JP4339696B2

JP4339696B2 - 解離蛍光増強アッセイ

Info

Publication number: JP4339696B2
Application number: JP2003575112A
Authority: JP
Inventors: ヘミラー，イルッカ; ブロムベルグ，カイ; ムッカラ，ベリ−マッティ; ハカラ，ハリー
Original assignee: ワラックオサケユイチア
Priority date: 2002-03-08
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2009-10-07
Anticipated expiration: 2023-02-28
Also published as: ATE392616T1; US20070015284A1; DE60320388T2; CN100350250C; DE60320388D1; WO2003076939A1; US7381567B2; CN1650165A; JP2005519305A; US20030170907A1; ES2305446T3; CA2477385C; EP1483582B1; EP1483582A1; US7211440B2; AU2003212393A1; CA2477385A1

Description

本発明は、ＤＥＬＦＩＡ(商標)として市場で知られているアッセイ技術を改良するための修飾であって、標識としてランタニドイオン又はそれらのキレートを、且つ検出のためのツールとして解離蛍光増強を使用する修飾に関する。

本発明の背景に光を当てるために本明細書で使用する刊行物及び他の資料、特に実務に関する更なる詳細を提示するためのケースは、引用によって組み入れられる。

ランタニド及びそれらのキレートは、種々のアッセイ、例えばイムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、受容体−リガンドアッセイ等において重要な標識群となっている[概説:Hemmila, Application of Fluorescence in Immunoassays, Wiley, 1991; Hemmila, Stahlberg and Mottram (eds. ), Bioanalytical Applications of Labeling Technologies, Wallac, 1995; Hemmila and Mukkala, Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 38 (6): 441-519 (2001) ]。ランタニドの長期の励起状態の寿命は、バックグラウンドの干渉を取り除き、そして蛍光定量法の究極的な感度を得るために、非常に効率的で、且つ単純に時間分解能を利用することを可能にする。ランタニド標識の他の利点は、それらの並外れたスペクトル特性、例えば、長いストークシフト（２５０ｎｍ超）及び狭いバンドのイオンに特徴のある輝線に関する。当該スペクトル特性は、検出がスペクトル分解能及び時間分解能の両方を活用し得るリアルマルチラベルアッセイにおいてランタニドを使用することを可能にする。

標識としてランタニドを用いる技術が多く存在している。その最初のオリジナルな技術、すなわちＤＥＬＦＩＡ(商標)技術は、２つのキレート系を使用し、一方は、標識のために最適化されており、そして第二のものは蛍光の増強及び検出を可能にするために実際のアッセイが完了した後に作られる（ＵＳ４，５６５，７９０、ＥＰ００６４４８４）。この技術は、未だに最も感度がよく、そして広範に使用されている。これは、診断、スクリーニング、薬物の発見及び他の研究分野において多く利用されている。広範な研究及び多数の特許にも関わらず、増強無しに類似のアッセイ性能を可能にする、最適化された特性を有する単一のランタニドキレート構造の開発は、例えばエネルギー転移、強度、保護、生体適合性及びカップリングの問題により、挑戦が続いている。

最初のＤＥＬＦＩＡ(商標)技術の主要な問題は、増強過程のリガンドの変化に関連する。β−ジケトンのトリフルオロ誘導体、最も一般的にはナフトイルトリフルオロアセトン（β−ＮＴＡ、すなわち、４，４，４−トリフルオロ−１−（２−ナフチル）−１，３−ブタンジオン）から構成される既存の増強を用いると、使用することができる最低のｐＨは約３．０である。従って、その目的のために特別なタンパク質標識キレートが、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−四酢酸基（ＤＴＴＡ）（ＵＳ４，８０８，５４１、ＥＰ０１３９６７５）に基づいて開発され、これは、増強溶液中で適用されたｐＨで、ユーロピウムイオンを素早く放出し、そして増強溶液中に過剰に存在するナフトイルトリフルオロアセトンと新規な高度に蛍光のキレートを創りだす。

バイオアッセイがより高度の熱力学的安定性及び動力学的安定性のある標識キレートを必要とする場合、最初の増強系は、増強のためにかなり長い時間を必要とし、これは、迅速な普遍的システムが開発されるべき場合には、不都合であり、又は受け入れられるものではない。例えば、ＤＮＡプローブの使用は、より安定なキレート試薬を極めて頻繁に必要とし、そしてＤＮＡベースの利用の場合、２，２’、２”、２”’−[[４−[２−（４−イソチオシアナートフェニル）エチル]−ピリジン−２，６−ジイル]ビス（メチレンニトリロ）]テトラキス（酢酸）（ＥＰ０２９８９３９、ＵＳ６，１２７，５２９）のランタニドキレートが最適であると明らかにされている。しかしながら、使用するキレートは、より長期の蛍光の発生時間を必要とし、そして通例２０〜３０分が、増強溶液中で蛍光を安定させるのに必要とされる。

現在のＤＥＬＦＩＡ(商標)技術が不適当であることが明らかとなっている利用は、全て一体の乾燥試薬系を用いて実施される試料のラピッドランダムアクセス解析である[Pettersson et al., Luminescence, 15,: 399-407 (2000)]。この系において、乾燥試薬アッセイ特異的な全て一体となったウェルを調製するために使用する乾燥手順は、乾燥過程の間のイオンの解離の危険性により、強力なキレート試薬を必要とする。ＤＥＬＦＩＡ(商標)のために最適化されたＤＴＴＡの使用は、このアプローチに非常に適しているとは明らかにされなかった。他方で、より強力にキレートする標識試薬が使用される場合、増強に必要とされる時間は、全過程からみて長すぎる。

最初のＤＥＬＦＩＡ(商標)技術が不適当な別の場合は、高濃度のクエン酸塩又はＥＤＴＡを含み得る血漿試料の解析である。解析物のワンステップ解析において（例えば、ハプテン抗原の競合解析において必要とされる）、ＤＥＬＦＩＡに最適なＤＴＴＡキレートは、競合するキレート化過程に起因して使用されえない。

改良型の増強／標識系を必要とする更に別のアッセイタイプは、遊離の又は錯体のランタニドが標識として使用される利用に関する。これらのアッセイの例は、例えば、細胞毒性アッセイであり、ここでは、ＤＴＰＡのユーロピウムキレートが細胞内標識として使用される。他の類似のアッセイは、広範な過程（環境試料、代謝経路等）のために標識／トレーサーとしてランタニドを使用しうる。

ＤＴＴＡよりも高度な安定性を有する標識キレート及び改良型の増強を必要とする他のアッセイタイプは、反応混合物が高濃度の金属イオンを含む利用に関する。これらのアッセイの例は、例えば酵素活性測定及びイムノアッセイによる土壌解析であり、これは、比較的大量の重金属が存在し得る。

Mulltinax等（ＵＳ６，０３０，８４０、ＷＯ９９／６６３３３）は、増強溶液に幾つかのポリアニオン性化合物を追加することによって、ＤＥＬＦＩＡ(商標)法を改良した。彼等は、キレートからのランタニドイオンの解離がより高いｐＨで既により速いことを教示している。それらの実施例において使用したキレートは、ベンジル−ＥＤＴＡ誘導体及びＤＴＰＡであり、ここで、１つの酢酸基が生体分子へのカップリングに使用されている。これらのキレートの安定性は、ＤＥＬＦＩＡ(商標)法で使用されるＤＴＴＡより低いか、又はほぼ同じである。Mullinax等によって提示された方法が、生体分子の標識に使用されるより安定なキレートとともに働くという証拠又はデータはない。市販の増強溶液（Wallacの製品）と比較して、上文で言及した方法は、改良を示さず、これは、市販のＤＥＬＦＩＡ(商標)増強が既がポリアニオン（フタル酸）を含むためである。

Dakubu（ＵＳ５，１２４，２６８）は、蛍光の増強を二つに分けた。最初の部分は、ｐＨを１．５〜３．０に下げることによる、安定なランタニドキレートからの金属の解離である。当該方法の第二の部分は、３．５超へのｐＨの変化及び蛍光ランタニドキレートの発生である。しかしながら、この二段階の方法は、自動診断系において使用するにはとても困難であり、これは、それが１つの余計なインキュベーション段階及び添加段階を要求するためである。

本発明の目的及び要約
本発明の目的は、標識としてランタニドイオン又はそれらのキレートを、且つ検出のためのツールとして解離蛍光増強を用いるアッセイ技術のための改良型の増強溶液を提供することにある。

本発明の別の目的は、標識としてランタニドイオン又はそれらのキレートを、且つ検出のためのツールとして解離蛍光増強を用いる改良型のアッセイを提供することにある。

このように、本発明は、標識としてランタニドイオン又はそれらのキレートを、且つ検出のためのツールとして解離蛍光増強を用いるアッセイ技術のための増強溶液を提供し、ここで、前記増強溶液は、式Ｉ

（ここで、
Ｒ₁はアリールであり、これは任意に一置換又は多置換されており、そして
Ｒ₂は、４以上のフッ素原子で置換された２〜９個の炭素原子を有する直鎖又は分枝アルキル鎖であり、これは任意にフッ素以外の置換基で一置換又は多置換されている）
のβ−ジケトンを含んで成る。

本発明は更に、標識としてランタニドイオン又はそれらのキレートを、且つ検出のためのツールとして解離蛍光増強を用いる生物学的親和性(bioaffinity)アッセイであって、
ａ）アッセイ混合物を得るために、アッセイする分析物を含んで成る試料を、前記アッセイの反応物と混合し；
ｂ）前記分析物と前記反応物を反応させ、ここで、前記分析物と前記アッセイの反応物との間の生物学的親和性反応が起こり、反応産物が生じ、ここで、
ｉ）当該分析物は、ランタニド又はランタニドキレートで共有結合的に又は非共有結合的に標識した少なくとも１つの反応物と結合しており、又は
ｉｉ）当該分析物に対し量が正比例又は反比例している分析物類似体又は他の反応物が、ランタニドで直接標識され、
ここで、上文のｉ）又はｉｉ）のランタニドは、以降標識ランタニドと称する；
ｃ）上文で定義した前記標識ランタニドを含んで成る、前記標識段階ｂ）で得られた前記反応産物を未結合の遊離標識反応物から分離し；
ｄ）上文で定義した増強溶液を添加し、
ｉ）標識ランタニドを、段階ｂ）の反応産物のキレートから解離させ、そして
ｉｉ）前記増強溶液のβ−ジケトンにより、高度の蛍光ランタニドキレートを創りだし、そして
ｅ）段階ａ）の試料の分析物の量と正比例又は反比例する、段階ｄ）の標識ランタニドの量を、β−ジケトン錯体として蛍光定量法で測定すること、
を含んで成るアッセイを提供する。

本発明の詳細な説明
本発明は、標識としてランタニドイオン又はそれらのキレートを、且つ検出のためのツールとして解離蛍光増強を用いるアッセイ技術に関する。その技術は、広く診断及び研究において利用されており、市場ではＤＥＬＦＩＡ(商標)技術として知られている。本発明は、全ての利用に単一の標識試薬を使用することを可能にし、且つ非常に安定な標識キレートを用いても迅速な増強過程を可能にする、ＤＥＬＦＩＡ(商標)増強過程の改良を提供する。改良された増強系は、上文で言及した問題を対処するのを助け、そして利用に関係なく迅速なリガンド交換の動力学を可能にする。

本明細書に記載したように増強過程を変更することによって、スピード及びロバスト性における改善が達成される。新規の改良された増強過程は、より安定な標識キレートを必要とする利用を可能にし、そして事実上全ての利用のための単一型のキレート標識の使用を可能にする。この新規な増強系はまた、例えば高濃度のＥＤＴＡ又はクエン酸塩又は他の強力なキレート化剤を含む血漿試料又は他の試料、高濃度の金属イオンを含む試料及び緩衝液、あるいは他の理由で標識キレートの安定性に対する高度の要求を設定するあらゆるアッセイ、に関連する当初の技術における困難性をも回避する。

本発明は、使用したβ−ジケトンの構造を変化させることによって可能となる。β−ジケトンは、生体分子の標識に使用したランタニドキレートからの金属の解離後の、蛍光増強リガンドとして使用されてきた。Wallcによって市販され、且つ前記文献に記載の本増強溶液は、トリフルオロ置換β−ジケトン、例えば、４，４，４−トリフルオロ−１−（２−ナフチル）−１，３−ブタンジオン又は４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオンを基にしている。これらの化合物は、３．０〜３．５の使用した解離ｐＨで、発光ランタニドキレートを形成することができる。当該ｐＨがより低い場合、三フッ化(trifluororinated)β−ジケトンは、もはや有効ではない。本発明によると、β−ジケトン中のトリフルオロメチル基は、より高度にフッ化された基で置換され、その結果、より低いｐＨの使用を可能にする。本発明の好ましいβ−ジケトンは、１−アリール−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン及び１−アリール−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１，３−ヘキサンジオンである。

β−ジケトンの構造における強力に電気陰性のフッ素原子の追加は、それらの活性を増大させる。この作用に起因して、これらの新規β−ジケトンは、２．０のｐＨを２．８に下げてランタニド金属をキレート化することができる。これらの新規β−ジケトンを含む本発明の増強溶液及びより低いｐＨは、分離速度及び新規キレートの形成を加速させる。解離がより安定である場合、ランタニドキレートは、生体分子の標識に使用することができる。

４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１−アリール−１，３−ペンタンジオン及び４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１−アリール−１，３−ヘキサンジオンの構造のβ−ジケトンは、文献公知である。括弧内のＣＡ登録番号と共に例を挙げると、４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１，３−ペンタンジオン[８１５１６−１２−３]、１−（２，５−ジフルオロフェニル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ１，３−ペンタジオン[６４２８７−１６−７]、４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１−（４−フルオロフェニル）−１，３−ペンタンジオン[６４２８７−１２−３]、１−（４−ブロモ−フェニル）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１，３−ヘキサンジオン[３０７５３１−５６−２]、１−（９Ｈ−フルオレン−２−イル）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１，３−ヘキサンジオン[２０２４６０−６６−０]及び１−[１，１’−ビフェニル]−４−イル−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１，３−ヘキサンジオン[１７１６６６−８６−７]であるが、アッセイ系におけるそれらの使用は、説明も示唆もされていない。

このように、本発明は、標識としてランタニドイオン又はそれらのキレートを用い、且つ検出のためのツールとして解離蛍光増強を用いるアッセイ技術のための増強溶液に関するものであり、ここで、前記増強溶液は、式Ｉ

（ここで、
Ｒ₁はアリールであり、これは任意に一置換又は多置換されており、そして
Ｒ₂は、４以上のフッ素原子で置換された２〜９個、好ましくは２〜５個の炭素原子を有する直鎖又は分枝アルキル鎖であり、これは任意にフッ素以外の置換基で一置換又は多置換されている）
のβ−ジケトンを含んで成る。

Ｒ₁の前記アリールは、好ましくは、フェニル、９Ｈ−フルオレン−２−イル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−フェナントロリル、３−フェナントロリル、４−フェナントロリル、５−フェナントロリル、２−フリル、３−フリル、２−ベンゾフリル、３−ベンゾフリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンゾ[ｂ]チエニル、３−ベンゾ[ｂ]チエニル、２−ピリミジル、４−ピリミジル及び５−ピリミジルから成る群から選択される。

Ｒ₁の前記アリールは、一置換又は多置換されていてもよい。各置換基は、独立して、例えば直鎖又は分枝鎖アルキル、アルコキシ、アリール、アロイル、アリールオキシ、ニトロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシ、クロロ、ブロモ、フルオロ又はアシルであってもよい。当該置換基が置換されうる原子を含んで成る場合、これらは順次置換されうる。

アルキル鎖Ｒ₂は、好ましくは４〜９個のフッ素原子で、そして最も好ましくは５〜７個のフッ素原子で置換される。

アルキル鎖Ｒ₂の、カルボニル基に最も近い炭素原子、好ましくは最初の２〜５の炭素原子は、フッ素原子、好ましくは５〜７個のフッ素原子で置換される。

４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１−アリール−１，３−ペンタンジオン及び４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１−アリール−１，３−ヘキサンジオンは、増強溶液のβ−ジケトンの好ましい代替物である。増強溶液の典型的なβ−ジケトンは、１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン、１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１，３−ヘキサンジオン、１−（２−ベンゾ[ｂ]チエニル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ１，３−ペンタンジオン及び１−（２−ベンゾ[ｂ]チエニル）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１，３−ヘキサンジオンである。

Ｒ₂は、フッ素以外の置換基で一置換又は多置換されていてもよく、そして各置換基は、独立して、直鎖又は分枝鎖アルキル、アルコキシ、アリール、アロイル、アリールオキシ、ニトロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシ、クロロ、ブロモ及びアシルから成る群から選択されてもよい。当該置換基が置換されうる原子を含んで成る場合、これらは順次置換されうる。

増強溶液は、好ましくは２．０〜２．８のｐＨを有する緩衝液である。増強溶液は、好ましくは１〜５０μＭのβ−ジケトン溶液である。

増強溶液は、好ましくはアルキルアリールポリエーテルアルコール、双性イオンの、又は四級アンモニウム化合物である界面活性剤を含んで成る。増強溶液は、典型的に、０．１％〜０．５％のアルキルアリールポリエーテルアルコールを含んで成る。増強溶液の界面活性剤の典型的な代替物は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸及び臭化セチルトリメチルアンモニウムである。増強溶液は、好ましくはトリアルキルホスフィンオキサイド又はトリアリールホスフィンオキシドであるルイス塩基を含んで成る。ルイス塩基は典型的にトリオクチルホスフィンオキシドであり、そして増強溶液は、好ましくは１０〜１００μＭのトリオクチルホスフィンオキシド溶液である。

本発明は更に、標識としてランタニドイオン又はそれらのキレートを用い、且つ検出のためのツールとして解離蛍光増強を用いる生物学的親和性アッセイであって、
ａ）アッセイ混合物を得るために、アッセイする分析物を含んで成る試料を前記アッセイの反応物と混合し；
ｂ）前記分析物と前記反応物を反応させ、ここで、前記分析物と前記アッセイの反応物との間の生物学的親和性反応が起こり、反応産物が生じ、ここで、
ｉ）当該分析物は、ランタニド又はランタニドキレートで共有結合的に又は非共有結合的に標識した少なくとも１つの反応物と結合しており、又は
ｉｉ）当該分析物に対し量が正比例又は反比例している分析物類似体又は他の反応物が、ランタニドで直接標識され、
ここで、上文のｉ）又はｉｉ）のランタニドは、以降標識ランタニドと称する；
ｃ）上文で定義した前記標識ランタニドを含んで成る、前記標識段階ｂ）で得られた前記反応産物を、好ましくは固相固定化反応物をキャッチャーとして用いて、未結合の遊離標識反応物から分離し；
ｄ）本発明に従う増強溶液を添加し、
ｉ）標識ランタニドを、段階ｂ）の反応産物のキレートから解離させ、そして
ｉｉ）前記増強溶液のβ−ジケトンにより、高度の蛍光ランタニドキレートを創りだし、そして
ｅ）段階ａ）の試料の分析物の量と正比例又は反比例する、段階ｄ）の標識ランタニドの量を、β−ジケトン錯体として、好ましくは時間分解能を用いた蛍光定量法で測定すること、
を含んで成るアッセイを提供する。

前記アッセイの反応物は、生物学的結合試薬、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、人工抗体又はフラグメント抗体、受容体、リガンド、天然結合タンパク質、酵素、ペプチド、レクチン、ストレプトアビジン又はアビジン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、結合性プラスチックインプリント、細胞、細胞フラグメント、膜又はミセルを含んで成ることもある。生物学的結合試薬がオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである場合、前記試薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡアレイ、ｍＲＮＡ、ＰＮＡ又はアプタマーから成る群から選択されてもよい。

分析物は、ハプテン、抗原、ホルモン、タンパク質、ペプチド、薬物、ウイルス、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ、微生物、環境毒素、細胞、細胞フラグメント、膜又はミセル、であってもよい。

段階ｂ）の反応産物は、例えば、免疫複合体、タンパク質間複合体、抗原−抗体複合体、ヌクレオチドハイブリッド、酵素反応の最終産物又は細胞反応の最終産物であってもよい。

ランタニドは、ユーロピウム、テルビウム、サマリウム又はディスプロシウムであってもよい。

分析物を測定するために使用する反応物は、例えば酵素基質であってもよい。

本発明に従う方法はまた、同一の試料及びアッセイ混合物を用いて、各アッセイの反応物を異なるランタニドで標識することによって実施される２又はそれ以上の生物学的親和性アッセイを含んで成ることもある。異なるランタニドの蛍光は、同一の増強溶液を用いて測定され得る。

本発明は、実施例１〜１０で開示する適当なβ−ジケトンの合成法によって例示される。増強溶液のランタニドシグナルに対するＥＤＴＡ濃度の影響は、実施例１１に提示する。実施例１２は、異なる量の１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン（ＢＦＰＰ）及び、（Ｓ）−１−（４−イソチオシアナートベンジル）ジエチレン−トリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸のユーロピウムキレートで標識した抗ＨＣＧを含む増強溶液中の蛍光の発生時間を示す。

実施例１
４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ペンタンジオン
２−アセチルチオフェン（４．３ｍｌ）を乾燥トルエン（４０ｍｌ）中で溶解した。水素化ナトリウム（６０％、３．２ｇ）をゆっくりと添加し、そして混合物を１５分間攪拌した。ペンタフルオロプロピオン酸エチル（１３．４４ｇ）を添加し、そして当該攪拌を一晩続けた。硫酸（１０％、５０ｍｌ）を添加し、そして相を分離した。有機相を水（５０ｍｌ）で洗浄し、そしてそれを乾燥するまで蒸発させた。残渣を蒸留し（沸点９２〜９４℃／０．１５ｍｂａｒ（１５Ｐａ））、生成物が得られた（９．０ｇ）。¹H NMR(CDCl₃) : 6.50(s, 1 H); 7.21(dd, 1 H, J = 3.9 & 4.9) ; 7.77(dd, 1 H, J = 1.1 & 4.9 Hz); 7. 85(dd, 1 H, J = 1.1 & 3.9 Hz). IR (film): 1592 (C=O) ; 1202 (C-F).

実施例２
４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ヘキサンジオン
当該化合物は、実施例１に従い、出発材料として２−アセチルチオフェン及びヘプタフルオロ酪酸エチルを用いて合成した。¹H NMR(CDCl₃) : 6.49 (s, 1 H); 7.21(dd, 1 H, J = 3.8 & 5.1) ; 7.77(dd, 1 H, J = 1.2 & 5.1 Hz); 7.85(dd,1 H, J = 1.2 & 3.8 Hz). IR (film) : 1589 (C=O) ; 1230 (C-F).

実施例３
１−（５−シアノ−２−チエニル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン
当該化合物は、実施例１に従い、出発材料として２−アセチル−５−シアノチアゾール及びペンタフルオロプロピオン酸エチルを用いて合成した。¹H NMR(CDCl₃) : 6.53 (s, 1 H); 7.68 (d, 1 H, J = 4.2 Hz) ; 7.79(d,1 H, J = 4. 2 Hz).

実施例４
１−（５−カルボキシ−２−チエニル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン
１−（５−シアノ−２−チエニル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン（０．７８ｇ）、硫酸（９ｍｌ）及び酢酸（１０ｍｌ）の混合物を２時間環流した。冷却した混合物を１００ｍｌの水に注いだ。沈殿をろ過し、そして水で洗浄した。¹H NMR(CDC13) : 6.53(s, 1 H); 7.57(d, 1 H, J = 4.1 Hz); 7.78(d, 1 H, J = 4.1 Hz).

実施例５
４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１−（２−フリル）−１，３−ヘキサンジオン
当該化合物は、実施例１に従い、出発材料として２−アセチルフラン及びヘプタフルオロ酪酸を用いて合成した。¹H NMR (CDCl₃) : 6.54(s, 1 H); 6.65(dd, 1 H, J = 1.6 & 3.6 Hz); 7.37(dd, 1 H, J = 0.6 & 3.6 Hz); 7.70(dd,1 H, J = 0.6 & 1.6 Hz). IR (film) : 1616 (C=O) ; 1231 (C-F).

実施例６
４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１−（２−ナフチル）−１，３−ペンタンジオン
当該化合物は、実施例１に従い、出発材料として２−アセチルナフタレン及びペンタフルオロプロピオン酸エチルを用いて合成した。¹H NMR(CDCl₃) : 6.79 (s, 1 H); 7.57- 7.67(m, 2 H); 7.90(bd, 1 H); 7.94-7. 95(m, 2 H); 7.99(bd, 1 H); 8.53 (s, 1 H). IR (film): 1602 (C=O) ; 1201 (C-F).

実施例７
４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１−（２−ナフチル）−１，３−ヘキサンジオン
当該化合物は、実施例２に従い、出発材料として２−アセチルナフタレン及びヘプタフルオロ酪酸エチルを用いて合成した。生成物は、石油エーテルから結晶化した。¹H NMR (CDCl₃) : 6.76(s, 1 H); 7.57- 7.66 (m, 2 H); 7.90(bd, 1 H); 7.93-7. 94 (m, 2 H); 7. 98(bd, 1 H); 8.53 (s, 1 H). IR (film): 1602 (C=O) ; 1232 (C-F).

実施例８
１−（２−ベンゾ［ｂ］チエニル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン
当該化合物は、実施例１に従い、出発材料として２−アセチルベンゾ［ｂ］チエニル及びペンタフルオロプロピオン酸エチルを用いて合成した。生成物は、エタノールから結晶化した。¹H NMR(CDCl₃) : 6.63(s, 1 H); 7.89- 7.93 (m, 3 H); 8.12(d,1 H, J = 0.6 Hz). IR (film): 1589 (C=O) ; 1203 (C-F).

実施例９
１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン
当該化合物は、実施例１に従い、出発材料として２−アセチルベンゾフラン及びペンタフルオロプロピオン酸エチルを用いて合成した。生成物は、石油エーテルから結晶化した。¹H NMR (CDCl₃) : 6.75 (s, 1 H); 7.35(ddd, 1 H, J = 0.9 & 7.1 & 7.9 Hz); 7.51(ddd, 1 H, J = 1.3 & 7.1 & 8.4 Hz); 7.58-7. 60 (m, 1 H); 7.67(d, 1 H, J = 0.9 Hz); 7.71-7. 73(m, 1 H). IR (film): 1614 (C=O) ; 1211,1200 (C-F).

実施例１０
１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１，３−ヘキサンジオン
当該化合物は、実施例１に従い、出発材料として２−アセチルベンゾフラン及びヘプタフルオロ酪酸エチルを用いて合成した。生成物は、石油エーテルから結晶化した。¹H NMR (CDCl₃) : 6.74 (s, 1 H); 7.35(ddd,1 H, J = 0.9 & 7.2 & 8. 0 Hz); 7.52(ddd, 1 H, J = 1.3 & 7.2 & 8. 4 Hz); 7.58-7. 61(m, 1 H); 7.68 (d, 1 H, J = 0.9 Hz); 7.71-7. 74(m, 1 H). IR (film) : 1614 (C=O) ; 1232 (C-F).

実施例１１
１時間振とうした後の増強溶液のランタニドシグナルに対するＥＤＴＡ濃度の影響を図１に提示する。ＥＳ−Ｗは、Wallcが市販している増強溶液に相当し、ＥＳ−ＢＦＰＰ及びＥＳ−ＢＦＨＨは、これらに対応して、１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン（ＢＦＰＰ）及び１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１，３−ヘキサンジオン（ＢＦＨＨ）を含む本発明の増強溶液である。新規増強溶液の内容は以下の通りである：５μＭのβ−ジケトン、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０μＭのトリオクチルホスフィンオキシド及びｐＨ２．３のグリシン−ＨＣｌ緩衝液。

実施例１２
異なる量の１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン（ＢＦＰＰ）及び、（Ｓ）−１−（４−イソチオシアナートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸のユーロピウムキレートで標識した抗ＨＣＧを含む増強溶液中の蛍光の発生時間を図２に提示する。ＥＳ−Ｗは、Wallcによって市販されている増強溶液に相当する。

本発明が、種々の態様の形態でにおいて組み入れられることがあり、これらのわずかに幾つかを本明細書で開示していることが理解されよう。当業者には、他の態様が存在し、且つ本発明の精神を逸脱していないことは自明であろう。このように、説明した態様は例示であり、限定するものと解されるべきではない。

図１は、１時間振とうした後の増強溶液のランタニドシグナルに対するＥＤＴＡ濃度の影響を示す。図２は、異なる量の１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン（ＢＦＰＰ）及び、（Ｓ）−１−（４−イソチオシアナートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸のユーロピウムキレートで標識した抗ＨＣＧ抗体を含む増強溶液中の蛍光の発生時間を示す。

Claims

標識としてランタニドイオン又はそれらのキレートを用い、且つ検出のためのツールとして解離蛍光増強を用いるアッセイ技術のための増強溶液であって、２．０〜２．８のｐＨを有する緩衝液であり、且つ式Ｉ

（ここで、
Ｒ₁はアリールであり、これは任意に一置換又は多置換されており、そして
Ｒ₂は、４以上のフッ素原子で置換された２〜９個の炭素原子を有する直鎖又は分枝アルキル鎖であり、これは任意にフッ素以外の置換基で一置換又は多置換されている）
のβ−ジケトンを含んで成ることを特徴とする増強溶液。
Ｒ₁の前記アリールが、フェニル、９Ｈ−フルオレン−２−イル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−フェナントロリル、３−フェナントロリル、４−フェナントロリル、５−フェナントロリル、２−フリル、３−フリル、２−ベンゾフリル、３−ベンゾフリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンゾ[ｂ]チエニル、３−ベンゾ[ｂ]チエニル、２−ピリミジル、４−ピリミジル及び５−ピリミジルから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の増強溶液。
Ｒ₁の前記アリールが一置換又は多置換され、そして各置換基が、独立して、直鎖又は分枝鎖アルキル、アルコキシ、アリール、アロイル、アリールオキシ、ニトロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシ、クロロ、ブロモ、フルオロ及びアシルから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の増強溶液。
アルキル鎖Ｒ₂が２〜５個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖アルキル鎖であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の増強溶液。
アルキル鎖Ｒ₂が４〜９個のフッ素原子で置換されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の増強溶液。
アルキル鎖Ｒ₂が５〜７個のフッ素原子で置換されることを特徴とする、請求項５に記載の増強溶液。
アルキル鎖Ｒ₂が、Ｒ₂の最初の２〜５個の炭素原子の置換である５〜７個の炭素原子で置換されることを特徴とする、請求項６に記載の増強溶液。
β−ジケトンが、４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１−アリール−１，３−ペンタンジオン又は４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１−アリール−１，３−ヘキサンジオンであることを特徴とする、請求項７に記載の増強溶液。
β−ジケトンが、１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン、１−（２−ベンゾフリル）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１，３−ヘキサンジオン、１−（２−ベンゾ[ｂ]チエニル）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロ−１，３−ペンタンジオン及び１−（２−ベンゾ[ｂ]チエニル）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロ−１，３−ヘキサンジオンから成る群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の増強溶液。
Ｒ₂が、フッ素以外の置換基で一置換又は多置換され、且つ各置換基が、独立して、直鎖又は分枝鎖アルキル、アルコキシ、アリール、アロイル、アリールオキシ、ニトロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、カルボキシ、クロロ、ブロモ及びアシルから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の増強溶液。
１〜５０μＭの前記β−ジケトン溶液であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の増強溶液。
ａ）アルキルアリールポリエーテルアルコール、
ｂ）双性イオン、又は
ｃ）四級アンモニウム化合物、
である界面活性剤を含んで成ることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の増強溶液。
０．１％〜０．５％のアルキルアリールポリエーテルアルコールを含んで成ることを特徴とする、請求項１２に記載の増強溶液。
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸及び臭化セチルトリメチルアンモニウム、から成る群から選択される界面活性剤を含んで成ることを特徴とする、請求項１２に記載の増強溶液。
トリアルキルホスフィンオキサイド又はトリアリールホスフィンオキシドであるルイス塩基を含んで成ることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の増強溶液。
ルイス塩基がトリオクチルホスフィンオキシドであり、且つ増強溶液が１０〜１００μＭのトリオクチルホスフィンオキシド溶液であることを特徴とする、請求項１５に記載の増強溶液。
標識としてランタニドイオン又はそれらのキレートを用い、且つ検出のためのツールとして解離蛍光増強を用いる生物学的親和性アッセイ方法であって、
ａ）アッセイ混合物を得るために、アッセイする分析物を含んで成る試料を前記アッセイの反応物と混合し；
ｂ）前記分析物と前記反応物を反応させ、ここで、前記分析物と前記アッセイの反応物との間の生物学的親和性反応が起こり、反応産物が生じ、ここで、
ｉ）当該分析物は、ランタニド又はランタニドキレートで共有結合的に又は非共有結合的に標識した少なくとも１つの反応物と結合しており、又は
ｉｉ）当該分析物に対し量が正比例又は反比例している分析物類似体又は他の反応物が、ランタニドで直接標識され、
ここで、上文のｉ）又はｉｉ）のランタニドは、以降標識ランタニドと称する；
ｃ）上文で定義した前記標識ランタニドを含んで成る、前記標識段階ｂ）で得られた前記反応産物を未結合の遊離標識反応物から分離し；
ｄ）増強溶液を添加し、
ｉ）標識ランタニドを、段階ｂ）の反応産物のキレートから解離させ、そして
ｉｉ）前記増強溶液のβ−ジケトンにより、高度の蛍光ランタニドキレートを創りだし、そして
ｅ）段階ａ）の試料の分析物の量と正比例又は反比例する、段階ｄ）の標識ランタニドの量を、β−ジケトン錯体として蛍光定量法で測定する、
段階を含んで成り、増強溶液が請求項１に記載のものであることを特徴とするアッセイ方法。
分離段階ｃ）が、キャッチャーとして固相固定化反応物を用いて実施されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
段階ｅ）の測定が時間分解能を用いて実施されることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
アッセイの反応物が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、人工抗体又はフラグメント抗体、受容体、リガンド、天然結合タンパク質、酵素、ペプチド、レクチン、ストレプトアビジン又はアビジン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、結合性プラスチックインプリント、細胞、細胞フラグメント、膜及びミセルを含んで成る群から選択される生物学的結合試薬を含んで成ることを特徴とする、請求項１７、１８又は１９に記載の方法。
生物学的結合試薬が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡアレイ、ｍＲＮＡ、ＰＮＡ又はアプタマーから成る群から選択されるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
分析物が、ハプテン、抗原、ホルモン、タンパク質、ペプチド、薬物、ウイルス、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ、微生物、環境毒素、細胞、細胞フラグメント、膜又はミセル、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
ランタニドが、ユーロピウム、テルビウム、サマリウム又はディスプロシウムであることを特徴とする、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
２又はそれ以上の生物学的親和性アッセイが、同一の試料及びアッセイ混合物を用いて、各アッセイの反応物を異なるランタニドで標識することによって実施されることを特徴とする、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
異なるランタニドの蛍光が同一の増強溶液を用いて測定されることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。