JP4398362B2 - 包装固形培地および調製済み固形培地の提供方法 - Google Patents

Description

本発明は、細菌類・酵母・カビその他の微生物、生体組織を培養するための包装固形培地、および雑菌の混入もなく速やかに固形培地として使用できる調製済み固形培地の提供方法に関する。

固形培地は、臨床検査分野あるいは食品・医薬品の品質管理分野で病原菌或いは食品汚染菌などの微生物の検出に使用される。かかる固形培地は、通常、１．５〜２重量％の寒天を含有し、含水率９５〜９８重量％程度の液状微生物検出用培地を、プラスチック製シャーレに無菌状態で分注後、冷却し、寒天をゲル化・固体状にした状態で微生物バリア性のある包装材料で包装して作製されている（特許文献１、特許文献２参照）。

そして、微生物による品質低下のおそれのある食品、医薬品等を包装する包装袋においては、二重包装を行った包装袋を使用することが知られている（特許文献３、段落番号００２５参照）。また、調製済み固形培地のうち、高度な清浄度を要求される環境、たとえば無菌医薬品の製造環境等で使用されるものについても、二重包装後にγ線滅菌を行った調製済み固形培地を使用することが知られている（非特許文献１参照）。外側の包装材料は、梱包材料あるいは外部環境と接触しており微生物が付着している可能性が高いため、かかる外側包装材料を、高度な清浄度が要求される環境に持ち込む直前に取り除くことにより、環境内への微生物の持込を防止しようとするものである。しかし、透湿度の異なる内側包装と外側包装を使用するとの記載も示唆もない。

なお、特許文献４には、互いにガス透過率の異なる２種類のフィルムで二重包装した培地を開示しているが、これは液体培地であって、特に固形培地に適度な水分量を維持調節するとの課題はなく、また、特許文献４にいうガスとは酸素を意味し、酸素による液体培地の変質を問題にしており、また、合成樹脂フィルムのガス透過率は、一般にガスの種類によって全く異なる挙動を示すことから本願とは無関係である。

特開平１０−２６２６４６号公報 特開昭５５−０２９９６３号公報 特開２０００−１５９２１０号公報 特開平０４−０７１４８２号公報 ＢＤ ＢＢＬＴＭ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｐａｃｋ Ｍｅｄｉａ １−２３２４ Ｊｕｎｅ ２０００ Ｐｒｉｎｔｅｄ ｉｎ ＵＳＡ

一般的に調製済み固形培地の包装材料としては、ガスバリアー性を有するポリエチレンフィルムの単体やポリエチレンとポリプロピレンフィルムとの重合体からなる合成樹脂が知られている（特許文献１参照)。これらのガスバリアー性を有するフィルムを二重包装する場合、固形培地からの水分蒸発がないため、余剰水分を使用時に調節しなければならない。しかし、使用前に包装材料を取り除き、固形培地を乾燥させる必要があるため、乾燥のための手間と場所が必要になるとともに、乾燥中の微生物汚染の可能性もある。

そこで、二重包装の包装材料として、通気性に優れたポリエチレン不織布（登録商標 Ｔｙｖｅｋ）／ポリエチレン複合材料を使用した包装固形培地も知られている。しかし、保管温度が高いと乾燥が進みすぎるため、冷蔵保管が必要となる。

従って、本発明は、室温で長期間、無菌状態のまま保存できるとともに、使用直前の余剰水分の乾燥の手間を大幅に低減できる包装固形培地、および乾燥中の雑菌の混入もなく速やかに固形培地として使用できる調製済み固形培地の提供方法を与えることを課題とする。

本発明の包装固形培地は、固形培地を充填した容器を、内側包装と外側包装とで包装した培地において、２２℃、湿度５０％の条件において、前記内側包装と外側包装とで包装した固形培地の２０日間保存後の培地重量減少率が約０．１０重量％／日以下であり、内側包装のみで包装された固形培地の７日間保存後の培地重量減少率が約０．２０重量％／日以上であることを特徴とする。

また、本発明の調製済み固形培地の提供方法は、以下の工程１〜４を行うことを特徴とする。
（工程１） 本発明の包装固形培地を無菌環境下に持ち込む工程、
（工程２） 前記包装固形培地の外側包装を除去し、内側包装を露出させる工程、
（工程３） 得られた内側包装のみで包装された固形培地を培地重量減少量が約３〜２０重量％の範囲内になるように、放置して乾燥させる工程、
（工程４） 内側包装を除去し、調製済み固形培地を取り出す工程。

本発明の包装培地によれば、室温で長期間、無菌状態のまま保存でき、使用直前の余剰水分の乾燥の手間を大幅に低減できるとともに乾燥中の雑菌の混入もない。また、本発明の調製済み固形培地の提供方法によれば、乾燥中の雑菌の混入もなく速やかに使用に適した調製済み固形培地を得ることができる。

１ 包装固形培地
本発明の第一の態様は、固形培地を充填した容器を、内側包装袋と外側包装袋とで包装した培地において、２２℃、湿度５０％の条件において、前記内側包装袋と外側包装袋とで包装した固形培地の培地重量減少率が約０．１０重量％／日以下であり、内側包装のみで包装された固形培地の培地重量減少率が約０．２０重量％／日以上であることを特徴とする包装固形培地を与えるものである。

図１に本発明の一実施形態を示す。一枚或いは複数枚の調製済み固形培地２は、透湿性の高い包材４に封入され、該包材４は微生物の侵入がないように完全にシールされている。調製済み固形培地２および前記包材４は、さらに、透湿性の低い包材６に封入され、前記包材４と同様、該包材６も微生物の侵入がないように完全にシールされている。

（１） 内側包装
内側包装とは、固形培地を充填した容器を多重包装する包装のうち、内側に位置する包装であって、７日間保存後の培地重量減少率が約０．２０重量％／日以上、好ましくは約０．５０重量％／日以上、より好ましくは約０．６０重量％以上、さらに好ましくは約１．０重量％／日以上となるような良好な透湿性を有する包装材料で構成されている包装のことをいう。さらに該包装は微生物バリア性を有することが望ましい。ここで、微生物バリア性を有するとは、フィルム面に微生物または微生物胞子の侵入が可能な最低直径である０．２μｍ以上のピンホールが存在せず、かつフィルムが気密に接着されていることをいう。

また、滅菌工程でガンマ線等の放射線を用いるため、該内側包装はガンマ線耐性を有することが望ましい。２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）等の適切な抗酸化剤を配合して、ガンマ線の照射によって発生するラジカルによる低級カルボン酸の生成を抑制することにより、ガンマ線耐性を得ることができる。

使用直前に外側包装を除去し、内側包装を露出させることで、該内側包装の良好な透湿性により、固形培地を速やかに使用に適した乾燥度に調整できる。この際、任意に乾燥剤を併用すれば、より速やかに乾燥度を調整できる。また、該内側包装が微生物バリア性を有する材料を用いることで、乾燥中でも、より有効に雑菌の混入を防ぐこともできる。

ここで、内側包装による７日間保存後の培地重量減少率（％／日）とは、内側包装のみで包装された容器入り固形培地、すなわち本発明の包装固形培地において外側包装を除去し内側包装を露出させたものに対応する包装固形培地を、外側包装除去時から、２２℃、湿度５０％の条件で７日間保存した場合において、以下の式１により計算されるものをいう。これは内側包装の全体としての透湿性の尺度となるパラメーターである。

内側包装の使用に適した包装材料としては、透湿度［ＪＩＳ Ｚ０２０８防湿包装材料の透湿度試験方法（カップ法）、厚さ０．０３ｍｍに換算］が好ましくは約５０ｇ／ｍ^２／２４ｈｒ以上、より好ましくは約１００〜４００ｇ／ｍ^２／２４ｈｒである材料が好ましく、たとえば、ナイロン（透湿度１２０〜１５０ｇ／ｍ^２／２４ｈｒ）、ポリビニルアルコール（透湿度１００〜４００ｇ／ｍ^２／２４ｈｒ）からなる群から選択される材料の単独若しくは複合フィルムを用いることができる。かかる透湿度を有する材料を用いてヒートシール等により密封することで、上記培地重量減少率を充分に充たすことができる。また、滅菌紙や不織布を包装材料の一部として用いることで透湿度を調整した複合材料も用いることができ、たとえばポリエチレン不織布、より具体的にはＴｙｖｅｋ（登録商標）／ポリエチレン複合材料を用いることができる。これらの中でも特に包装体全体での透湿度を任意に調整できる複合材料が好ましい。

また、該内側包装は、固形培地入り容器との間に一定の空間を残して包装してもよいし、真空包装することでほとんど空間のないものにしてもよい。

該内側包装は、たとえば、上記の好ましい包装材料をヒートシール等の当業者に周知の包装技術を用いて製袋することで準備できる。

（２） 外側包装
外側包装とは、固形培地を充填した容器を多重包装する包装袋のうち、外側に位置する包装であって、本発明の多重包装した固形培地の培地重量減少率が約０．１０重量％／日以下、好ましくは約０．０５重量％／日以下、さらに好ましくは約０．０１重量％／日以下となるような透湿性の低い包装材料で構成されている包装のことをいう。滅菌工程でガンマ線等の放射線を用いるため、ガンマ線耐性を有することが望ましい。２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）等の適切な抗酸化剤を配合して、ガンマ線の照射によって発生するラジカルによる低級カルボン酸の生成を抑制することにより、ガンマ線耐性を得ることができる。

かかる外側包装は、さらに微生物バリア性を有することが好ましく、該バリア性により、保存時の雑菌混入を防止できるとともに、該外側包装の透湿性が低いことから、冷蔵保存しなくても保存時の固形培地の乾燥を防止できる。ここで、微生物バリア性を有するとは、内側包装の場合と同様である。

また、前記多重包装した固形培地の培地重量減少率とは、内側包装と外側包装とで多重に包装した容器入り固形培地、すなわち本発明の多重包装培地に対応する包装培地を、２２℃、湿度５０％の条件で２０日間保存した場合において、以下の式２により計算されるものをいう。これは直接的には前記内側包装袋と外側包装袋との包装袋全体の透湿性の尺度となるパラメーターであるが、前記内側包装袋の透湿性は高く設定されていることから、外側包装袋の透湿性の低さを示す尺度としても参酌できる。

外側包装の使用に適した包装材料としては、透湿度［ＪＩＳ Ｚ０２０８防湿包装材料の透湿度試験方法（カップ法）、厚さ０．０３ｍｍに換算］が好ましくは約１０ｇ／ｍ^２／２４ｈｒ以下、より好ましくは約５〜１０ｇ／ｍ^２／２４ｈｒである材料であり、たとえば、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレートあるいはそれらのポリプロピレンフィルムとの積層フィルムを好ましく用いることができる。これらの中でも特にポリエチレンテレフタレートとポリプロピレンの積層フィルムが好ましい。かかる透湿度を有する材料を用いてヒートシール等により密封することで、上記培地重量減少率を充分に充たすことができる。

また、該外側包装と内側包装との間の空間の有無については、前記内側包装と固形培地入り容器との間の空間と同様である。

さらに、内側包装と外側包装との間に任意に乾燥剤を配置して、保存中の適度な水分調整を行うこともできる。

また、本発明の効果を損なわない範囲で、内側包装と外側包装との間に、第３の包装を介在させてもよい。

該外側包装は、たとえば、上記の好ましい包装材料をヒートシール等の当業者に周知の包装技術を用いて製袋することで準備できる。

（３） 固形培地を充填した容器
固形培地とは、固体状の培地をいい寒天のようにゲル化したものを含む。たとえば、寒天を１．５〜２．０重量％、水９５〜９８重量％を含むゲル状固体を好ましく用いることができる。

前記固形培地を充填すべき容器としては、プラスチック製あるいはガラス製の蓋付シャーレ等を挙げることができ、たとえば液状寒天溶液を注ぎ入れて冷却することにより、固形培地を充填した容器を作製する。

（４） 包装固形培地の作製方法
本発明の包装固形培地は、当業者に知られている任意の方法で作製できるが、たとえば以下のような工程を行うことで好ましく作製することができる。
（ａ) 培地調製工程
たとえば寒天培地を作製する場合、栄養分と寒天を含んだ粉末を水に溶解し加熱する。水分量は通常、９５重量％程度の量を用いる。
（ｂ) 滅菌工程
得られた培地溶液中の雑菌を、高温で一定時間（たとえば１２１℃、２０分以上）処理して、滅菌する。
（ｃ) 分注工程
上記の滅菌した培地溶液を容器に分注する。たとえば、容器として直径１００ｍｍあるいは１５０ｍｍのシャーレを用い、これに上記の滅菌した培地溶液をクリーンルーム内で分注する。直径１００ｍｍのシャーレの場合、２０ｍｌ、直径１５０ｍｍのシャーレの場合、７５ｍｌ程度の量で分注する。
（ｄ） 固化工程
上記注ぎいれた培地溶液が固まるまで冷却する。
（ｅ） スリーブ包装工程
得られた容器入り固形培地を包装する。容器として直径１００ｍｍのシャーレを用いた場合は１０枚程度、直径１５０ｍｍのシャーレを用いた場合は４枚程度を内側包装袋に収納し、ヒートシールするのが通常である。
（ｆ） 箱詰め工程
クリーンルームから包装固形培地を取り出し、箱詰めする。
（ｇ) 滅菌工程
箱詰めされた包装固形培地を滅菌する。好ましくは、ガンマ線を照射して滅菌する。

このようにして得られた本発明の包装固形培地は、冷蔵保管は必ずしも必要ではなく、室温で保管することができる。

２ 調製済み固形培地の提供方法
本発明の第２の態様は、以下の工程１〜４を行うことを特徴とする培地の提供方法である。
（工程１） 本発明の包装固形培地を無菌環境下に持ち込む工程、
（工程２） 前記包装固形培地の外側包装を除去し、内側包装を露出させる工程、
（工程３） 得られた内側包装のみで包装された固形培地を培地重量減少量が約３〜２０重量％の範囲内になるように、放置して乾燥させる工程、
（工程４） 内側包装を除去し、調製済み固形培地を取り出す工程。

本発明に係る包装固形培地につき、上記のような工程を経ることにより、雑菌の混入することなく、かつ比較的速やかに固形培地の乾燥度を調節して使用できる状態の固形培地を提供できる。

（１）工程１において、本発明の多重包装固形培地をクリーン・ルーム等の無菌環境下に持ち込む。好ましくは、無菌環境下に持ち込む前に外側包装の表面を殺菌剤液に浸漬あるいは殺菌剤液で拭き取る等、殺菌剤により殺菌することで、より一層、雑菌の混入の防止が図れる。たとえば、３〜１０重量％濃度程度の過酸化水素水等の殺菌剤溶液に本発明の包装固形培地を浸漬することが挙げられる。本発明の包装固形培地の外側包装は、透湿性が低いため、かかる処理によっても、殺菌液が包装袋内部に浸透することがないという利点を有する。

（２）工程２において外側包装を除去し、内部包装を露出させる。

（３）工程３において、使用に適した乾燥度、すなわち約３〜２０重量％、より好ましくは約３〜１０重量％、さらに好ましくは約５〜８重量％の培地重量減少量の範囲内になるまで、放置して乾燥する。室温で乾燥させるのが簡便であり、さらに乾燥剤を並存させておけばさらに乾燥速度を速めることができる。ここでいう、培地重量減少量とは、外側包装を除去し、内側包装を暴露した際の固形培地そのもの（包装及び容器の重量を含まない）の重量を１００として、固形培地の重量減少の程度を百分率で表現したものをいう。暴露された内側包装の透湿性が高いため、速やかに使用に適する乾燥度に調整できる。

標準的な寒天培地による実験の結果では、調製済み培地の培地分注量が３重量％程度減少した時に培地表面に余剰水分が存在しなくなることを確認した。また、培地分注量の２０重量％以上が減少した場合、調製済み培地の使用目的である微生物の発育性能に悪影響を生じることが判明した。したがって、ここにおける培地重量減少量としては約３〜２０重量％の範囲内になるように乾燥すべきである。また、好ましい乾燥度になることを視覚化するため濾紙に微量の塩化コバルトを染み込ませた湿度センサー等の湿度インジケーターを内側包装に備えてもよい。

（４) 上記工程３で適度な乾燥度にした後、工程４で、内側包装を除去し、雑菌の混入のない、即時に使用できる調製済み固形培地を与えることができる。

以下、本発明の実施の形態について説明する。

（実施例１）
直径１００ｍｍのペトリディシュ１０枚に各々２０ｍｌのソイビーンカゼインダイジェスト寒天培地（水１リットル当たりカゼイン製ペプトン １５ｇ、ダイズ製ペプトン ５ｇ、塩化ナトリウム １５ｇ、寒天 １５ｇを含む）を分注した調製済み培地を用意した。次いで、内側包装として、ポリエチレン不織布であるＴｙｖｅｋ（デュポン社登録商標）を総表面積の４０％およびポリエチレンを総表面積の６０％組み合わせた複合素材（透湿度５０ｇ／ｍ^２／２４ｈｒ以上）を、外側包装として、ポリエチレンテレフタレート１２μｍと無延伸ポリプロピレンフィルム４０μｍとの積層フィルム（透湿度１０ｇ／ｍ^２／２４ｈｒ）を使用して、該調製済み培地を二重包装した。この際、内側包装、外側包装ともに、ガンマ線に耐性を有するように適切な抗酸化剤を配合した原材料を使用し、また微生物が侵入しないように完全にヒートシールした。得られた包装固形培地を、２２℃、相対湿度５０％の環境下、２０日間保管した。

保管前の該包装固形培地重量が３５０ｇ（このうち培地そのものの総重量は２００ｇ、残りは容器と内側及び外側包装の合計重量となる）、２０日間保管後の該包装固形培地重量は３４９ｇであった。前記式２より内側包装と外側包装とからなる多重包装された固形培地の培地重量減少率（重量％／日）を算出すると、｛１／（２００×２０）｝×１００重量％／日、すなわち０．０２５重量％／日であった。

次いで、外側包装であるポリエチレンフィルムを除去し、Ｔｙｖｅｋ／ポリエチレン複合素材である内側包装のみの一重包装とした。外側包装を除去した直後の包装固形培地重量は３４５ｇ（このうち培地そのものの総重量は１９９ｇ、残りは容器と内側包装の合計重量となる）、さらにこれを２２℃、相対湿度５０％の環境下、７日間保管した後の包装固形培地重量は３３６．６ｇであった。前記式１より内側包装のみで包装された固形培地の培地重量減少率を算出すると、｛８．４／（１９９×７）｝×１００重量％／日、すなわち０．６０重量％／日であった。

この結果、本発明の二重包装した包装固形培地を室温保管した場合、調製済み培地の微生物発育性能に影響の出る培地重量減少量である２０重量％にまで到達するためには、計算上、８００日（＝２０重量％／０．０２５重量％）かかる。通常の生培地の有効期限としては半年程度で充分であることからすれば、上記の二重包装した包装固形培地は室温で保存しても充分に長い有効期限を有することができる。

また、外側包装であるポリエチレンフィルムを除去し、Ｔｙｖｅｋ／ポリエチレン複合素材である内側包装のみの一重包装とした場合、余剰水分がなくなる３重量％の培地重量減少量にまで到達するためには、調製直後の調製済み培地でも計算上、５日（＝３重量％／０．６重量％）であり、本発明の二重包装された包装固形培地を室温で１００日間保管後の場合には、０．８３日[＝（３重量％−０．０２５重量％×１００）／０．６重量％]であり、速やかに調製済み培地の余剰水分を微生物的汚染がない状態で乾燥させることが可能である。

（試験例１）
ペトリディッシュ入り調製済み寒天培地として、第１４改正日本薬局方 一般試験法 ５０．微生物限度試験法に開示されているソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地（以下、ＳＣＤ寒天培地）を作製し、直径１５０ｍｍのペトリディッシュに７５ｍｌづつ加え 固化させたもの４枚を下記表１のスリーブで包装したサンプル１〜４を、各２セット準備した。

得られた包装培地サンプル１〜４をガンマ線照射前後から冷蔵保管し（５℃）、常法によるガンマ線滅菌処理の後、保冷配送によりガンマ線照射施設から各サンプルを回収した。

（試験例２）
上記各サンプル１〜４の各１セットを冷蔵温度（５℃）で、ガンマ線照射施設から戻ってきた時点から、１週間置きに重量減少量を測定した。その結果を表２に示す。

上記表２の結果から、冷蔵保存条件下では、いずれのサンプルも２８日間保存後でもその重量減少量は３重量％未満であり固形培地に余剰水を残した状態で保存できていることがわかる。

（試験例３）
上記各サンプル１〜４の各１セットをガンマ線照射施設から戻ってきた時点から、５日間冷蔵温度（５℃）で保管後、室温保存に切り替え、室温切り替えから起算して１週間置きに重量減少量を測定した。その結果を表３に示す。

上記表３の結果から、本発明であるサンプル品１は、低透湿性スリーブで２重に包装した比較品であるサンプル品２と同様、室温で２８日間保存後でも、重量減少量は３重量％未満であり、固形培地に余剰水を残した状態で保存できることがわかる。これに対して、高透湿性スリーブで２重に包装した比較品であるサンプル品３および高透湿性スリーブで１重に包装した比較品であるサンプル品４では、室温で２８日間保存後では、重量減少量が３重量％を越えており、余剰水を残して保存できないことを示している。

本発明は、雑菌の混入の防止を必要とする細菌類・酵母・カビその他の微生物、生体組織を培養するための調製済み固形培地を提供する用途に適用できる。

本発明の実施例である包装固形培地を示した図である。

符号の説明

２ 容器
４ 固形培地
６ 内側包装
８ 外側包装

Claims (4)

1. 固形培地を充填した容器を、内側包装と外側包装とで包装した培地において、
   外側包装が、透湿度が１０ｇ／ｍ ^２ ／２４ｈｒ以下の単独若しくは複合フィルムからなり、内側包装が、透湿度が５０ｇ／ｍ ^２ ／２４ｈｒ以上の単独または複合フィルムからなり、
   ２２℃、相対湿度５０％の条件において、前記内側包装と外側包装とで包装した固形培地の２０日間保存後の培地重量減少率が０．１０重量％／日以下であり、内側包装のみで包装された固形培地の７日間保存後の培地重量減少率が０．２０重量％／日以上であることを特徴とする培地。
2. 内側包装、外側包装共に、微生物バリア性を有するものであることを特徴とする請求項１に記載の培地。
3. 以下の工程１〜４を行うことを特徴とする培地の提供方法。
   （工程１） 請求項１または２に記載の包装固形培地を無菌環境下に持ち込む工程、
   （工程２） 前記包装固形培地の外側包装を除去し、内側包装を露出させる工程、
   （工程３） 得られた内側包装のみで包装された固形培地を培地重量減少量が３〜２０重量％の範囲内になるように、放置して乾燥させる工程、
   （工程４） 内側包装を除去し、調製済み固形培地を取り出す工程。
4. 前記工程１の包装固形培地を無菌環境下に持ち込む前に、包装固形培地の外側包装の外表面を殺菌剤液に浸漬あるいは殺菌剤液で拭き取ることにより殺菌することを特徴とする請求項３記載の培地の提供方法。