固定化（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
調製例２の方法で調製した（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液に、酵素活性３００単位に対して調製例３と同じ固定化担体１ｇを添加し、緩やかに一晩混合した。次いで、濾過して固定化酵素を回収し、これを以降の反応に用いた。
【００３２】
（実施例１）
ｔ−ブチルメチルエーテル６１０gと青酸４１ｇを混合したものに、０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７）を添加し、撹拌混合した後、静置してから有機相を分離した。この有機相に調製例４で調製した固定化酵素（６万単位）を添加し、次いでベンズアルデヒド１０６ｇを添加した。これを室温で撹拌することによって、（Ｓ）−マンデロニトリルの合成を行った。３０分間反応させた後、反応液を回収し、ＨＰＬＣによりアルデヒドの転換率を測定した。回収した反応液には、安定剤としてｐ−トルエンスルホン酸・１水和物を２．７ｇ添加した。この溶液を５０ torr、４５℃で減圧蒸留し、溶媒のｔ−ブチルメチルエーテルと未反応の青酸を蒸留分離して回収した。
【００３３】
更に、反応終了後の固定化酵素を回収し、前記と同じ操作で調製した基質液と回収した固定化酵素を再び混合し、同じ条件で繰り返し反応を行った。回分反応３回目までは新しいｔ−ブチルメチルエーテル及び青酸を使用し、回分反応４回目以降は上記の蒸留操作によって回収した青酸を含むｔ−ブチルメチルエーテルに不足分の青酸を加えて青酸濃度を調整したものをリサイクル使用した。この結果を図1に示した。
【００３４】
これらの検討の結果、反応溶媒であるｔ−ブチルメチルエーテル及び未反応の青酸ともに８５％以上の平均回収率で回収できることがわかった（ｔ−ブチルメチルエーテル：８６％、未反応の青酸：８８％）。また、蒸留したｔ−ブチルメチルエーテル及び未反応の青酸をリサイクル使用しても、酵素反応にはまったく悪影響がなく、新しい青酸及びｔ−ブチルメチルエーテルを使用した場合となんら変わらない反応結果が得られた。
【００３５】
（実施例２）
ｔ−ブチルメチルエーテル６２３ｇと青酸３５ｇを混合したものに、０．２Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ５．５)を添加し、撹拌混合した後、静置してから有機相を分離した。この有機相に調製例３で調製した固定化酵素（１７万単位）を添加し、次いで２−クロロベンズアルデヒド１４１ｇを添加した。これを室温で撹拌することによって、（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの合成を行った。３．５時間反応させた後、反応液を回収し、ＨＰＬＣによりアルデヒドの転換率を測定した。回収した反応液には、安定剤としてｐ−トルエンスルホン酸・１水和物を２．７ｇ添加した。この溶液を５０ torr、５０℃で減圧蒸留し、溶媒のｔ−ブチルメチルエーテルと未反応の青酸を蒸留分離して回収した。
【００３６】
更に、反応終了後の固定化酵素を回収し、前記と同じ操作で調製した基質液と回収した固定化酵素を再び混合し、同じ条件で繰り返し反応を行った。回分反応３回目までは新しいｔ−ブチルメチルエーテル及び青酸を使用し、回分反応４回目以降は上記の蒸留操作によって回収した青酸を含むｔ−ブチルメチルエーテルに不足分の青酸を加えて青酸濃度を調整したものをリサイクル使用した。この結果を図２に示した。
【００３７】
これらの検討の結果、反応溶媒であるｔ−ブチルメチルエーテル及び未反応の青酸ともに９０％以上の平均回収率で回収できることがわかった(ｔ−ブチルメチルエーテル：９０％、未反応の青酸：９２％)。また、蒸留したｔ−ブチルメチルエーテル及び未反応の青酸をリサイクル使用しても、酵素反応にはまったく悪影響がなく、新しい青酸及びｔ−ブチルメチルエーテルを使用した場合となんら変わらない反応結果が得られた。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、シアノヒドリンの製造方法における反応溶媒及び未反応のシアニドドナーのリサイクルが可能になり、反応溶媒及びシアニドドナーに関するコストが低減され、シアノヒドリンを工業上有利に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、（Ｓ）−マンデロ二トリルの合成における回分反応の回数とベンズアルデヒドの転換率との関係を示す図である。
【図２】図２は、（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの合成における回分反応の回数と２−クロロベンズアルデヒドの転換率との関係を示す図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態をフローチャートとして示した概略図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an industrial process for producing cyanohydrin.
[0002]
[Prior art]
Cyanohydrin is a useful compound as an intermediate for the production of pyrethroid pesticides and pharmaceutical synthesis. There are many reports on the reaction of synthesizing cyanohydrin using a carbonyl compound and a cyanide donor as raw materials, using an organic solvent substantially immiscible with water as a reaction solvent, and using an enzyme such as hydroxynitrile lyase as a catalyst. Cyanohydrin produced by such an enzyme reaction is dissolved in an organic solvent as a solvent. The cyanohydrin in the organic solvent is usually recovered by a known method of distilling a reaction product solution containing cyanohydrin and distilling off the low boiling point solvent. However, no attention is paid to the method of collecting and / or recycling the solution containing the organic solvent distilled at this time, and there is a problem from the viewpoint of global environmental problems and cost reduction.
Therefore, a method for effectively using the distilled solution and synthesizing cyanohydrin in an industrially advantageous manner is important in solving the above problems.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an industrially advantageous production method of cyanohydrin by effectively utilizing a reaction solvent and an unreacted cyanide donor.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have distilled the reaction solution after completion of the enzyme reaction, and recovered the unreacted cyanide donor and organic solvent. For example, the present inventors have established a method that can recover cyanidic acid, which is difficult to recover due to its low boiling point, with almost no loss and can be easily reused, thereby completing the present invention.
[0005]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) An unreacted cyanide donor obtained by distilling a reaction solution after completion of an enzyme reaction in a method for producing cyanohydrin by an enzyme reaction in a solvent containing an organic solvent using a carbonyl compound as a substrate in the presence of a cyanide donor. And a method of producing cyanohydrin, wherein the recovered liquid containing the organic solvent is repeatedly used at least once.
(2) The method according to (1), further comprising separating and removing water contained in the collected liquid.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the temperature during distillation is 0 ° C to 100 ° C and the degree of vacuum is 1 to 600 torr.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein a phase-separated aqueous phase is separated from the recovered liquid, and the remaining organic phase is recovered and used for the next reaction.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The cyanohydrin produced by the method of the present invention includes optically active cyanohydrin. The optically active substance refers to a substance containing one enantiomer in a larger amount than the other enantiomer or a substance consisting of only one of the enantiomers.
[0007]
Examples of the enzyme that catalyzes a reaction for synthesizing cyanohydrin using a carbonyl compound as a substrate in the present invention include hydroxynitrile lyase. The term “hydroxynitrile lyase” used in the present invention means that having an activity of synthesizing cyanohydrin from a carbonyl compound in the presence of a cyanide donor, and as hydroxynitrile lyase ((R) -hydroxynitrile lyase) for synthesizing R-cyanohydrin. Almond (Prunus amygdalus(R) -Hydroxynitrile lyase derived from Rosaceae plants such as), (R) -Hydroxynitrile lyase derived from flaxaceae, and hydroxynitrile lyase ((S) -hydroxynitrile lyase) for synthesizing S-cyanohydrin. , Sorghum (Sorghum bicolor(S) -Hydroxynitrile lyase, cassava (Manihot esculenta), Para rubber tree (Hevea brasiliensis) And other (S) -hydroxynitrile lyases derived from Euphorbiaceae plants, xymenia (Ximenia americanaAnd (S) -hydroxynitrile lyase derived from a thorny family such as).
[0008]
The enzyme can be prepared by extraction from a biological tissue containing the enzyme, but can also be produced by a genetically modified organism prepared by cloning the gene of the enzyme and incorporating the gene. Further, a hydroxynitrile lyase obtained by modifying a natural hydroxynitrile lyase gene and modifying the enzyme function can be used in the present invention as long as it has the above activity. Extraction may be carried out by a conventional method, and even if the preparation contains components other than hydroxynitrile lyase, it does not need to be particularly purified as long as the reaction is not adversely affected.
[0009]
Further, the enzyme may be in the form of a powdery enzyme, an enzyme solution dissolved in a buffer solution or the like, or an immobilized enzyme immobilized on a suitable carrier. Since the enzyme can be easily recovered and reused from the reaction solution after completion of the reaction, an immobilized enzyme is preferably used.
In the present invention, a carbonyl compound is used as a substrate for producing cyanohydrin.
[0010]
Here, the carbonyl compound refers to an aldehyde or a ketone, specifically, the following formula (I):
R¹-CO-R² (I)
(Wherein R¹And R²May be the same as or different from each other, and each represents a hydrogen atom or a monovalent hydrocarbon group having 22 or less carbon atoms, and —CH₂-And -CH_ThreeCH₂May be replaced by a carbonyl group, a sulfonyl group, -O- or -S-₂May be replaced by ═O or ═S, and —CH₂-C-H, -CH_ThreeC—H,> CH—C—H, ═CH—C—H and ═CH₂C—H may be replaced by N or C-halogen, and R¹And R²May jointly represent a divalent group. )
Indicated by
[0011]
In the formula (I), the monovalent hydrocarbon group having 22 or less carbon atoms is a linear or branched chain hydrocarbon group, a monocyclic hydrocarbon group having no side chain or having a side chain, A polycyclic hydrocarbon group having no side chain or having a side chain, a spiro hydrocarbon group having no side chain or having a side chain, a hydrocarbon group having a ring assembly structure having no side chain or having a side chain, or Any of the chain hydrocarbon groups substituted by the cyclic hydrocarbon group is included. Further, it includes both a saturated hydrocarbon group and an unsaturated hydrocarbon group, but the unsaturated hydrocarbon group excludes a group containing an allene structure of C═C═C.
[0012]
In the following, an aromatic group having no side chain, an aromatic group having a side chain, and a phenylphenyl group or a phenylphenyl group having a side chain are collectively referred to as an aryl group. The linear or branched alkyl group thus formed is called an aralkyl group. As for other cyclic hydrocarbon groups, unless otherwise specified, when referring to those having no side chain on the ring, names such as cycloalkyl groups are simply used. As for the chain hydrocarbon group, when referring to a straight chain and a branched chain together, a name such as an alkyl group is simply used.
[0013]
In the hydrocarbon group, —CH₂When-is replaced by a carbonyl group, a sulfonyl group, -O- or -S-, a ketone, sulfone, ether or thioether structure is introduced, respectively, and -CH_Three-CH₂When-is replaced by a carbonyl group, -O- or -S-, it changes to a formyl group (aldehyde), a hydroxyl group or a mercapto group, respectively, or the terminal = CH₂Is replaced with ═O or ═S means that a structure of ketone or thioketone is introduced, and —CH₂When -CH is changed to N, -NH- is obtained, and when CH of -CH- is changed to N,> N- is obtained, and when CH of -CH- is changed to N, = N- And the terminal —CH_ThreeWhen C—H of N is changed to N, —NH₂Is introduced and = CH₂When C—H is changed to N, ═NH. Also, -CH_Three, -CH₂When C—H of —, ═CH—, ≡CH or> CH— is replaced by C-halogen, a halogen atom is substituted on the carbon. In addition, when the substitution to —O—, —S—, or N in the carbon chain corresponds to oxa substitution, thia substitution, or aza substitution for the hydrocarbon group, respectively, for example, occurs at the skeleton carbon of the ring of the hydrocarbon ring. The hydrocarbon ring is converted into an oxygen-containing heterocycle, a sulfur-containing heterocycle and a nitrogen-containing heterocycle, respectively. In the hydrocarbon group, CH₂In addition, the replacement in C—H may be performed independently, and in addition, after the above replacement, CH is still present on the carbon.₂Alternatively, further replacement may be performed when C—H remains. Furthermore, by the above replacement,₂-CH_Three-CO-O-H; conversion into a carboxylic acid structure is also performed.
[0014]
In this specification, the halogen atom refers to a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom, and a fluorine atom, a chlorine atom, or a bromine atom is preferable.
Accordingly, as the hydrocarbon group, any of a hydrocarbon group having a ring structure such as a chain hydrocarbon group and a cyclic hydrocarbon group can be selected. For example, the hydrocarbon group is a straight chain or branched chain which is a saturated chain hydrocarbon group. Saturated cyclic carbonization such as linear alkyl group, unsaturated chain hydrocarbon group linear or branched alkenyl group, linear or branched alkynyl group, linear or branched alkadienyl group, etc. Cycloalkenyl groups that are hydrogen groups, cycloalkenyl groups that are unsaturated cyclic hydrocarbon groups, cycloalkynyl groups, cycloalkadienyl groups, etc., aryl groups that are aromatic hydrocarbon groups, aralkyl groups, arylalkenyl groups, etc. Is mentioned.
[0015]
More specifically, examples of the linear or branched alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, a 1-methylpropyl group, a pentyl group, a 1-methylbutyl group, a hexyl group, 1-methylpentyl group, heptyl group, 1-methylhexyl group, 1-ethylpentyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, undecyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, 2-methylpropyl group, 2- Methylbutyl group, 3-methylbutyl group, 2-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 4-methylpentyl group, methylhexyl group, methylheptyl group, methyloctyl group, methylnonyl group, 1,1-dimethylethyl group, 1 , 1-dimethylpropyl group, 2,6-dimethylheptyl group, 3,7-dimethyloctyl group, 2-ethyl Examples of the cycloalkyl group such as cyclohexyl group include cyclopentylmethyl group and cyclohexylmethyl group. Examples of the cycloalkyl group include cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, methylcyclopentyl group, cyclohexyl group, methylcyclohexyl group, and cycloheptyl group. Examples of the bicycloalkyl group such as a cyclooctyl group include a norbornyl group, a bicyclo [2.2.2] octyl group, an adamantyl group, and the like. Examples of the linear or branched alkenyl group include a vinyl group, an allyl group, a crotyl group (2-butenyl group), an isopropenyl group (1-methylvinyl group), and the like as a cycloalkenyl group or a cycloalkadienyl group. Includes a cyclopentenyl group, a cyclopentadienyl group, a cyclohexenyl group, a cyclohexanedienyl group, and the like. Examples of the linear or branched alkynyl group include an ethynyl group, a propynyl group, and a butynyl group. Examples of the aryl group include a phenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group, 2-phenylphenyl group, 3-phenylphenyl group, 4-phenylphenyl group, 9-anthryl group, methylphenyl group, dimethylphenyl group, Examples thereof include a trimethylphenyl group, an ethylphenyl group, a methylethylphenyl group, a diethylphenyl group, a propylphenyl group, and a butylphenyl group. Examples of aralkyl groups include benzyl, 1-naphthylmethyl, 2-naphthylmethyl, phenethyl (2-phenylethyl), 1-phenylethyl, phenylpropyl, phenylbutyl, phenylpentyl, phenyl Examples include hexyl group, methylbenzyl group, methylphenethyl group, dimethylbenzyl group, dimethylphenethyl group, trimethylbenzyl group, ethylbenzyl group, and diethylbenzyl group. Examples of the arylalkenyl group include a styryl group, a methylstyryl group, an ethylstyryl group, a dimethylstyryl group, and a 3-phenyl-2-propenyl group.
[0016]
CH in the hydrocarbon group₂Is a carbonyl group, a sulfonyl group, O or S, or a group in which C—H is replaced by N or C-halogen includes ketone, aldehyde, carboxylic acid, sulfone, ether, thioether, amine, alcohol, thiol, halogen And a group containing at least one structure such as a heterocyclic ring (for example, an oxygen-containing heterocyclic ring, a sulfur-containing heterocyclic ring, or a nitrogen-containing heterocyclic ring). The oxygen-containing heterocycle, sulfur-containing heterocycle, and nitrogen-containing heterocycle mean those in which the carbon of the ring skeleton of the cyclic hydrocarbon group is replaced by oxygen, sulfur, or nitrogen, respectively. May be a heterocycle having two or more. Examples of the hydrocarbon group having the substitution include acetylmethyl group and acetylphenyl group having a ketone structure; methanesulfonylmethyl group having a sulfone structure; methoxymethyl group, methoxyethyl group, ethoxyethyl group, and methoxypropyl group having an ether structure. , Butoxyethyl group, ethoxyethoxyethyl group, methoxyphenyl group, dimethoxyphenyl group, phenoxymethyl group; thioether structure methylthiomethyl group, methylthiophenyl group; amine structure aminomethyl group, 2-aminoethyl group, 2-aminopropyl Group, 3-aminopropyl group, 2,3-diaminopropyl group, 2-aminobutyl group, 3-aminobutyl group, 4-aminobutyl group, 2,3-diaminobutyl group, 2,4-diaminobutyl group, 3,4-diaminobutyl group, 2,3,4-tria Nobutyl group, methylaminomethyl group, dimethylaminomethyl group, methylaminoethyl group, propylaminomethyl group, cyclopentylaminomethyl group, aminophenyl group, diaminophenyl group, aminomethylphenyl group; tetrahydrofuranyl group of oxygen-containing heterocycle, Tetrahydropyranyl group, morpholylethyl group; oxygen-containing heteroaromatic furyl group, furfuryl group, benzofuryl group, benzofurfuryl group; sulfur-containing heteroaromatic thienyl group; nitrogen-containing heteroaromatic pyrrolyl group, imidazolyl group, oxazolyl Group, thiadiazolyl group, pyridyl group, pyrimidinyl group, pyridazinyl group, pyrazinyl group, tetrazinyl group, quinolyl group, isoquinolyl group, pyridylmethyl group; 2-hydroxyethyl group, 2-hydroxypropyl group, 3-hydroxy group of alcohol structure Propyl group, 2,3-dihydroxypropyl group, 2-hydroxybutyl group, 3-hydroxybutyl group, 4-hydroxybutyl group, 2,3-dihydroxybutyl group, 2,4-dihydroxybutyl group, 3,4-dihydroxy Butyl group, 2,3,4-trihydroxybutyl group, hydroxyphenyl group, dihydroxyphenyl group, hydroxymethylphenyl group, hydroxyethylphenyl group; 2-mercaptoethyl group, 2-mercaptopropyl group, 3-mercapto of thiol structure Propyl group, 2,3-dimercaptopropyl group, 2-mercaptobutyl group, 3-mercaptobutyl group, 4-mercaptobutyl group, mercaptophenyl group; 2-chloroethyl group and 2-chloropropyl which are halogenated hydrocarbon groups Group, 3-chloropropyl group, 2-chlorobutyl Group, 3-chlorobutyl group, 4-chlorobutyl group, fluorophenyl group, chlorophenyl group, bromophenyl group, difluorophenyl group, dichlorophenyl group, dibromophenyl group, chlorofluorophenyl group, trifluorophenyl group, trichlorophenyl group, fluoromethyl Phenyl group, trifluoromethylphenyl group; 2-amino-3-hydroxypropyl group, 3-amino-2-hydroxypropyl group, 2-amino-3-hydroxybutyl group, 3-amino- having an amine structure and an alcohol structure 2-hydroxybutyl group, 2-amino-4-hydroxybutyl group, 4-amino-2-hydroxybutyl group, 3-amino-4-hydroxybutyl group, 4-amino-3-hydroxybutyl group, 2,4- Diamino-3-hydroxybutyl group, 3-amino -2,4-dihydroxybutyl group, 2,3-diamino-4-hydroxybutyl group, 4-amino-2,3-dihydroxybutyl group, 3,4-diamino-2-hydroxybutyl group, 2-amino-3 , 4-dihydroxybutyl group, aminohydroxyphenyl group; fluorohydroxyphenyl group, chlorohydroxyphenyl group, which is a hydrocarbon group substituted with a halogen and a hydroxyl group; carboxyphenyl group having a carboxylic structure.
R¹And R²The asymmetric divalent group represented by the formula is not particularly limited, and examples thereof include norbornane-2-ylidene and 2-norbornene-5-ylidene.
[0017]
Examples of the carbonyl compound represented by the formula (I) include benzaldehyde, m-phenoxybenzaldehyde, p-methylbenzaldehyde, o-chlorobenzaldehyde, m-chlorobenzaldehyde, p-chlorobenzaldehyde, m-nitrobenzaldehyde, 3,4 -Aromatic aldehydes such as methylenedioxybenzaldehyde, 2,3-methylenedioxybenzaldehyde, phenylacetaldehyde, furfural; Aliphatic aldehydes such as acetaldehyde, butyraldehyde, isobutyraldehyde, valeraldehyde, cyclohexanealdehyde; ethyl methyl ketone, butyl methyl Ketone, methyl propyl ketone, isopropyl methyl ketone, methyl pentyl ketone, methyl (2-methylpropyl) ketone, methyl ( -Saturated aliphatic ketones such as methyl butyl) ketone; unsaturated aliphatic ketones such as methyl (2-propenyl) ketone and (3-butenyl) methyl ketone; alkyl (haloalkyl) ketones such as (3-chloropropyl) methyl ketone; (Alkoxycarbonylamino) -3- (protected amino) aldehyde such as cyclohexylpropionaldehyde; alkylthioaliphatic aldehyde such as 3-methylthiopropionaldehyde.
[0018]
In the present invention, in order to convert a carbonyl compound as a substrate into cyanohydrin, an enzyme reaction is carried out in the presence of a cyanide donor. In this specification, the cyanide donor means cyanide, that is, cyanide ion (CN) by adding to the reaction system.^-For example, hydrogen cyanide, hydrocyanic acid (hydrogen cyanide), hydrogen cyanide salts such as sodium cyanide and potassium cyanide, and cyanohydrins such as acetone cyanohydrin. In particular, it is preferable to use hydrocyanic acid (hydrocyanic acid) which can be easily recovered and recycled. As a supply method of the cyanide donor, either a method of supplying as a liquid by a conventional method or a method of supplying as a gas by a conventional method can be employed.
[0019]
In the present invention, an organic solvent that is substantially immiscible with water is used as the reaction solvent in order to increase the concentration of the reaction raw material and increase the productivity. Here, the “organic solvent substantially immiscible with water” means an organic solvent excluding a solvent that dissolves in water at an arbitrary ratio. Any organic solvent can be used without particular limitation as long as it is substantially immiscible with water, sufficiently dissolves the substrate and product, and does not adversely affect the enzyme reaction. Such an organic solvent can be appropriately selected according to the physical properties of the raw material aldehyde or ketone and the physical properties of the product cyanohydrin.
[0020]
Specific examples of organic solvents that are substantially immiscible with water include hydrocarbon solvents that may be halogenated (eg, linear, branched or cyclic saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbons, aromatics). Group hydrocarbons), for example, pentane, hexane, cyclohexane, benzene, toluene, xylene, methylene chloride, chloroform, etc .; alcohol solvents that may be halogenated (for example, linear, branched or cyclic saturated or unsaturated). Saturated aliphatic alcohols, aralkyl alcohols), such as n-butanol, isobutanol, t-butanol, hexanol, cyclohexanol, n-amyl alcohol, etc .; ether solvents that may be halogenated (eg, linear, Branched or cyclic saturated or unsaturated aliphatic ethers, aromatic ethers), for example diethyl Ethers, dipropyl ethers, diisopropyl ethers, dibutyl ethers, t-butyl methyl ethers, dimethoxyethanes, etc .; ester solvents which may be halogenated (eg linear, branched or cyclic saturated or unsaturated aliphatics) Ester, aromatic ester), for example, methyl formate, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate and the like. These may be used alone or in combination of two or more. In particular, diisopropyl ether, dibutyl ether, t-butyl methyl ether, and ethyl acetate are preferably used.
[0021]
The organic solvent is preferably saturated with water or an aqueous buffer. Here, the aqueous buffer solution is not particularly limited, but a buffer solution that exhibits a buffering ability near the optimum pH (pH 4 to 7) of the enzyme activity, such as phosphoric acid, citric acid, glutaric acid, malic acid, malon. A buffer solution composed of a salt of acid, o-phthalic acid, succinic acid, or the like is preferably used.
In the present invention, the form of the enzymatic reaction for synthesizing cyanohydrin is not limited. That is, the enzyme reaction can be effectively carried out in any reaction system such as a water / organic solvent mixed system, an organic solvent system, an organic solvent aqueous two-phase system, and a reaction system using an immobilized enzyme.
[0022]
In the present invention, the amounts of the enzyme, substrate and cyanide donor used, and the reaction temperature are appropriately determined according to the substrate used. Usually, the enzyme is used in an amount of 250 to 100,000 units, preferably 500 to 50,000 units, based on 50 mmol of the substrate carbonyl compound. The concentration of the carbonyl compound is usually set in the range of 0.1 to 10 mol / L, and the cyanide donor is added at a concentration of 1 to 5 times mol, preferably 1.1 to 3 times mol of the carbonyl compound used. In this reaction, since the enzyme activity and the reaction rate vary depending on the substrate concentration, the substrate concentration is appropriately determined according to the type of the carbonyl compound used. The reaction time is appropriately limited until the conversion rate of the carbonyl compound as a substrate reaches 80% or more, preferably 90% or more, but is not limited thereto. The reaction temperature may be a temperature at which the activity of the enzyme is sufficiently exerted, and is usually 0 to 40 ° C, preferably 4 to 30 ° C.
[0023]
When the reaction is carried out batchwise in the reaction system, the enzyme is dispersed in the reaction system by stirring or the like. When the reaction is performed by filling the column with the immobilized enzyme, the solution containing the substrate can be flowed into the column at an appropriate flow rate, and the effluent can be collected. In the case of batch reaction, mixing is stopped when the reaction is completed, and the product can be recovered by taking out the organic phase in which the product is dissolved by a conventional method. These enzymes can be reused by mixing with a solution containing the substrate prepared in the same way as the first time.
[0024]
In the present invention, the reaction solvent and the unreacted cyanide donor are recovered from the reaction solution containing cyanohydrin after completion of the enzyme reaction by distillation. Distillation is preferably performed under reduced pressure at a relatively low temperature rather than under normal pressure and high temperature because cyanohydrin is unstable at high temperature. In this distillation operation, a known cyanohydrin stabilizer can also be added. Any stabilizer can be used as long as it can maintain the distillation bottom acidic, and an organic acid such as p-toluenesulfonic acid and acetic acid, and an inorganic acid such as sulfuric acid are added in an amount of 1/200 to 1/10 mol of cyanohydrin. This can be done.
[0025]
The degree of reduced pressure and temperature can be appropriately determined according to the type of organic solvent used. Usually, when a solvent having a boiling point of about 30 to 100 ° C. such as t-butyl methyl ether or diisopropyl ether is used, the distillation temperature is preferably 0 to 100 ° C., more preferably 20 to 70 ° C., even more preferably. The temperature is set to 20 to 60 ° C., and the degree of vacuum is 1 to 600 torr, preferably 5 to 400 torr, but is not limited thereto. The distilled solvent and cyanide donor can be efficiently collected using a cooling pipe cooled to a temperature sufficient to collect the solvent and cyanide donor, for example, 10 ° C. or less. By this operation, the water contained in the reaction solution is also distilled azeotropically. Therefore, the recovered liquid obtained by distillation contains water distilled azeotropically. When an organic solvent that is substantially immiscible with water is used as the main reaction solvent, it is difficult to control the substrate concentration, the amount of the reaction solution, and the like if it is recycled to the next reaction while leaving an excessively separated aqueous phase. Therefore, in order to recycle the reaction solvent and the cyanide donor, it is preferable to separate the aqueous phase that has been phase-separated after the above distillation operation and recover the remaining organic phase for use in the next reaction. The recovered organic phase contains most of the cyanide donor that was contained in the reaction mixture. The organic solvent containing the unreacted cyanide donor recovered in this way can be used as a solvent for the next enzyme reaction.
[0026]
When using cyanic acid as a cyanide donor, unreacted cyanic acid recovered in this way usually does not contain stabilizers and the like contained in industrially produced cyanic acid, so that enzyme deactivation does not occur, Industrially advantageous.
The organic solvent and cyanide donor collected by distillation by the method of the present invention can be measured and quantified by gas chromatography (GC) or the like. On the other hand, the produced cyanohydrin can be measured and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) or the like.
[0027]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
Preparation Example 1 Preparation of (R) -hydroxynitrile lyase
(1) 200 ml of acetone was mixed with 100 g of almond seed pulverized product and stirred for 2 hours, followed by filtration to recover the solid content. 600 g of water was added to the dried solid and adjusted to pH 7.5 with aqueous ammonia, followed by stirring and mixing overnight. The slurry was then centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was adjusted to pH 5.5 and then centrifuged to recover a liquid from which insolubles had been removed.
[0028]
(2) The activity of the (R) -hydroxynitrile lyase enzyme solution prepared in (1) was measured. The enzyme activity was calculated by measuring the rate of change in absorbance at 249.6 nm using DL-mandelonitrile as a substrate and the rate at which the substrate was decomposed by the enzyme to produce benzaldehyde. Here, one unit (U; unit) was defined as the activity of producing 1 μmol of benzaldehyde in one minute. When the enzyme activity of the enzyme solution prepared in (1) was measured by this method, it was found that 25,000 units of enzyme could be recovered with an activity of 60.57 U / ml.
[0029]
(Preparation Example 2) Preparation of (S) -hydroxynitrile lyase
(1) (S) -Hydroxynitrile lyase is prepared by culturing a genetically modified yeast obtained by genetically recombining cassava-derived gene with yeast Saccharomyces cerevisiae as a host. did. A solution obtained by culturing the genetically modified yeast in 1 L of YPD medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%) for 24 hours, crushing the collected cells and removing insolubles. It was collected.
(2) The activity of the (S) -hydroxynitrile lyase enzyme solution prepared in (1) above was measured by the same method as in Preparation Example 1 (2). As a result, it was found that the activity was 40 U / ml, and 9000 units Of the enzyme could be recovered.
[0030]
Preparation Example 3 Preparation of Immobilized (R) -Hydroxynitrile Lyase
The (R) -hydroxynitrile lyase enzyme solution prepared by the method of Preparation Example 1 was subjected to ammonium sulfate precipitation, and the enzyme was concentrated to prepare a 1000 U / ml enzyme solution. 1 g of the immobilization carrier (porous silica gel, microbead silicagel 300A, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd.) was mixed with 1 ml of the enzyme solution. This was used for the synthesis reaction as it was.
[0031]
(Preparation Example 4) Preparation of immobilized (S) -hydroxynitrile lyase
To the (S) -hydroxynitrile lyase enzyme solution prepared by the method of Preparation Example 2, 1 g of the same immobilization carrier as in Preparation Example 3 was added to 300 units of enzyme activity, and gently mixed overnight. Subsequently, the immobilized enzyme was recovered by filtration and used for the subsequent reaction.
[0032]
Example 1
To a mixture of 610 g of t-butyl methyl ether and 41 g of hydrocyanic acid, 0.2 M citrate buffer (pH 7) was added, mixed with stirring, allowed to stand, and then the organic phase was separated. To this organic phase, the immobilized enzyme prepared in Preparation Example 4 (60,000 units) was added, and then 106 g of benzaldehyde was added. This was stirred at room temperature to synthesize (S) -mandelonitrile. After reacting for 30 minutes, the reaction solution was recovered, and the conversion rate of aldehyde was measured by HPLC. To the recovered reaction solution, 2.7 g of p-toluenesulfonic acid monohydrate was added as a stabilizer. This solution was distilled under reduced pressure at 50 torr and 45 ° C., and the solvent t-butyl methyl ether and unreacted hydrocyanic acid were recovered by distillation.
[0033]
Furthermore, the immobilized enzyme after completion of the reaction was recovered, the substrate solution prepared by the same operation as described above and the recovered immobilized enzyme were mixed again, and the reaction was repeated under the same conditions. Fresh t-butyl methyl ether and hydrocyanic acid are used until the third batch reaction, and after the fourth batch reaction, deficient hydrocyanic acid is added to t-butyl methyl ether containing hydrocyanic acid recovered by the above distillation operation to adjust the hydrocyanic acid concentration. The adjusted one was recycled. The results are shown in FIG.
[0034]
As a result of these studies, it was found that both the reaction solvent t-butyl methyl ether and unreacted hydrocyanic acid could be recovered at an average recovery rate of 85% or more (t-butyl methyl ether: 86%, unreacted hydrocyanic acid: 88 %). In addition, even when distilled t-butyl methyl ether and unreacted cyanic acid are recycled, there is no adverse effect on the enzyme reaction, and the reaction results are the same as when new cyanic acid and t-butyl methyl ether are used. It was.
[0035]
(Example 2)
To a mixture of 623 g of t-butyl methyl ether and 35 g of hydrocyanic acid, 0.2 M citrate buffer (pH 5.5) was added, mixed with stirring, allowed to stand, and then the organic phase was separated. To this organic phase, the immobilized enzyme (170,000 units) prepared in Preparation Example 3 was added, and then 141 g of 2-chlorobenzaldehyde was added. This was stirred at room temperature to synthesize (R) -2-chloromandelonitrile. After reacting for 3.5 hours, the reaction solution was recovered, and the conversion rate of aldehyde was measured by HPLC. To the recovered reaction solution, 2.7 g of p-toluenesulfonic acid monohydrate was added as a stabilizer. This solution was distilled under reduced pressure at 50 torr and 50 ° C., and t-butyl methyl ether as a solvent and unreacted hydrocyanic acid were recovered by distillation.
[0036]
Furthermore, the immobilized enzyme after completion of the reaction was recovered, the substrate solution prepared by the same operation as described above and the recovered immobilized enzyme were mixed again, and the reaction was repeated under the same conditions. Fresh t-butyl methyl ether and hydrocyanic acid are used until the third batch reaction, and after the fourth batch reaction, deficient hydrocyanic acid is added to t-butyl methyl ether containing hydrocyanic acid recovered by the above distillation operation to adjust the hydrocyanic acid concentration. The adjusted one was recycled. The results are shown in FIG.
[0037]
As a result of these studies, it was found that both the reaction solvent t-butyl methyl ether and unreacted hydrocyanic acid could be recovered at an average recovery rate of 90% or more (t-butyl methyl ether: 90%, unreacted hydrocyanic acid: 92 %). In addition, even when distilled t-butyl methyl ether and unreacted cyanic acid are recycled, there is no adverse effect on the enzyme reaction, and the reaction results are the same as when new cyanic acid and t-butyl methyl ether are used. It was.
[0038]
【The invention's effect】
According to the present invention, the reaction solvent and the unreacted cyanide donor in the method for producing cyanohydrin can be recycled, the costs relating to the reaction solvent and the cyanide donor are reduced, and cyanohydrin can be advantageously produced industrially.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between the number of batch reactions and the conversion rate of benzaldehyde in the synthesis of (S) -mandelonitrile.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between the number of batch reactions and the conversion rate of 2-chlorobenzaldehyde in the synthesis of (R) -2-chloromandelonitrile.
FIG. 3 is a schematic diagram showing an embodiment of the present invention as a flowchart.

Claims

In a method for producing optically active cyanohydrin by an enzymatic reaction in the presence of a cyanide donor in a solvent containing an aromatic aldehyde as a substrate and an organic solvent having a boiling point of 30 to 100 ° C., the reaction solution after completion of the enzymatic reaction is treated at a temperature of 0 A method for producing an optically active cyanohydrin, characterized in that a recovered liquid containing an unreacted cyanide donor and an organic solvent obtained by distillation at 70 ° C. and a reduced pressure of 5 to 600 torr is repeatedly used at least once. .

The process according to claim 1 , wherein the distillation is carried out under acidic conditions.

The process according to claim 1 or 2 , wherein the aromatic aldehyde is chlorobenzaldehyde.

Further comprising a method according to any one of claims 1 to 3 to separate and remove the water contained in the recovered solution.

The method according to any one of claims 1 to 4 , wherein a phase-separated aqueous phase is separated from the recovered liquid, and the remaining organic phase is recovered and used for the next reaction.