JP4347522B2 - 創傷治癒組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、生化学分野および医学分野に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物の創傷治癒促進に有用な組成物および方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
哺乳動物の組織における創傷（すなわち、裂傷または開口）は、創傷表面での微小血管系の組織の破壊および凝固を引き起こす。このような組織の修復は、損傷に対する規則正しく調節された細胞反応を示す。全ての軟部組織創傷は、サイズに関係なく類似の様式で治癒する。組織の成長および修復は、酸素勾配の存在下で細胞増殖および血管形成が起こる生物学的機構である。組織修復の間に起こる連続的な形態学的および構造的変化は、非常に詳細に特徴づけられており、いくつかの例において定量されている：Hunt, T.K.他、血管形成および創傷治癒の凝固およびマクロファージ刺激、The surgical wound, 1〜18、F. Dineen & G. Hidrick-Smith編（Lea & Febiger, Philadelphia, 1981）。
【０００３】
細胞形態学は、異なる３つの領域からなる。中央の無血管性創傷腔は、酸素欠乏症、アシドーシスおよび過炭酸性であり、乳酸レベルが高い。創傷腔に隣接する領域は、線維芽細胞の分割によって群集する局所的貧血（虚血）の勾配領域である。先導領域の後部には、成熟線維芽細胞および多数の新規に形成された毛細血管（すなわち、新生血管形成）によって特徴づけられる活性コラーゲン合成領域である。この新血管成長（血管新生）が創傷組織の治癒に必要であるにもかかわらず、血管形成薬は、一般に組織修復に対して、長期間必要とされる付加的な生合成効果の要求を満たすことはできない。より迅速な治癒が必要な創傷（すなわち、重篤な火傷、手術による切開、裂傷および他の外傷）が存在するにも関わらず、現在、薬理学的因子を用いた創傷治癒の促進は、成功例が限られている。
【０００４】
DiZeregaに付与された米国特許第5,015,629号は、創傷組織の治癒速度を増加させる方法が記載されており、それには、治癒速度を増加させるのに十分量のアンギオテンシンII（AII）の創傷組織への適用が含まれている。創傷組織へのアンギオテンシンIIの適用は、創傷の治癒速度を有意に増加させ、より迅速な再上皮形成および組織修復を導く。用語「アンギオテンシンII」は、ヒトおよび他の種に存在する配列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号１）を有するオクタペプチドをいう。アンギオテンシンIIは、公知の昇圧薬であり、市販されている。
【０００５】
アンギオテンシンIII（AIII）は、AIIのＮ末端から１つのアミノ酸を除いたAII由来の生物学的に活性な化合物である。したがって、AIIIは、配列Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号２）を有する。AIIとAIIIには、明らかに構造的に関連があるにも関わらず、これらの分子は、ある範囲の機能的相違を示す。例えば、AIIは、ニューロンのノルエピネフリン放出（早期型減少の後遅延型増加を示す）を惹起する二相性効果を示す一方で、たった12分後にはノルエピネフリンの自発性放出が増大し、AIIIは、ニューロンのノルエピネフリンの惹起性および自発性放出の両方に二相性効果を示す：Vatta, M.S.他、1992、ラット副腎髄質におけるノルエピネフリンの取り込みおよび放出に対するアンギオテンシンIIおよびIIIの単相および二相性効果、Can. J. Physiol. Pharmacol., 70, 821。さらに、AIIおよびAIIIは、圧受圧器−聴覚反射に対して異なる影響を示す−AIIは反射の敏感性を増大させるが、AIIIは減少させる：Brattstrom, A.他、1992、孤束核内のニューロペプチドは、中枢神経性の心血管の制御プロセスを調節する、Progress in Brain Research, 91, 75。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の第１の態様は、創傷治癒促進に有用な組成物に関する。この組成物には、適切なキャリアまたは希釈剤、および一般式
R1-Arg-norLeu-R3-R4-His-Pro-R5（配列番号11）
R1-Arg-R2-Tyr(PO3)2-R4-His-Pro-R5（配列番号12）
R1-Arg- R2-homoSer-R4-His-Pro-R5（配列番号13）および
R1-Arg- R2-R3-norLeu-His-Pro-R5（配列番号14）
の任意の１つであり得る少なくとも５つの連続的なアミノ酸を有する少なくとも１つの化合物の創傷治癒を促進する量が含まれる。これらの一般式のうち、R1は、HまたはAspであり、R2は、ValまたはnorLeuであり、R3はTyr、Tyr(PO3)2、またはhomoSerであり、R4はIleまたはnorLeuであり、R5は、H、PheまたはIleである。
【０００７】
１つの実施形態によれば、化合物は、Asp-Arg-Val-Tyr(PO3)2-Ile-His-Pro-Phe（配列番号4）、Asp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号５）、Asp-Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe（配列番号６）、Asp-Arg-Val-homoSer-Ile-His-Pro-Phe（配列番号７）、Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号９）、Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe（配列番号10）またはAsp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro（配列番号15）のいずれかであり得る。異なる実施形態によれば、一般式のR5位は、水素部分で占められる。別の実施形態によれば、化合物は基質溶液（matrical solution）またはミセル溶液中に存在する。別の実施形態によれば、化合物は、１ng/ml〜5,000μg/mlの濃度、あるいは10〜500μg/mlの濃度、または30〜200μg/mlの濃度でキャリアまたは希釈剤中に分散される。好ましい実施形態では、化合物は、少なくとも30μg/mlの濃度でキャリアまたは希釈剤に存在する。本発明のさらに別の実施形態によれば、キャリアまたは希釈剤は、半固形（semi-solid）ポリエチレングリコールポリマー、カルボキシメチルセルロース調製物、晶質調製物（crystalloid preparations）、粘弾性物質（viscoelastics）またはポリプロピレングリコールのいずれかであり得る。特定の実施形態によれば、本発明の化合物は、創傷手当て用具上に配置される。
【０００８】
本発明の別の態様は、創傷治癒促進用の化合物に関する。本化合物は、好ましくは、一般式
R1-Arg-norLeu-R3-R4-His-Pro-R5（配列番号11）
R1-Arg-R2-Tyr(PO3)2-R4-His-Pro-R5（配列番号12）
R1-Arg- R2-homoSer-R4-His-Pro-R5（配列番号13）および
R1-Arg- R2-R3-norLeu-His-Pro-R5（配列番号14）
の任意の少なくとも１つであり得る少なくとも５つの連続的なアミノ酸を有する。これらの一般式のうち、R1は、HまたはAspであり、R2は、ValまたはnorLeuであり、R3はTyr、Tyr(PO3)2またはhomoSerであり、R4はIleまたはnorLeuであり、R5は、H、PheまたはIleである。１つの実施形態によれば、本発明の化合物は、Asp-Arg-Val-Tyr(PO3)2-Ile-His-Pro-Phe（配列番号4）、Asp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号５）、Asp-Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe（配列番号６）、Asp-Arg-Val-homoSer-Ile-His-Pro-Phe（配列番号７）、Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号９）、Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe（配列番号10）またはAsp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro（配列番号15）のいずれかで与えられたポリペプチド配列を有する。別の実施形態では、本発明の化合物は基質溶液またはミセル溶液中に存在する。別の実施形態では、化合物は、１ng/ml〜5,000μg/mlの濃度、あるいは10〜500μg/mlの濃度、または30〜200μg/mlの濃度でキャリアまたは希釈剤中に分散される。好ましい実施形態では、化合物は、少なくとも30μg/mlの濃度でキャリアまたは希釈剤中に存在する。本発明のさらに別の実施形態によれば、キャリアまたは希釈剤は、半固形ポリエチレングリコールポリマー、カルボキシメチルセルロース調製物、晶質調製物、粘弾性物質またはポリプロピレングリコールのいずれかであり得る。特定の実施形態によれば、本発明の化合物は、創傷手当て用具上に配置される。
【０００９】
本発明の別の態様は、創傷治癒を促進するための薬物の製造に関する任意の上記化合物の使用に関する。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、創傷治癒促進に使用するための任意の上記の化合物に関する。
【００１１】
本発明は、以下の添付の図面を参照して理解するとよりよく理解できる。
【００１２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明によれば、哺乳動物における創傷治癒は、本明細書中に開示の少なくとも１つのAII類似体（アナログ）の有効量を含む組成物の使用によって促進される。活性因子は、一般に、基質溶液またはミセル溶液で投与されて、非常に低い濃度でも再上皮形成および組織修復を促進するのに有効である。
【００１３】
本発明による特定の目的の活性なAII類似体およびAIIフラグメントの類似体は、一般式
R1-Arg-norLeu-R3-R4-His-Pro-R5（配列番号11）、
R1-Arg-R2-Tyr(PO3)2-R4-His-Pro-R5（配列番号12）、
R1-Arg-R2-homoSer-R4-His-Pro-R5（配列番号13）および
R1-Arg-R2-R3-norLeu-His-Pro-R5（配列番号14）（式中、R1は、HまたはAspであり、R2は、ValおよびnorLeuからなる群から選択され、R3はTyr、Tyr(PO3)2、およびhomoSerからなる群から選択され、R4はIleおよびnorLeuからなる群から選択され、R5は、PheおよびIleからなる群から選択される）
のいずれかであり得る少なくとも５つの連続したアミノ酸配列を含むことで特徴づけられる。
【００１４】
本発明の特に好ましい組成物には、以下の表１に示した配列を有するアンギオテンシン類似体が含まれる。意義深いことに、アンギオテンシンIIのフラグメントまたは類似体およびアンギオテンシンIIフラグメントの全てが本発明の組成物を都合よく特徴づける創傷治癒活性を有するわけではないことが明白である。例えば、AII(6-8)、His-Pro-PheおよびAII(4-8)、Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号３）を試験したところ、本発明者らのin vivoモデル系において創傷治癒の促進には有効ではないことが見出されている。
【００１５】
本発明によれば、他の特に好ましい組成物には、任意の配列番号11〜14のR5位が水素で占められているAII(1-7)の類似体が含まれる。さらに他の特に好ましい組成物には、配列番号11〜14の配列の最初の２つのＮ末端が水素で置換されているAII(3-8)の類似体が含まれる。従って、これらの後者のものでは、分子のアミノ末端がnorLeuまたはValである。AII(3-8)もまた「AIV」として公知であることが特記すべきである。
【００１６】
上記の式では、アミノ酸残基の標準的な３文字表記を用いた。それに対して、表示はしていないが、Ｌ型アミノ酸を意味する。
【００１７】
AIIおよびその類似体は、γまたはβターンのいずれかを採用していることが示唆されている（Regoli, D.他、1974、アンギオテンシンの薬理学、 Pharmacological Reviews, 26, 69）。一般に、R2、R4位における中性側鎖および分子の第７位のアミノ酸分子Proは、R3位の活性基の間の適切な距離の維持に関与しているであろうと考えられている。HisおよびR5残基は、主に、レセプターへの結合および／または内因性活性を担う。R2位、R4位およびR5位における疎水性側鎖はまた、ペプチドの全コンフォメーションに重要な役割を果たし、そして／または仮説上の疎水性ポケットの形成に寄与し得る。
【００１８】
分子の第２番目のアミノ酸のArg側鎖は、標的レセプターの化合物との親和性に関与し、および／またはペプチドのコンフォメーションにおいて重要な役割を果たし得る。
【００１９】
本発明の目的のために、R2は、R4（γターンモデル）またはHis（βターンモデル）との直鎖または非直鎖水素結合の形成に関与し得ると考えられる。R2はまた、β逆平行構造（これもまた、可能な構造として示唆されている）中の第１のターンに関与しているだろう。上記の一般式の他の位置と対照的に、βおよびγ分枝は、この位置において等しく影響を及ぼすようである。さらに、１つの水素結合で、比較的安定なコンフォメーションを維持するのに十分であり得る。従って、R2は、ValおよびnorLeuから適切に選択することができる。
【００２０】
R3に関して、コンフォメーション分析によって、この位置（ならびにR2およびR4）における側鎖が、レセプターの占有および刺激に重要であると考えられる疎水性クラスターに寄与することが示唆されている。従って、R3は、Tyr、Tyr(PO3)2およびhomoSerから選択されることが好ましい。
【００２１】
R4位では、β脂肪族または脂環鎖を有するアミノ酸が特に望ましい。従って、この位置におけるアミノ酸は、IleおよびnorLeuから選択されることが好ましい。
【００２２】
本発明による特定の目的の類似体では、分子の第６番目のアミノ酸は、Hisで占められる。ヒスチジンのイミダゾール環の独特の特性（例えば、生理学的pHでのイオン化、プロトンドナーまたはアクセプターとして作用する能力、芳香族としての特性）は、分子のこの位置でのその特定の利用性に寄与していると考えられる。例えば、コンフォメーションモデルは、Hisが水素結合形成（βモデル）または分子の第７番目の位置のアミノ酸でのProの配向への影響による逆平行構造の第２のターンに関与し得ることを示唆する。
【００２３】
分子の第８番目のアミノ酸位置では、目的の類似体のレセプターへの結合に疎水性側鎖が特に有用である。最も好ましくは、分子の第８番目の位置としてR5は、PhaまたはIleから選択される。
【００２４】
以下に記載のように、ペプチド類似体は、本明細書中で、上付き文字で示された位置でのアミノ酸置換を有するAIIの類似体またはAIIフラグメントの類似体として選択的に同定された。従って、例えば、（TyrPO3)2 4-AIIは、AIIの第４番目の位置で置換された（TyrPO3)2残基を有するAII類似体を示す。
【００２５】
本発明の実施における類似体は、以下を含むことが特に好ましい。
【００２６】
【表１】
【００２７】
アンギオテンシンIIは、公知の最も強力な血管収縮剤の１つであり、分枝した小動脈の収縮を引き起こして毛細管（すなわち、細動脈）を形成する。アンギオテンシンの生物学的形成は、血漿基質アンジオテンシノーゲンに対するレニンの作用によって開始される。このようにして形成された物質は、アンギオテンシンIと呼ばれるデカペプチドで、これは、アンギオテンシンIからＣ末端のHis-Leu残基を取り去る転換酵素アンジオテンシナーゼによってアンギオテンシンIIに変換される。
【００２８】
いくつかの研究によって、レニン−アンギオテンシン系の血管作用性産物AIIが創傷治癒に関連する成長因子の放出、有糸分裂誘発、走化性および培養細胞の細胞外物質の放出を増加させることが示されている：Dzau, V.E.他、1989、血管成長および心成長の調節におけるアンギオテンシンの分子機構、J. Mol. Cell. Cardiol., 21（増刊III）, S7、Berk, B.C.他、1989、アンギオテンシンIIは、培養血管性平滑筋細胞におけるタンパク質合成を刺激する、Hypertension, 13, 305, 14、Kawahara, Y.他、1988、アンギオテンシンIIは、培養血管性平滑筋細胞におけるプロテインキナーゼCの活性化およびカルシウムイオン動員によってc-fos遺伝子発現を誘導する、BBRC, 150, 52〜9、Naftilan, A.J.他、1989、培養ラット血管性平滑筋細胞におけるアンギオテンシンIIによる血小板由来の成長因子A鎖およびc-myc遺伝子発現の誘導、J. Clin. Invest, 83, 1419〜24、Taubman, M.B.他、1989、アンギオテンシンIIは大動脈性平滑筋におけるc-fos mRNAを誘導する、Ｃａ2+動員およびプロテインキナーゼC活性化の役割、J. Biol. Chem., 264, 526〜530、Nakahara, K他、1992、ウサギ血管性平滑筋における３つの型のPDGF-A鎖遺伝子転写物の同定および発達中およびアンギオテンシンIIによるそれらの発現の調節、BBRC, 184, 811〜8、Stouffer, G.A.およびG.K. Owens, 1992、自然発症高血圧ラット由来の培養平滑筋細胞の有糸分裂誘発を誘導するアンギオテンシンIIは、トランスホーミング増殖因子βのオートクライン産生に依存する、Circ. Res., 70, 820、Wolf, G.他、1992、アンギオテンシンIIは、培養海生動物メサンギウム細胞におけるI型コラーゲンの増殖および生合成を刺激する、Am. J. Pathol., 140, 95〜107、Bell, L.およびJ.A. Madri, 1990、内皮細胞および平滑筋細胞移動に対するアンギオテンシン系の影響、Am. J. Pathol, 137, 7〜12。さらに、AIIは、ウサギ角膜およびニワトリ絨毛漿尿膜モデルで血管形成することが示された：Fernadez, L.A.他、1985、アンギオテンシンIIによって産生された新血管新生、J. Lab. Clin. Med., 105, 141、LeNoble, F.A.C.他、1991、アンギオテンシンIIは、ニワトリ胚の漿尿膜における血管形成を刺激する、Eur. J. Pharmacol., 195, 305〜6。従って、AIIは、新血管新生、成長因子放出、再上皮形成および細胞外マトリックスの産生の増加によって創傷修復を促進することができる。損傷組織への血流および栄養分の流れの増加によって、AIIは創傷修復の速度を増加させることができる。AIIはまた、創傷部位での成長因子の産生によって創傷修復を促進することができる。成長因子の外来的添加は、種々の機構によって創傷修復を促進することが示されている：Grotendorst, G.R.他、1985、正常および糖尿病ラットにおける血小板由来の成長因子による肉芽組織形成の刺激、J. Clin. Invest., 76, 2323〜9、Mustoe, T.A.他、1987、ラットにおける切開創傷の治癒の促進は、増殖因子βの形質転換によって誘導される、Science, 237, 1333〜5、Pierce, G.F.他、1988、in vivo切開創傷治癒は、血小板由来の成長因子および組換えc-sis遺伝子ホモ二量体タンパク質によって増加する、J. Exp. Med., 157, 974〜87、Lynch, S.E.他、1989、創傷治癒における成長因子、J. Clin. Invest., 84, 640〜6、Greenhalgh, D.G.他、1990、PDGFおよびFGFは、遺伝性糖尿病マウスにおける創傷治癒を刺激する、Am. J. Pathol., 136, 1235〜46。最近の研究で、AIIは、創傷後の頚動脈および大動脈における新血管内膜形成を増大させることが示された：Powell, J.S.他、1989、アンギオテンシン転換酵素のインヒビターは、血管損傷後の筋内膜増殖を防止する、Science, 245, 186〜8、Powell, J.S.他、1991、血管損傷に対する増殖反応は、変換酵素阻害によって抑制される、J. Cardiovasc. Pharmacol., 16（増刊４）, S42〜9、Capron, L.他、1991、バルーンカテーテルを用いたラット胸大動脈損傷反応に対するラミプリル（アンギオテンシン変換酵素のインヒビター）の効果、J. Cardiovasc. Pharmacol., 18, 207〜11、Osterriedes, W.他、1991、ラットにおける損傷誘導性新血管内膜形成に対するアンギオテンシンIIの役割、Hypertension, 18, 増刊1160〜64、Daemen, M.J. A.P.他、1991、アンギオテンシンIIは、正常および損傷ラットの動脈壁における平滑筋細胞増殖を誘導する、Circ. Res., 68, 450〜6。これらの観察結果として、内因性AIIが血管内膜過形成を誘導し得る機構を同定する研究が行われた。AIIは、平滑筋細胞、線維芽細胞および内皮細胞のマイトジェンとして作用することが示された：Schelling, P.他、1979、3T3細胞およびSV3T3細胞における細胞成長およびレニンに対するアンギオテンシンIIおよびアンギオテンシンIIアンタゴニストであるサラリシンの効果、J. Cell. Physiol., 98, 503〜13、Campbell-Boswell, M.およびA.L. Robertson、1981、in vitroでのヒト平滑筋細胞に対するアンギオテンシンIIおよびバソプレシンの効果、Exp. Mol. Pathol., 35, 265〜76、Emmett, N.他、1986、3T3細胞成長および増殖に対するサララシン（アンギオテンシンIIのアンタゴニスト）の効果、J. Cell. Biol., 103, 171（要約）、Paquet, J. L.他、1990、自発性高血圧ラットの大動脈筋細胞のアンギオテンシンII誘導性増殖、J. Hypertens., 8, 565〜72、Dzau他、前出。AIIはまた、血管性平滑筋細胞のタンパク質含有量およびサイズを増加させた：Berk他、1989、前出、Geisterfer, A.A.T.他、1988、アンギオテンシンIIは、培養ラット大動脈平滑筋細胞の過形成ではなく肥大を誘導する、Cir. Res., 62, 749〜56。AIIは、PDGF、ヘパリン結合性EGFおよびトランスホーミング増殖因子β（TFGβ）を含む種々の型の成長因子および平滑筋細胞、内皮細胞および心線維芽細胞由来の増殖関連プロトオンコジーンの放出を増加させることが研究で示された：Kawahara他、1988、前出、Naftilan, A.J.、1992、血管性平滑筋細胞成長におけるアンギオテンシンIIの役割、J. Cardiovas. Pharmacol., 20, S37〜40、Naftilan他、1989、前出、Taubman他、1989、前出、Nakahara他、1992、前出、Temizer他、1992、前出、Gibbons, G.H.他、1992、血管性平滑筋細胞の肥大と過形成、オートクライントランスホーミング増殖因子β１発現は、アンギオテンシンIIに対する成長反応を決定する、J. Clin. Invest., 90, 456〜61、Bell, L.他1992、ウシ大動脈性内皮細胞の移動およびプラスミノゲンアクチベーターのオートクラインアンギオテンシン系の調節は、プロトオンコジーンpp60C-src発現の調節に影響する、J. Clin. invest., 89, 315〜20、StoufferおよびOwens、1992、前出。AIIによる血管性平滑筋細胞の肥大は、PDGFによって媒介される：Berk, B.C.およびG.N. Rao、1993、アンギオテンシンII誘導性血管性平滑筋細胞肥大−PDGF A鎖はサイズの増大を媒介する、J. Cell. Physiol., 154, 368〜80。
【００２９】
従って、AIIは、創傷組織におけるこれらの成長因子のレベルを増加させることによって創傷治癒を促進させるように作用すると考えられる。さらに、AIIは、コラーゲン合成を刺激することが示されており、これは、細胞外マトリックス形成におけるこれらの因子の役割を示唆している：Wolf, G.他、1991、培養近位尿細管細胞におけるアンギオテンシンII誘導性細胞肥大後の転写の細胞内シグナリングおよびIV型コラーゲンの分泌、Cell. Reg., 2, 219〜27、Wolf他、1992、前出、Zhou, G.他、1992、アンギオテンシンIIは、培養心線維芽細胞におけるコラーゲン合成刺激を媒介した、FASEB. J., 6, A1914。創傷修復はまた、創傷ベッドへの必要な細胞型の走化性に影響する。AIIはまた、in vitroでの内皮細胞および平滑筋細胞の移動を誘導することが示された：BellおよびMadri、1990、前出。
【００３０】
最近の研究では、AIIレセプターの発現が、創傷修復プロセスの間に変化することもまた示されている：Viswanathan, M.およびJ.M. Saavedra、1992、実験的創傷治癒の間のラットの皮膚におけるアンギオテンシンII AT2レセプターの発現、Peptides, 13, 783〜6、Kimura, B.他、1992、ラットにおける創傷治癒の間の皮膚アンギオテンシンIIレセプターの変化、BBRC, 187, 1083〜1090。修復部位でのAIIの局所産生の増加に関するこれらの変化は、AIIが創傷修復プロセスおいて鍵となる役割を果たし得ることを示唆する。
【００３１】
最近、創傷治癒に関与し得るAIIの作用が概説されている：Phillips他、1994、ラットの皮膚におけるトランスホーミング増殖因子βのアンギオテンシンレセプター刺激およびアンギオテンシンレセプターにおける創傷治癒（JM SaavedraおよびPBMWM Timmermans編）、Plenum Press, New York, NY, 377〜396。報告された研究の大多数が、これらの効果がAT1レセプターによって媒介されることを示している。
【００３２】
AIIの血圧への影響（およびアルドステロン分泌および口渇の増大などの最も多い他の影響）は、１型レセプター（AT1レセプター）によって媒介される：Wong, PC. 1994、アンギオテンシンレセプターにおける高血圧モデルにおけるアンギオテンシンアンタゴニスト（JM SaavedraおよびPBMWM Timmermans編）、Plenum Press, NY, NY, 319〜336、MacKenzie他、1994、TCV116は、ラットにおいて広範な腎切除に伴う腎損傷の進行を防止する、J. Hypertension, 12（増刊９）, S11〜Ｓ16、Gupta他、1995、副腎に局所的に産生されたアンギオテンシンIIは、基底のコルチコトロピンおよびカリウム刺激性アルドステロン分泌を調節する、Hypertension, 25, 443〜448、Llorens-Cortes他、1994、１型アンギオテンシンIIレセプターの組織発現および調節は、定量的な逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応分析によって亜類型を検査する、Hypertension, 24, 538〜548、Wong他、1992、ラットにおけるPD 123177によるロサルタン（Dup 753）誘導アンギオテンシンIIレセプター拮抗作用の促進、Eur. J. Pharmacol, 220, 267〜70。この結論は、レセプター亜類型特異的アンタゴニストによるAII作用のブロッキングに基づく。
【００３３】
血管損傷および修復の２つの実験モデルにおけるAIIおよびAIIアンタゴニストの影響が試験されている。いくつかの研究によって、血管系のバルーン損傷後の血管の過形成とAT2との関与が結びつけられている。ラットの頚動脈において、大多数のレセプターはAT2である：Pratt, RE他、1992、アンギオテンシンレセプターのAT2イソ型は、血管損傷後の筋血管内膜の過形成を媒介する、Hypertension, 20, 432。それに対して、損傷したラット胸大動脈の新血管内膜細胞は、独占的にAT1レセプターを発現する：Viswanathan, M.他、バルーン血管形成術は、ラット大動脈の新血管内膜におけるアンギオテンシンII亜類型AT1レセプターの発現を促進する、J. Clin. Invest., 90, 1707〜12、1992。PD 123319（AT2特異的アンタゴニスト）を用いたラットの処理により、血管内膜の過形成が73％まで減少する一方で、ロサルタン（AT1特異的アンタゴニスト）処理では、血管内膜の領域は95％までの減少であった、Pratta他、1992、前出。類似のモデルにおいて、14日間脈管周囲に融合させたCGP 42112（AT2アンタゴニスト）は新血管内膜形成を防止するが、低用量のロサルタンでは有効ではなかった：Janiak他、1992、血管損傷後の新血管内膜形成におけるアンギオテンシン亜類型２レセプターの役割、Hypertension, 20, 737〜45。他の研究では、高用量でのロサルタンは有効であることが見出された：Forney Prescott他、1991、アンギオテンシン変換酵素インヒビター対アンギオテンシンII（AT1レセプターアンタゴニスト）、バルーンカテーテル損傷後の平滑筋細胞移動および増殖に対する影響、Am. J. Pathol., 139, 1291〜6、Kauffman他、1991、ロサルタン（非ペプチドアンギオテンシンII（Ang II）レセプターアンタゴニスト）は、ラット頚動脈へのバルーン損傷後の新血管内膜形成を阻害する、Life Sci., 49, 223〜228。従って、両レセプター亜類型は、バルーン損傷後の血管外傷形成の役割を果たし得ると考えられる。
【００３４】
幼若動物における実験的創傷治癒の間、AIIレセプターの発現は、創傷周囲の皮膚表面の真皮内組織の局所化バンドにおいて有意に増加し、主要な増加の比率はAT2レセプターによるものである：Viswanathan他、1992、実験的創傷治癒の間のラットの皮膚におけるアンギオテンシンII AT2レセプターの発現、Peptides, 13, 783〜6、Kimura他、創傷治癒の間のラットにおける皮膚アンギオテンシンIIレセプターの変化、Biochem. Biophys. Res. Commun., 187, 1083〜90。これらの研究は成体ラット（本明細書中で報告された実験において使用された）で行われ、AT1レセプターは切開損傷後変化する。これらの後者の研究における実験設計は、真皮および他の創傷部位を識別していない。
【００３５】
多くの実験で、その活性を評価するためにAII（1-7）が注目されている。AT2レセプターによる作用にはAII（1-7）が多数影響している。しかし、これは、試験された組織と一致も依存もしていない。
【００３６】
AII（1-7）は、AIIの多くには影響しない。AII（1-7）は、昇圧活性を欠くかまたは試験モデルおよび投与ルートに依存する血圧に対して非常に穏やかな（AIIの用量の10,000〜100,000倍で有効）効果を有する。実際、AII（1-7）は、プロスタノイド合成によって媒介され得る血圧に対する降圧効果を有する。さらに、AIIの効果に対して、AII（1-7）は、カテコールアミン放出およびアルドステロン放出を引き起こさず、口渇誘発性ではない：Webb他、1992、ラットの褐色細胞腫細胞におけるアンギオテンシンIIのII型レセプターの分子特性、Peptides, 13, 499〜508、Cheng他、1994、ネコの肺血管床におけるアンギオテンシンI、IIおよびIIIに対する昇圧反応の比較、Am. J. Physiol., 266, H2247〜H2255、Moriguchi, A.他、1994、マウスRen-2遺伝子を保有するトランスジェニックラットにおける中枢神経系のバソプレシン調節の相違、Am. J. Physiol., 267, R786〜R791、Schiavone他、1990、アンギオテンシン（1-7）−脳における新規の作用の証明、J. Cardiovascular Pharmacol., 16（増刊４）, S19〜S24、Ferrario他、1991、アンギオテンシン（1-7）−アンギオテンシン系の新規のホルモン、Hypertension, 19（増刊III）, III-126〜III-133。
【００３７】
ある報告では、AII（1-7）は、AIIに匹敵する反応を得るためにはAIIの約10,000倍量のAII（1-7）を必要とするほど昇圧作用が弱い：Benter他、1993、アンギオテンシン（1-7）の心臓血管作用、Peptides, 14, 679〜684。この系では、AII（1-7）は、用量依存性の長期降圧効果を有した。AII（3-7）は、AII（1-7）よりも昇圧効果が少ないが、降圧効果はない。AII（1-7）、AII（2-7）およびAII（3-7）がドーパミン系および記憶に影響を与え得ることもまた特筆すべきである。
【００３８】
いくつかの系において、AII（1-7）の作用はAII由来であることは非常に明白である。AIIは、AT1レセプターによるラットメサンギウム細胞におけるコリン産生を刺激し、AII（1-7）およびAII（1-6）は、このパラメーターに対して非常に弱い効果しか有さない：Pfeilschifter他、1992、ラット腎メサンギウム細胞におけるホスホリパーゼＤのアンギオテンシンII刺激は、AT1レセプター亜類型によって媒介される、Eur. J. Pharmacol., 225, 57〜62。
【００３９】
ブタ大動脈内皮細胞では、AIおよびAII（1-7）はプロスタグランジンE2およびI2の放出を刺激したが、AIIはこの効果を有さなかった：Jaiswal他、1992、アンギオテンシンペプチドによる内皮細胞のプロスタグランジン産生の刺激、レセプターの特徴付け、Hypertension, 19（増刊II）, II-49〜II-55。AIIは、他の細胞型および無傷の血管におけるプロスタノイドの放出を刺激することができるが、ヒトまたはブタの内皮細胞を刺激することができない。内皮細胞に対する効果は、AT1とAT2とを区別するレセプターによる。
【００４０】
ラット糸球体調製物において、AIIは、ATIレセプターによって、ヒスタミン、セロトニンおよび副甲状腺ホルモンに対する反応におけるcAMPの形成を阻害する：Edwards, R.M.およびE.J. Stack、1993、アンギオテンシンIIは、アンギオテンシンIIレセプター亜類型１（AT1）を介する糸球体アデニル酸シクラーゼを阻害する、J. Pharmacol. Exper. Ther., 266, 506〜510。AII（1-7）は、この効果を有さない。
【００４１】
ブタ血管性平滑筋細胞およびヒト神経膠星状細胞において、AIIおよびAI（1-7）はプロスタグランジン放出を増加させ、アンギオテンシンIIのみが細胞内Ca2+の放出を増加させる：Jaiswal他、1993、ブタ大動脈平滑筋細胞におけるアンギオテンシンペプチドによる調節の相違−関連するアンギオテンシンレセプターの亜類型、J. Pharmacol. and Exp. Therapeutic., 265, 664〜673、Jaiswal他、1991、亜類型２アンギオテンシンレセプターは、ヒト神経膠星状細胞におけるプロスタグランジン合成を媒介する、Hypertension, 17, 1115〜1120。
【００４２】
AII（1-7）は、おそらく一酸化窒素によって、ブタ冠状動脈リングを膨張させる：Porsti他、1994、アンギオテンシン（1-7）によるブタ環状内皮細胞からの一酸化窒素の放出−新規のアンギオテンシンレセプターの関連、Br. J. Pharmacol., 111, 652〜654。これは、AII、AIIIまたはAII（3-8）では認められなかった。この効果は、AT1またはAT2レセプターのアンタゴニストによって減少しない。
【００４３】
AIIは、ラットから単離した結節性ガングリオンの脱分極を引き起こすが、AII（1-7）では引き起こさない：Widdop他、1992、ラットから単離した結節性ガングリオンに対するアンギオテンシンペプチドの電気生理学的反応、Clin. and Exper. Hyper-Theory and Practice, A14, 597〜613。実際、AII（1-7）は、脳機能に対して新規の作用を有する：Schiavone他、1990、アンギオテンシン（1-7）−脳における新規の作用の証明、J. Cardiovascular Pharmacolo., 16,（増刊４）,S19〜S24。
【００４４】
AII（1-7）には、近位細管細胞におけるバソプレシンの放出およびホスホリパーゼA2活性の調節などをAIIと共有する活性が存在する：Andreatta-Van Leyen, S.他、1993、アンギオテンシン（1-7）によるホスホリパーゼA2活性およびナトリウム輸送の調節、Kidney International, 44, 932〜6、Moriguchi, A.他、1994、マウスRen-2遺伝子を保有するトランスジェニックラットにおける中枢神経バソプレシンの調節の相違、Am. J. Physiol., 267, R786〜R791、Ferrario他、1991、アンギオテンシン（1-7）−アンギオテンシン系の新規のホルモン、Hypertension, 19（増刊III）,III-126〜III-133。しかし、これらの活性は創傷治癒に関与しないようである。
【００４５】
AIIの他のフラグメントの効果を研究した例は非常に少ない。室傍核中のほとんどのニューロンはAng（1-7）、AIIおよびAIIIによって励起されるが、AII（1-7）はこの効果は比較的弱く、いくつかのニューロンにおいて、AII（2-7）は不活性である：Ambuhl他、1992、室傍核ニューロンに対するアンギオテンシン類似体およびアンギオテンシンレセプターの効果、Regulatory Peptides, 38, 11〜120。側脳室に注入されたAIIは、運動性、常同症および回避条件付け反応の習得を増大させ、AII（1-6）およびAII（2-6）は、これらの精神作用性活性において活性ではない：Holy, Z.他、1993、Polish J. Pharmacol., 45, 31〜41。
【００４６】
AII（4-8）、AII（5-8）およびAII（1-4）は、ラットの間脳前部に注入した場合、水の取り込みに対してわずかな効果を示すのみであり、AII（1-7）は完全に不活性である：Fitzsimmons, J.T.、1971、ラットの間脳に注入したアンギオテンシンIIのペプチド前駆体および短鎖ペプチドフラグメントの飲用に対する効果、J. Physiol., 214, 295〜303。ラットにおけるAIIフラグメント（AII（4-8）およびAII（5-8））の脳室内融合では、AIIで血圧が上昇した濃度よりも1,000倍の高い濃度で投与した場合でさえも、血圧に対して最小の結果しか得られなかった：Wright他、1989、ラットにおける昇圧作用の脳アンギオテンシン調節の構造−機能分析、Am. J. Physiol., 257, R1551〜R1557。これらの両研究において、フラグメントを脳に直接注入するが、これは、高度に人工的であり、全身性の代謝をさせない。
【００４７】
本発明の方法によれば、本明細書中で開示された１つまたはそれ以上の活性AII類似体を、組織の治癒速度を増大させるのに十分な量で創傷組織に適用する。これらの化合物は、in vivoでのナノモルレベルでの治癒速度を有為に促進することができる。任意に投与した活性因子により、日常の実験のみを経験的に用いて処方物投与のための至適濃度を容易に決定することができる。一般に、本発明による使用のために適切な活性因子の量は、約0.001μg〜約10mg／kg体重の範囲である。
【００４８】
本発明の化合物は、種々の溶液中で適用することができる。本発明による使用のために適切な溶液は、滅菌した可溶性の十分量のペプチドであり、これは創傷組織に有害ではない。これに関して、本発明の化合物は非常に安定であるが、強酸および強塩基によって水和される。本発明の化合物は、pH5〜8で有機溶媒または水溶液に溶解する。
【００４９】
組織に活性因子を流入させる間中、任意の型の適用手段を使用することができる。例えば、水溶液をガーゼの包帯または細片によって創傷組織に適用することができるであろう。またはそのような溶液を、一定時刻に灌流できるように処方することができるであろう（リポソーム、外用薬、ミセルなどを用いる）。本発明の化合物を有するこれらの処方物の製造法は、当業者には自明である。本化合物はナノモル量で存在したとしても組織修復効果を得ることができるので、使用された活性因子の特定の濃度は重要ではない。
【００５０】
好ましくは、１ng/ml〜5,000μg/ml、10〜500μg/mlまたは30〜500μg/mlの濃度範囲の活性因子を含む基質溶液またはミセル溶液を使用する。好ましく、都合の良い濃度範囲は、少なくとも30μg/mlである。記載の実施例で都合よく使用されている特定の基質溶液は、Hydro Med Science, New Brunswick, New Jerseyから商標HYDRONとして市販されている半固形ポリエチレングリコールポリマーである。別の好ましい溶液は、BASF, Ludwigshafen, Germanyから商標名PLURONICS F108として市販されているミセル溶液である。室温条件下では、この溶液は液体であるが、温かい組織に適用されると、この溶液は、数日間創傷組織に活性因子を注入することが可能なゲルが形成される。他の好ましい処方物には、カルボキシメチルセルロース調製物、晶質調製物（例えば、生理食塩水、リンゲル乳酸塩溶液、リン酸緩衝化生理食塩水など）、粘弾性物質、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよび創傷手当て用具（dressing）（例えば、包帯など）が含まれる。
【００５１】
本発明の化合物の治癒効果は、種々の例において得ることができる。溶液は、潰瘍、外傷、損傷、糖尿病による潰瘍、火傷、外傷、うっ血性潰瘍、歯周病、裂傷および他の病気の治療において創傷組織の表面に局所投与することができる。さらに、侵襲性の手術などによる腹腔内の創傷組織は、本発明の組成物で治療して創傷治癒を促進することができる。例えば、結腸または他の組織の切開による手術的な除去後、手術面を、手術部位を閉じる前に内部毛細管灌流および治癒を促進するために活性因子の溶液で被覆することができる。さらに、局所化治癒の速度は、活性因子の注入または他の皮下投与によって増加させることができる。
【００５２】
本明細書中で開示された構造を有するアンギオテンシンIIの類似体およびアンギオテンシンIIフラグメントの類似体を、自動化ペプチド合成機および当業者によく知られている方法を用いて調製した。各類似体を、以下に記載の方法によって、創傷治癒の促進能力について試験した。この手順の結果を使用して、２、４、７、および９日目で、ベヒクル処理コントロール創傷％として計算して創傷の閉じ程度を同定した。同一の実験手順の間に全ての類似体が試験されていないので、AIIを、試験したペプチドの各群のコントロールとして含めた。
【００５３】
本発明は、添付の実施例を参照してよりよく理解することができるが、これは、例示のみが目的とされており、本発明の任意の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、本発明は、本明細書に添付の請求項で規定される。以下に記載の実験結果は、創傷治療用の本発明の組成物の一般的な利用を確立する。
【００５４】
以下の実施例は、本明細書中に開示の構造を有するアンギオテンシン類似体がin vivo治癒アッセイにおいて予想外に良好な活性を示したことを示すために使用した方法を記載する。
【００５５】
（実施例１）
創傷治癒組成物の使用
12週齢の雌のSprague Dawleyラットを、Simonsen Laboratories, Gilroy, Californiaから得た。手術当日、手術を行う前にラットにケタミン／ロンプン麻酔を筋肉注射した。ラットの毛を剃り、ベタジンを擦り込んだ。ラットの背部表面に、十分な厚さの1.5×1.5cm皮膚創傷を２つ作製した。皮膚の切除後、ガラススライドに創傷のサイズの輪郭を描き、薬物を、0.05Mリン酸緩衝液（pH 7.2）中100μlの10％カルボキシメチルセルロースにて投与した。試験物質を、無作為な様式で投与した。全ての物質は、100μg／創傷で試験した。コントロールを、ベヒクルのみで処理した。物質の投与後、ラットに包帯をし、麻酔から解放した。手術後の最初の５日間毎日薬物を投与した。２、４、７および９日目で、メトキシフルラン麻酔（Pittman-Moore, Mundelein, IllinoisよりMetofaneとして市販されている）をして測定した。創傷領域を、（１）グラフ用紙（１×１mm方眼）に創傷の形を写し、（２）その形を切り取り、（３）用紙を秤量して1.5×1.5cmに切り取った用紙の重量と比較し、そして（４）方眼の数を計数することによって同定した。さらに、２および４日目での肉芽組織の領域を同様に同定した。
【００５６】
図１〜図６および図１３に示すように、試験化合物を上記の一般式の類似体１〜８で処理した場合、創傷の閉じは、コントロール創傷と比較して実質的に促進された。図１〜図６および図１３に示すように、全ての場合において、１つの類似体の投与により、手術後の少々の閉じが促進された。図７〜図１２は、肉芽組織の形成におけるコントロール形成％を示す。全ての場合において、１つの類似体の投与は、ベヒクルのみの投与と比較して肉芽組織形成が促進された。これらの結果は、本発明のアミノ酸配列を有するAII類似体またはAIIフラグメントの類似体を使用するとどのように創傷治癒が促進することができるのかを示す。さらに、これらの結果は、本発明の組成物が十分な厚さの創傷の治癒用の予想外に強力なプロモーターとして特徴づけられたことを確証する。
【００５７】
上記記載から、当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、且つ種々の利用および条件に本発明を適用することができる。形態の変化および等価物の代用は、その状況によって便法を示唆するか与えるものとして意図される。本明細書中で特定の用語が使用されているが、それらは、意味の説明を意図するものであって、限定を目的するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 AIIまたは(TyrPO3)2 4-AIIを使用したベヒクル処理コントロールと創傷の閉じにおいて比較したコントロール反応％を示す図である。
【図２】 AIIまたは類似体GSD-39Bを使用したベヒクル処理コントロールと比較した創傷の閉じにおけるコントロール反応％を示す図である。
【図３】 AIIまたは類似体GSD-40Bを使用したベヒクル処理コントロールと比較した創傷の閉じにおけるコントロール反応％を示す図である。
【図４】 AIIまたは類似体GSD-41Bを使用したベヒクル処理コントロールと比較した創傷の閉じにおけるコントロール反応％を示す図である。
【図５】 AIIまたは類似体GSD-28を使用したベヒクル処理コントロールと比較した創傷の閉じにおけるコントロール反応％を示す図である。
【図６】 AIIまたは類似体GSD-39AおよびGSD-40Aを使用したベヒクル処理コントロールと比較した創傷の閉じにおけるコントロール反応％を示す図である。
【図７】 コントロールおよびAIIまたは(TyrPO3)2 4-AIIのいずれかで処理した試験創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。
【図８】 コントロールおよびAIIまたは類似体GSD-39Bのいずれかで処理した試験創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。
【図９】 コントロールおよびAIIまたは類似体GSD-40Bのいずれかで処理した試験創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。
【図１０】 コントロールおよびAIIまたは類似体GSD-28のいずれかで処理した試験創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。
【図１１】 図１２に示したAII、GSD-39AまたはGSD-40Aのいずれかで処理した創傷についてコントロールとして使用したベヒクル処理創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。
【図１２】 AII、GSD-39AまたはGSD-40Aのいずれかで処理した試験創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。ベヒクル処理コントロールは、図１１に示した結果と一致している。
【図１３】 AII、AII(1-7)およびnorLeu3AII(9GD)を使用したベヒクル処理コントロールの創傷の閉じにおいて比較したコントロール反応％を示す図である。
【配列表】
（発明の分野）
本発明は、一般に、生化学分野および医学分野に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物の創傷治癒促進に有用な組成物および方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
哺乳動物の組織における創傷（すなわち、裂傷または開口）は、創傷表面での微小血管系の組織の破壊および凝固を引き起こす。このような組織の修復は、損傷に対する規則正しく調節された細胞反応を示す。全ての軟部組織創傷は、サイズに関係なく類似の様式で治癒する。組織の成長および修復は、酸素勾配の存在下で細胞増殖および血管形成が起こる生物学的機構である。組織修復の間に起こる連続的な形態学的および構造的変化は、非常に詳細に特徴づけられており、いくつかの例において定量されている：Hunt, T.K.他、血管形成および創傷治癒の凝固およびマクロファージ刺激、The surgical wound, 1〜18、F. Dineen & G. Hidrick-Smith編（Lea & Febiger, Philadelphia, 1981）。
【０００３】
細胞形態学は、異なる３つの領域からなる。中央の無血管性創傷腔は、酸素欠乏症、アシドーシスおよび過炭酸性であり、乳酸レベルが高い。創傷腔に隣接する領域は、線維芽細胞の分割によって群集する局所的貧血（虚血）の勾配領域である。先導領域の後部には、成熟線維芽細胞および多数の新規に形成された毛細血管（すなわち、新生血管形成）によって特徴づけられる活性コラーゲン合成領域である。この新血管成長（血管新生）が創傷組織の治癒に必要であるにもかかわらず、血管形成薬は、一般に組織修復に対して、長期間必要とされる付加的な生合成効果の要求を満たすことはできない。より迅速な治癒が必要な創傷（すなわち、重篤な火傷、手術による切開、裂傷および他の外傷）が存在するにも関わらず、現在、薬理学的因子を用いた創傷治癒の促進は、成功例が限られている。
【０００４】
DiZeregaに付与された米国特許第5,015,629号は、創傷組織の治癒速度を増加させる方法が記載されており、それには、治癒速度を増加させるのに十分量のアンギオテンシンII（AII）の創傷組織への適用が含まれている。創傷組織へのアンギオテンシンIIの適用は、創傷の治癒速度を有意に増加させ、より迅速な再上皮形成および組織修復を導く。用語「アンギオテンシンII」は、ヒトおよび他の種に存在する配列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号１）を有するオクタペプチドをいう。アンギオテンシンIIは、公知の昇圧薬であり、市販されている。
【０００５】
アンギオテンシンIII（AIII）は、AIIのＮ末端から１つのアミノ酸を除いたAII由来の生物学的に活性な化合物である。したがって、AIIIは、配列Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号２）を有する。AIIとAIIIには、明らかに構造的に関連があるにも関わらず、これらの分子は、ある範囲の機能的相違を示す。例えば、AIIは、ニューロンのノルエピネフリン放出（早期型減少の後遅延型増加を示す）を惹起する二相性効果を示す一方で、たった12分後にはノルエピネフリンの自発性放出が増大し、AIIIは、ニューロンのノルエピネフリンの惹起性および自発性放出の両方に二相性効果を示す：Vatta, M.S.他、1992、ラット副腎髄質におけるノルエピネフリンの取り込みおよび放出に対するアンギオテンシンIIおよびIIIの単相および二相性効果、Can. J. Physiol. Pharmacol., 70, 821。さらに、AIIおよびAIIIは、圧受圧器−聴覚反射に対して異なる影響を示す−AIIは反射の敏感性を増大させるが、AIIIは減少させる：Brattstrom, A.他、1992、孤束核内のニューロペプチドは、中枢神経性の心血管の制御プロセスを調節する、Progress in Brain Research, 91, 75。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の第１の態様は、創傷治癒促進に有用な組成物に関する。この組成物には、適切なキャリアまたは希釈剤、および一般式
R1-Arg-norLeu-R3-R4-His-Pro-R5（配列番号11）
R1-Arg-R2-Tyr(PO3)2-R4-His-Pro-R5（配列番号12）
R1-Arg- R2-homoSer-R4-His-Pro-R5（配列番号13）および
R1-Arg- R2-R3-norLeu-His-Pro-R5（配列番号14）
の任意の１つであり得る少なくとも５つの連続的なアミノ酸を有する少なくとも１つの化合物の創傷治癒を促進する量が含まれる。これらの一般式のうち、R1は、HまたはAspであり、R2は、ValまたはnorLeuであり、R3はTyr、Tyr(PO3)2、またはhomoSerであり、R4はIleまたはnorLeuであり、R5は、H、PheまたはIleである。
【０００７】
１つの実施形態によれば、化合物は、Asp-Arg-Val-Tyr(PO3)2-Ile-His-Pro-Phe（配列番号4）、Asp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号５）、Asp-Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe（配列番号６）、Asp-Arg-Val-homoSer-Ile-His-Pro-Phe（配列番号７）、Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号９）、Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe（配列番号10）またはAsp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro（配列番号15）のいずれかであり得る。異なる実施形態によれば、一般式のR5位は、水素部分で占められる。別の実施形態によれば、化合物は基質溶液（matrical solution）またはミセル溶液中に存在する。別の実施形態によれば、化合物は、１ng/ml〜5,000μg/mlの濃度、あるいは10〜500μg/mlの濃度、または30〜200μg/mlの濃度でキャリアまたは希釈剤中に分散される。好ましい実施形態では、化合物は、少なくとも30μg/mlの濃度でキャリアまたは希釈剤に存在する。本発明のさらに別の実施形態によれば、キャリアまたは希釈剤は、半固形（semi-solid）ポリエチレングリコールポリマー、カルボキシメチルセルロース調製物、晶質調製物（crystalloid preparations）、粘弾性物質（viscoelastics）またはポリプロピレングリコールのいずれかであり得る。特定の実施形態によれば、本発明の化合物は、創傷手当て用具上に配置される。
【０００８】
本発明の別の態様は、創傷治癒促進用の化合物に関する。本化合物は、好ましくは、一般式
R1-Arg-norLeu-R3-R4-His-Pro-R5（配列番号11）
R1-Arg-R2-Tyr(PO3)2-R4-His-Pro-R5（配列番号12）
R1-Arg- R2-homoSer-R4-His-Pro-R5（配列番号13）および
R1-Arg- R2-R3-norLeu-His-Pro-R5（配列番号14）
の任意の少なくとも１つであり得る少なくとも５つの連続的なアミノ酸を有する。これらの一般式のうち、R1は、HまたはAspであり、R2は、ValまたはnorLeuであり、R3はTyr、Tyr(PO3)2またはhomoSerであり、R4はIleまたはnorLeuであり、R5は、H、PheまたはIleである。１つの実施形態によれば、本発明の化合物は、Asp-Arg-Val-Tyr(PO3)2-Ile-His-Pro-Phe（配列番号4）、Asp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号５）、Asp-Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe（配列番号６）、Asp-Arg-Val-homoSer-Ile-His-Pro-Phe（配列番号７）、Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号９）、Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro-Phe（配列番号10）またはAsp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro（配列番号15）のいずれかで与えられたポリペプチド配列を有する。別の実施形態では、本発明の化合物は基質溶液またはミセル溶液中に存在する。別の実施形態では、化合物は、１ng/ml〜5,000μg/mlの濃度、あるいは10〜500μg/mlの濃度、または30〜200μg/mlの濃度でキャリアまたは希釈剤中に分散される。好ましい実施形態では、化合物は、少なくとも30μg/mlの濃度でキャリアまたは希釈剤中に存在する。本発明のさらに別の実施形態によれば、キャリアまたは希釈剤は、半固形ポリエチレングリコールポリマー、カルボキシメチルセルロース調製物、晶質調製物、粘弾性物質またはポリプロピレングリコールのいずれかであり得る。特定の実施形態によれば、本発明の化合物は、創傷手当て用具上に配置される。
【０００９】
本発明の別の態様は、創傷治癒を促進するための薬物の製造に関する任意の上記化合物の使用に関する。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、創傷治癒促進に使用するための任意の上記の化合物に関する。
【００１１】
本発明は、以下の添付の図面を参照して理解するとよりよく理解できる。
【００１２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明によれば、哺乳動物における創傷治癒は、本明細書中に開示の少なくとも１つのAII類似体（アナログ）の有効量を含む組成物の使用によって促進される。活性因子は、一般に、基質溶液またはミセル溶液で投与されて、非常に低い濃度でも再上皮形成および組織修復を促進するのに有効である。
【００１３】
本発明による特定の目的の活性なAII類似体およびAIIフラグメントの類似体は、一般式
R1-Arg-norLeu-R3-R4-His-Pro-R5（配列番号11）、
R1-Arg-R2-Tyr(PO3)2-R4-His-Pro-R5（配列番号12）、
R1-Arg-R2-homoSer-R4-His-Pro-R5（配列番号13）および
R1-Arg-R2-R3-norLeu-His-Pro-R5（配列番号14）（式中、R1は、HまたはAspであり、R2は、ValおよびnorLeuからなる群から選択され、R3はTyr、Tyr(PO3)2、およびhomoSerからなる群から選択され、R4はIleおよびnorLeuからなる群から選択され、R5は、PheおよびIleからなる群から選択される）
のいずれかであり得る少なくとも５つの連続したアミノ酸配列を含むことで特徴づけられる。
【００１４】
本発明の特に好ましい組成物には、以下の表１に示した配列を有するアンギオテンシン類似体が含まれる。意義深いことに、アンギオテンシンIIのフラグメントまたは類似体およびアンギオテンシンIIフラグメントの全てが本発明の組成物を都合よく特徴づける創傷治癒活性を有するわけではないことが明白である。例えば、AII(6-8)、His-Pro-PheおよびAII(4-8)、Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号３）を試験したところ、本発明者らのin vivoモデル系において創傷治癒の促進には有効ではないことが見出されている。
【００１５】
本発明によれば、他の特に好ましい組成物には、任意の配列番号11〜14のR5位が水素で占められているAII(1-7)の類似体が含まれる。さらに他の特に好ましい組成物には、配列番号11〜14の配列の最初の２つのＮ末端が水素で置換されているAII(3-8)の類似体が含まれる。従って、これらの後者のものでは、分子のアミノ末端がnorLeuまたはValである。AII(3-8)もまた「AIV」として公知であることが特記すべきである。
【００１６】
上記の式では、アミノ酸残基の標準的な３文字表記を用いた。それに対して、表示はしていないが、Ｌ型アミノ酸を意味する。
【００１７】
AIIおよびその類似体は、γまたはβターンのいずれかを採用していることが示唆されている（Regoli, D.他、1974、アンギオテンシンの薬理学、 Pharmacological Reviews, 26, 69）。一般に、R2、R4位における中性側鎖および分子の第７位のアミノ酸分子Proは、R3位の活性基の間の適切な距離の維持に関与しているであろうと考えられている。HisおよびR5残基は、主に、レセプターへの結合および／または内因性活性を担う。R2位、R4位およびR5位における疎水性側鎖はまた、ペプチドの全コンフォメーションに重要な役割を果たし、そして／または仮説上の疎水性ポケットの形成に寄与し得る。
【００１８】
分子の第２番目のアミノ酸のArg側鎖は、標的レセプターの化合物との親和性に関与し、および／またはペプチドのコンフォメーションにおいて重要な役割を果たし得る。
【００１９】
本発明の目的のために、R2は、R4（γターンモデル）またはHis（βターンモデル）との直鎖または非直鎖水素結合の形成に関与し得ると考えられる。R2はまた、β逆平行構造（これもまた、可能な構造として示唆されている）中の第１のターンに関与しているだろう。上記の一般式の他の位置と対照的に、βおよびγ分枝は、この位置において等しく影響を及ぼすようである。さらに、１つの水素結合で、比較的安定なコンフォメーションを維持するのに十分であり得る。従って、R2は、ValおよびnorLeuから適切に選択することができる。
【００２０】
R3に関して、コンフォメーション分析によって、この位置（ならびにR2およびR4）における側鎖が、レセプターの占有および刺激に重要であると考えられる疎水性クラスターに寄与することが示唆されている。従って、R3は、Tyr、Tyr(PO3)2およびhomoSerから選択されることが好ましい。
【００２１】
R4位では、β脂肪族または脂環鎖を有するアミノ酸が特に望ましい。従って、この位置におけるアミノ酸は、IleおよびnorLeuから選択されることが好ましい。
【００２２】
本発明による特定の目的の類似体では、分子の第６番目のアミノ酸は、Hisで占められる。ヒスチジンのイミダゾール環の独特の特性（例えば、生理学的pHでのイオン化、プロトンドナーまたはアクセプターとして作用する能力、芳香族としての特性）は、分子のこの位置でのその特定の利用性に寄与していると考えられる。例えば、コンフォメーションモデルは、Hisが水素結合形成（βモデル）または分子の第７番目の位置のアミノ酸でのProの配向への影響による逆平行構造の第２のターンに関与し得ることを示唆する。
【００２３】
分子の第８番目のアミノ酸位置では、目的の類似体のレセプターへの結合に疎水性側鎖が特に有用である。最も好ましくは、分子の第８番目の位置としてR5は、PhaまたはIleから選択される。
【００２４】
以下に記載のように、ペプチド類似体は、本明細書中で、上付き文字で示された位置でのアミノ酸置換を有するAIIの類似体またはAIIフラグメントの類似体として選択的に同定された。従って、例えば、（TyrPO3)2 4-AIIは、AIIの第４番目の位置で置換された（TyrPO3)2残基を有するAII類似体を示す。
【００２５】
本発明の実施における類似体は、以下を含むことが特に好ましい。
【００２６】
【表１】
アンギオテンシンIIは、公知の最も強力な血管収縮剤の１つであり、分枝した小動脈の収縮を引き起こして毛細管（すなわち、細動脈）を形成する。アンギオテンシンの生物学的形成は、血漿基質アンジオテンシノーゲンに対するレニンの作用によって開始される。このようにして形成された物質は、アンギオテンシンIと呼ばれるデカペプチドで、これは、アンギオテンシンIからＣ末端のHis-Leu残基を取り去る転換酵素アンジオテンシナーゼによってアンギオテンシンIIに変換される。
【００２８】
いくつかの研究によって、レニン−アンギオテンシン系の血管作用性産物AIIが創傷治癒に関連する成長因子の放出、有糸分裂誘発、走化性および培養細胞の細胞外物質の放出を増加させることが示されている：Dzau, V.E.他、1989、血管成長および心成長の調節におけるアンギオテンシンの分子機構、J. Mol. Cell. Cardiol., 21（増刊III）, S7、Berk, B.C.他、1989、アンギオテンシンIIは、培養血管性平滑筋細胞におけるタンパク質合成を刺激する、Hypertension, 13, 305, 14、Kawahara, Y.他、1988、アンギオテンシンIIは、培養血管性平滑筋細胞におけるプロテインキナーゼCの活性化およびカルシウムイオン動員によってc-fos遺伝子発現を誘導する、BBRC, 150, 52〜9、Naftilan, A.J.他、1989、培養ラット血管性平滑筋細胞におけるアンギオテンシンIIによる血小板由来の成長因子A鎖およびc-myc遺伝子発現の誘導、J. Clin. Invest, 83, 1419〜24、Taubman, M.B.他、1989、アンギオテンシンIIは大動脈性平滑筋におけるc-fos mRNAを誘導する、Ｃａ2+動員およびプロテインキナーゼC活性化の役割、J. Biol. Chem., 264, 526〜530、Nakahara, K他、1992、ウサギ血管性平滑筋における３つの型のPDGF-A鎖遺伝子転写物の同定および発達中およびアンギオテンシンIIによるそれらの発現の調節、BBRC, 184, 811〜8、Stouffer, G.A.およびG.K. Owens, 1992、自然発症高血圧ラット由来の培養平滑筋細胞の有糸分裂誘発を誘導するアンギオテンシンIIは、トランスホーミング増殖因子βのオートクライン産生に依存する、Circ. Res., 70, 820、Wolf, G.他、1992、アンギオテンシンIIは、培養海生動物メサンギウム細胞におけるI型コラーゲンの増殖および生合成を刺激する、Am. J. Pathol., 140, 95〜107、Bell, L.およびJ.A. Madri, 1990、内皮細胞および平滑筋細胞移動に対するアンギオテンシン系の影響、Am. J. Pathol, 137, 7〜12。さらに、AIIは、ウサギ角膜およびニワトリ絨毛漿尿膜モデルで血管形成することが示された：Fernadez, L.A.他、1985、アンギオテンシンIIによって産生された新血管新生、J. Lab. Clin. Med., 105, 141、LeNoble, F.A.C.他、1991、アンギオテンシンIIは、ニワトリ胚の漿尿膜における血管形成を刺激する、Eur. J. Pharmacol., 195, 305〜6。従って、AIIは、新血管新生、成長因子放出、再上皮形成および細胞外マトリックスの産生の増加によって創傷修復を促進することができる。損傷組織への血流および栄養分の流れの増加によって、AIIは創傷修復の速度を増加させることができる。AIIはまた、創傷部位での成長因子の産生によって創傷修復を促進することができる。成長因子の外来的添加は、種々の機構によって創傷修復を促進することが示されている：Grotendorst, G.R.他、1985、正常および糖尿病ラットにおける血小板由来の成長因子による肉芽組織形成の刺激、J. Clin. Invest., 76, 2323〜9、Mustoe, T.A.他、1987、ラットにおける切開創傷の治癒の促進は、増殖因子βの形質転換によって誘導される、Science, 237, 1333〜5、Pierce, G.F.他、1988、in vivo切開創傷治癒は、血小板由来の成長因子および組換えc-sis遺伝子ホモ二量体タンパク質によって増加する、J. Exp. Med., 157, 974〜87、Lynch, S.E.他、1989、創傷治癒における成長因子、J. Clin. Invest., 84, 640〜6、Greenhalgh, D.G.他、1990、PDGFおよびFGFは、遺伝性糖尿病マウスにおける創傷治癒を刺激する、Am. J. Pathol., 136, 1235〜46。最近の研究で、AIIは、創傷後の頚動脈および大動脈における新血管内膜形成を増大させることが示された：Powell, J.S.他、1989、アンギオテンシン転換酵素のインヒビターは、血管損傷後の筋内膜増殖を防止する、Science, 245, 186〜8、Powell, J.S.他、1991、血管損傷に対する増殖反応は、変換酵素阻害によって抑制される、J. Cardiovasc. Pharmacol., 16（増刊４）, S42〜9、Capron, L.他、1991、バルーンカテーテルを用いたラット胸大動脈損傷反応に対するラミプリル（アンギオテンシン変換酵素のインヒビター）の効果、J. Cardiovasc. Pharmacol., 18, 207〜11、Osterriedes, W.他、1991、ラットにおける損傷誘導性新血管内膜形成に対するアンギオテンシンIIの役割、Hypertension, 18, 増刊1160〜64、Daemen, M.J. A.P.他、1991、アンギオテンシンIIは、正常および損傷ラットの動脈壁における平滑筋細胞増殖を誘導する、Circ. Res., 68, 450〜6。これらの観察結果として、内因性AIIが血管内膜過形成を誘導し得る機構を同定する研究が行われた。AIIは、平滑筋細胞、線維芽細胞および内皮細胞のマイトジェンとして作用することが示された：Schelling, P.他、1979、3T3細胞およびSV3T3細胞における細胞成長およびレニンに対するアンギオテンシンIIおよびアンギオテンシンIIアンタゴニストであるサラリシンの効果、J. Cell. Physiol., 98, 503〜13、Campbell-Boswell, M.およびA.L. Robertson、1981、in vitroでのヒト平滑筋細胞に対するアンギオテンシンIIおよびバソプレシンの効果、Exp. Mol. Pathol., 35, 265〜76、Emmett, N.他、1986、3T3細胞成長および増殖に対するサララシン（アンギオテンシンIIのアンタゴニスト）の効果、J. Cell. Biol., 103, 171（要約）、Paquet, J. L.他、1990、自発性高血圧ラットの大動脈筋細胞のアンギオテンシンII誘導性増殖、J. Hypertens., 8, 565〜72、Dzau他、前出。AIIはまた、血管性平滑筋細胞のタンパク質含有量およびサイズを増加させた：Berk他、1989、前出、Geisterfer, A.A.T.他、1988、アンギオテンシンIIは、培養ラット大動脈平滑筋細胞の過形成ではなく肥大を誘導する、Cir. Res., 62, 749〜56。AIIは、PDGF、ヘパリン結合性EGFおよびトランスホーミング増殖因子β（TFGβ）を含む種々の型の成長因子および平滑筋細胞、内皮細胞および心線維芽細胞由来の増殖関連プロトオンコジーンの放出を増加させることが研究で示された：Kawahara他、1988、前出、Naftilan, A.J.、1992、血管性平滑筋細胞成長におけるアンギオテンシンIIの役割、J. Cardiovas. Pharmacol., 20, S37〜40、Naftilan他、1989、前出、Taubman他、1989、前出、Nakahara他、1992、前出、Temizer他、1992、前出、Gibbons, G.H.他、1992、血管性平滑筋細胞の肥大と過形成、オートクライントランスホーミング増殖因子β１発現は、アンギオテンシンIIに対する成長反応を決定する、J. Clin. Invest., 90, 456〜61、Bell, L.他1992、ウシ大動脈性内皮細胞の移動およびプラスミノゲンアクチベーターのオートクラインアンギオテンシン系の調節は、プロトオンコジーンpp60C-src発現の調節に影響する、J. Clin. invest., 89, 315〜20、StoufferおよびOwens、1992、前出。AIIによる血管性平滑筋細胞の肥大は、PDGFによって媒介される：Berk, B.C.およびG.N. Rao、1993、アンギオテンシンII誘導性血管性平滑筋細胞肥大−PDGF A鎖はサイズの増大を媒介する、J. Cell. Physiol., 154, 368〜80。
【００２９】
従って、AIIは、創傷組織におけるこれらの成長因子のレベルを増加させることによって創傷治癒を促進させるように作用すると考えられる。さらに、AIIは、コラーゲン合成を刺激することが示されており、これは、細胞外マトリックス形成におけるこれらの因子の役割を示唆している：Wolf, G.他、1991、培養近位尿細管細胞におけるアンギオテンシンII誘導性細胞肥大後の転写の細胞内シグナリングおよびIV型コラーゲンの分泌、Cell. Reg., 2, 219〜27、Wolf他、1992、前出、Zhou, G.他、1992、アンギオテンシンIIは、培養心線維芽細胞におけるコラーゲン合成刺激を媒介した、FASEB. J., 6, A1914。創傷修復はまた、創傷ベッドへの必要な細胞型の走化性に影響する。AIIはまた、in vitroでの内皮細胞および平滑筋細胞の移動を誘導することが示された：BellおよびMadri、1990、前出。
【００３０】
最近の研究では、AIIレセプターの発現が、創傷修復プロセスの間に変化することもまた示されている：Viswanathan, M.およびJ.M. Saavedra、1992、実験的創傷治癒の間のラットの皮膚におけるアンギオテンシンII AT2レセプターの発現、Peptides, 13, 783〜6、Kimura, B.他、1992、ラットにおける創傷治癒の間の皮膚アンギオテンシンIIレセプターの変化、BBRC, 187, 1083〜1090。修復部位でのAIIの局所産生の増加に関するこれらの変化は、AIIが創傷修復プロセスおいて鍵となる役割を果たし得ることを示唆する。
【００３１】
最近、創傷治癒に関与し得るAIIの作用が概説されている：Phillips他、1994、ラットの皮膚におけるトランスホーミング増殖因子βのアンギオテンシンレセプター刺激およびアンギオテンシンレセプターにおける創傷治癒（JM SaavedraおよびPBMWM Timmermans編）、Plenum Press, New York, NY, 377〜396。報告された研究の大多数が、これらの効果がAT1レセプターによって媒介されることを示している。
【００３２】
AIIの血圧への影響（およびアルドステロン分泌および口渇の増大などの最も多い他の影響）は、１型レセプター（AT1レセプター）によって媒介される：Wong, PC. 1994、アンギオテンシンレセプターにおける高血圧モデルにおけるアンギオテンシンアンタゴニスト（JM SaavedraおよびPBMWM Timmermans編）、Plenum Press, NY, NY, 319〜336、MacKenzie他、1994、TCV116は、ラットにおいて広範な腎切除に伴う腎損傷の進行を防止する、J. Hypertension, 12（増刊９）, S11〜Ｓ16、Gupta他、1995、副腎に局所的に産生されたアンギオテンシンIIは、基底のコルチコトロピンおよびカリウム刺激性アルドステロン分泌を調節する、Hypertension, 25, 443〜448、Llorens-Cortes他、1994、１型アンギオテンシンIIレセプターの組織発現および調節は、定量的な逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応分析によって亜類型を検査する、Hypertension, 24, 538〜548、Wong他、1992、ラットにおけるPD 123177によるロサルタン（Dup 753）誘導アンギオテンシンIIレセプター拮抗作用の促進、Eur. J. Pharmacol, 220, 267〜70。この結論は、レセプター亜類型特異的アンタゴニストによるAII作用のブロッキングに基づく。
【００３３】
血管損傷および修復の２つの実験モデルにおけるAIIおよびAIIアンタゴニストの影響が試験されている。いくつかの研究によって、血管系のバルーン損傷後の血管の過形成とAT2との関与が結びつけられている。ラットの頚動脈において、大多数のレセプターはAT2である：Pratt, RE他、1992、アンギオテンシンレセプターのAT2イソ型は、血管損傷後の筋血管内膜の過形成を媒介する、Hypertension, 20, 432。それに対して、損傷したラット胸大動脈の新血管内膜細胞は、独占的にAT1レセプターを発現する：Viswanathan, M.他、バルーン血管形成術は、ラット大動脈の新血管内膜におけるアンギオテンシンII亜類型AT1レセプターの発現を促進する、J. Clin. Invest., 90, 1707〜12、1992。PD 123319（AT2特異的アンタゴニスト）を用いたラットの処理により、血管内膜の過形成が73％まで減少する一方で、ロサルタン（AT1特異的アンタゴニスト）処理では、血管内膜の領域は95％までの減少であった、Pratta他、1992、前出。類似のモデルにおいて、14日間脈管周囲に融合させたCGP 42112（AT2アンタゴニスト）は新血管内膜形成を防止するが、低用量のロサルタンでは有効ではなかった：Janiak他、1992、血管損傷後の新血管内膜形成におけるアンギオテンシン亜類型２レセプターの役割、Hypertension, 20, 737〜45。他の研究では、高用量でのロサルタンは有効であることが見出された：Forney Prescott他、1991、アンギオテンシン変換酵素インヒビター対アンギオテンシンII（AT1レセプターアンタゴニスト）、バルーンカテーテル損傷後の平滑筋細胞移動および増殖に対する影響、Am. J. Pathol., 139, 1291〜6、Kauffman他、1991、ロサルタン（非ペプチドアンギオテンシンII（Ang II）レセプターアンタゴニスト）は、ラット頚動脈へのバルーン損傷後の新血管内膜形成を阻害する、Life Sci., 49, 223〜228。従って、両レセプター亜類型は、バルーン損傷後の血管外傷形成の役割を果たし得ると考えられる。
【００３４】
幼若動物における実験的創傷治癒の間、AIIレセプターの発現は、創傷周囲の皮膚表面の真皮内組織の局所化バンドにおいて有意に増加し、主要な増加の比率はAT2レセプターによるものである：Viswanathan他、1992、実験的創傷治癒の間のラットの皮膚におけるアンギオテンシンII AT2レセプターの発現、Peptides, 13, 783〜6、Kimura他、創傷治癒の間のラットにおける皮膚アンギオテンシンIIレセプターの変化、Biochem. Biophys. Res. Commun., 187, 1083〜90。これらの研究は成体ラット（本明細書中で報告された実験において使用された）で行われ、AT1レセプターは切開損傷後変化する。これらの後者の研究における実験設計は、真皮および他の創傷部位を識別していない。
【００３５】
多くの実験で、その活性を評価するためにAII（1-7）が注目されている。AT2レセプターによる作用にはAII（1-7）が多数影響している。しかし、これは、試験された組織と一致も依存もしていない。
【００３６】
AII（1-7）は、AIIの多くには影響しない。AII（1-7）は、昇圧活性を欠くかまたは試験モデルおよび投与ルートに依存する血圧に対して非常に穏やかな（AIIの用量の10,000〜100,000倍で有効）効果を有する。実際、AII（1-7）は、プロスタノイド合成によって媒介され得る血圧に対する降圧効果を有する。さらに、AIIの効果に対して、AII（1-7）は、カテコールアミン放出およびアルドステロン放出を引き起こさず、口渇誘発性ではない：Webb他、1992、ラットの褐色細胞腫細胞におけるアンギオテンシンIIのII型レセプターの分子特性、Peptides, 13, 499〜508、Cheng他、1994、ネコの肺血管床におけるアンギオテンシンI、IIおよびIIIに対する昇圧反応の比較、Am. J. Physiol., 266, H2247〜H2255、Moriguchi, A.他、1994、マウスRen-2遺伝子を保有するトランスジェニックラットにおける中枢神経系のバソプレシン調節の相違、Am. J. Physiol., 267, R786〜R791、Schiavone他、1990、アンギオテンシン（1-7）−脳における新規の作用の証明、J. Cardiovascular Pharmacol., 16（増刊４）, S19〜S24、Ferrario他、1991、アンギオテンシン（1-7）−アンギオテンシン系の新規のホルモン、Hypertension, 19（増刊III）, III-126〜III-133。
【００３７】
ある報告では、AII（1-7）は、AIIに匹敵する反応を得るためにはAIIの約10,000倍量のAII（1-7）を必要とするほど昇圧作用が弱い：Benter他、1993、アンギオテンシン（1-7）の心臓血管作用、Peptides, 14, 679〜684。この系では、AII（1-7）は、用量依存性の長期降圧効果を有した。AII（3-7）は、AII（1-7）よりも昇圧効果が少ないが、降圧効果はない。AII（1-7）、AII（2-7）およびAII（3-7）がドーパミン系および記憶に影響を与え得ることもまた特筆すべきである。
【００３８】
いくつかの系において、AII（1-7）の作用はAII由来であることは非常に明白である。AIIは、AT1レセプターによるラットメサンギウム細胞におけるコリン産生を刺激し、AII（1-7）およびAII（1-6）は、このパラメーターに対して非常に弱い効果しか有さない：Pfeilschifter他、1992、ラット腎メサンギウム細胞におけるホスホリパーゼＤのアンギオテンシンII刺激は、AT1レセプター亜類型によって媒介される、Eur. J. Pharmacol., 225, 57〜62。
【００３９】
ブタ大動脈内皮細胞では、AIおよびAII（1-7）はプロスタグランジンE2およびI2の放出を刺激したが、AIIはこの効果を有さなかった：Jaiswal他、1992、アンギオテンシンペプチドによる内皮細胞のプロスタグランジン産生の刺激、レセプターの特徴付け、Hypertension, 19（増刊II）, II-49〜II-55。AIIは、他の細胞型および無傷の血管におけるプロスタノイドの放出を刺激することができるが、ヒトまたはブタの内皮細胞を刺激することができない。内皮細胞に対する効果は、AT1とAT2とを区別するレセプターによる。
【００４０】
ラット糸球体調製物において、AIIは、ATIレセプターによって、ヒスタミン、セロトニンおよび副甲状腺ホルモンに対する反応におけるcAMPの形成を阻害する：Edwards, R.M.およびE.J. Stack、1993、アンギオテンシンIIは、アンギオテンシンIIレセプター亜類型１（AT1）を介する糸球体アデニル酸シクラーゼを阻害する、J. Pharmacol. Exper. Ther., 266, 506〜510。AII（1-7）は、この効果を有さない。
【００４１】
ブタ血管性平滑筋細胞およびヒト神経膠星状細胞において、AIIおよびAI（1-7）はプロスタグランジン放出を増加させ、アンギオテンシンIIのみが細胞内Ca2+の放出を増加させる：Jaiswal他、1993、ブタ大動脈平滑筋細胞におけるアンギオテンシンペプチドによる調節の相違−関連するアンギオテンシンレセプターの亜類型、J. Pharmacol. and Exp. Therapeutic., 265, 664〜673、Jaiswal他、1991、亜類型２アンギオテンシンレセプターは、ヒト神経膠星状細胞におけるプロスタグランジン合成を媒介する、Hypertension, 17, 1115〜1120。
【００４２】
AII（1-7）は、おそらく一酸化窒素によって、ブタ冠状動脈リングを膨張させる：Porsti他、1994、アンギオテンシン（1-7）によるブタ環状内皮細胞からの一酸化窒素の放出−新規のアンギオテンシンレセプターの関連、Br. J. Pharmacol., 111, 652〜654。これは、AII、AIIIまたはAII（3-8）では認められなかった。この効果は、AT1またはAT2レセプターのアンタゴニストによって減少しない。
【００４３】
AIIは、ラットから単離した結節性ガングリオンの脱分極を引き起こすが、AII（1-7）では引き起こさない：Widdop他、1992、ラットから単離した結節性ガングリオンに対するアンギオテンシンペプチドの電気生理学的反応、Clin. and Exper. Hyper-Theory and Practice, A14, 597〜613。実際、AII（1-7）は、脳機能に対して新規の作用を有する：Schiavone他、1990、アンギオテンシン（1-7）−脳における新規の作用の証明、J. Cardiovascular Pharmacolo., 16,（増刊４）,S19〜S24。
【００４４】
AII（1-7）には、近位細管細胞におけるバソプレシンの放出およびホスホリパーゼA2活性の調節などをAIIと共有する活性が存在する：Andreatta-Van Leyen, S.他、1993、アンギオテンシン（1-7）によるホスホリパーゼA2活性およびナトリウム輸送の調節、Kidney International, 44, 932〜6、Moriguchi, A.他、1994、マウスRen-2遺伝子を保有するトランスジェニックラットにおける中枢神経バソプレシンの調節の相違、Am. J. Physiol., 267, R786〜R791、Ferrario他、1991、アンギオテンシン（1-7）−アンギオテンシン系の新規のホルモン、Hypertension, 19（増刊III）,III-126〜III-133。しかし、これらの活性は創傷治癒に関与しないようである。
【００４５】
AIIの他のフラグメントの効果を研究した例は非常に少ない。室傍核中のほとんどのニューロンはAng（1-7）、AIIおよびAIIIによって励起されるが、AII（1-7）はこの効果は比較的弱く、いくつかのニューロンにおいて、AII（2-7）は不活性である：Ambuhl他、1992、室傍核ニューロンに対するアンギオテンシン類似体およびアンギオテンシンレセプターの効果、Regulatory Peptides, 38, 11〜120。側脳室に注入されたAIIは、運動性、常同症および回避条件付け反応の習得を増大させ、AII（1-6）およびAII（2-6）は、これらの精神作用性活性において活性ではない：Holy, Z.他、1993、Polish J. Pharmacol., 45, 31〜41。
【００４６】
AII（4-8）、AII（5-8）およびAII（1-4）は、ラットの間脳前部に注入した場合、水の取り込みに対してわずかな効果を示すのみであり、AII（1-7）は完全に不活性である：Fitzsimmons, J.T.、1971、ラットの間脳に注入したアンギオテンシンIIのペプチド前駆体および短鎖ペプチドフラグメントの飲用に対する効果、J. Physiol., 214, 295〜303。ラットにおけるAIIフラグメント（AII（4-8）およびAII（5-8））の脳室内融合では、AIIで血圧が上昇した濃度よりも1,000倍の高い濃度で投与した場合でさえも、血圧に対して最小の結果しか得られなかった：Wright他、1989、ラットにおける昇圧作用の脳アンギオテンシン調節の構造−機能分析、Am. J. Physiol., 257, R1551〜R1557。これらの両研究において、フラグメントを脳に直接注入するが、これは、高度に人工的であり、全身性の代謝をさせない。
【００４７】
本発明の方法によれば、本明細書中で開示された１つまたはそれ以上の活性AII類似体を、組織の治癒速度を増大させるのに十分な量で創傷組織に適用する。これらの化合物は、in vivoでのナノモルレベルでの治癒速度を有為に促進することができる。任意に投与した活性因子により、日常の実験のみを経験的に用いて処方物投与のための至適濃度を容易に決定することができる。一般に、本発明による使用のために適切な活性因子の量は、約0.001μg〜約10mg／kg体重の範囲である。
【００４８】
本発明の化合物は、種々の溶液中で適用することができる。本発明による使用のために適切な溶液は、滅菌した可溶性の十分量のペプチドであり、これは創傷組織に有害ではない。これに関して、本発明の化合物は非常に安定であるが、強酸および強塩基によって水和される。本発明の化合物は、pH5〜8で有機溶媒または水溶液に溶解する。
【００４９】
組織に活性因子を流入させる間中、任意の型の適用手段を使用することができる。例えば、水溶液をガーゼの包帯または細片によって創傷組織に適用することができるであろう。またはそのような溶液を、一定時刻に灌流できるように処方することができるであろう（リポソーム、外用薬、ミセルなどを用いる）。本発明の化合物を有するこれらの処方物の製造法は、当業者には自明である。本化合物はナノモル量で存在したとしても組織修復効果を得ることができるので、使用された活性因子の特定の濃度は重要ではない。
【００５０】
好ましくは、１ng/ml〜5,000μg/ml、10〜500μg/mlまたは30〜500μg/mlの濃度範囲の活性因子を含む基質溶液またはミセル溶液を使用する。好ましく、都合の良い濃度範囲は、少なくとも30μg/mlである。記載の実施例で都合よく使用されている特定の基質溶液は、Hydro Med Science, New Brunswick, New Jerseyから商標HYDRONとして市販されている半固形ポリエチレングリコールポリマーである。別の好ましい溶液は、BASF, Ludwigshafen, Germanyから商標名PLURONICS F108として市販されているミセル溶液である。室温条件下では、この溶液は液体であるが、温かい組織に適用されると、この溶液は、数日間創傷組織に活性因子を注入することが可能なゲルが形成される。他の好ましい処方物には、カルボキシメチルセルロース調製物、晶質調製物（例えば、生理食塩水、リンゲル乳酸塩溶液、リン酸緩衝化生理食塩水など）、粘弾性物質、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよび創傷手当て用具（dressing）（例えば、包帯など）が含まれる。
【００５１】
本発明の化合物の治癒効果は、種々の例において得ることができる。溶液は、潰瘍、外傷、損傷、糖尿病による潰瘍、火傷、外傷、うっ血性潰瘍、歯周病、裂傷および他の病気の治療において創傷組織の表面に局所投与することができる。さらに、侵襲性の手術などによる腹腔内の創傷組織は、本発明の組成物で治療して創傷治癒を促進することができる。例えば、結腸または他の組織の切開による手術的な除去後、手術面を、手術部位を閉じる前に内部毛細管灌流および治癒を促進するために活性因子の溶液で被覆することができる。さらに、局所化治癒の速度は、活性因子の注入または他の皮下投与によって増加させることができる。
【００５２】
本明細書中で開示された構造を有するアンギオテンシンIIの類似体およびアンギオテンシンIIフラグメントの類似体を、自動化ペプチド合成機および当業者によく知られている方法を用いて調製した。各類似体を、以下に記載の方法によって、創傷治癒の促進能力について試験した。この手順の結果を使用して、２、４、７、および９日目で、ベヒクル処理コントロール創傷％として計算して創傷の閉じ程度を同定した。同一の実験手順の間に全ての類似体が試験されていないので、AIIを、試験したペプチドの各群のコントロールとして含めた。
【００５３】
本発明は、添付の実施例を参照してよりよく理解することができるが、これは、例示のみが目的とされており、本発明の任意の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、本発明は、本明細書に添付の請求項で規定される。以下に記載の実験結果は、創傷治療用の本発明の組成物の一般的な利用を確立する。
【００５４】
以下の実施例は、本明細書中に開示の構造を有するアンギオテンシン類似体がin vivo治癒アッセイにおいて予想外に良好な活性を示したことを示すために使用した方法を記載する。
【００５５】
（実施例１）
創傷治癒組成物の使用
12週齢の雌のSprague Dawleyラットを、Simonsen Laboratories, Gilroy, Californiaから得た。手術当日、手術を行う前にラットにケタミン／ロンプン麻酔を筋肉注射した。ラットの毛を剃り、ベタジンを擦り込んだ。ラットの背部表面に、十分な厚さの1.5×1.5cm皮膚創傷を２つ作製した。皮膚の切除後、ガラススライドに創傷のサイズの輪郭を描き、薬物を、0.05Mリン酸緩衝液（pH 7.2）中100μlの10％カルボキシメチルセルロースにて投与した。試験物質を、無作為な様式で投与した。全ての物質は、100μg／創傷で試験した。コントロールを、ベヒクルのみで処理した。物質の投与後、ラットに包帯をし、麻酔から解放した。手術後の最初の５日間毎日薬物を投与した。２、４、７および９日目で、メトキシフルラン麻酔（Pittman-Moore, Mundelein, IllinoisよりMetofaneとして市販されている）をして測定した。創傷領域を、（１）グラフ用紙（１×１mm方眼）に創傷の形を写し、（２）その形を切り取り、（３）用紙を秤量して1.5×1.5cmに切り取った用紙の重量と比較し、そして（４）方眼の数を計数することによって同定した。さらに、２および４日目での肉芽組織の領域を同様に同定した。
【００５６】
図１〜図６および図１３に示すように、試験化合物を上記の一般式の類似体１〜８で処理した場合、創傷の閉じは、コントロール創傷と比較して実質的に促進された。図１〜図６および図１３に示すように、全ての場合において、１つの類似体の投与により、手術後の少々の閉じが促進された。図７〜図１２は、肉芽組織の形成におけるコントロール形成％を示す。全ての場合において、１つの類似体の投与は、ベヒクルのみの投与と比較して肉芽組織形成が促進された。これらの結果は、本発明のアミノ酸配列を有するAII類似体またはAIIフラグメントの類似体を使用するとどのように創傷治癒が促進することができるのかを示す。さらに、これらの結果は、本発明の組成物が十分な厚さの創傷の治癒用の予想外に強力なプロモーターとして特徴づけられたことを確証する。
【００５７】
上記記載から、当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、且つ種々の利用および条件に本発明を適用することができる。形態の変化および等価物の代用は、その状況によって便法を示唆するか与えるものとして意図される。本明細書中で特定の用語が使用されているが、それらは、意味の説明を意図するものであって、限定を目的するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 AIIまたは(TyrPO3)2 4-AIIを使用したベヒクル処理コントロールと創傷の閉じにおいて比較したコントロール反応％を示す図である。
【図２】 AIIまたは類似体GSD-39Bを使用したベヒクル処理コントロールと比較した創傷の閉じにおけるコントロール反応％を示す図である。
【図３】 AIIまたは類似体GSD-40Bを使用したベヒクル処理コントロールと比較した創傷の閉じにおけるコントロール反応％を示す図である。
【図４】 AIIまたは類似体GSD-41Bを使用したベヒクル処理コントロールと比較した創傷の閉じにおけるコントロール反応％を示す図である。
【図５】 AIIまたは類似体GSD-28を使用したベヒクル処理コントロールと比較した創傷の閉じにおけるコントロール反応％を示す図である。
【図６】 AIIまたは類似体GSD-39AおよびGSD-40Aを使用したベヒクル処理コントロールと比較した創傷の閉じにおけるコントロール反応％を示す図である。
【図７】 コントロールおよびAIIまたは(TyrPO3)2 4-AIIのいずれかで処理した試験創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。
【図８】 コントロールおよびAIIまたは類似体GSD-39Bのいずれかで処理した試験創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。
【図９】 コントロールおよびAIIまたは類似体GSD-40Bのいずれかで処理した試験創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。
【図１０】 コントロールおよびAIIまたは類似体GSD-28のいずれかで処理した試験創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。
【図１１】 図１２に示したAII、GSD-39AまたはGSD-40Aのいずれかで処理した創傷についてコントロールとして使用したベヒクル処理創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。
【図１２】 AII、GSD-39AまたはGSD-40Aのいずれかで処理した試験創傷についての肉芽組織のサイズ変化％を示す図である。ベヒクル処理コントロールは、図１１に示した結果と一致している。
【図１３】 AII、AII(1-7)およびnorLeu3AII(9GD)を使用したベヒクル処理コントロールの創傷の閉じにおいて比較したコントロール反応％を示す図である。
【配列表】
Claims (14)
- 下記アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
Asp-Arg-Val-homoSer-Ile-His-Pro-Phe（配列番号7）、
Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号9）および
Asp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro（配列番号15） - 前記アミノ酸配列が、Asp-Arg-Val-homoSer-Ile-His-Pro-Phe（配列番号7）である、請求項１に記載のポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe（配列番号9）である、請求項１に記載のポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、Asp-Arg-norLeu-Tyr-Ile-His-Pro（配列番号15）である、請求項１に記載のポリペプチド。
- 請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチド及び薬学的に許容されるキャリアを含む医薬。
- 前記ポリペプチドは、基質溶液またはミセル溶液中に存在する、請求項５に記載の医薬。
- 前記ポリペプチドは、前記キャリア中に１ng/ml〜5,000μg/mlの濃度で分散している、請求項５に記載の医薬。
- 前記ポリペプチドは、前記キャリア中に10〜500μg/mlの濃度で分散している、請求項５に記載の医薬。
- 前記ポリペプチドは、前記キャリア中に30〜200μg/mlの濃度で分散している、請求項５に記載の医薬。
- 前記ポリペプチドは、前記キャリア中に少なくとも30μg/mlの濃度で分散している、請求項５に記載の医薬。
- 前記キャリアは、半固形ポリエチレングリコールポリマー、カルボキシメチルセルロース調製物、晶質調製物、粘弾性物質およびポリプロピレングリコールからなる群から選択される、請求項５〜１０の何れか一項に記載の医薬。
- 損傷治癒を促進するための請求項５〜１１の何れか一項に記載の医薬。
- 創傷手当て用具上に配置された請求項５〜１２の何れか一項に記載の医薬を含む、医薬。
- 請求項１〜４の何れか一項に記載のポリペプチドを薬学的に許容されるキャリア中に分散させることを含む、医薬の製造方法。
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