JP3905690B2

JP3905690B2 - Enzyme reaction method

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Publication number: JP3905690B2
Application number: JP2000166578A
Authority: JP
Inventors: 尚仙波; 幸生 ▲土▼▲橋▼
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2007-04-18
Anticipated expiration: 2020-06-02
Also published as: JP2001346595A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固定化酵素を用いて有用物質を生産するための酵素反応方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機溶媒を反応溶媒として酵素反応を行うことは、水に難溶な基質や生成物の濃度を上げられるため有利であり、種々の酵素の反応系として使われてきている。しかし、酵素は水系環境では安定で活性も高いが、有機溶媒系では酵素タンパクの変性を起こしたりすることが多く、一般には不安定である。そこで、工業的に酵素反応を利用した有用物質の合成においては、反応系の構築は酵素の性質に左右され、高濃度反応をとるか、酵素の安定性を重視するかについてはケースによって異なっている。特に、ヒドロキシニトリルリアーゼを触媒として、シアン化水素とカルボニル化合物を基質として光学活性なシアノヒドリンを合成する方法において、本酵素は比較的有機溶媒中での安定性は高いが、反応系に水が存在しない場合には反応速度が顕著に低下する。よって、従来知られている有機溶媒系でのヒドロキシニトリルリアーゼの反応は反応時間が長いという問題があった。また、本酵素の基質となる芳香族系のカルボニル化合物は、水に対する溶解度が低く、本反応を水系で実施するのは基質及び生産物濃度が低いため、実用的ではない。
【０００３】
これまで報告されている、ヒドロキシニトリルリアーゼを触媒に用いた光学活性シアノヒドリンを合成する反応系としては、水系、即ち水又は水性緩衝液に酵素及び基質を溶解させて反応を行う系（特公平７−５３１１６号公報）、極性溶媒と水と混合した溶媒系(Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 29, 419-425, 1988)、水又は水性緩衝液を飽和させた有機溶媒系（特開昭６３−２１９３８８号公報）、有機溶媒と水又は水性緩衝液を体積比で１／５から５／１で混合した二相系（特開平５−３１７０６５号公報、Biocatal. Biotrans. Vol. 12, 255-266, 1995、特開平１１−２４３９８３号公報)などがある。
【０００４】
水系の反応系の場合、基質であるアルデヒドやケトン等のカルボニル化合物が一般に水溶性が低く、基質濃度と生産物濃度を上げられずに効率がよくないという問題がある。極性溶媒と水とを混合した溶媒系では、純粋な水系よりは基質の濃度をやや増加させられるが、充分ではなく、また、極性溶媒は酵素の安定性に対して悪影響を与えやすいという問題がある。水又は水性緩衝液を飽和させた有機溶媒を使う方法では、基質及び生産物濃度を高くすることができる反面、水分含量が少なすぎるために反応速度が遅いという問題がある。有機溶媒と水の二相系では、反応速度が速く、基質及び生産物濃度を上げられる点では好ましいが、実際には、有機溶媒と酵素が直接接触するため、酵素や夾雑タンパク質が有機溶媒によって変性しやすく、変性したタンパク質によって有機相と水相の界面が分離しにくくなり、場合によりエマルジョン化してしまい、二相分離が困難になるという問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、充分な反応速度かつ高濃度で目的生産物を合成できる固定化酵素反応系を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、水分含量１０重量％以上の固定化酵素を用い、水又は水性緩衝液で飽和させた、基質を含む有機溶媒系で反応を行うことによって、反応速度が速く、かつ高濃度の反応が可能であり、しかも反応後の酵素と反応液の分離回収も極めて容易である反応系が構築できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）酵素として、水分含量１０重量％以上の固定化酵素を用い、反応溶媒として、水と実質的に混和しない有機溶媒を用いて、溶液相が水又は水性緩衝液で飽和されているが相分離しない均一系となる条件で酵素反応を行うことを特徴とする酵素反応方法。
（２）固定化酵素として、シアン化水素とカルボニル化合物からシアノヒドリンを合成する活性を有する酵素であるヒドロキシニトリルリアーゼを固定化してなる固定化酵素を用い、カルボニル化合物を対応する光学活性シアノヒドリンに変換する反応を行う前記（１）に記載の方法。
【０００８】
（３）ヒドロキシニトリルリアーゼが（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ又は（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼであり、非対称カルボニル化合物を対応する光学活性シアノヒドリンに変換する反応を行う前記（２）に記載の方法。
（４）固定化酵素の担体として、水分を保持する能力を有する担体を用いる前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）反応の最中に固定化酵素から反応溶液相に水分が移行しないように、反応溶液相に飽和量の水分が含まれている条件で反応を行う前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
本発明は、反応系が有機溶媒の均一系であるため、基質及び生産物の濃度が上げられるばかりでなく、酵素は充分な水分を保持した固定化担体内に存在するため、酵素活性が充分発揮されて安定性も高い。更に、反応液との分離も、反応液がエマルジョン化することなく、清澄であり、固液分離を行うことによって非常に簡単になしうるところが特徴である。反応系内にわずかに水分を存在させた有機溶媒系での反応系は、一般に有機溶媒微水系の酵素反応と呼ばれているが、この場合の水分含量は通常数％以下である。これに対し、本発明では水分が固定化酵素の内部に存在し、反応溶液中に水の相として存在して二相を形成しなければ、反応系全体に対する水分含量の上限は特に限定せず、むしろ固定化酵素中１０重量％以上という、有機溶媒微水系に比べて多くの水分が存在する方が酵素反応に好ましいので、有機溶媒微水系とは全く異なっている。
【００１０】
更に、本発明はヒドロキシニトリルリアーゼを触媒としてカルボニル化合物とシアン化水素とから光学活性なシアノヒドリンを合成する反応において特に好適に用いることができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる酵素としては、特に制限はなく、有機溶媒を反応溶媒として用いることにより、反応効率が向上できる反応系に用いるものであれば使用することができる。このような酵素としては、水に難溶又は不溶な化合物が基質となる反応系の酵素触媒で、例えば、芳香族化合物の酸化還元を行う、モノオキシゲナーゼなどの酸化又は還元酵素、エステル化合物の合成、置換を行うエステラーゼなどのエステル加水分解酵素、水に難溶又は不溶な化合物への配糖化反応を行うグルコシダ−ゼなどの糖転移酵素、ニトリル化合物を加水分解するニトリルヒドラターゼ、有機溶媒に易溶なカルボニル化合物を基質として光学活性シアノヒドリンを合成する反応を触媒するヒドロキシニトリルリアーゼなどが挙げられる。特に、ヒドロキシニトリルリアーゼによる光学活性シアノヒドリン合成反応に好ましく用いることができる。
【００１２】
前記ヒドロキシニトリルリアーゼとは、シアン化水素とカルボニル化合物とから光学活性なシアノヒドリンを合成する活性を有するものを意味し、Ｒ体のシアノヒドリンを合成するヒドロキシニトリルリアーゼ（（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、アーモンド(Prunus amygdalus)などのバラ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、アマ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、Ｓ体のシアノヒドリンを合成するヒドロキシニトリルリアーゼ（（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、モロコシ(Sorghum bicolor)などのイネ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キャッサバ(Manihot esculenta)、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)などのトウダイグサ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キシメニア(Ximenia americana)などのボロボロノキ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼなどが例示できる。
【００１３】
前記酵素は酵素を含む生物組織からの抽出によって調製することができるが、前記酵素の遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作成した遺伝子組換え生物によっても生産することができる。
【００１４】
本発明では、酵素及び水分を保持する場として固定化担体を使用する。この固定化担体としては、酵素及び水分を保持することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。好ましい担体としては、親水性、又は担体内部に水又は水性緩衝液を保持することができる担体であって、例えば、多孔性の無機担体、セルロースなどの繊維分を含み、水分を保持できる担体、高分子化合物からなる担体などが挙げられ、具体的には、多孔性のセラミック粒子、多孔性のシリカゲル粒子、ゼオライト系粒子などの無機担体、寒天、アルギン酸カルシウム、キトサンなどの天然高分子ゲル、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールなどの合成高分子ゲルなどが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
本発明における酵素の固定化方法としては、特に制限はなく、例えば、担体に酵素液を吸収させる方法、酵素液と担体とを混合し、酵素を吸着固定する方法、酵素を包括固定化する方法、酵素を架橋剤で架橋する方法等が挙げられる。
本発明においては、固定化酵素の水分含量は、反応系（固定化酵素、水又は水性緩衝液、溶媒、基質及び生産物より構成される）全体に対する水分含量（％）が、基質及び／又は生産物を含んだ反応溶媒に溶解しうる飽和水分量（％）よりも多くなるようにすることが重要である。
【００１６】
前記の飽和水分量程度の水分では、酵素近傍の水分は実質的になく、反応速度が極めて遅くなる。一方、固定化酵素内部に保持できる水分量より大過剰の水分を投入してしまうと、溶液相が有機溶媒と水の二相系になり、固定化酵素の反応溶媒中での分散が悪くなり、反応効率が低下する。
実際には、用いる溶媒、温度条件、基質濃度条件によって溶媒に溶解する水の量は変動するので、用いる反応条件によって適宜選択することが好ましい。
【００１７】
本発明においては、反応原料の濃度を高め、生産性を高めるために、反応溶媒として、水と実質的に混和しない有機溶媒を用いる。ここで、「水と実質的に混和しない有機溶媒」とは、水に任意の割合で溶解する溶媒を除く有機溶媒を意味する。有機溶媒としては、水と実質的に混和せず、酵素反応に悪影響を与えないものであれば特に制限なく用いることができる。例えば、ヒドロキシニトリルリアーゼによる光学活性シアノヒドリンの合成においては、合成反応に用いる原料のアルデヒド又はケトンの物性、生成物であるシアノヒドリンの物性に応じて適宜選択することができる。
【００１８】
水と実質的に混和しない有機溶媒としては、具体的には、ハロゲン化されていてもよい炭化水素系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素）、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルムなど；ハロゲン化されていてもよいアルコール系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族アルコール、アラルキルアルコール）、例えば、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコールなど；ハロゲン化されていてもよいエーテル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エーテル、芳香族エーテル）、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど；ハロゲン化されていてもよいエステル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エステル、芳香族エステル）、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等が挙げられ、これらを単独で用いてもまた２種以上を混合して用いてもよい。
【００１９】
反応に用いる有機溶媒を単に水又は水性緩衝液で飽和させたものを反応に用いても、基質を本溶液に溶解すると水の溶解度が増す場合があり、固定化酵素から水分を奪ってしまう。このため、前記のような性質を有する基質を反応に用いる場合の水又は水性緩衝液を飽和させる処理は、基質を有機溶媒に溶解してから行う方が好ましい。
【００２０】
例えば、青酸を基質として用いる光学活性シアノヒドリンの合成方法においては、基質の青酸を有機溶媒に溶解してから水又は水性緩衝液で飽和させる処理を行う方が好ましい。即ち、所定濃度で青酸を有機溶媒に溶解した後、飽和量の水又は水性緩衝液を加えて混合する方法によって実施できる。また、前記の基質を溶解した有機溶媒中に溶解する水分量を予め測定しておき、飽和処理を行っていない有機溶媒と基質を反応系に添加した後、飽和量の水又は水性緩衝液を添加してもよい。ここで用いる水性緩衝液としては、酵素反応の至適ｐＨ付近に調整されていれば、特に制限はないが、例えば、リン酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸などの塩等によって構成されている緩衝液が挙げられる。
【００２１】
例えば、反応溶媒としてｔ−ブチルメチルエーテルを用い、基質としてベンズアルデヒド（１Ｍ）、青酸（シアン化水素酸）（１．５Ｍ）を用い、固定化ヒドロキシニトリルリアーゼを触媒として、反応温度２０℃付近で光学活性シアノヒドリンの合成を実施する場合に、前記の反応系を構築するには、以下のような手法で系を構築することができる。
【００２２】
１．固定化酵素の調製
酵素液に固定化担体を投入し、酵素を吸着固定化するか、又は担体が吸収しうる水分量以下の酵素液を固定化担体と混合して水分を１０重量％以上含んだ固定化酵素を作成する。この際の水分含量は、固定化酵素内部に保持できる範囲、即ち、溶液相が有機溶媒の均一系になる範囲であれば、制限はなく、好ましくは１０〜６０重量％、更に好ましくは２０〜５０重量％である。また、酵素１単位（Ｕ；unit）に対する固定化酵素中の水分含量は、好ましくは０．１〜１００μＬ／Ｕ、更に好ましくは１〜５０μＬ／Ｕである。
【００２３】
２．反応系の構築
反応温度付近の温度で溶媒と青酸を予め混合した溶液に水又は水性緩衝液を加えて飽和させる。この条件での水の飽和溶解度はおよそ２重量％程度であるから、少なくともこの量以上の水又は水性緩衝液を反応液に含ませる方が好ましい。一方、固定化酵素は活性を発現するに充分であり、かつ、反応溶媒中で容易に分散させうる程度の水分を含んだ状態のものを使用する。水分が過剰な場合は、反応液中への水分の添加量を少なく調整することで目的を達することもできる。また、固定化担体の水分がやや少ない場合には、固定化酵素を含む反応系に、水又は水性緩衝液をそのまま添加することによっても調整が可能である。
【００２４】
３．反応
反応系において、回分式で反応を行う場合には、攪拌などにより、固定化酵素が反応系内に分散するようにする。カラムなどに固定化酵素を充填して反応を行う場合には、基質を含む溶液を適当な流速でカラムに流入させ、流出液を採取することで実施できる。回分反応の場合には、反応が完結した時点で混合を止め、固定化酵素を沈降させ、生産物が溶解している有機相を常法により取り出すことで生産物を回収できる。この固定化酵素は初回と同じ方法で調製した基質を含む溶液と混合することによって再使用することができる。
【００２５】
本発明によって合成できる光学活性シアノヒドリンの反応基質としてはカルボニル化合物及びシアン化水素を用いる。
ここでカルボニル化合物とは、アルデヒド又はケトンをいい、具体的には、次式（Ｉ）：
【００２６】
【化１】
Ｒ¹−ＣＯ−Ｒ² （Ｉ）
（式中、Ｒ¹及びＲ²は、互いに異なり、それぞれ水素原子又は炭素数２２以下の１価の炭化水素基を表し、前記炭化水素基中、−ＣＨ₂−並びに−ＣＨ₃のＣＨ₂はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく、＝ＣＨ₂は＝Ｏ又は＝Ｓで置き換えられていてもよく、また−ＣＨ₂−のＣ−Ｈ、−ＣＨ₃のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ並びに＝ＣＨ₂のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置き換えられていてもよく、また、Ｒ¹及びＲ²は、共同して非対称の２価の基を表してもよい。）
で示される。
【００２７】
前記式（Ｉ）において、炭素数２２以下の１価の炭化水素基とは、直鎖状又は分岐状の鎖状炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある単環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある多環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のあるスピロ炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある環集合構造の炭化水素基、あるいは、前記の環式炭化水素基が置換した鎖状炭化水素基のいずれをも含む。また、飽和な炭化水素基並びに不飽和な炭化水素基のいずれをも含むが、不飽和な炭化水素基において、Ｃ＝Ｃ＝Ｃのアレン構造を含む基は除く。直鎖状又は分岐状の鎖状炭化水素基としては、例えば、飽和な鎖状炭化水素基である、炭素数１以上の直鎖状アルキル基、炭素数３以上の分岐状アルキル基、不飽和な鎖状炭化水素基である、炭素数２以上の直鎖状アルケニル基、炭素数３以上の分岐状アルケニル基、炭素数３以上の直鎖状アルキニル基、炭素数４以上の分岐状アルキニル基、炭素数４以上の直鎖状アルカジエニル基、炭素数５以上の分岐状アルカジエニル基などを例示することができる。単環式炭化水素基としては、例えば、飽和な単環式炭化水素基である、炭素数３以上の側鎖のないシクロアルキル基、総炭素数４以上の側鎖のあるシクロアルキル基、不飽和な単環式炭化水素基である、炭素数４以上の側鎖のないシクロアルケニル基、総炭素数５以上の側鎖のあるシクロアルキニル基、炭素数５以上の側鎖のないシクロアルカジエニル基、総炭素数６以上の側鎖のあるシクロアルカジエニル基などを例示することができる。不飽和な単環式又は多環式炭化水素基としては、芳香族炭化水素基、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、９−アントリル基など総炭素数６〜２２の側鎖のない芳香族基、総炭素数７以上の側鎖のある芳香族基、更には、環集合構造の炭化水素基でもある、炭素数１２のフェニルフェニル基、総炭素数１３以上の側鎖のあるフェニルフェニル基を例示することができる。また、多環式炭化水素基としては、炭素数６以上の側鎖のない縮合環式炭化水素基、総炭素数７以上の側鎖のある縮合環式炭化水素基、炭素数７以上の側鎖のない架橋環式炭化水素基、総炭素数８以上の側鎖のある架橋環式炭化水素基、総炭素数９以上の側鎖のないスピロ炭化水素基、総炭素数１０以上の側鎖のあるスピロ炭化水素基などを例示することができる。なお、前記の側鎖のない縮合環式炭化水素基において、縮合する環の一つがベンゼン環である場合、その総炭素数が９以上となるものを挙げることができ、前記の側鎖のある縮合環式炭化水素基において、縮合する環の一つがベンゼン環である場合、その総炭素数が１０以上となるものを挙げることができる。環集合構造の炭化水素基としては、総炭素数６以上の側鎖のないシクロアルキルシクロアルキル基、総炭素数７以上の側鎖のあるシクロアルキルシクロアルキル基、総炭素数６以上の側鎖のないシクロアルキリデンシクロアルキル基、総炭素数７以上の側鎖のあるシクロアルキリデンシクロアルキル基などを例示することができる。なお、これらの環式炭化水素において、側鎖のあるとは、環上に鎖状炭化水素基が置換していることを意味する。前述する環式炭化水素基が置換した鎖状炭化水素基としては、総炭素数７以上の側鎖のない芳香族基で置換された直鎖状アルキル基、総炭素数８以上の側鎖のある芳香族基で置換された直鎖状アルキル基、総炭素数９以上の側鎖のない芳香族基で置換された分岐状アルキル基、総炭素数１０以上の側鎖のある芳香族基で置換された分岐状アルキル基、総炭素数８以上の側鎖のない芳香族基で置換された直鎖状アルケニル基、総炭素数９以上の側鎖のある芳香族基で置換された直鎖状アルケニル基、総炭素数９以上の側鎖のない芳香族基で置換された分岐状アルケニル基、総炭素数１０以上の側鎖のある芳香族基で置換された分岐状アルケニル基、総炭素数８以上の側鎖のない芳香族基で置換された直鎖状アルキニル基、総炭素数９以上の側鎖のある芳香族基で置換された直鎖状アルキニル基、総炭素数１０以上の側鎖のない芳香族基で置換された分岐状アルキニル基、総炭素数１１以上の側鎖のある芳香族基で置換された分岐状アルキニル基、総炭素数１０以上の側鎖のない芳香族基で置換された直鎖状アルカジエニル基、総炭素数１１以上の側鎖のある芳香族基で置換された直鎖状アルカジエニル基、総炭素数１１以上の側鎖のない芳香族基で置換された分岐状アルカジエニル基、総炭素数１２以上の側鎖のある芳香族基で置換された分岐状アルカジエニル基、総炭素数４以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された直鎖状アルキル基、総炭素数５以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された直鎖状アルキル基、総炭素数６以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された分岐状アルキル基、総炭素数７以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された分岐状アルキル基、総炭素数５以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された直鎖状アルケニル基、総炭素数６以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された直鎖状アルケニル基、総炭素数６以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された分岐状アルケニル基、総炭素数７以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された分岐状アルケニル基、総炭素数５以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された直鎖状アルキニル基、総炭素数６以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された直鎖状アルキニル基、総炭素数７以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された分岐状アルキニル基、総炭素数８以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された分岐状アルキニル基、総炭素数８以上の側鎖のないシクロアルキル基で置換された分岐状アルカジエニル基、総炭素数９以上の側鎖のあるシクロアルキル基で置換された分岐状アルカジエニル基などを例示することができる。
【００２８】
なお、以下においては、側鎖のない芳香族基、側鎖のある芳香族基、並びに、フェニルフェニル基又は側鎖のあるフェニルフェニル基などを併せて、アリール基といい、このアリール基で置換された直鎖状又は分岐状のアルキル基をアラルキル基という。他の環式炭化水素基に関しても、特に明記しない場合、環上に側鎖のないものとあるものを併せて指す場合には、単にシクロアルキル基等の名称を用いる。鎖状炭化水素基についても、直鎖状のものと分岐状のものを併せて指す場合には、単にアルキル基等の名称を用いる。
【００２９】
前記炭化水素基中、−ＣＨ₂−がカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられると、それぞれケトン、スルホン、エーテル又はチオエーテルの構造が導入され、−ＣＨ₃の−ＣＨ₂−がカルボニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換わると、それぞれホルミル基（アルデヒド）、水酸基又はメルカプト基に変わり、あるいは、末端の＝ＣＨ₂が＝Ｏ又は＝Ｓに置き換わると、ケトン、チオケトンの構造が導入されることを意味し、また、−ＣＨ₂−のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ−となり、＞ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＞Ｎ−となり、＝ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＝Ｎ−となり、末端の−ＣＨ₃のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ₂が導入され、＝ＣＨ₂のＣ−ＨがＮに変わると、＝ＮＨとなる。また、−ＣＨ₃、−ＣＨ₂−、＝ＣＨ−、≡ＣＨ又は＞ＣＨ−のＣ−ＨがＣ−ハロゲンで置き換えられると、当該炭素上へハロゲン原子を置換することになる。なお、炭素鎖中における−Ｏ−、−Ｓ−、Ｎへの置き換えは、当該炭化水素基に対する、それぞれオキサ置換、チア置換、アザ置換に当たり、例えば、炭化水素環の環の骨格炭素で起こると、炭化水素環のそれぞれ含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環への変換となる。該炭化水素基中、ＣＨ₂並びにＣ−Ｈにおける置き換えは、それぞれ独立に行われてよく、加えて、前記の置き換えを行った後、なお当該炭素上にＣＨ₂又はＣ−Ｈが残存する際には、更に置き換えがなされてもよい。更には、前記の置き換えにより、−ＣＨ₂−ＣＨ₃の−ＣＯ−Ｏ−Ｈ；カルボン酸構造への変換などもなされる。
【００３０】
本明細書において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を指すが、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。
従って、前記炭化水素基としては、鎖状炭化水素基並びに環式炭化水素基など環構造を有する炭化水素基のいずれをも選択でき、例えば、飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルキル基、不飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルケニル基、直鎖状又は分岐状のアルキニル基、直鎖状又は分岐状のアルカジエニル基など、飽和な環式炭化水素基であるシクロアルキル基、不飽和な環式炭化水素基であるシクロアルケニル基、シクロアルキニル基、シクロアルカジエニル基など、芳香族炭化水素基であるアリール基、アラルキル基、アリールアルケニル基などが挙げられる。
【００３１】
更に詳しくいえば、直鎖状又は分岐状のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、１−エチルペンチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、２−メチルプロピル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、メチルヘキシル基、メチルヘプチル基、メチルオクチル基、メチルノニル基、１，１−ジメチルエチル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，６−ジメチルヘプチル基、３，７−ジメチルオクチル基、２−エチルヘキシル基など、シクロアルキルアルキル基としては、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基など、シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基など、ビシクロアルキル基としては、ノルボルニル基、ビシクロ［２．２．２］オクチル基、アダマンチル基などが挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、クロチル基（２−ブテニル基）、イソプロペニル基（１−メチルビニル基）など、シクロアルケニル基又はシクロアルカジエニル基としては、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサンジエニル基などが挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−フェニルフェニル基、３−フェニルフェニル基、４−フェニルフェニル基、９−アントリル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、エチルフェニル基、メチルエチルフェニル基、ジエチルフェニル基、プロピルフェニル基、ブチルフェニル基などが挙げられる。アラルキル基としては、例えばベンジル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、フェネチル基（２−フェニルエチル基）、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルベンジル基、ジメチルフェネチル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、ジエチルベンジル基などが挙げられる。アリールアルケニル基としては、例えばスチリル基、メチルスチリル基、エチルスチリル基、ジメチルスチリル基、３−フェニル−２−プロペニル基などが挙げられる。
【００３２】
前記炭化水素基中のＣＨ₂がカルボニル基、スルホニル基、Ｏ又はＳで、又はＣ−ＨがＮ又はＣ−ハロゲンで置き換えられた基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、スルホン、エーテル、チオエーテル、アミン、アルコール、チオール、ハロゲン、複素環（例えば、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環）などの構造を一つ以上含む基が挙げられる。なお、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環とは、環式炭化水素基の環骨格の炭素がそれぞれ酸素、硫黄、窒素で置き換わるものを意味し、更には、これらヘテロ原子置換が二種以上ある複素環であってもよい。前記の置換を有する炭化水素基としては、例えば、ケトン構造のアセチルメチル基、アセチルフェニル基；スルホン構造のメタンスルホニルメチル基；エーテル構造のメトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、メトキシプロピル基、ブトキシエチル基、エトキシエトキシエチル基、メトキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、フェノキシメチル基；チオエーテル構造のメチルチオメチル基、メチルチオフェニル基；アミン構造のアミノメチル基、２−アミノエチル基、２−アミノプロピル基、３−アミノプロピル基、２，３−ジアミノプロピル基、２−アミノブチル基、３−アミノブチル基、４−アミノブチル基、２，３−ジアミノブチル基、２，４−ジアミノブチル基、３，４−ジアミノブチル基、２，３，４−トリアミノブチル基、メチルアミノメチル基、ジメチルアミノメチル基、メチルアミノエチル基、プロピルアミノメチル基、シクロペンチルアミノメチル基、アミノフェニル基、ジアミノフェニル基、アミノメチルフェニル基；含酸素複素環のテトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリルエチル基；含酸素複素芳香環のフリル基、フルフリル基、ベンゾフリル基、ベンゾフルフリル基；含硫黄複素芳香環のチエニル基；含窒素複素芳香環のピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、テトラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、ピリジルメチル基；アルコール構造の２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基、２，３−ジヒドロキシブチル基、２，４−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジヒドロキシブチル基、２，３，４−トリヒドロキシブチル基、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、ヒドロキシメチルフェニル基、ヒドロキシエチルフェニル基；チオール構造の２−メルカプトエチル基、２−メルカプトプロピル基、３−メルカプトプロピル基、２，３−ジメルカプトプロピル基、２−メルカプトブチル基、３−メルカプトブチル基、４−メルカプトブチル基、メルカプトフェニル基；ハロゲン化炭化水素基である２−クロロエチル基、２−クロロプロピル基、３−クロロプロピル基、２−クロロブチル基、３−クロロブチル基、４−クロロブチル基、フルオロフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、ジフルオロフェニル基、ジクロロフェニル基、ジブロモフェニル基、クロロフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基、トリクロロフェニル基、フルオロメチルフェニル基、トリフルオロメチルフェニル基；アミン構造とアルコール構造を有する２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル基、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基、２−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、２，４−ジアミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２，４−ジヒドロキシブチル基、２，３−ジアミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２，３−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジアミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−３，４−ジヒドロキシブチル基、アミノヒドロキシフェニル基；ハロゲンと水酸基で置換された炭化水素基であるフルオロヒドロキシフェニル基、クロロヒドロキシフェニル基；カルボン構造のカルボキシフェニル基などが挙げられる。
【００３３】
Ｒ¹及びＲ²で表される非対称の２価の基としては、特に制限はなく、例えば、ノルボルナン−２−イリデン、２−ノルボルネン−５−イリデンが挙げられる。前記式（Ｉ）で示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。
【００３４】
前記のアルデヒド又はケトンを光学活性シアノヒドリンに変換するためには、シアン化水素を原料として用いるが、シアン化水素の供給方法としては液体として供給する方法、気体として供給する方法のいずれをも採用することができる。またシアン化水素だけではなく、シアン化水素の水溶液である、シアン化水素酸（即ち青酸）も全く同様に用いることができる。更に、反応系へ添加することによってシアン化物イオン（ＣＮ^-）を生じる物質であれば用いることができ、例えば、シアン化ナトリウムやシアン化カリウムなどのシアン化水素酸の塩、アセトンシアンヒドリンなどのシアノヒドリン類などが挙げられる。
【００３５】
本発明に用いるヒドロキシニトリルリアーゼ酵素の調製は、酵素を含む植物組織からの抽出、酵素遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え生物を培養した培養物からの抽出によって行える。抽出は常法によって実施すればよく、調製物にはヒドロキシニトリルリアーゼ以外の成分が含まれていても反応に悪影響を与えなければ特に精製する必要はない。こうして調製したヒドロキシニトリルリアーゼ酵素を固定化することによって固定化酵素を得る。
【００３６】
固定化酵素の水分含量の測定は、乾燥状態の固定化担体と酵素固定化後の固定化酵素との重量の比率から求めることもできるが、カールフィッシャー水分計などを使用しても測定することができる。
【００３７】
固定化酵素及び基質の使用量、反応温度は、用いる基質に応じて適宜決定される。通常、固定化酵素の使用量は基質であるカルボニル化合物５０mmolに対して１〜１０００単位、好ましくは１０〜５００単位である。基質の濃度は、カルボニル化合物の場合は通常０.１〜１０mol/Lの範囲に設定し、シアン化水素は用いるカルボニル化合物に対して１〜５倍モル、好ましくは１.１〜３倍モルの濃度で添加する。本反応は基質濃度によって酵素活性及び反応速度が変化するので、用いるカルボニル化合物の種類に応じて適宜決定する。反応時間は、基質であるカルボニル化合物の転換率が８０％以上、好ましくは９０％以上に達するまでの時間が適当であるが、この限りではない。反応温度は酵素の活性が十分発揮される温度であればよく、通常０〜４０℃、好ましくは４〜３０℃である。
【００３８】
本発明方法によって生成された光学活性シアノヒドリンなどの生成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などによって、測定、定量することができ、必要に応じて、抽出、減圧蒸留、カラム分離などの通常の手段によって分離精製することができ、長時間保存する場合には安定剤を添加してもよい。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
（調製例１）（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
（１）アーモンド種子粉砕物１００ｇにアセトン２００ｍｌを混合し、２時間攪拌した後、濾過し、固形分を回収した。この固形分を乾燥したものに水６００ｇを加え、アンモニア水でｐＨ７．５に調整した後、攪拌混合を一晩行った。次いで、このスラリーを遠心分離し、上澄液を回収した。この上澄液のｐＨを５．５に調整した後、遠心分離し、不溶分を除去した液を回収した。
【００４０】
（２）前記（１）で調製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液の活性を測定した。酵素活性はＤＬ−マンデロニトリルを基質として基質が酵素によって分解されベンズアルデヒドが生成される速度を２４９．６ｎｍの吸光度変化を測定することによって測定し、活性を算出した。ここで、１単位（Ｕ；unit）は１分間にベンズアルデヒド１μｍｏｌを生成する活性と定義した。この方法で前記（１）で調製した酵素液の酵素活性を測定したところ、６０．５７Ｕ／ｍｌの活性で酵素を２．５万単位回収することができたことがわかった。
【００４１】
（調製例２）（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
（１）（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、酵母サッカロマイセス・セレビシエを宿主として、キャッサバ由来の当該遺伝子をクローニングしたものを当該酵母へ遺伝子組換えして得た遺伝子組換え酵母を培養することによって調製した。当該遺伝子組換え酵母をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）１Ｌで２４時間当該遺伝子組換え酵母を培養し、回収した菌体を破砕して不溶分を除去した液を回収した。
（２）前記（１）で調製した（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液の活性を調製例１（２）と同様の方法で測定したところ、４０Ｕ／ｍｌの活性があることがわかり、９０００単位の酵素を回収することができた。
【００４２】
（調製例３）固定化（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
調製例１の方法で調製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液を硫安沈澱処理し、酵素を濃縮し、１０００Ｕ／ｍｌの酵素液を調製した。この酵素液１ｍｌに対して１ｇの固定化担体（多孔性シリカゲル、microbead silicagel 300A、富士シリシア化学製）を混合した。これをこのまま合成反応に用いることにした。この固定化酵素の水分含量は５０重量％であった。
【００４３】
（調製例４）固定化（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
調製例２の方法で調製した（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液に、酵素活性３００単位に対して調製例３と同じ固定化担体１ｇを添加し、緩やかに一晩混合した。次いで、濾過して固定化酵素を回収し、これを以降の反応に用いた。こうして調製した固定化酵素の水分含量をカールフィッシャー水分計で測定したところ、水分含量５０重量％であることがわかった。
【００４４】
（実施例１）（Ｒ）−シアノヒドリンの合成
アーモンド由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液１０００Ｕ／ｍｌ６ｍｌと多孔性シリカゲルmicrobead silicagel 300A（富士シリシア化学製）６ｇを混合し、固定化酵素を調製した。水分量と反応効率の関係を調べるために、同様の操作によって調製した固定化酵素をエバポレーターで３時間減圧乾燥した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を添加して水分含量を調整したものを作成した。表１に示した条件４においては、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５.５）で酵素濃度を１／２に希釈して、酵素量は同じであるが酵素液量を２倍にした酵素液を、他の条件の２倍量の固定化担体に固定化した固定化酵素を用いた。
【００４５】
検討に用いた未処理ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）中の水分含量は０．０３重量％であり、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で飽和させたものの水分含量は１．３４重量％であった。この溶媒を前記緩衝液で飽和させた条件及び飽和処理しない条件を設定し、反応系全体の水分含量を変化させた。
【００４６】
いずれの条件においても、基質である２−クロロベンズアルデヒド（ｏ−クロロベンズアルデヒド）と青酸の濃度はそれぞれ１Ｍ及び１．５Ｍと一定にした。前記において調製した固定化酵素６００単位分を、それぞれ１０ｍｌの反応容器に入れ、次いで溶媒４.１４３ｍｌ、青酸０.２９２ｍｌを添加した。ここへ、２−クロロベンズアルデヒド０.５６５ｍｌを添加することによって反応を開始した。反応は、２５℃で反応容器をボトルローラーで緩やかに撹拌することで実施した。条件及び結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】

【００４８】
この結果から、緩衝液で飽和させた溶媒を用いても、反応効率が低く、溶媒の飽和水分量に対して過剰の水分を含んだ反応系において高い反応効率が得られた。条件３及び４では、反応溶媒が含有しうる水分量に比べ大過剰の水分を加えているにもかかわらず、反応溶液相は二相分離せず、有機溶媒相の単一相で形成されていた。
【００４９】
（実施例２）
調製例１で使用した固定化担体の水分保持量は重量のほぼ１倍であったので、酵素量は同じにし、担体量を変化させることで反応系内の水分含量を変化させた条件を設定し、水分含量と反応効率との関係を調べた。調製例３の方法で調製した固定化酵素を減圧乾燥し、水分を除去したものに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加えて水分量を調整した固定化酵素を作成し、水分含量と反応効率との関係を調べた。
【００５０】
６００単位の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを固定化し、水分含量の異なる固定化酵素を調製した。一方、青酸をｔ−ブチルメチルエーテルに溶解し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を飽和量添加した。次いで、固定化酵素に前記の原料液を添加した後、２−クロロベンズアルデヒドを添加した。この反応系の有機相は５ｍｌであり、青酸の濃度は１．５Ｍ、２−クロロベンズアルデヒドの濃度は１Ｍであった。この混合物を２５℃で緩やかに混合することで反応を行い、５時間後の２−クロロベンズアルデヒドの（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルへの転換率を測定したところ、図１に示す結果が得られた。この結果、固定化酵素の水分含量が高いほど、反応効率が高いことがわかった。
【００５１】
（実施例３）
ｔ−ブチルメチルエーテル６１０ｇに青酸４１ｇを添加した溶液に０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７）を４０ｍｌ加えて攪拌し、静置後、有機相を回収した。この有機相に調製例４の方法で調製した固定化酵素（６万単位）を添加した。この時の固定化酵素の水分含量は５０重量％であった。次いで、ベンズアルデヒドを１０６ｇ添加後、反応混合物を攪拌し、反応を開始した。反応温度は２０℃に設定した。ＨＰＬＣで反応液の分析を行ったところ、１時間後に（Ｓ）−マンデロニトリルが１２６ｇ生成していることがわかった。この時のアルデヒドの転換率は９３％、（Ｓ）−マンデロニトリルの光学純度は９９％ｅｅであった。次いで、反応終了後、固定化酵素を回収し、同様の条件で繰り返して反応を行ったところ、１６回の反応において平均転換率９４．２％で光学純度９９％ｅｅ以上の（Ｓ）−マンデロニトリルを合成することができた。この結果から、固定化酵素に水分を保持させて反応を行うことによって、非常に効率よく、かつ安定に光学活性シアノヒドリンの合成が行えることがわかった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、非常に効率よく、かつ安定に目的生産物を合成できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】固定化酵素の水分含量と反応効率との関係を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an enzymatic reaction method for producing a useful substance using an immobilized enzyme.
[0002]
[Prior art]
Performing an enzyme reaction using an organic solvent as a reaction solvent is advantageous because it can increase the concentration of a substrate or product that is hardly soluble in water, and has been used as a reaction system for various enzymes. However, an enzyme is stable and highly active in an aqueous environment, but in an organic solvent system, the enzyme protein is often denatured and is generally unstable. Therefore, in the synthesis of useful substances using enzymatic reactions industrially, the construction of the reaction system depends on the nature of the enzyme, and it depends on the case whether to take a high-concentration reaction or focus on the stability of the enzyme. Yes. In particular, in the method of synthesizing optically active cyanohydrin using hydroxynitrile lyase as a catalyst and hydrogen cyanide and carbonyl compounds as substrates, this enzyme is relatively stable in organic solvents, but water is not present in the reaction system. The reaction rate is significantly reduced. Therefore, the reaction of hydroxynitrile lyase in a conventionally known organic solvent system has a problem that the reaction time is long. In addition, the aromatic carbonyl compound serving as the substrate of the enzyme has low solubility in water, and it is impractical to carry out the reaction in an aqueous system because of low substrate and product concentrations.
[0003]
As a reaction system for synthesizing an optically active cyanohydrin using hydroxynitrile lyase as a catalyst, which has been reported so far, an aqueous system, that is, a system in which an enzyme and a substrate are dissolved in water or an aqueous buffer solution (Japanese Patent Publication No. 7). No.-53116), solvent system mixed with polar solvent and water (Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 29, 419-425, 1988), organic solvent system saturated with water or aqueous buffer solution 63-219388), a two-phase system in which an organic solvent and water or an aqueous buffer are mixed at a volume ratio of 1/5 to 5/1 (JP-A-5-317065, Biocatal. Biotrans. Vol. 12, 255). -266, 1995, and Japanese Patent Laid-Open No. 11-243983).
[0004]
In the case of an aqueous reaction system, there is a problem that carbonyl compounds such as aldehydes and ketones which are substrates are generally low in water solubility, and the substrate concentration and product concentration cannot be increased, resulting in poor efficiency. In a solvent system in which a polar solvent and water are mixed, the concentration of the substrate can be slightly increased compared to a pure water system, but it is not sufficient, and the problem that the polar solvent tends to adversely affect the stability of the enzyme. is there. In the method using an organic solvent saturated with water or an aqueous buffer, the concentration of the substrate and the product can be increased, but there is a problem that the reaction rate is slow because the water content is too small. The two-phase system of organic solvent and water is preferable in that the reaction rate is high and the substrate and product concentration can be increased. However, in practice, the organic solvent and the enzyme are in direct contact with each other. There is a problem that the interface between the organic phase and the aqueous phase is not easily separated by the denatured protein, and the emulsion is sometimes emulsified, which makes it difficult to separate two phases.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an immobilized enzyme reaction system capable of synthesizing a target product with a sufficient reaction rate and high concentration.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have used an immobilized enzyme having a water content of 10% by weight or more, saturated with water or an aqueous buffer, and an organic solvent system containing a substrate. By carrying out the reaction, the present inventors have found that a reaction system can be constructed in which the reaction rate is high and a reaction at a high concentration is possible, and the enzyme and the reaction solution after the reaction can be separated and recovered very easily. It came to.
[0007]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) An immobilized enzyme having a water content of 10% by weight or more is used as an enzyme, an organic solvent that is substantially immiscible with water is used as a reaction solvent, and the solution phase is saturated with water or an aqueous buffer. An enzyme reaction method characterized in that an enzyme reaction is carried out under conditions that make a homogeneous system without phase separation.
(2) A reaction for converting a carbonyl compound into a corresponding optically active cyanohydrin using an immobilized enzyme formed by immobilizing hydroxynitrile lyase, an enzyme having an activity of synthesizing cyanohydrin from hydrogen cyanide and a carbonyl compound, as an immobilized enzyme. The method according to (1) above.
[0008]
(3) The method according to (2) above, wherein the hydroxynitrile lyase is (R) -hydroxynitrile lyase or (S) -hydroxynitrile lyase, and a reaction for converting an asymmetric carbonyl compound into a corresponding optically active cyanohydrin is performed.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein a carrier having an ability to retain moisture is used as the carrier for the immobilized enzyme.
(5) The reaction described in (1) to (4) above, wherein the reaction is carried out under the condition that the reaction solution phase contains a saturated amount of moisture so that the moisture does not migrate from the immobilized enzyme to the reaction solution phase during the reaction. The method according to any one.
[0009]
In the present invention, since the reaction system is a homogeneous system of an organic solvent, not only the concentration of the substrate and the product can be increased, but also the enzyme activity is sufficient because the enzyme is present in an immobilization carrier holding sufficient moisture. Demonstrated and highly stable. Further, the separation from the reaction solution is characterized in that the reaction solution is clear without being emulsified, and can be very easily performed by performing solid-liquid separation. A reaction system in an organic solvent system in which a slight amount of water is present in the reaction system is generally called an enzyme reaction of an organic solvent fine water system. In this case, the water content is usually several percent or less. On the other hand, in the present invention, the upper limit of the moisture content with respect to the entire reaction system is not particularly limited as long as moisture is present inside the immobilized enzyme and does not form two phases by being present as a water phase in the reaction solution. Rather, it is completely different from the organic solvent fine water system because it is preferable for the enzyme reaction that 10% by weight or more of the immobilized enzyme is present in the presence of more water than the organic solvent fine water system.
[0010]
Furthermore, the present invention can be particularly suitably used in a reaction for synthesizing optically active cyanohydrin from a carbonyl compound and hydrogen cyanide using hydroxynitrile lyase as a catalyst.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
There is no restriction | limiting in particular as an enzyme used for this invention, If it uses for the reaction system which can improve reaction efficiency by using an organic solvent as a reaction solvent, it can be used. As such an enzyme, a reaction system enzyme catalyst in which a compound hardly soluble or insoluble in water is a substrate, for example, oxidation or reduction of an aromatic compound, oxidation or reductase such as monooxygenase, synthesis of an ester compound , Ester hydrolases such as esterases that perform substitution, glycosyltransferases such as glucosidases that perform glycosylation reactions to compounds that are sparingly or insoluble in water, nitrile hydratases that hydrolyze nitrile compounds, and organic solvents Examples thereof include a hydroxynitrile lyase that catalyzes a reaction for synthesizing an optically active cyanohydrin using a soluble carbonyl compound as a substrate. In particular, it can be preferably used for an optically active cyanohydrin synthesis reaction by hydroxynitrile lyase.
[0012]
The hydroxy nitrile lyase means one having an activity of synthesizing an optically active cyanohydrin from hydrogen cyanide and a carbonyl compound, and as a hydroxy nitrile lyase ((R) -hydroxy nitrile lyase) for synthesizing an R cyanohydrin, (R) -Hydroxynitrile lyase derived from Rosaceae such as almond (Prunus amygdalus), (R) -Hydroxynitrile lyase derived from flaxaceae, hydroxynitrile lyase ((S) -hydroxynitrile for synthesizing S-cyanohydrin Examples of the lyase include (S) -hydroxynitrile lyase derived from gramineous plants such as Sorghum bicolor, and (S) -hydroxynitrile lyase derived from Euphorbiaceae plants such as Manihot esculenta and Hevea brasiliensis. , Shimenia (Ximenia americana) from Boroboronoki family plants such (S) - such as hydroxynitrile lyase can be exemplified.
[0013]
The enzyme can be prepared by extraction from a biological tissue containing the enzyme, but can also be produced by a genetically modified organism prepared by cloning the gene of the enzyme and incorporating the gene.
[0014]
In the present invention, an immobilization carrier is used as a place for holding an enzyme and moisture. Any immobilization carrier can be used without particular limitation as long as it can retain an enzyme and moisture. Preferred carriers are hydrophilic or carriers that can hold water or an aqueous buffer inside the carrier and include, for example, porous inorganic carriers, fibers such as cellulose, and carriers that can hold moisture, Specific examples include carriers made of polymer compounds. Specifically, porous ceramic particles, porous silica gel particles, inorganic carriers such as zeolite-based particles, natural polymer gels such as agar, calcium alginate, chitosan, poly Examples include synthetic polymer gels such as acrylic acid, polyacrylamide, and polyvinyl alcohol, but are not limited thereto.
[0015]
The method for immobilizing an enzyme in the present invention is not particularly limited. For example, a method for absorbing an enzyme solution on a carrier, a method for adsorbing and immobilizing an enzyme by mixing the enzyme solution and a carrier, and a method for comprehensively immobilizing an enzyme. And a method of crosslinking an enzyme with a crosslinking agent.
In the present invention, the moisture content of the immobilized enzyme is such that the moisture content (%) of the whole reaction system (consisting of immobilized enzyme, water or aqueous buffer, solvent, substrate and product) is the substrate and / or It is important that the saturated water content (%) that can be dissolved in the reaction solvent containing the product is increased.
[0016]
When the water content is about the above saturated water content, there is substantially no water in the vicinity of the enzyme, and the reaction rate becomes extremely slow. On the other hand, if a larger amount of water than the amount of water that can be held inside the immobilized enzyme is added, the solution phase becomes a two-phase system of an organic solvent and water, and the dispersion of the immobilized enzyme in the reaction solvent becomes worse. , Reaction efficiency decreases.
Actually, the amount of water dissolved in the solvent varies depending on the solvent to be used, the temperature condition, and the substrate concentration condition. Therefore, it is preferable to select appropriately depending on the reaction condition to be used.
[0017]
In the present invention, an organic solvent that is substantially immiscible with water is used as the reaction solvent in order to increase the concentration of the reaction raw material and increase the productivity. Here, the “organic solvent substantially immiscible with water” means an organic solvent excluding a solvent that dissolves in water at an arbitrary ratio. Any organic solvent can be used without particular limitation as long as it is substantially immiscible with water and does not adversely affect the enzyme reaction. For example, in the synthesis of an optically active cyanohydrin using hydroxynitrile lyase, it can be appropriately selected according to the physical properties of the raw material aldehyde or ketone used in the synthesis reaction and the physical properties of the product cyanohydrin.
[0018]
Specific examples of organic solvents that are substantially immiscible with water include hydrocarbon solvents that may be halogenated (eg, linear, branched or cyclic saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbons, aromatics). Group hydrocarbons), for example, pentane, hexane, cyclohexane, benzene, toluene, xylene, methylene chloride, chloroform, etc .; alcohol solvents that may be halogenated (for example, linear, branched or cyclic saturated or unsaturated). Saturated aliphatic alcohols, aralkyl alcohols), such as n-butanol, isobutanol, t-butanol, hexanol, cyclohexanol, n-amyl alcohol, etc .; ether solvents that may be halogenated (eg, linear, Branched or cyclic saturated or unsaturated aliphatic ethers, aromatic ethers), for example diethyl Ethers, dipropyl ethers, diisopropyl ethers, dibutyl ethers, t-butyl methyl ethers, dimethoxyethanes, etc .; ester solvents which may be halogenated (eg linear, branched or cyclic saturated or unsaturated aliphatics) Ester, aromatic ester), for example, methyl formate, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
[0019]
Even if the organic solvent used for the reaction is simply saturated with water or an aqueous buffer, the solubility of water may increase when the substrate is dissolved in this solution, and water is deprived from the immobilized enzyme. For this reason, it is preferable to perform the treatment for saturating water or an aqueous buffer when a substrate having the above properties is used for the reaction after dissolving the substrate in an organic solvent.
[0020]
For example, in a method for synthesizing an optically active cyanohydrin using hydrocyanic acid as a substrate, it is preferable to perform a treatment of dissolving hydrocyanic acid of the substrate in an organic solvent and then saturating with water or an aqueous buffer. That is, it can be carried out by a method in which hydrocyanic acid is dissolved in an organic solvent at a predetermined concentration, and then a saturated amount of water or an aqueous buffer is added and mixed. In addition, the amount of water dissolved in the organic solvent in which the substrate is dissolved is measured in advance, and after adding an organic solvent and a substrate not subjected to saturation treatment to the reaction system, a saturated amount of water or an aqueous buffer solution is added. It may be added. The aqueous buffer used here is not particularly limited as long as it is adjusted to around the optimum pH of the enzyme reaction. For example, phosphoric acid, citric acid, glutaric acid, malic acid, malonic acid, o-phthalic acid And a buffer composed of a salt such as succinic acid.
[0021]
For example, t-butyl methyl ether is used as a reaction solvent, benzaldehyde (1M) and hydrocyanic acid (hydrocyanic acid) (1.5M) are used as substrates, and optical activity is obtained at a reaction temperature of about 20 ° C. using immobilized hydroxynitrile lyase as a catalyst. In the case of carrying out the synthesis of cyanohydrin, in order to construct the above reaction system, the system can be constructed by the following method.
[0022]
1. Preparation of immobilized enzyme An immobilized carrier is put into an enzyme solution to adsorb and immobilize the enzyme, or an enzyme solution having a water content that can be absorbed by the carrier is mixed with the immobilized carrier to contain 10% by weight or more of moisture. Create an immobilized enzyme. The water content in this case is not limited as long as it is within a range that can be retained inside the immobilized enzyme, that is, within a range in which the solution phase becomes a homogeneous system of an organic solvent, preferably 10 to 60% by weight, more preferably 20 to 20%. 50% by weight. The water content in the immobilized enzyme with respect to 1 unit (U) of the enzyme is preferably 0.1 to 100 μL / U, more preferably 1 to 50 μL / U.
[0023]
2. Construction of the reaction system Water or an aqueous buffer solution is added to a solution in which a solvent and hydrocyanic acid are mixed in advance at a temperature close to the reaction temperature and saturated. Since the saturated solubility of water under these conditions is about 2% by weight, it is preferable to contain at least this amount of water or an aqueous buffer in the reaction solution. On the other hand, the immobilized enzyme is used in such a state that it is sufficient to express the activity and contains water to such an extent that it can be easily dispersed in the reaction solvent. When the water is excessive, the object can be achieved by adjusting the amount of water added to the reaction solution to be small. Further, when the immobilized carrier has a little water content, it can also be adjusted by adding water or an aqueous buffer as it is to the reaction system containing the immobilized enzyme.
[0024]
3. In the reaction reaction system, when the reaction is performed batchwise, the immobilized enzyme is dispersed in the reaction system by stirring or the like. When the reaction is performed by filling the column with the immobilized enzyme, the solution containing the substrate can be flowed into the column at an appropriate flow rate, and the effluent can be collected. In the case of batch reaction, when the reaction is completed, mixing is stopped, the immobilized enzyme is allowed to settle, and the organic phase in which the product is dissolved is taken out by a conventional method, whereby the product can be recovered. This immobilized enzyme can be reused by mixing it with a solution containing the substrate prepared in the same manner as the first time.
[0025]
As the reaction substrate for the optically active cyanohydrin that can be synthesized by the present invention, a carbonyl compound and hydrogen cyanide are used.
Here, the carbonyl compound refers to an aldehyde or a ketone, specifically, the following formula (I):
[0026]
[Chemical 1]
R ¹ —CO—R ² (I)
(In the formula, R ¹ and R ² are different from each other and each represents a hydrogen atom or a monovalent hydrocarbon group having 22 or less carbon atoms, and in the hydrocarbon group, CH ₂ — and —CH ₃ CH ₂ are May be replaced by a carbonyl group, a sulfonyl group, -O- or -S-, ═CH ₂ may be replaced by ═O or ═S, or —CH ₂ —C—H, —CH ₃ CH,> CH—CH, ═CH—CH, and ═CH ₂ CH may be replaced by N or C-halogen, and R ¹ and R ² may jointly represent an asymmetric divalent group.)
Indicated by
[0027]
In the formula (I), the monovalent hydrocarbon group having 22 or less carbon atoms is a linear or branched chain hydrocarbon group, a monocyclic hydrocarbon group having no side chain or having a side chain, A polycyclic hydrocarbon group having no side chain or having a side chain, a spiro hydrocarbon group having no side chain or having a side chain, a hydrocarbon group having a ring assembly structure having no side chain or having a side chain, or Any of the chain hydrocarbon groups substituted by the cyclic hydrocarbon group is included. Further, it includes both a saturated hydrocarbon group and an unsaturated hydrocarbon group, but the unsaturated hydrocarbon group excludes a group containing an allene structure of C═C═C. Examples of the linear or branched chain hydrocarbon group include a saturated chain hydrocarbon group, a linear alkyl group having 1 or more carbon atoms, a branched alkyl group having 3 or more carbon atoms, and an unsaturated group. A straight chain alkenyl group having 2 or more carbon atoms, a branched alkenyl group having 3 or more carbon atoms, a linear alkynyl group having 3 or more carbon atoms, or a branched alkynyl group having 4 or more carbon atoms. And a linear alkadienyl group having 4 or more carbon atoms and a branched alkadienyl group having 5 or more carbon atoms. Examples of the monocyclic hydrocarbon group include a saturated monocyclic hydrocarbon group having no side chain having 3 or more carbon atoms, a cycloalkyl group having side chains having 4 or more carbon atoms, A saturated monocyclic hydrocarbon group having no side chain with 4 or more carbon atoms, a cycloalkynyl group having a side chain with 5 or more carbon atoms, or a cycloalkadi with no side chain having 5 or more carbon atoms Examples thereof include an enyl group and a cycloalkadienyl group having a side chain having 6 or more carbon atoms in total. The unsaturated monocyclic or polycyclic hydrocarbon group includes aromatic hydrocarbon groups such as phenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group, 9-anthryl group, etc. An aromatic group having no chain, an aromatic group having a side chain having a total carbon number of 7 or more, a phenylphenyl group having 12 carbon atoms and a side chain having a total carbon number of 13 or more, which are also hydrocarbon groups having a ring assembly structure Examples of the phenylphenyl group are as follows. The polycyclic hydrocarbon group includes a condensed cyclic hydrocarbon group having no side chain having 6 or more carbon atoms, a condensed cyclic hydrocarbon group having a side chain having 7 or more total carbon atoms, and a side having 7 or more carbon atoms. Cross-linked cyclic hydrocarbon group having no chain, cross-linked cyclic hydrocarbon group having a side chain having 8 or more carbon atoms, spiro hydrocarbon group having no side chain having 9 or more carbon atoms, side chain having 10 or more carbon atoms Examples of the spiro hydrocarbon group are as follows. In addition, in the condensed cyclic hydrocarbon group having no side chain, when one of the condensed rings is a benzene ring, examples in which the total number of carbon atoms is 9 or more can be mentioned. In the condensed cyclic hydrocarbon group, when one of the condensed rings is a benzene ring, one having a total carbon number of 10 or more can be exemplified. The hydrocarbon group having a ring assembly structure includes a cycloalkyl cycloalkyl group having no side chain having 6 or more carbon atoms, a cycloalkyl cycloalkyl group having a side chain having 7 or more carbon atoms, and a side chain having 6 or more carbon atoms. Examples thereof include a cycloalkylidenecycloalkyl group having no carbon atoms and a cycloalkylidenecycloalkyl group having a side chain having a total carbon number of 7 or more. In these cyclic hydrocarbons, having a side chain means that a chain hydrocarbon group is substituted on the ring. Examples of the chain hydrocarbon group substituted by the cyclic hydrocarbon group described above include a linear alkyl group substituted with an aromatic group having no side chain having a total carbon number of 7 or more, and a side chain having a total carbon number of 8 or more. A linear alkyl group substituted with a certain aromatic group, a branched alkyl group substituted with an aromatic group having no side chain having a total carbon number of 9 or more, and an aromatic group having a side chain having a total number of carbon atoms of 10 or more. A substituted branched alkyl group, a linear alkenyl group substituted with an aromatic group having no total side chain of 8 or more carbon atoms, and a straight chain substituted with an aromatic group having a side chain total number of 9 or more carbon atoms Alkenyl group, branched alkenyl group substituted with an aromatic group having 9 or more carbon atoms and no side chain, branched alkenyl group substituted with an aromatic group having 10 or more carbon atoms and a side chain, total carbon A straight-chain alkynyl group substituted with an aromatic group having no side chain of several 8 or more, a side chain having 9 or more carbon atoms in total A linear alkynyl group substituted with an aromatic group, a branched alkynyl group substituted with an aromatic group having no total side chain of 10 or more carbon atoms, and an aromatic group having a side chain with a total number of carbon atoms of 11 or more. A substituted branched alkynyl group, a linear alkadienyl group substituted with an aromatic group having no total side chain of 10 or more carbon atoms, a straight chain substituted with an aromatic group having a side chain having a total number of carbon atoms of 11 or more -Like alkadienyl group, branched alkadienyl group substituted with aromatic group having 11 or more carbon atoms and no side chain, branched alkadienyl group substituted with aromatic group having 12 or more carbon atoms in side chain, total carbon A linear alkyl group substituted with a cycloalkyl group having no side chain of 4 or more, a linear alkyl group substituted with a cycloalkyl group having a side chain of 5 or more carbon atoms, a total of 6 or more carbon atoms Substituted with cycloalkyl group without side chain A branched alkyl group, a branched alkyl group substituted with a cycloalkyl group having a side chain having a total carbon number of 7 or more, a linear alkenyl group substituted with a cycloalkyl group having no total side chain of 5 or more carbon atoms, Linear alkenyl group substituted with a cycloalkyl group having a side chain with a total carbon number of 6 or more, branched alkenyl group substituted with a cycloalkyl group with a side chain with a total number of carbon atoms of 6 or more, total carbon number of 7 or more A branched alkenyl group substituted with a cycloalkyl group having a side chain, a linear alkynyl group substituted with a cycloalkyl group having no total side chain of 5 or more carbon atoms, or a side chain having a total number of carbon atoms of 6 or more Substituted with a straight chain alkynyl group substituted with a cycloalkyl group, a branched alkynyl group substituted with a cycloalkyl group having no total side chain of 7 or more carbon atoms, or a cycloalkyl group having a side chain with a total number of carbon atoms of 8 or more Branch Illustrative examples include linear alkynyl groups, branched alkadienyl groups substituted with a cycloalkyl group having 8 or more carbon atoms and no side chain, and branched alkadienyl groups substituted with a cycloalkyl group having 9 or more carbon atoms and a side chain. can do.
[0028]
In the following, an aromatic group having no side chain, an aromatic group having a side chain, and a phenylphenyl group or a phenylphenyl group having a side chain are collectively referred to as an aryl group. The linear or branched alkyl group thus formed is called an aralkyl group. As for other cyclic hydrocarbon groups, unless otherwise specified, when referring to those having no side chain on the ring, names such as cycloalkyl groups are simply used. As for the chain hydrocarbon group, when referring to a straight chain and a branched chain together, a name such as an alkyl group is simply used.
[0029]
In the hydrocarbon group, when —CH ₂ — is replaced by a carbonyl group, a sulfonyl group, —O— or —S—, a structure of ketone, sulfone, ether or thioether is introduced, respectively, and —CH _{2 of} —CH ₃ When-is replaced with a carbonyl group, -O- or -S-, respectively, a formyl group (aldehyde), a hydroxyl group or a mercapto group is substituted, or when terminal = CH ₂ is replaced with = O or = S, a ketone or a thioketone And when CH of —CH ₂ — is changed to N, it is —NH—, and when CH of —CH— is changed to N, it is> N— When CH = CH-- changes to N, it becomes = N-, and when -CH ₃ CH at the terminal changes to N, -NH ₂ is introduced, and CH-CH of = CH ₂ changes to N When it changes, it becomes = NH. In addition, when C—H of —CH ₃ , —CH ₂ —, ═CH—, ≡CH or> CH— is replaced by C-halogen, a halogen atom is substituted on the carbon. In addition, when the substitution to —O—, —S—, or N in the carbon chain corresponds to oxa substitution, thia substitution, or aza substitution for the hydrocarbon group, respectively, for example, occurs at the skeleton carbon of the ring of the hydrocarbon ring. The hydrocarbon ring is converted into an oxygen-containing heterocycle, a sulfur-containing heterocycle and a nitrogen-containing heterocycle, respectively. In the hydrocarbon group, CH _{2 and} C—H may be independently replaced. In addition, after the above replacement, CH ₂ or C—H still remains on the carbon. Further replacements may be made. Furthermore, by the above replacement, —CH ₂ —CH ₃ is converted to —CO—O—H; a carboxylic acid structure, and the like.
[0030]
In this specification, the halogen atom refers to a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom, and a fluorine atom, a chlorine atom, or a bromine atom is preferable.
Therefore, as the hydrocarbon group, any of a hydrocarbon group having a ring structure such as a chain hydrocarbon group and a cyclic hydrocarbon group can be selected. For example, a straight chain or branched chain which is a saturated chain hydrocarbon group Saturated cyclic carbonization such as linear alkyl group, unsaturated chain hydrocarbon group linear or branched alkenyl group, linear or branched alkynyl group, linear or branched alkadienyl group, etc. Cycloalkenyl groups that are hydrogen groups, cycloalkenyl groups that are unsaturated cyclic hydrocarbon groups, cycloalkynyl groups, cycloalkadienyl groups, aryl groups that are aromatic hydrocarbon groups, aralkyl groups, arylalkenyl groups, etc. Is mentioned.
[0031]
More specifically, examples of the linear or branched alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, a 1-methylpropyl group, a pentyl group, a 1-methylbutyl group, a hexyl group, 1-methylpentyl group, heptyl group, 1-methylhexyl group, 1-ethylpentyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, undecyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, 2-methylpropyl group, 2- Methylbutyl group, 3-methylbutyl group, 2-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 4-methylpentyl group, methylhexyl group, methylheptyl group, methyloctyl group, methylnonyl group, 1,1-dimethylethyl group, 1 , 1-dimethylpropyl group, 2,6-dimethylheptyl group, 3,7-dimethyloctyl group, 2-ethyl Examples of the cycloalkyl group such as a cyclohexyl group include a cyclopentylmethyl group and a cyclohexylmethyl group. Examples of the cycloalkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a methylcyclopentyl group, a cyclohexyl group, a methylcyclohexyl group, and a cycloheptyl group. Examples of the bicycloalkyl group such as a cyclooctyl group include a norbornyl group, a bicyclo [2.2.2] octyl group, an adamantyl group, and the like. Examples of the linear or branched alkenyl group include a vinyl group, an allyl group, a crotyl group (2-butenyl group), an isopropenyl group (1-methylvinyl group), and the like as a cycloalkenyl group or a cycloalkadienyl group. Includes a cyclopentenyl group, a cyclopentadienyl group, a cyclohexenyl group, a cyclohexanedienyl group, and the like. Examples of the linear or branched alkynyl group include an ethynyl group, a propynyl group, and a butynyl group. Examples of the aryl group include a phenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group, 2-phenylphenyl group, 3-phenylphenyl group, 4-phenylphenyl group, 9-anthryl group, methylphenyl group, dimethylphenyl group, Examples thereof include a trimethylphenyl group, an ethylphenyl group, a methylethylphenyl group, a diethylphenyl group, a propylphenyl group, and a butylphenyl group. Examples of aralkyl groups include benzyl, 1-naphthylmethyl, 2-naphthylmethyl, phenethyl (2-phenylethyl), 1-phenylethyl, phenylpropyl, phenylbutyl, phenylpentyl, phenyl Examples include hexyl group, methylbenzyl group, methylphenethyl group, dimethylbenzyl group, dimethylphenethyl group, trimethylbenzyl group, ethylbenzyl group, and diethylbenzyl group. Examples of the arylalkenyl group include a styryl group, a methyl styryl group, an ethyl styryl group, a dimethyl styryl group, and a 3-phenyl-2-propenyl group.
[0032]
Examples of the group in which CH ₂ in the hydrocarbon group is replaced with a carbonyl group, a sulfonyl group, O or S, or C—H with N or C-halogen include ketone, aldehyde, carboxylic acid, sulfone, ether, thioether , Groups containing one or more structures such as amine, alcohol, thiol, halogen, and heterocycle (eg, oxygen-containing heterocycle, sulfur-containing heterocycle, and nitrogen-containing heterocycle). The oxygen-containing heterocycle, sulfur-containing heterocycle, and nitrogen-containing heterocycle mean those in which the carbon of the ring skeleton of the cyclic hydrocarbon group is replaced by oxygen, sulfur, or nitrogen, respectively. May be a heterocycle having two or more. Examples of the hydrocarbon group having the substitution include acetylmethyl group and acetylphenyl group having a ketone structure; methanesulfonylmethyl group having a sulfone structure; methoxymethyl group, methoxyethyl group, ethoxyethyl group, and methoxypropyl group having an ether structure. , Butoxyethyl group, ethoxyethoxyethyl group, methoxyphenyl group, dimethoxyphenyl group, phenoxymethyl group; thioether structure methylthiomethyl group, methylthiophenyl group; amine structure aminomethyl group, 2-aminoethyl group, 2-aminopropyl Group, 3-aminopropyl group, 2,3-diaminopropyl group, 2-aminobutyl group, 3-aminobutyl group, 4-aminobutyl group, 2,3-diaminobutyl group, 2,4-diaminobutyl group, 3,4-diaminobutyl group, 2,3,4-tria Nobutyl group, methylaminomethyl group, dimethylaminomethyl group, methylaminoethyl group, propylaminomethyl group, cyclopentylaminomethyl group, aminophenyl group, diaminophenyl group, aminomethylphenyl group; tetrahydrofuranyl group of oxygen-containing heterocycle, Tetrahydropyranyl group, morpholylethyl group; oxygen-containing heteroaromatic furyl group, furfuryl group, benzofuryl group, benzofurfuryl group; sulfur-containing heteroaromatic thienyl group; nitrogen-containing heteroaromatic pyrrolyl group, imidazolyl group, oxazolyl Group, thiadiazolyl group, pyridyl group, pyrimidinyl group, pyridazinyl group, pyrazinyl group, tetrazinyl group, quinolyl group, isoquinolyl group, pyridylmethyl group; 2-hydroxyethyl group, 2-hydroxypropyl group, 3-hydroxy group of alcohol structure Propyl group, 2,3-dihydroxypropyl group, 2-hydroxybutyl group, 3-hydroxybutyl group, 4-hydroxybutyl group, 2,3-dihydroxybutyl group, 2,4-dihydroxybutyl group, 3,4-dihydroxy Butyl group, 2,3,4-trihydroxybutyl group, hydroxyphenyl group, dihydroxyphenyl group, hydroxymethylphenyl group, hydroxyethylphenyl group; thiol structure 2-mercaptoethyl group, 2-mercaptopropyl group, 3-mercapto Propyl group, 2,3-dimercaptopropyl group, 2-mercaptobutyl group, 3-mercaptobutyl group, 4-mercaptobutyl group, mercaptophenyl group; 2-chloroethyl group and 2-chloropropyl which are halogenated hydrocarbon groups Group, 3-chloropropyl group, 2-chlorobutyl Group, 3-chlorobutyl group, 4-chlorobutyl group, fluorophenyl group, chlorophenyl group, bromophenyl group, difluorophenyl group, dichlorophenyl group, dibromophenyl group, chlorofluorophenyl group, trifluorophenyl group, trichlorophenyl group, fluoromethyl Phenyl group, trifluoromethylphenyl group; 2-amino-3-hydroxypropyl group, 3-amino-2-hydroxypropyl group, 2-amino-3-hydroxybutyl group, 3-amino- having an amine structure and an alcohol structure 2-hydroxybutyl group, 2-amino-4-hydroxybutyl group, 4-amino-2-hydroxybutyl group, 3-amino-4-hydroxybutyl group, 4-amino-3-hydroxybutyl group, 2,4- Diamino-3-hydroxybutyl group, 3-amino -2,4-dihydroxybutyl group, 2,3-diamino-4-hydroxybutyl group, 4-amino-2,3-dihydroxybutyl group, 3,4-diamino-2-hydroxybutyl group, 2-amino-3 , 4-dihydroxybutyl group, aminohydroxyphenyl group; fluorohydroxyphenyl group and chlorohydroxyphenyl group which are hydrocarbon groups substituted with halogen and hydroxyl group; carboxyphenyl group having a carboxylic structure.
[0033]
The asymmetric divalent group represented by R ¹ and R ² is not particularly limited, and examples thereof include norbornane-2-ylidene and 2-norbornene-5-ylidene. Examples of the carbonyl compound represented by the formula (I) include benzaldehyde, m-phenoxybenzaldehyde, p-methylbenzaldehyde, o-chlorobenzaldehyde, m-chlorobenzaldehyde, p-chlorobenzaldehyde, m-nitrobenzaldehyde, 3,4 -Aromatic aldehydes such as methylenedioxybenzaldehyde, 2,3-methylenedioxybenzaldehyde, phenylacetaldehyde, furfural; Aliphatic aldehydes such as acetaldehyde, butyraldehyde, isobutyraldehyde, valeraldehyde, cyclohexanealdehyde; ethyl methyl ketone, butyl methyl Ketone, methyl propyl ketone, isopropyl methyl ketone, methyl pentyl ketone, methyl (2-methylpropyl) ketone, methyl ( -Saturated aliphatic ketones such as methyl butyl) ketone; unsaturated aliphatic ketones such as methyl (2-propenyl) ketone and (3-butenyl) methyl ketone; alkyl (haloalkyl) ketones such as (3-chloropropyl) methyl ketone; (Alkoxycarbonylamino) -3- (protected amino) aldehyde such as cyclohexylpropionaldehyde; alkylthioaliphatic aldehyde such as 3-methylthiopropionaldehyde.
[0034]
In order to convert the aldehyde or ketone into the optically active cyanohydrin, hydrogen cyanide is used as a raw material. As a method for supplying hydrogen cyanide, either a liquid supply method or a gas supply method can be employed. Further, not only hydrogen cyanide but also hydrocyanic acid (ie, hydrocyanic acid) which is an aqueous solution of hydrogen cyanide can be used in the same manner. Furthermore, any substance that generates cyanide ions (CN ⁻ ) when added to the reaction system can be used. Examples thereof include salts of hydrocyanic acid such as sodium cyanide and potassium cyanide, and cyanohydrins such as acetone cyanohydrin. Is mentioned.
[0035]
The hydroxynitrile lyase enzyme used in the present invention can be prepared by extraction from a plant tissue containing the enzyme or extraction from a culture in which a genetically modified organism into which the enzyme gene has been incorporated is cultured. Extraction may be carried out by a conventional method, and even if the preparation contains components other than hydroxynitrile lyase, it does not need to be particularly purified as long as the reaction is not adversely affected. An immobilized enzyme is obtained by immobilizing the thus prepared hydroxynitrile lyase enzyme.
[0036]
The moisture content of the immobilized enzyme can be determined from the weight ratio between the immobilized carrier in the dry state and the immobilized enzyme after enzyme immobilization, but it can also be measured using a Karl Fischer moisture meter. Can do.
[0037]
The usage amount of the immobilized enzyme and the substrate and the reaction temperature are appropriately determined according to the substrate used. Usually, the amount of the immobilized enzyme used is 1-1000 units, preferably 10-500 units, with respect to 50 mmol of the substrate carbonyl compound. In the case of a carbonyl compound, the concentration of the substrate is usually set in the range of 0.1 to 10 mol / L, and hydrogen cyanide is used in a concentration of 1 to 5 times mol, preferably 1.1 to 3 times mol of the carbonyl compound used. Added. In this reaction, the enzyme activity and the reaction rate vary depending on the substrate concentration, so that it is appropriately determined according to the type of the carbonyl compound used. The reaction time is not limited to a suitable time until the conversion rate of the carbonyl compound as a substrate reaches 80% or more, preferably 90% or more. The reaction temperature may be a temperature at which the activity of the enzyme is sufficiently exerted, and is usually 0 to 40 ° C, preferably 4 to 30 ° C.
[0038]
Products such as optically active cyanohydrin produced by the method of the present invention can be measured and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) or the like, and if necessary, ordinary products such as extraction, distillation under reduced pressure, and column separation can be used. It can be separated and purified by means, and a stabilizer may be added when stored for a long time.
[0039]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
(Preparation Example 1) Preparation of (R) -hydroxynitrile lyase (1) 200 ml of acetone was mixed with 100 g of almond seed pulverized product and stirred for 2 hours, followed by filtration to recover a solid content. 600 g of water was added to the dried solid and adjusted to pH 7.5 with aqueous ammonia, followed by stirring and mixing overnight. The slurry was then centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was adjusted to pH 5.5 and then centrifuged to recover a liquid from which insolubles had been removed.
[0040]
(2) The activity of the (R) -hydroxynitrile lyase enzyme solution prepared in (1) was measured. The enzyme activity was calculated by measuring the rate of change in absorbance at 249.6 nm using DL-mandelonitrile as a substrate and the rate at which the substrate was decomposed by the enzyme to produce benzaldehyde. Here, one unit (U; unit) was defined as the activity of producing 1 μmol of benzaldehyde in one minute. When the enzyme activity of the enzyme solution prepared in (1) was measured by this method, it was found that 25,000 units of enzyme could be recovered with an activity of 60.57 U / ml.
[0041]
(Preparation Example 2) Preparation of (S) -hydroxynitrile lyase (1) (S) -Hydroxynitrile lyase is obtained by genetic recombination of cassava-derived genes cloned into yeast using Saccharomyces cerevisiae as a host. The recombinant yeast thus obtained was prepared by culturing. A solution obtained by culturing the genetically modified yeast in 1 L of YPD medium (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%) for 24 hours, crushing the collected cells and removing insolubles. It was collected.
(2) The activity of the (S) -hydroxynitrile lyase enzyme solution prepared in (1) above was measured by the same method as in Preparation Example 1 (2). As a result, it was found that the activity was 40 U / ml, and 9000 units The enzyme was recovered.
[0042]
(Preparation Example 3) Preparation of Immobilized (R) -Hydroxynitrile Lyase The (R) -hydroxynitrile lyase enzyme solution prepared by the method of Preparation Example 1 was subjected to ammonium sulfate precipitation, the enzyme was concentrated, and 1000 U / ml enzyme solution was prepared. Was prepared. 1 g of the immobilization carrier (porous silica gel, microbead silicagel 300A, manufactured by Fuji Silysia Chemical Co., Ltd.) was mixed with 1 ml of the enzyme solution. This was used for the synthesis reaction as it was. The water content of the immobilized enzyme was 50% by weight.
[0043]
(Preparation Example 4) Preparation of Immobilized (S) -Hydroxynitrile Lyase In the (S) -hydroxynitrile lyase enzyme solution prepared by the method of Preparation Example 2, the same immobilization carrier as in Preparation Example 3 with respect to 300 units of enzyme activity. 1 g was added and gently mixed overnight. Subsequently, the immobilized enzyme was recovered by filtration and used for the subsequent reaction. The moisture content of the immobilized enzyme thus prepared was measured with a Karl Fischer moisture meter and found to have a moisture content of 50% by weight.
[0044]
(Example 1) Synthesis of (R) -cyanohydrin 6 ml of (R) -hydroxynitrile lyase enzyme solution 1000 U / ml derived from almonds and 6 g of porous silica gel microbead silicagel 300A (manufactured by Fuji Silysia Chemical) were mixed, and the immobilized enzyme was mixed. Prepared. In order to investigate the relationship between the amount of water and the reaction efficiency, the immobilized enzyme prepared by the same operation was dried under reduced pressure for 3 hours with an evaporator, and then the water content was adjusted by adding 10 mM phosphate buffer (pH 5.5). Created something. In condition 4 shown in Table 1, the enzyme concentration was diluted by half with 10 mM phosphate buffer (pH 5.5), and the enzyme amount was the same, but the enzyme solution was doubled. An immobilized enzyme immobilized on an immobilization carrier twice as much as other conditions was used.
[0045]
The water content in the untreated t-butyl methyl ether (TBME) used for the study was 0.03% by weight, and the water content saturated with 10 mM phosphate buffer (pH 5.5) was 1.34% by weight. Met. Conditions for saturating the solvent with the buffer and conditions for not saturating the solvent were set to change the water content of the entire reaction system.
[0046]
Under any condition, the concentrations of the substrates 2-chlorobenzaldehyde (o-chlorobenzaldehyde) and hydrocyanic acid were fixed at 1M and 1.5M, respectively. 600 units of the immobilized enzyme prepared above were put in a 10 ml reaction vessel, respectively, and then 4.143 ml of solvent and 0.292 ml of hydrocyanic acid were added. To this, the reaction was started by adding 0.565 ml of 2-chlorobenzaldehyde. The reaction was carried out by gently stirring the reaction vessel with a bottle roller at 25 ° C. The conditions and results are shown in Table 1.
[0047]
[Table 1]

[0048]
From this result, even when a solvent saturated with a buffer solution was used, the reaction efficiency was low, and a high reaction efficiency was obtained in a reaction system containing excess water relative to the saturated water content of the solvent. Under conditions 3 and 4, the reaction solution phase was not separated into two phases but formed as a single organic solvent phase, although a large excess of water was added compared to the amount of water that the reaction solvent could contain. It was.
[0049]
(Example 2)
Since the amount of water retained in the immobilization carrier used in Preparation Example 1 was almost 1 times the weight, the enzyme amount was the same, and the conditions for changing the moisture content in the reaction system were set by changing the amount of carrier. The relationship between water content and reaction efficiency was investigated. The immobilized enzyme prepared by the method of Preparation Example 3 was dried under reduced pressure, and the immobilized enzyme was prepared by adding 10 mM phosphate buffer (pH 5.5) to the water from which moisture was removed. The relationship with reaction efficiency was investigated.
[0050]
600 units of (R) -hydroxynitrile lyase were immobilized, and immobilized enzymes with different water contents were prepared. On the other hand, hydrocyanic acid was dissolved in t-butyl methyl ether, and a saturated amount of 10 mM phosphate buffer (pH 5.5) was added. Next, after adding the raw material solution to the immobilized enzyme, 2-chlorobenzaldehyde was added. The organic phase of this reaction system was 5 ml, the concentration of hydrocyanic acid was 1.5M, and the concentration of 2-chlorobenzaldehyde was 1M. This mixture was reacted by gently mixing at 25 ° C., and the conversion rate of 2-chlorobenzaldehyde to (R) -2-chloromandelonitrile after 5 hours was measured. The result shown in FIG. Obtained. As a result, it was found that the higher the water content of the immobilized enzyme, the higher the reaction efficiency.
[0051]
(Example 3)
40 ml of 0.2 M citrate buffer (pH 7) was added to a solution obtained by adding 41 g of hydrocyanic acid to 610 g of t-butyl methyl ether, and the mixture was stirred and allowed to stand, and then the organic phase was recovered. To this organic phase, the immobilized enzyme (60,000 units) prepared by the method of Preparation Example 4 was added. The water content of the immobilized enzyme at this time was 50% by weight. Next, after adding 106 g of benzaldehyde, the reaction mixture was stirred to initiate the reaction. The reaction temperature was set at 20 ° C. Analysis of the reaction solution by HPLC revealed that 126 g of (S) -mandelonitrile was formed after 1 hour. At this time, the conversion rate of aldehyde was 93%, and the optical purity of (S) -mandelonitrile was 99% ee. Then, after the reaction was completed, the immobilized enzyme was recovered and the reaction was repeated under the same conditions. As a result, (S) -Man having an average conversion rate of 94.2% and an optical purity of 99% ee or more in 16 reactions. Delonitrile could be synthesized. From this result, it was found that the optically active cyanohydrin can be synthesized very efficiently and stably by carrying out the reaction with the immobilized enzyme holding water.
[0052]
【The invention's effect】
According to the present invention, the target product can be synthesized very efficiently and stably.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between the water content of immobilized enzyme and reaction efficiency.

Claims

After preparing a reaction solution phase containing hydrogen cyanide in an organic solvent that is substantially immiscible with water, the reaction solution phase being a homogeneous system that is saturated with water or an aqueous buffer but does not phase separate,
A reaction system comprising an immobilized enzyme having a water content of 10% by weight or more and immobilizing hydroxynitrile lyase, an enzyme having an activity of synthesizing cyanohydrin from hydrogen cyanide and a carbonyl compound, a carbonyl compound, and the reaction solution phase. Build and
A method for producing an optically active cyanohydrin, comprising performing a reaction for converting the carbonyl compound into a corresponding optically active cyanohydrin in the reaction system.

The method according to claim 1 , wherein a carrier having an ability to retain moisture is used as the carrier for the immobilized enzyme.

The method according to claim 1 or 2 , wherein the reaction is performed under a condition in which a saturated amount of water is contained in the reaction solution phase so that water does not migrate from the immobilized enzyme to the reaction solution phase during the reaction.

The reaction solution phase is prepared by dissolving hydrogen cyanide in an organic solvent substantially immiscible with water and then saturating the obtained organic solvent containing hydrogen cyanide with water or an aqueous buffer. The method according to any one of claims 1 to 3.