JP4380139B2

JP4380139B2 - アミノペプチダーゼｂの阻害剤

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Publication number: JP4380139B2
Application number: JP2002307815A
Authority: JP
Inventors: 博横田; 仁志早坂
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2002-10-23
Publication date: 2009-12-09
Anticipated expiration: 2022-10-23
Also published as: JP2004143057A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は卵巣癌の治療剤および／または診断方法に関する。より詳しくは、アミノペプチダーゼＢの阻害剤を含有する卵巣癌の治療剤、アミノペプチダーゼＢを阻害することを特徴とする卵巣癌の治療方法、アミノペプチダーゼのＢの阻害剤の同定方法、およびアミノペプチダーゼＢの発現量および／または酵素活性を測定する工程を含む卵巣癌の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミノペプチダーゼＢ（以下ＡＰＢと略称することもある）は、ペプチドのＮ末端がＡｒｇおよび／またはＬｙｓであるペプチドの、該Ａｒｇおよび／またはＬｙｓ残基を特異的に切断するＺｎ^２＋依存性のエキソペプチダーゼであり、主にラット細胞を用いた研究において機能解析が進められてきた（尚、本明細書におけるアミノ酸の表記にはアルファベット３文字表記法を用いている。）。ラットのＡＰＢは、炎症やアレルギー反応等の伝達物質であるロイコトリエンＡ４の加水分解酵素と類似したモチーフを有しており、主に細胞膜内に存在するが、細胞外にも分泌される蛋白質であることが知られている（非特許文献１参照）。ＡＰＢが作用する合成基質としては、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−エンケファリン（ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、Ａｒｇ−Ｍｅｔ−エンケファリン、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）等が知られている。また、ラットＡＰＢは、大脳皮質、副睾丸、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、筋肉、膵臓等の多種の臓器でその存在が認められている。
【０００３】
本発明者は、ＧｅｎＢａｎｋのヒトｃＤＮＡライブラリーを用い、ラットＡＰＢ遺伝子とのホモロジー検索により選出したＡＰＢのヒトホモログを特願２００１−１３３６２０号の明細書にて開示している。この出願明細書には、遺伝子の全長を決定し、該遺伝子を大腸菌発現系で発現させて該遺伝子がコードする蛋白質を得たことが記載されている。さらには、合成基質を用いた酵素活性の確認及びＡＰＢ阻害剤であるピューロマイシンによる酵素活性阻害確認試験を行った結果が記載されている。また、これらの知見に基づき、該蛋白質の機能または生理学的作用を調節することによる疾病診断手段および医薬用組成物が提供されることが記載されている。
【０００４】
しかし、ヒトＡＰＢの生体内における生理的な意義および疾患との関連性については完全に解明されているとはいえなかった。
【０００５】
【非特許文献１】
ＦｏｕｌｏｎＴ．、ＣａｄｅｌＳ．、ＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＢ、ＴｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９９９、ｖｏｌ．３１、Ｎｏ．７、ｐ．７４７−７５０
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題の一つは、ヒトＡＰＢの生理的な作用をさらに明らかにすることによって、ＡＰＢの機能を調節することによる疾病の予防剤および／または治療剤、および予防方法および／または治療方法を提供することである。
【０００７】
また、本発明の別の課題は、ＡＰＢの発現量および／または酵素活性を指標とした疾病の診断方法を提供することである。
【０００８】
【課題解決のための手段】
上記課題を解決すべく本発明者は鋭意努力し、疾患関連データベースを用いたヒト正常および癌組織におけるＡＰＢ遺伝子発現解析を行うことにより、ＡＰＢ遺伝子が、卵巣未分化胚細胞腫組織において、正常組織に比べ顕著に高度に発現していることを見出した。
【０００９】
さらには、蛍光トリペプチドライブラリーを用いてＡＰＢの基質特異性解析を行い、ＡＰＢが高い切断活性を示すペプチド配列およびＡＰＢの機能を阻害する低分子ペプチドを見出した。
【００１０】
これらの結果に基づき、ＡＰＢの阻害剤を含有する卵巣癌の予防剤および／または治療剤、および、それらの同定方法、さらにはＡＰＢの発現量および／または酵素活性を指標とした卵巣癌の診断方法を提供することによって本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、アミノペプチダーゼＢの阻害剤を含有する卵巣癌の予防剤および／または治療剤に関する。
【００１２】
また、低分子ペプチドであるアミノペプチダーゼＢの阻害剤を含有する卵巣癌の予防剤および／または治療剤に関する。
【００１３】
さらに、Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ、その塩または溶媒和物を含有する卵巣癌の予防剤および／または治療剤に関する。
【００１４】
また、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏから選ばれるアミノ酸の残基をＣ末端に保持するペプチドに対する切断活性の存在もしくは不存在または変化を測定し、該切断活性を阻害する化合物をアミノペプチダーゼＢの阻害剤であると判断する工程を含む、アミノペプチダーゼＢの阻害剤の同定方法に関する。
【００１５】
さらに、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇで示されるアミノ酸配列をＣ末端部分に保持するペプチドに対する切断活性の存在もしくは不存在または変化を測定し、該切断活性を阻害する化合物をアミノペプチダーゼＢの阻害剤であると判断する工程を含む、アミノペプチダーゼＢの阻害剤の同定方法に関する。
【００１６】
また、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏから選ばれるアミノ酸の残基をＣ末端に保持し、かつ、切断された際にシグナルとして検出され得る物質で修飾されているペプチドに対する切断活性を、該シグナルの存在もしくは不存在または変化を検出することにより測定し、該シグナルを減弱させる化合物をアミノペプチダーゼＢの阻害剤であると判断する工程を含む、アミノペプチダーゼＢの阻害剤の同定方法に関する。
【００１７】
さらに、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇで示されるアミノ酸配列をＣ末端部分に保持し、かつ、切断された際にシグナルとして検出され得る物質で修飾されているペプチドに対する切断活性を、該シグナルの存在もしくは不存在または変化を検出することにより測定し、該シグナルを減弱させる化合物をアミノペプチダーゼＢの阻害剤であると判断する工程を含む、アミノペプチダーゼＢの阻害剤の同定方法に関する。
【００１８】
また、前記ペプチドが、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇで示されるアミノ酸配列をＣ末端部分に保持し、かつ、蛍光物質で修飾されているペプチドである、上記の同定方法に関する。
【００１９】
さらに、上記の同定方法により同定されたアミノペプチダーゼＢの阻害剤に関する。
【００２０】
また、Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ、その塩または溶媒和物からなるアミノペプチダーゼＢの阻害剤に関する。
【００２１】
さらに、アミノペプチダーゼＢの阻害剤の同定に用いるキットであって、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏから選ばれるアミノ酸の残基をＣ末端に保持するペプチドを含んでなるキットに関する。
【００２２】
また、アミノペプチダーゼＢの阻害剤の同定に用いるキットであって、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇで示されるアミノ酸配列をＣ末端部分に保持するペプチドを含んでなるキットに関する。
【００２３】
さらに、前記ペプチドが、さらに、切断された際にシグナルとして検出され得る物質で修飾されているペプチドである、上記キットに関する。
【００２４】
また、アミノペプチダーゼＢの阻害剤の同定に用いるキットであって、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇで示されるアミノ酸配列をＣ末端部分に保持し、かつ、蛍光物質で修飾されているペプチドを含んでなるキットに関する。
【００２５】
さらに、アミノペプチダーゼＢを阻害することを特徴とする卵巣癌の予防方法および／または卵巣癌の治療方法に関する。
【００２６】
また、アミノペプチダーゼＢの量および／または酵素活性を測定する工程を含む卵巣癌の診断方法に関する。
【００２７】
さらに、アミノペプチダーゼＢの量および／または酵素活性を測定する工程が、アミノペプチダーゼＢ遺伝子の発現量を測定する工程である上記診断方法に関する。
【００２８】
また、アミノペプチダーゼＢの量および／または酵素活性を測定する工程が、アミノペプチダーゼＢの蛋白質産生量を測定する工程である上記診断方法に関する。
【００２９】
さらに、アミノペプチダーゼＢの量および／または酵素活性を測定する工程が、アミノペプチダーゼＢ遺伝子の発現量およびアミノペプチダーゼＢの蛋白質産生量を測定する工程である上記診断方法に関する。
【００３０】
また、アミノペプチダーゼＢの量および／または酵素活性を測定する工程が、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏから選ばれるアミノ酸の残基をＣ末端に保持するペプチドに対する切断活性の存在もしくは不存在または変化を測定する工程である上記診断方法に関する。
【００３１】
さらに、アミノペプチダーゼＢの量および／または酵素活性を測定する工程が、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇで示されるアミノ酸配列をＣ末端部分に保持するペプチドに対する切断活性の存在もしくは不存在または変化を測定する工程である上記診断方法に関する。
【００３２】
また、卵巣癌の診断に用いるキットであって、アミノペプチダーゼＢ遺伝子由来物が検出可能なヌクレオチドプローブ、アミノペプチダーゼＢ蛋白質由来物に対する抗体、アミノペプチダーゼＢのペプチド基質のうちの少なくともいずれか一つを含んでなるキットに関する。
【００３３】
【発明の実施の形態】
ヒトＡＰＢ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＣ００１０６４として登録されており、特願２００１−１３３６２０号明細書に記載の方法によって、全長ｃＤＮＡを得ることができる。本発明者は、ＡＰＢ遺伝子について、疾患関連データベースであるＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社）を用いた解析を行い、卵巣未分化胚細胞腫の組織において正常組織に比べ高度（４．５３倍）に発現していることを明らかにした。したがって、発明者は、ＡＰＢが卵巣癌の発症に関与すると考えている。
【００３４】
また、精巣悪性新生物でのＡＰＢ遺伝子の発現量は、正常組織の２．９倍、精巣の胚細胞腫瘍の一種である精上皮腫でのＡＰＢ遺伝子の発現量は正常組織の２．６倍であった。したがって、精巣癌を含む生殖腺癌、さらには、胚細胞由来の癌にＡＰＢが関与すると発明者は考えている。
【００３５】
ＴＹＫ−ｎｕ、ＰＡ−１などの卵巣癌由来細胞株、ＮＥＣ１４、ＮＥＣ８などの精巣癌由来細胞株に、ＡＰＢ遺伝子に対してアンチセンス効果やＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）効果を示すオリゴヌクレオチドを導入し、細胞増殖、形態、転移能等の癌細胞の形質変化を確認すれば、上記癌へのＡＰＢの関与が確認できる。これらの細胞株はヒューマンサイエンス財団より入手できる。
【００３６】
本発明の一つの態様は、ＡＰＢの阻害剤である卵巣癌の予防剤および／または治療剤を提供することである。上述のように、ＡＰＢが卵巣癌に関与することが明らかであることから、ＡＰＢの阻害剤は卵巣癌の予防剤および／または治療剤となり得る。また、ＡＰＢを阻害することは卵巣癌の予防方法および／または治療方法につながる。
【００３７】
ＡＰＢの阻害剤は、ＡＰＢの機能を阻害するものであってもよいし、ＡＰＢの生体内における遺伝子産物の発現を阻害するものであってもよい。
【００３８】
該阻害剤は、天然に存在する化合物、合成された化合物、ＲＮＡｉ効果を示す核酸等を含むが、低分子化合物、低分子ペプチド、低分子ポリヌクレオチドが好ましい。これらは適当な塩や溶媒和物の形態を有していてもよい。また、ＡＰＢをコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸は遺伝子治療に用いることができ、そのような態様も本発明に含まれる。本願実施例においては、トリペプチドをＡＰＢの阻害剤として用いることができることが記載されている。Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇが特に好ましい。さらには、Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇの配列に基づき、この構造を模倣して設計されたＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇの均等物も本発明の範囲に含まれる。
【００３９】
本発明の別の態様は、ＡＰＢ阻害剤の同定方法を提供するものである。ＡＰＢの阻害剤の同定には、ＡＰＢ蛋白質、ＡＰＢ遺伝子、およびそれらの由来物、それらを認識する抗体、ＡＰＢ遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体などを用いることができる。
【００４０】
例えば、天然のＡＰＢを一般的酵素精製手段により精製して得たり、あるいは、遺伝子工学的手法により生産したりなどして得たＡＰＢを酵素とし、適当な基質を加えて、ＡＰＢの酵素反応を起こし、ＡＰＢによる基質の切断活性の存在もしくは不存在または変化を検出し、該切断活性を阻害する化合物をＡＰＢ阻害剤であると判断すればよい。本願実施例においては、ＡＰＢとしては、６×Ｈｉｓタグ融合蛋白質として大腸菌で発現させ、アフィニティーにより精製して得たものを用いているがこれに限定されない。
【００４１】
好適な基質としてはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏから選ばれるアミノ酸の残基をＣ末端に保持するペプチドが挙げられ、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇで示されるアミノ酸配列をＣ末端部分に保持するペプチドがさらに好ましい。ここでいうＣ末端部分とは、ペプチド鎖のＣ末端側から３つのアミノ酸残基からなる部分構造をいう。試験化合物は、酵素反応時に同時に添加していてもよいし、酵素とプレインキュベーションしておいてもよい。
【００４２】
基質としては、Ａｒｇ−Ｍｅｔ−ｅｎｋｅｐｈｌｉｎ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ソマトスタチンなどの合成基質も適用できる。さらに好適なものとしては、切断された際にシグナルとして検出され得る物質で修飾されており、該シグナルの存在もしくは不存在または変化を検出することによりＡＰＢの切断活性を検出できるペプチドが挙げられる。該シグナルを減弱させる化合物をＡＰＢの阻害剤であると判断すればよい。切断された際にシグナルとして検出され得る物質としては、発色物質、蛍光物質、放射性物質等が挙げられ、発色物質としてはｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）、β―ナフチルアミン（βＮＡ）、その他、３−ヒドロキシメチル―４―ニトロアニリノ基、４―（Ｎ―エチル―Ｎ―β―ヒドロキシエチル）アミノアニリノ基、４―（Ｎ,Ｎ―ジエチル）アミノアニリノ基等を有する物質等が挙げられる。蛍光物質としては、７―アミノ―４―メチルクマリン、７―アミノ―４―トリフルオロメチルクマリン、βナフチルアミンや消光性蛍光基質等が挙げられる。このような修飾を施したペプチドを用いるＡＰＢ阻害剤同定方法も本発明に含まれる。さらには、ペプチド鎖の末端をアセチル基等で保護したもの等も好適である。
【００４３】
上記のように、ＡＰＢは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏから選ばれるアミノ酸の残基をＣ末端に保持するペプチドに対する切断活性が高いので、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏから選ばれるアミノ酸の残基をＣ末端に保持するペプチドを含んでなるキットは、ＡＰＢの阻害剤の同定に用いることができる。Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇで示されるアミノ酸配列をＣ末端部分に保持するペプチドを含んでなるキットがさらに好ましい。キットに含まれるペプチドは、切断された際にシグナルとして検出され得る物質で修飾されていてもよく、さらに末端が適当な保護基で保護されていてもよい。
【００４４】
上記同定方法等により同定されたＡＰＢの阻害剤は適当な医薬担体と組み合わせて処方して卵巣癌の予防剤および／または治療剤として用いると良い。かかる処方は、治療上有効量の上記阻害剤、医薬上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。処方は投与経路に適したものを選択すればよい。
【００４５】
投与経路は、全身投与であっても局所投与であってもよい。全身投与の好ましい一態様は、注射、例えば、静脈注射が挙げられる。皮下、筋肉内、または腹腔内のような他の注射経路をもちいることもできる。投与の別の態様は、腸溶処方またはカプセル処方等の経口投与もある。さらに、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる形粘膜または経皮投与を用いることもできる。局所的な投与のときは、膏薬、パスタ、ゲルなどの形態を利用できる。
【００４６】
必要な用量範囲は、上記阻害剤の有効性、投与経路、処方の性質、対象の症状および担当医師の判断によるが、適当な用量は、例えば、対象の体重１ｋｇあたり０．１乃至１００μｇの範囲である。
【００４７】
製剤化にあたっては、例えば、阻害剤の物性に応じた公知の製剤化手段を導入すればよい。具体的には、例えば、散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリンなどの包接体などの製剤化方法が利用できる。
【００４８】
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
【００４９】
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、ＰＥＧなどのグリコール類、油類を使用して製造できる。
【００５０】
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
【００５１】
リポソーム化は、例えば、リン脂質を有機溶媒（クロロホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心分離した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
【００５２】
脂肪乳化剤は、例えば、当該阻害剤、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油などの植物油など）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えば、グリセリン、糖類（例えば、ブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。
【００５３】
シクロデキストリン包接化は、例えば、当該阻害剤を溶媒（エタノール）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌感想することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該阻害剤の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α型、β型、γ型）を適宜選択すればよい。
【００５４】
本発明の別の態様は、ＡＰＢの量および／または酵素活性を測定する工程を含む卵巣癌の診断方法を提供するものである。
【００５５】
本明細書において、ＡＰＢの量を測定することには、ＡＰＢ遺伝子の発現量を測定すること、およびＡＰＢの蛋白質産生量を測定することを含む。ＡＰＢ遺伝子の発現量およびＡＰＢの蛋白質産生量の双方を測定してもよい。ＡＰＢの量を測定するための試料としては、個体由来の細胞、例えば、血液、尿、唾液、髄液、組織生検サンプル、剖検サンプルなどを挙げることができる。これらの試料から、自体公知の方法により、遺伝子や蛋白質、これらに由来するポリヌクレオチド断片、ペプチド断片などを精製等して測定に用いるとよい。
【００５６】
遺伝子の発現量の測定は、例えば、サザンブロッティング法などのように、遺伝子そのものの増幅を確認する方法、ノーザンブロッティング法などのようにｍＲＮＡの量を測定する方法やＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップを用いた解析などのようにｍＲＮＡを一旦ｃＤＮＡ化し、さらに増幅等を行って測定する方法など、発現遺伝子量を直接的、間接的に測定できるいかなる方法を適用してもよい。核酸の検出にはヌクレオチドプローブが好適に用いられるが、プローブは蛍光物質、放射性物質、発色性酵素等の修飾を施してもよい。ここでプローブとは、対象のヌクレオチドとハイブリッド形成をすることが可能なポリヌクレオチドを言う。
【００５７】
蛋白質産生量を測定する方法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡアッセイ等、ＡＰＢ蛋白質の一部を認識する抗体を用いた方法が好適に用いられるが、その他公知のいかなる手段を適用してもよい。
【００５８】
ＡＰＢの酵素活性の測定は、個体由来の細胞、例えば、血液、尿、唾液、髄液、組織生検サンプル、剖検サンプル等を適当な精製を施す等した後、ＡＰＢの好適な基質に対する切断活性の存在もしくは不存在または変化を測定すればよい。
【００５９】
好適な基質としてはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏから選ばれるアミノ酸の残基をＣ末端に保持するペプチドが挙げられ、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇで示されるアミノ酸配列をＣ末端に保持するペプチドがさらに好ましい。Ａｒｇ−Ｍｅｔ−エンケファリン、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ソマトスタチンなどの合成基質も適用できる。
【００６０】
さらに好適な基質としては、切断された際にシグナルとして検出され得る物質で修飾されており、該シグナルの存在もしくは不存在または変化を検出することによりＡＰＢの切断活性を検出できるペプチドが挙げられる。切断された際にシグナルとして検出され得る物質としては、発色物質、蛍光物質、放射性物質等が挙げられ、発色物質としてはｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）、β―ナフチルアミン（βＮＡ）、その他、３−ヒドロキシメチル―４―ニトロアニリノ基、４―（Ｎ―エチル―Ｎ―β―ヒドロキシエチル）アミノアニリノ基、４―（Ｎ,Ｎ―ジエチル）アミノアニリノ基等を有する物質等が挙げられる。蛍光物質としては、７―アミノ―４―メチルクマリン、７―アミノ―４―トリフルオロメチルクマリン、βナフチルアミンや、消光性蛍光基質等が挙げられる。さらに、ペプチド鎖の末端が適当な保護基により保護されていてもよい。
【００６１】
上記の方法により、患部組織と正常組織におけるＡＰＢの量および／または酵素活性を比較することにより卵巣癌の診断を行うことができる。試料が患部組織のみまたは正常組織との混合でのみしか入手できない場合は、一定のＲＮＡ量や蛋白質量あたりのＡＰＢ発現量、酵素活性の相対値を得ることにより測定するとよい。正常者のＲＮＡ量や蛋白質量あたりのＡＰＢ発現量の値をあらかじめ基準値として定め、その値と比較してもよい。
【００６２】
疾患関連データベースであるＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社）は単位ＲＮＡ量あたりの各種遺伝子の発現量をアフィメトリクス社のＧｅｎｅＣｈｉｐシステムを用いて解析したものであり、本発明者らは、これを利用して、ＡＰＢの発現量について、発現の組織特異性を解析した。その結果、正常卵巣でのＡＰＢ遺伝子の発現量はその他正常組織と同等であったのに対し、卵巣癌の一種である卵巣未分化胚細胞腫では４．５３倍高かった。したがって、正常組織由来サンプル等を用いてあらかじめ定めておいた基準値との比較において、２倍以上、さらに好ましくは４倍以上のＡＰＢの発現量および／または酵素活性が得られた場合は、卵巣癌の可能性が高いと診断できる。
【００６３】
上述のようにＡＰＢ遺伝子由来物が検出可能なヌクレオチドプローブ、ＡＰＢ蛋白質由来物に対する抗体、ＡＰＢのペプチド基質は、卵巣癌の診断に有用である。したがって、これらのいずれかを少なくとも含むキットは卵巣癌の診断用に提供される。該キットに含まれるヌクレオチドプローブ、抗体、ペプチド基質等は発色物質、蛍光物質等の検出時における利便性を付与する分子で適宜修飾されていてもよい。
【００６４】
ここで、「ＡＰＢ遺伝子由来物」はＡＰＢ遺伝子そのもの、その一部分である断片、転写物、転写物の断片など、ＡＰＢ遺伝子に由来して生体内あるいは採取した試料中で生成され得るポリヌクレオチドを含む。人工的に蛍光ラベルなどの修飾を施したものも含まれる。
【００６５】
「ＡＰＢ蛋白質由来物」は、ＡＰＢ蛋白質そのもの、その一部分である断片など、ＡＰＢ蛋白質に由来して生体内あるいは採取した試料中で生成され得るすべてのペプチドを含む。人工的にペプチド鎖の切断等を施したものも含まれる。
【００６６】
本発明において提供される診断用キットは、被験者から採取した生体由来試料中に含まれるＡＰＢおよび／またはＡＰＢ由来物の量を測定したり、酵素活性を測定したりすることに用いる物から構成されるキットのみならず、生体内に投与し、ＡＰＢの生体内分布を測定する場合に用いる試薬キットをも含む。後者の場合においては、ＡＰＢ遺伝子由来物、ＡＰＢ蛋白質由来物に対する放射活性標識ヌクレオチドプローブなどを含むことが好ましい。
【００６７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【００６８】
（ＡＰＢの発現）
ＡＰＢは、Ｎ末端６×Ｈｉｓタグ融合蛋白質として大腸菌で発現させた。すなわち、ＧａｔｅｗａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて構築されたヒトＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＢの発現ベクター（ｐＤＥＳＴ１７／ｈＡＰＢ＃１；特願２００１−１３３６２０号明細書参照）を導入した大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ（特願２００１−１３３６２０号明細書参照）を、アンピシリン含有ＬＢ培地中、３７℃で一晩培養後、培地を約１０倍量追加してＯＤ（６００ｎｍ）が１前後となるまで培養を継続した。次いで終濃度が０．３Ｍとなるように５ＭＮａＣｌを培養液に添加後、２０℃で２４時間培養し、蛋白質発現を誘導した。培養終了後、遠心分離により集菌した大腸菌ペレットを−８０℃で凍結保存した。
【００６９】
（ＡＰＢのアフィニティー精製）
ＴＡＬＯＮＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてＡＰＢをアフィニティー精製した。培養液５０ｍｌ分の大腸菌ペレットを含むチューブ３本のそれぞれに、氷冷した１ｍＭＰＭＳＦ（ＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌＦｌｕｏｒｉｄｅ）、１×Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ４ｍｌを氷上で添加後、ペレットを懸濁し、これらを１チューブ（約１２ｍｌ）にまとめ、２０ｍｇ／ｍｌＬｙｓｏｚｙｍｅ水溶液４５０μｌを添加後、氷上でソニケーター（Ｗ−２２５、ＨｅａｔＳｙｓｔｅｍ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社）を用い大腸菌を超音波破砕した。破砕後の懸濁液を４℃、１２，０００ｒｐｍ（ローター：ＴＯＭＹ、ＴＭＳ−２１）で３０分間遠心処理後、可溶性画分である上清（約１２ｍｌ）を回収した。
【００７０】
ＴＡＬＯＮレジン懸濁液を１５ｍｌチューブ２本に各１ｍｌずつ分注し、１ｍＭＰＭＳＦ、１×Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ５ｍｌ／チューブで平衡化した。Ｂｕｆｆｅｒを除去後、可溶性画分上清を約６ｍｌ／チューブでレジンに添加した。４℃で２時間、穏やかに攪拌しながらＡＰＢを吸着させた後、７００×ｇで遠心処理し上清を除去した。１チューブのレジンを７．５ｍＭイミダゾール、１ｍＭＰＭＳＦ、１×Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ１ｍｌで懸濁後、残りの１チューブに移し、さらに同Ｂｕｆｆｅｒ９ｍｌを加えて懸濁後、遠心処理し上清を除去した。再度、同Ｂｕｆｆｅｒ１０ｍｌを加えて同様にレジンを洗浄した。レジンを７．５ｍＭイミダゾール、１ｍＭＰＭＳＦ、１×Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ１ｍｌで懸濁し、ディスポーザブルカラムに充填後、自然落下でＢｕｆｆｅｒを排出し、７．５ｍＭイミダゾール、１ｍＭＰＭＳＦ、１×Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ５ｍｌを注入して洗浄した。洗浄後、５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭＰＭＳＦ、１×Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ／ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ５ｍｌ、次いで１００ｍＭイミダゾールの同Ｂｕｆｆｅｒ５ｍｌ、最後に１５０ｍＭイミダゾールの同Ｂｕｆｆｅｒ５ｍｌを順に注入し、溶出画分１〜３０（約５００μｌ／ｆｒａｃｔｉｏｎ／チューブ）を得た。溶出画分を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％ｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌ、ＣＢＢ（クーマジーブルー）染色）にて分析し、ＡＰＢ（約７４ｋＤａ）を含む溶出画分３〜１４（ｔｏｔａｌ約６ｍｌ）をプールした。次に、Ｂｕｆｆｅｒ置換のため以下の操作を行った。置換Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で平衡化した遠心式限外ろ過フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−４、分画分子量１０，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に溶出画分３〜１４を注入後、４℃、７，５００×ｇで遠心処理し約２００μｌまで濃縮した。次に置換Ｂｕｆｆｅｒ４ｍｌを注入後、遠心処理し約２００μｌまで濃縮する操作を２回行った。置換Ｂｕｆｆｅｒでろ過膜を洗浄しながら、Ｂｕｆｆｅｒ置換された濃縮液を回収し、０．６５μｍフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で不溶物を除去し、ＡＰＢ標品を得た。
【００７１】
アフィニティー精製により得たＡＰＢ標品は、ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて測定した。ＡＰＢ標品の純度は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％ｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌ、ＣＢＢ染色）により調べた。ＡＰＢ標品の酵素活性は、ＡＰＢの合成基質であるＬ―ａｒｇｉｎｉｎｅ―４―ｍｅｔｈｙｌ―ｃｏｕｍａｒｙｌ―７―ａｍｉｄｅ（Ａｒｇ−ＡＭＣ）とＡＰＢ標品（終濃度：１μｇ／ｍｌの２倍希釈系列）を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ６．５）中、３７℃で３０分間インキュベート後、遊離したＡＭＣの蛍光強度（励起／蛍光波長：３６５／４５０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（ＭＴＰ−３２、コロナ社）で測定することにより確認した。
【００７２】
（蛍光トリペプチドライブラリーを用いたアッセイ）
ＡＰＢ標品（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）と蛍光トリペプチド（ＣＡＴ：ＣｈｅｍＲｘＡｄｖａｎｃｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、終濃度５μＭ）を０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２００μｌ中、３７℃で３０分間インキュベート後、蛍光プレートリーダー（ＭＴＰ−３２、コロナ社）で蛍光強度を測定した（励起／蛍光波長：３６５／４５０ｎｍ）。本実験で用いた蛍光トリペプチドライブラリーは全５９２０種類のペプチドを含み、濃度１ｍＭ（ＤＭＳＯ溶液）である。本蛍光トリペプチドはＮ−ａｃｅｔｙｌ−アミノ酸_１（ＡＡ_１）−アミノ酸_２（ＡＡ_２）−アミノ酸_３（ＡＡ_３）−ＡＭＣの構造を有し、ＡＡ_３−ＡＭＣのペプチド結合が切断されてＡＭＣが遊離すると蛍光を発する。
【００７３】
同時に、本蛍光トリペプチドと同じ蛍光団を有するＡｒｇ−ＡＭＣ（終濃度５μＭ）を基質とするコントロールサンプルも同様に測定した。各蛍光強度から、基質（蛍光トリペプチドまたはＡｒｇ−ＡＭＣ）のみを含むブランクサンプルの蛍光強度を差し引いた値（蛍光強度増加分）を算出した。
【００７４】
次いで、Ａｒｇ−ＡＭＣを基質としたサンプルの酵素活性（蛍光強度増加分）を１００％として、蛍光トリペプチドを基質としたサンプルの相対活性（％）を算出することにより、各蛍光トリペプチドに対するＡＰＢのプロテアーゼ活性を定量的に調べ、基質特異性を評価した。
【００７５】
その結果、ＡＰＢは蛍光トリペプチドのＣ末端アミノ酸残基（ＡＡ_３）の種類に依存した切断活性を示し、ＡＡ_３がＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏからなる配列の一部に対して１０％以上の切断活性を示した（表１）。その他の配列を有する蛍光トリペプチド（５８１５種類）については１０％未満の切断活性しか示さなかった。
【００７６】
ＡＰＢの基質として切断された蛍光トリペプチドのうちＡｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇおよびＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇについては、それぞれ８３％および８１％の切断活性を示し、他の配列に比べて突出した値であった（表２）。従って、ＡＰＢは、これらの配列に対して、非常に高い基質特異性を有するものと判断した。
【００７７】
【表１】

Ａｒｇ−ＡＭＣを基質としたサンプルの酵素活性（蛍光強度増加分）を１００％として、蛍光トリペプチドを基質としたサンプルの相対活性（％）を算出し、ＡＰＢの切断活性とした。
【００７８】
【表２】

¹ Ｏｒｎ：Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ
Ａｒｇ−ＡＭＣを基質としたサンプルの酵素活性（蛍光強度増加分）を１００％として、蛍光トリペプチドを基質としたサンプルの相対活性（％）を算出し、ＡＰＢの切断活性とした。
【００７９】
（合成トリペプチドによるプロテアーゼ活性阻害）
Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ（Ｌｏｔ＃９１０−２０５２８２）、Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ（Ｌｏｔ＃９１０−２０５２８１）、およびＡｌａ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ（Ｌｏｔ＃９１０−２０５２２２）はペプチド研究所（株）に合成依頼し凍結乾燥品として入手した。これらのペプチド、およびその他対照として、Ａｒｇ塩酸塩（和光純薬）およびＢｅｓｔａｔｉｎ（和光純薬）を秤量後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶解し、各種濃度の希釈系列を作製した。これら阻害剤の存在下、ＡＰＢ標品（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）とＡｒｇ−ＡＭＣ（終濃度５μＭ）を３７℃で３０分間インキュベート後、蛍光強度を測定した。阻害剤非添加サンプルの蛍光強度を１００％として、阻害剤添加サンプルの相対活性（％）を算出することにより、ＡＰＢに対するプロテアーゼ阻害活性を定量的に評価した。
【００８０】
蛍光トリペプチドを用いたアッセイ（前述）において非常に高い基質特異性が認められた２種の配列（Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡｒｇおよびＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ）を有するトリペプチドが、ＡＰＢのプロテアーゼ活性を阻害するか否かを評価した。その結果、これら２配列のうちＡｒｇ−Ｍｅｔ−ＡｒｇのＩＣ_５０（５０％阻害活性濃度）は約１００μＭであったが、Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇは１ｍＭでも阻害活性を示さなかった。また、蛍光トリペプチドのアッセイでは全く切断されなかった配列Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｒｇも、ほとんど阻害活性を示さなかった。
【００８１】
なお、Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅの阻害剤であるＢｅｓｔａｔｉｎは、ＡＰＢに対して約０．４μＭのＩＣ_５０を示した。
【００８２】
【発明の効果】
本発明により、ＡＰＢの阻害剤を含有する卵巣癌の予防剤、治療剤およびそれらの同定方法、ＡＰＢを阻害することを特徴とする卵巣癌の治療方法、さらには、ＡＰＢの発現量および／または酵素活性を指標とした卵巣癌の診断方法が提供される。

Claims

Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ、その塩または溶媒和物を含有する卵巣癌の予防剤および／または治療剤。
Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ、その塩または溶媒和物からなるアミノペプチダーゼＢの阻害剤。