JP4430374B2

JP4430374B2 - 骨芽細胞の細胞死阻害剤

Info

Publication number: JP4430374B2
Application number: JP2003363891A
Authority: JP
Inventors: 幸雄米田; 栄一檜井; 展明森口; 仁柴田
Original assignee: Taiko Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiko Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-10-23
Filing date: 2003-10-23
Publication date: 2010-03-10
Anticipated expiration: 2023-10-23
Also published as: JP2005126371A

Description

本発明は、骨芽細胞の細胞死阻害剤に関する。

骨代謝性疾患の１つである骨粗鬆症は、現在日本では約５００万〜８００万人もの骨粗鬆症患者がいるといわれ、年々増え続けている。この疾患は、周知のとおりカルシウム不足が進んで骨密度が減少し、骨がスカスカになって折れやすくなる病気である。すなわち、骨には、古くなった骨を破壊すべく骨のカルシウムを溶解する破骨細胞と、破壊された骨を修復して再生する骨芽細胞の２種類がある。両者のバランスが崩れ、破骨細胞による骨の溶解（骨吸収）が骨芽細胞による骨の再生を上回ることにより、骨のカルシウム不足が進行して骨密度が減少し、そして骨粗鬆症などの骨代謝性疾患が引き起こされる。

これに対し、腸管からカルシウム吸収を増加させ、骨形成を促進する活性型ビタミンＤ３やカルシトリオール、骨吸収を抑制し骨形成を促進するカルシトニンやエルカトニン、あるいは骨吸収を抑制しエストロゲンのカルシトニン分泌を促進するイプリフラボンなどの治療用薬剤が用いられ、ある程度の成果が得られている（例えば特許文献１）。しかしながら、骨粗鬆症の国内罹患者数が５００万〜８００万人という非常に高い数字や、この疾患が患者を、特に老人を寝たきり、延いては痴呆にしてしまう原因になることから事態は深刻であり、より一層効果的な予防手段あるいは治療手段が望まれていた。
特開平７−１７８５４号公報

ところで、骨形成の過程の途中で５０〜７０％の骨芽細胞は死滅し、その数が減少すると言われている。また、その原因の１つは、体内で産生された過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）であると言われている。すなわち、体内で産生された過酸化水素に骨芽細胞が曝露されると、その骨芽細胞は細胞死の方向に誘導されると報告されている。骨代謝において崩れたバランスを立て直す（あるいはバランスが崩れないように予防する）ことに鑑み、本発明者は骨芽細胞の死滅に着目した。すなわち、過酸化水素による骨芽細胞の死滅を最小限に食い止めてその絶対数を高いレベルで維持し、これによって骨形成優勢をもたらすことで骨代謝性疾患を予防あるいは治療することが効果的であろうと考え、そのような作用を持つ（過酸化水素に曝露されても骨芽細胞の細胞死を回避（予防）し得るような）化合物を種々試みた。いくつかの試行錯誤を重ねた結果、本発明者はついにある種の化合物が骨芽細胞の死滅を抑制することを突き止め、そして本発明に至った。

本発明の、骨芽細胞の細胞死阻害剤は、下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする。

［ただし、上記一般式におけるＲ¹ は炭素数１〜２のアルキル基、Ｒ ² は炭素数１〜３のアルキル基であって、Ｒ¹とＲ²は同一であっても異なっていてもよい。］

本発明によれば、骨形成の過程の途中で５０〜７０％が無くなると言われる骨芽細胞の死滅（骨芽細胞数の減少）を最小限に食い止めることができるので、全体的には骨形成優勢となる。別のメカニズムを持つ他の薬剤（例えば、破骨細胞の活性を抑制する薬剤）と併用することにより、より一層骨形成優勢となる。

上記一般式（Ｉ）におけるＲ¹ は、骨芽細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で、メチル基であることが好ましい。またＲ² は、骨芽細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で、メチル基あるいはエチル基であることが好ましい。骨芽細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で、２−メトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＭＰ」ともいう）、２−メトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＥＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＭＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＥＰ」ともいう）が好ましく、その中でも２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰ、及び２Ｅ４ＭＰが最も好ましい。なお、上記一般式（Ｉ）で示される化合物は１種類を単独で使用しても良いし、２種以上を併用することもできる。

これら２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰはいずれも、木クレオソートの構成成分である（Ogata N., Baba T.Analysis of beechwood creosote by gas chromatographymass spectrometry and high-performance liquid chromatography. Res Commun Chem Pathol Pharmacol ６６，４１１−４２３（１９８９）,ブナ木クレオソートのガスクロマトグラフィー・質量分析法および高速液体クロマトグラフィー法による分析）。緒方規男（N. Ogata）他著ファーマコロジー（Pharmacology）、４６巻、（１９９３）、第１７３頁には、クレオソートが腸管運動抑制に基づく止瀉作用を有する旨記載されている。また、医薬品製造指針（日本公定書協会編）１９８８年版第２４０頁の胃腸薬製造承認基準において、Ｖ欄の止瀉薬の区分中１項の殺菌剤として収載されている。また、伊藤宏著「薬理学」（（株）蛍光堂、１９８３年１月５日改訂第６版発行）第４１６頁にも、クレオソートは腸内防腐に用いるほか、吸入適応により去痰作用を示す旨記載され、日本薬局方でも、去痰、腸内異常醗酵、食中毒などに用いる旨記載されている。ザ・ユナイテッド・ステーツ・ディスペンサトリー（The United States Dispensatory）、２７th ed.（１９７３）、第３５５頁にも、クレオソートは、外用として殺菌剤、内用として去痰剤として使用される旨記載されている。

塩の形態
また、本発明、骨芽細胞の細胞死阻害剤は、塩基を用いた塩の形態とすることも可能である。用いる塩としては、薬学的に（薬剤学的に）許容し得る塩であれば特に限定するものではなく、例えば、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、リチウムなどの金属塩、アミン類（モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン）との塩、アンモニウム塩などが挙げられる。

使用量
本発明の、骨芽細胞の細胞死阻害剤の投与量（使用量）については、対象となる動物の種類あるいは性別、年齢、症状の程度によって変わるので一概にはいえないが、ヒトにおける経口投与あるいは直腸内投与（坐剤）の場合は、およそのところ１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．１〜１０ｍｇであり、０．５〜５ｍｇであることが好ましく、また注射剤としての投与の場合には、１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．０５〜５ｍｇであり、０．２５〜２．５ｍｇであることが好ましい。これらの１日量を１回でまたは分２〜分４、あるいはそれ以上の回数に分けて投与することができる。

剤型
本発明の、骨芽細胞の細胞死阻害剤は、医療用薬剤における一般的な形態で以て使用される。一般的な形態としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、顆粒剤、トローチ剤、チュアブル剤、内服液剤や、注射剤（血管内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与など）、あるいは坐剤などが挙げられる。錠剤、顆粒剤、散剤の形態に調製する際には、従来公知の担体を広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、澱粉、結晶セルロース等の賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ゼラチン、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等の結合剤、例えば、澱粉、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等の崩壊剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸などの滑沢剤が使用できる。錠剤には、必要に応じて、通常の剤皮を施すこともでき、例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠等とすることができ、さらに二層錠、多層錠としてもよい。また、顆粒剤や散剤も通常の剤皮を施すことができる。

本発明の一実施例を以下に説明するが、本発明はこれによって限定されない。

骨芽細胞の培養（図１および図２参照）
従来公知の方法によって骨芽細胞を培養した。すなわち、ラットの新生仔（１−２日齢）から摘出した頭蓋骨を０．２５％トリプシン液および０．１％コラーゲナーゼ液を含有するハンクス液中に投入した（３７℃で１０分を５回）。ついで、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むα−ＭＥＭ培養液で培養し、１×１０^４個／ｃｍ^２に調整した。次の日、１０％ＦＣＳ、アスコルビン酸およびβ−グリセロリン酸を含有するα−ＭＥＭ培養液で培養した。培養液は１日おきに交換し、２８日後に骨芽細胞の数を測定した（１well中）。また、骨芽細胞の生育を確認するために、上記２８日の間のカルシウム濃度を計測した（１well中）（図３参照）。図３に示すように、経時的にカルシウムの量（１well中）が増えていることに併せて、骨芽細胞の分化の指標としてのアルカリフォスファターゼ活性も経時的に増加していることから、上記の培養方法で骨芽細胞が育っていることが分かる。

過酸化水素による骨芽細胞の影響
過酸化水素の濃度を変えた状態で骨芽細胞に曝露し、６時間後の細胞の生存率を測定した（１well中）。その結果、図４に示すように３００μＭを超えたくらいから細胞死が目立ち、５００μＭおよび１０００μＭで著しい細胞死が確認された。これに従い、今後の実験として、細胞死をもたらす過酸化水素の濃度を５００μＭとした。

実施例１〜３および比較例１〜５
以下の実施例における２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰなどの使用量を１ｍＭとした根拠を図５に示す。すなわち、過酸化水素によって細胞死を誘導した状況下において、２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰなどの使用量を１ｍＭとした場合に、図５に示すように細胞死阻害作用（骨芽細胞生存率）が高いレベルで認められた。

実施例１（過酸化水素による細胞死の誘導と２Ｍ４ＭＰによる細胞死阻害）
図６の（ａ）は、無処理の骨芽細胞（７日後）の生育状態を顕微鏡で見て書き写した略示説明図である。（ｂ）は、過酸化水素（５００μＭ）を曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図である（骨芽細胞が死滅すると黒く変色する）。（ｃ）は、２−メトキシ−４−メチルフェノール（１ｍＭ）を曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図であり、（ｄ）は、過酸化水素５００μＭおよび２Ｍ４ＭＰ（東京化成工業（株）製、東京化成１級の２−メトキシ−４−メチルフェノール）１ｍＭを曝露した（同時投与）６時間後の生育状態を示す略示説明図である。

図６（ａ）〜（ｄ）から明らかなように、骨芽細胞の細胞死が過酸化水素によってもたらされている（ｂ）。しかしながら、過酸化水素と２Ｍ４ＭＰを併用した系（ｄ）では、骨芽細胞が生き続けていることから、過酸化水素の細胞死誘導を２Ｍ４ＭＰが阻止したと考えられ、２Ｍ４ＭＰには骨芽細胞の細胞死を防ぐ効果があることを示する。なお、２Ｍ４ＭＰ単独の系（ｃ）では骨芽細胞死を誘導していないので、２Ｍ４ＭＰの毒性は低く問題はない。

実施例２（過酸化水素による細胞死の誘導と２Ｍ４ＥＰによる細胞死阻害）
図７の（ａ）は、無処理の骨芽細胞（７日後）の生育状態を顕微鏡で見て書き写した略示説明図である。（ｂ）は、過酸化水素（５００μＭ）を曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図である（骨芽細胞が死滅すると黒く変色する）。（ｃ）は、２−メトキシ−４−エチルフェノール（１ｍＭ）を曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図であり、（ｄ）は、過酸化水素５００μＭおよび２Ｍ４ＥＰ（東京化成工業（株）製、東京化成１級の２−メトキシ−４−エチルフェノール）の１ｍＭを曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図である。

図７（ａ）〜（ｄ）から明らかなように、骨芽細胞の細胞死が過酸化水素によってもたらされている（ｂ）。しかしながら、過酸化水素と２Ｍ４ＥＰを併用した系（ｄ）では、骨芽細胞が生き続けていることから、過酸化水素の細胞死誘導を２Ｍ４ＥＰが阻止したと考えられ、２Ｍ４ＥＰには骨芽細胞の細胞死を防ぐ効果があることを示する。なお、２Ｍ４ＥＰ単独の系（ｃ）では骨芽細胞死を誘導していないので、２Ｍ４ＥＰの毒性は低く問題はない。

比較例１（疑似骨格化合物グアヤコールの作用）
図８の（ａ）は、無処理の骨芽細胞（７日後）の生育状態を顕微鏡で見て書き写した略示説明図である。（ｂ）は、過酸化水素（５００μＭ）を曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図である（骨芽細胞が死滅すると黒く変色する）。（ｃ）は、グアヤコール（２−メトキシフェノール）（１ｍＭ）を曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図であり、（ｄ）は、過酸化水素（５００μＭ）およびグアヤコール（１ｍＭ）を曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図である。

図８（ａ）〜（ｄ）から明らかなように、骨芽細胞の細胞死が過酸化水素によってもたらされ（ｂ）、その過酸化水素による骨芽細胞の細胞死はグアヤコールで防ぐことが出来なかった（ｄ）。

比較例２〜５（グアヤコール以外の疑似骨格化合物の作用）、及び実施例３（本発明の他の化合物（２Ｅ４ＭＰ）の細胞死阻害作用）
比較例１で使用したグアヤコールを、比較例２としてｏ−クレゾール（２−メチルフェノール）、比較例３としてｐ−クレゾール（４−メチルフェノール）、比較例４としてフェノール、及び比較例５としてチモール（２−イソプロピル−５−メチルフェノール）に変えたという以外は上記比較例１と同様に操作し、過酸化水素による細胞死の誘導に対する抑制作用（阻害作用）を調べた。その結果を、本発明における一般式（Ｉ）に含まれる他の化合物（２−エトキシ−４−メチルフェノール（２Ｅ４ＭＰ、使用量を１ｍＭおよび１００μＭとした）の結果と一緒に図９に記載する。

図９から明らかなように、本発明における一般式（Ｉ）に類似した上記化合物のいずれにも細胞死の抑制作用は認められなかった（２Ｅ４ＭＰを１００μＭ使用した系と比べても明らかである）。

実施例１〜３および比較例１〜５から、骨場細胞の細胞死を防ぐ効果は本発明における化合物の特異的な作用効果であると言える。上記実施例１〜３で使用した本発明の化合物および上記比較例１〜５で使用した比較化合物（疑似骨格化合物）の各々の構造式を下記［表１］にまとめる。

製剤例１（丸剤）
（処方１）
２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ５ｍｇ
カンゾウ２５ｍｇ
グリセリン１０ｍｇ
常水５０ｍｇ
下記処方の各成分を練合し、その丸剤塊を切丸機で分割し、製丸機で成丸し、１丸中に本発明の、骨芽細胞の細胞死阻害剤５ｍｇを含有する丸剤を調製した。

製剤例２（硬カプセル剤）
（処方２）
２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ１０ｍｇ
デンプン２５０ｍｇ
２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとデンプンを混合して混合末とし、硬カプセルに充填して１カプセル中に本発明の、骨芽細胞の細胞死阻害剤１０ｍｇを含有する硬カプセル剤を調製した。

製剤例３（軟カプセル剤）
（処方３）
２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ１０ｍｇ
オリーブ油２００ｍｇ
２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとオリーブ油に溶解して溶液を得、ソフトカプセルに充填して、１カプセル中に本発明の、骨芽細胞の細胞死阻害剤１０ｍｇを含有する軟カプセル剤を調製した。

製剤例４（錠剤）
（処方４）
２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ２０ｍｇ
乳糖２５０ｍｇ
メチルセルロース３ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
カルボキシメチルセルロース１０ｍｇ
上記処方のステアリン酸マグネシウム以外の各成分を混合し、これを水と混練して顆粒とし、この顆粒を乾燥後、ステアリン酸マグネシウムと混合して圧縮成型するか、あるいは上記処方の各成分を混合して直接圧縮成型し、１錠２８５ｍｇの錠剤を調製した。

本発明によれば、骨形成の過程の途中で５０〜７０％が無くなると言われる骨芽細胞の死滅（骨芽細胞数の減少）を最小限に食い止めることができる。単独での使用でも構わないし、別のメカニズムを持つ他の薬剤（例えば、破骨細胞の活性を抑制する薬剤）と併用することができる。

骨芽細胞の培養方法を示した略示説明図である。２８日間の骨芽細胞の培養において、α−ＭＥＭ培養液の交換時期とカルシウム量の測定時期を示したフローチャート図である。２８日間の骨芽細胞の培養において、アルカリフォスファターゼ活性とカルシウム量の増加を示したグラフ図である。過酸化水素の濃度を変えて行った細胞死の状況を示したグラフ図である。過酸化水素によって細胞死を誘導した状況下での２Ｍ４ＭＰと２Ｍ４ＥＰの細胞死阻害作用（骨芽細胞生存率）を示したグラフ図であり、実験的な使用量を１ｍＭとしたことの根拠となったグラフ図である。（ａ）は無処理の骨芽細胞の生育状態を顕微鏡で見て書き写した略示説明図、（ｂ）は過酸化水素を曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図、（ｃ）は２Ｍ４ＭＰを曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図、（ｄ）は過酸化水素および２Ｍ４ＭＰを曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図である。（ａ）は無処理の骨芽細胞の生育状態を顕微鏡で見て書き写した略示説明図、（ｂ）は過酸化水素を曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図、（ｃ）は２Ｍ４ＥＰを曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図、（ｄ）は過酸化水素および２Ｍ４ＭＰを曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図である。（ａ）は無処理の骨芽細胞の生育状態を顕微鏡で見て書き写した略示説明図、（ｂ）は過酸化水素を曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図、（ｃ）はグアヤコールを曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図、（ｄ）は過酸化水素およびグアヤコールを曝露した６時間後の生育状態を示す略示説明図である。過酸化水素によって細胞死を誘導した状況下でのｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、フェノール、チモール及び２Ｅ４ＭＰ（１ｍＭ，１００μＭ）の細胞死阻害作用（骨芽細胞生存率）を示したグラフ図である。

Claims

下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする骨芽細胞の細胞死阻害剤。

［ただし、上記一般式におけるＲ¹ は炭素数１〜２のアルキル基、Ｒ ² は炭素数１〜３のアルキル基であって、Ｒ¹とＲ²は同一であっても異なっていてもよい。］
前記化合物が、２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、及び２−エトキシ−４−メチルフェノールからなる群より選択された少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の骨芽細胞の細胞死阻害剤。