ES2305446T3 - Ensayo de mejora de fluorescencia disociativa. - Google Patents
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Abstract
Una disolución de intensificación para una tecnología de ensayo en que se usan iones de lantánidos o sus quelatos como marcadores y una intensificación disociativa de la fluorescencia como una herramienta para la detección, caracterizada porque dicha disolución de intensificación es un tampón que tiene un pH de 2,0 a 2,8 y dicha disolución de intensificación comprende una beta-dicetona de fórmula I (Ver fórmula) en la que R1 es un arilo, opcionalmente monosustituido o multisustituido, y R2 es una cadena alquílica lineal o ramificada con de 2 a 9 átomos de carbono, sustituida con cuatro o más átomos de flúor, opcionalmente monosustituida o multisustituida con otros sustituyentes distintos de flúor.
Description
Ensayo de mejora de fluorescencia
disociativa.
Este invento se refiere a una modificación para
mejorar una tecnología de ensayo comercialmente conocida como
DELFIA®, en que se usan iones de lantánidos o sus quelatos como
marcadores y una intensificación disociativa de la fluorescencia
como una herramienta para la detección.
\vskip1.000000\baselineskip
Las publicaciones y demás materiales aquí usados
para iluminar el fundamento del invento y, en particular, los casos
que proporcionan detalles adicionales con respecto a la práctica, se
incorporan por referencia.
Los lantánidos y sus quelatos se han convertido
en un grupo importante de marcadores en diversos ensayos, tales
como inmunoensayos, ensayos de hibridación, ensayos de
receptor-ligando y otros [revisiones: Hemmilä,
"Application of Fluorescence in Immunoassays", Wiley, 1991;
Hemmilä, St\ring{a}hlberg y Mottran (redactores),
"Bioanalytical Applications of Labeling Technologies", Wallac,
1995; Hemmilä y Mukkala, Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 38 (6):
441-519 (2001)]. La larga duración de los estados
excitados de los lantánidos hace posible explotar muy eficaz y
simplemente la resolución temporal con objeto de librarse de las
interferencias de fondo y obtener las sensibilidades últimas de la
fluorometría. Otras ventajas de los marcadores de lantánido se
refieren a sus excepcionales propiedades espectrales, tales como
largos desplazamientos de Stokes (de más de 250 nm) y líneas de
emisión de banda ancha características de iones. Las propiedades
espectrales permiten que los lantánidos sean utilizados en ensayos
reales con múltiples marcadores en que se pueden aprovechar tanto
las resoluciones espectrales como las temporales para la
detección.
Hay numerosas tecnologías en que se utilizan
lantánidos como marcadores. En la primera y original tecnología, es
decir, la tecnología DELFIA®, se utilizan dos sistemas de quelatos,
uno se optimiza para la marcación, y el segundo, que se crea una
vez que se ha llevado a cabo el ensayo real, permite la
intensificación de la fluorescencia y la detección (Documentos US
4.565.790 y EP 0.064.484). Esta tecnología es aún la más sensible y
ampliamente utilizada. Presenta muchas aplicaciones en diagnóstico,
exploración, descubrimiento de fármacos y otras áreas de
investigación. Independientemente de una amplia búsqueda y de
numerosas patentes, el desarrollo de una sola estructura de quelato
de lantánido con propiedades optimizadas que permitan similares
eficacias de ensayo sin intensificación ha seguido siendo un reto a
causa de, por ejemplo, los problemas de transferencia de energía,
intensidad, protección, biocompatibilidad y copulación.
Un problema importante de la tecnología DELFIA®
original se refiere al cambio en el ligando del proceso de
intensificación. Al utilizar la disolución de intensificación
existente, compuesta de derivados trifluorados de
\beta-dicetonas, muy habitualmente
naftoiltrifluoroacetona [\beta-NTA; es decir,
4,4,4-trifluoro-1-(2-naftil)-1,3-butanodiona],
el pH más bajo que se puede utilizar es aproximadamente 3,0. Por lo
tanto, para este fin, se ha desarrollado un especial quelato
marcador de proteínas basado en el grupo
dietilentriamina-N,N',N'',N''-tetraacetato
(DTTA; Documentos US 4.808.541 y EP 0.139.675), que, en el pH
aplicado en la disolución de intensificación (ES; del inglés,
enhancement solution), libera rápidamente iones europio y crea
nuevos quelatos muy fluorescentes con la naftoiltrifluoroacetona
presente en exceso en la disolución de intensificación.
Cuando se requiere un quelato marcador de mayor
estabilidad termodinámica o cinética en un bioensayo, el sistema de
intensificación original requiere un tiempo considerablemente más
prolongado para la intensificación, lo que no es conveniente ni
siquiera aceptable cuando se van a desarrollar sistemas universales
rápidos. Por ejemplo, el uso de sondas de DNA requiere bastante a
menudo un reactivo de quelato marcador más estable y, para
aplicaciones basadas en DNA, se ha hallado que el quelato de
lantánido y
2,2',2'',2'''-[{4-[2-(4-isotiocianatofenil)etil]-piridina-2,6-diil}-bis(metilenonitrilo)]tetrakis(ácido
acético) (Documentos EP 0.298.939 y US 6.127.529) es óptimo. Sin
embargo, el quelato utilizado requiere tiempos de desarrollo de
fluorescencia más prolongados, y se requieren rutinariamente
20-30 minutos para que se estabilice la
fluorescencia en la disolución de intensificación.
Una aplicación en que la presente tecnología
DELFIA® ha sido hallada inadecuada es el análisis rápido de muestras
con acceso aleatorio llevado a cabo con un sistema de reactivos
secos "todo en uno" [Pettersson et al., Luminiscence
15: 399-407 (2000)]. En este sistema, el
procedimiento de secado utilizado para preparar pocillos "todo en
uno" específicos para ensayos con reactivos secos requiere un
reactivo quelante fuerte a causa del riesgo de disociación iónica
durante el proceso de secado. Se ha hallado que, para este
procedimiento, el uso de quelatos de DTTA optimizados para DELFIA®
no es muy adecuado. Por otro lado, cuando se utilizan reactivos de
marcación quelantes más fuertes, el tiempo necesario para la
intensificación llega a ser demasiado largo para el proceso
completo.
Otro caso en que no es adecuada la tecnología
DELFIA® original es el análisis de muestras de plasma que pueden
contener concentraciones elevadas de citrato o EDTA. En los ensayos
de analitos en una operación (requeridos, por ejemplo, en el
análisis competitivo de antígenos hapténicos), no se puede utilizar
el quelato de DTTA optimizado para DELFIA® a causa de los procesos
de quelación competitivos.
Aún otro tipo de ensayo en que se requiere un
sistema de intensificación/marcación mejorado se refiere a
aplicaciones en que se utilizan lantánidos libres o complejados
como marcadores. Son ejemplos de estos ensayos, por ejemplo, los
ensayos de citotoxicidad en que se utiliza el quelato de europio y
DTPA como marcador intracelular. En otros ensayos parecidos se
pueden utilizar lantánidos como marcadores/trazadores para una gran
variedad de procesos (muestras ambientales, rutas metabólicas,
etc.).
Un tipo de ensayo más en que se requieren
quelatos marcadores con mayor estabilidad que los de DTTA y una
intensificación mejorada se refiere a aplicaciones en que la mezcla
de reacción contiene concentraciones elevadas de iones metálicos.
Son ejemplos de estos ensayos las mediciones de actividad enzimática
y el análisis de suelos con inmunoensayos, en los que pueden estar
presentes cantidades relativamente elevadas de metales pesados.
Mullinax et al. (Documentos US 6.030.840
y WO 99/66333) modificaron el método DELFIA® al añadir cierto
compuesto polianiónico a la disolución de intensificación. Enseñan
que la disociación del ión de lantánido del quelato es ya más
rápida en un pH mayor. Los quelatos utilizados en sus ejemplos son
DTPA y un derivado de bencil-EDTA, en que se
utiliza un grupo acetato para la copulación con la biomolécula. Las
estabilidades de estos quelatos son menores o aproximadamente
iguales que las del derivado de DTTA usado en el método DELFIA®. No
hay pruebas ni datos relativos a que el método presentado por
Mullinax et al. funcione con los quelatos más estables
utilizados para la marcación de biomoléculas. En comparación con la
disolución de intensificación comercializada (producto de Wallac),
el método anteriormente mencionado tampoco proporciona una mejora
porque la disolución de intensificación comercial de DELFIA® ya
contiene polianiones (ácido ftálico).
Dakubu (Documento US 5.124.268) dividió la
intensificación de la fluorescencia en dos partes. La primera parte
es la disociación del metal del quelato estable de lantánido al
reducir el pH a 1,5-3,0. La segunda parte del
procedimiento es el cambio del pH a un valor por encima de 3,5 y el
desarrollo del quelato de lantánido fluorescente. Sin embargo, este
método de dos operaciones es demasiado laborioso para ser utilizado
en sistemas de diagnóstico automáticos porque exige una operación
de incubación y adición extra.
Un objeto del presente invento es proporcionar
una disolución de intensificación mejorada para una tecnología de
ensayo en que se usan iones de lantánidos o sus quelatos como
marcadores y una intensificación disociativa de la fluorescencia
como una herramienta para la detección.
Otro objeto del presente invento es proporcionar
un ensayo mejorado en que se usan iones de lantánidos o sus
quelatos como marcadores y una intensificación disociativa de la
fluorescencia como una herramienta para la detección.
De esta manera, este invento proporciona una
disolución de intensificación para una tecnología de ensayo en que
se usan iones de lantánidos o sus quelatos como marcadores y una
intensificación disociativa de la fluorescencia como una
herramienta para la detección, disolución de intensificación que
comprende una \beta-dicetona de fórmula I
en la
que
R_{1} es un arilo, opcionalmente
monosustituido o multisustituido, y
R_{2} es una cadena alquílica lineal o
ramificada con de 2 a 9 átomos de carbono, sustituida con cuatro o
más átomos de flúor, opcionalmente monosustituida o multisustituida
con otros sustituyentes distintos de flúor.
\vskip1.000000\baselineskip
Este invento proporciona además un ensayo de
bioafinidad en que se usan iones de lantánidos o sus quelatos como
marcadores y una intensificación disociativa de la fluorescencia
como una herramienta para la detección, que comprende las
operaciones de
- a)
- mezclar una muestra, que comprende un analito que se va a ensayar, con reaccionantes de dicho ensayo para obtener una mezcla de ensayo;
- b)
- hacer reaccionar dicho analito con dichos reaccionantes, por lo que tiene lugar una reacción de bioafinidad entre dicho analito y dichos reaccionantes de dicho ensayo para dar lugar a un producto de reacción en que
- i)
- el analito está fijado al menos a un reaccionante covalente o no covalentemente marcado con un lantánido o un quelato de lantánido, o
- ii)
- un compuesto análogo del analito u otro reaccionante cuya cantidad se correlaciona directa o inversamente con el analito está directamente marcado con el lantánido,
- en que a los lantánidos de los puntos i) y ii) anteriores se hace más adelante referencia como lantánidos marcadores;
- c)
- separar dicho producto de reacción obtenido en la operación b), producto que comprende dichos lantánidos marcadores anteriormente definidos, de los reaccionantes marcados libres no unidos;
- d)
- añadir la disolución de intensificación anteriormente definida para
- i)
- disociar los lantánidos marcadores, de los quelatos de los productos de reacción de la operación b), y
- ii)
- crear un quelato de lantánido muy fluorescente con la \beta-dicetona de dicha disolución de intensificación, y
- e)
- medir por fluorometría la cantidad, que se correlaciona directa o inversamente con la cantidad de analito de la muestra en la operación a), de los lantánidos marcadores de la operación d) como complejos de \beta-dicetona.
La Figura 1 muestra la influencia de las
concentraciones de EDTA sobre las señales de lantánidos de las
disoluciones de intensificación después de una agitación durante
una hora.
La Figura 2 muestra el tiempo de desarrollo de
la fluorescencia en la disolución de intensificación que contiene
distintas cantidades de
1-(2-benzofuril)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona
(BFPP) y un anticuerpo anti-HCG marcado con quelato
de europio y ácido
(S)-1-(4-isotiocianatobencil)dietilentriamina-N,N,N',N'',N''-pentaacético
El presente invento se refiere a una tecnología
de ensayo en que se usan iones de lantánidos o sus quelatos como
marcadores y una intensificación disociativa de la fluorescencia
como una herramienta para la detección. Esta tecnología, muy
aplicada en el diagnóstico y la investigación, es comercialmente
conocida como tecnología DELFIA®. El invento proporciona una mejora
al proceso de intensificación de DELFIA® que hace posible utilizar
un único reactivo marcador para todas las aplicaciones y permite un
rápido proceso de intensificación incluso con quelatos marcadores
muy estables. El sistema de intensificación mejorado ayuda a atajar
los problemas anteriormente mencionados y permite una rápida
cinética de intercambio de ligandos independientemente de la
aplicación.
Al modificar el proceso de intensificación como
aquí se describe, se alcanzan mejoras en cuanto a velocidad y
solidez. El nuevo proceso de intensificación mejorado permite
aplicaciones que requieren quelatos marcadores más estables y
permite de manera práctica el uso de un solo tipo de marcador de
quelato para todas las aplicaciones. El nuevo sistema de
intensificación evita también las dificultades de la tecnología
original relacionadas con, por ejemplo, muestras de plasma y otras
muestras que contienen elevadas concentraciones de EDTA o citrato u
otros agentes fuertemente quelantes, muestras y tampones que
contienen elevadas concentraciones de iones metálicos, o cualquier
ensayo que por otras razones plantee elevadas exigencias en la
estabilidad de los quelatos marcadores.
El presente invento se hace posible al cambiar
la estructura de la \beta-dicetona utilizada. Las
\beta-dicetonas han sido utilizadas como ligandos
intensificadores de la fluorescencia después de la disociación del
metal del quelato de lantánido usado para la marcación de
biomoléculas. Las presentes disoluciones de intensificación, la
comercializada por Wallac y las descritas en la bibliografía, se
basan en \beta-dicetonas
trifluoro-sustituidas, tales como
4,4,4-trifluoro-1-(2-naftil)-1,3-butanodiona
y
4,4,4-trifluoro-1-(2-tienil)-1,3-butanodiona.
Estos compuestos son capaces de formar quelatos de lantánido
luminiscentes en el pH de disociación utilizado, de 3,0 a 3,5. Si
el pH es menor, las \beta-dicetonas trifluoradas
ya no son eficaces. De acuerdo con el presente invento, el grupo
trifluorometilo de las \beta-dicetonas es
sustituido por grupos más fluorados, lo que permite el uso de un pH
menor. Las \beta-dicetonas preferibles del
presente invento son
1-aril-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona
y
1-aril-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona.
La adición de átomos de flúor marcadamente
electronegativos a la estructura de las
\beta-dicetonas aumenta su acidez. A causa de
este efecto, estas nuevas \beta-dicetonas son
capaces de quelar metales lantánidos en un pH de hasta 2,0 a 2,8.
La disolución de intensificación de este presente invento, que
contiene estas nuevas \beta-dicetonas y pHs más
bajos, acelera la velocidad de disociación y la nueva formación de
quelatos. Cuando la disociación es más rápida, se pueden utilizar
quelatos de lantánido más estables para la marcación de
biomoléculas.
En la bibliografía se conocen
\beta-dicetonas con la estructura de la
4,4,5,5,5-pentafluoro-1-aril-1,3-pentanodiona
y la
4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1-aril-1,3-hexanodiona.
Son ejemplo, con n^{os} de registro del Chemical Abstract entre
corchetes:
4,4,5,5,5-pentafluoro-1-(3-fluoro-4-metoxifenil)-1,3-pentanodiona
[81516-12-3],
1-(2,5-difluorofenil)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona
[64287-16-7],
4,4,5,5,5-pentafluoro-1-(4-fluorofenil)-1,3-pentanodiona
[64287-12-3],
1-(4-bromofenil)-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona
[307531-56-2],
1-(9H-fluoren-2-il)-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona
[202460-66-0] y
1-(1,1'-bifenil)-4-il-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona
[171666-86-7], pero su uso en un
sistema de ensayo no ha sido descrito ni sugerido.
Por lo tanto, el presente invento trata de una
disolución de intensificación para una tecnología de ensayo en que
se utilizan iones de lantánidos o sus quelatos como marcadores y una
intensificación disociativa de la fluorescencia como una
herramienta para la detección, en que dicha disolución de
intensificación comprende una \beta-dicetona
de
fórmula I
fórmula I
en la
que
R_{1} es un arilo, opcionalmente
monosustituido o multisustituido, y
R_{2} es una cadena alquílica lineal o
ramificada con de 2 a 9, preferiblemente de 2 a 5, átomos de
carbono, sustituida con cuatro o más átomos de flúor, opcionalmente
monosustituida o multisustituida con otros sustituyentes distintos
de flúor.
\vskip1.000000\baselineskip
Dicho arilo de R_{1} es preferiblemente
seleccionado del grupo que consiste en fenilo,
9H-fluoren-2-ilo,
1-naftilo, 2-naftilo,
2-fenantrolilo, 3-fenantrolilo,
4-fenantrolilo, 5-fenantrolilo,
2-furilo, 3-furilo,
2-benzofurilo, 3-benzofurilo,
2-tienilo, 3-tienilo,
2-piridilo, 3-piridilo,
4-piridilo, 2-tiazolilo,
4-tiazolilo, 5-tiazolilo,
2-benzotiazolilo,
2-benzo-[b]tienilo,
3-benzo[b]tienilo,
2-pirimidilo, 4-pirimidilo y
5-pirimidilo.
Dicho arilo de R_{1} puede ser monosustituido
o multisustituido. Cada sustituyente puede ser independientemente,
por ejemplo, un alquilo lineal o ramificado, alcoxilo, arilo,
aroilo, ariloxilo, nitro, amino, ciano, hidroxilo, carboxilo,
cloro, bromo, flúor o acilo. Si las sustituciones comprenden átomos
que pueden estar sustituidos, estos, a su vez, pueden estar
sustituidos.
La cadena alquílica R_{2} está preferiblemente
sustituida con de 4 a 9 átomos de flúor, y muy preferiblemente con
de 5 a 7 átomos de flúor.
Los átomos de carbono más próximos a los grupos
carbonilo, preferiblemente los primeros 2 a 5 átomos de carbono, de
la cadena alquílica R_{2} están sustituidos con átomos de flúor,
preferiblemente con de 5 a 7 átomos de flúor.
La
4,4,5,5,5-pentafluoro-1-aril-1,3-pentanodiona
y la
4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1-aril-1,3-hexanodiona
son alternativas preferibles para la
\beta-dicetona de la disolución de
intensificación. Son \beta-dicetonas típicas de
la disolución de intensificación:
1-(2-benzofuril)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona,
1-(2-benzofuril)-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona,
1-(2-benzo[b]tienil)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona
y
1-(2-benzo[b]tienil)-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona.
R_{2} puede ser monosustituido o
multisustituido con otros sustituyentes distintos de flúor, y cada
sustituyente puede ser independientemente seleccionado del grupo
que consiste en alquilo lineal o ramificado, alcoxilo, arilo,
aroilo, ariloxilo, nitro, amino, ciano, hidroxilo, carboxilo, cloro,
bromo y acilo. Si las sustituciones comprenden átomos que pueden
estar sustituidos, estos, a su vez, pueden estar sustituidos.
La disolución de intensificación es
preferiblemente un tampón que tiene un pH de 2,0 a 2,8. La
disolución de intensificación es preferiblemente una disolución de
1 a 50 \muM de \beta-dicetona.
La disolución de intensificación comprende
preferiblemente un detergente que es un
alquil-aril-poliéter-alcohol,
un compuesto iónico dipolar o un compuesto de amonio cuaternario.
La disolución de intensificación comprende típicamente de 0,1% a
0,5% de un
alquil-aril-poliéter-alcohol.
Triton X-100,
3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato
y bromuro de cetiltrimetilamonio son típicas alternativas relativas
a los detergentes de la disolución de intensificación. La
disolución de intensificación comprende preferiblemente una base de
Lewis que es un óxido de trialquilfosfina o un óxido de
triarilfosfina. La base de Lewis es típicamente óxido de
trioctilfosfina, y la disolución de intensificación es
preferiblemente una disolución de 10 a 100 \muM de óxido de
trioctilfosfina.
El presente invento trata además de un ensayo de
bioafinidad en que se usan iones de lantánidos o sus quelatos como
marcadores y una intensificación disociativa de la fluorescencia
como una herramienta para la detección, que comprende las
operaciones de
- a)
- mezclar una muestra, que comprende un analito que se va a ensayar, con reaccionantes de dicho ensayo para obtener una mezcla de ensayo;
- b)
- hacer reaccionar dicho analito con dichos reaccionantes, por lo que tiene lugar una reacción de bioafinidad entre dicho analito y dichos reaccionantes de dicho ensayo para dar lugar a un producto de reacción en que
- i)
- el analito está fijado al menos a un reaccionante covalente o no covalentemente marcado con un lantánido o un quelato de lantánido, o
- ii)
- un compuesto análogo del analito u otro reaccionante cuya cantidad se correlaciona directa o inversamente con el analito está directamente marcado con el lantánido,
- en que a los lantánidos de los puntos i) y ii) anteriores se hace más adelante referencia como lantánidos marcadores;
- c)
- separar dicho producto de reacción obtenido en la operación b), producto que comprende dichos lantánidos marcadores anteriormente definidos, de los reaccionantes marcados libres no unidos usando preferiblemente, como captador, un reaccionante inmovilizado en una fase sólida;
- d)
- añadir la disolución de intensificación de acuerdo con el invento para
- i)
- disociar los lantánidos marcadores, de los quelatos de los productos de reacción de la operación b), y
- ii)
- crear un quelato de lantánido muy fluorescente con la \beta-dicetona de dicha disolución de intensificación, y
- e)
- medir por fluorometría, usando preferiblemente resolución temporal, la cantidad, que se correlaciona directa o inversamente con la cantidad de analito de la muestra en la operación a), de los lantánidos marcadores de la operación d) como complejos de \beta-dicetona.
\vskip1.000000\baselineskip
Los reaccionantes de dicho ensayo pueden
comprender un reactivo biológico ligante tal como un anticuerpo
monoclonal, policlonal o diseñado, o un fragmento del mismo, un
receptor, un ligando, una proteína ligante natural, una enzima, un
péptido, una lectina, estreptavidina o avidina, un oligonucleótido,
un polinucleótido, una impresión plástica ligante, una célula, un
fragmento celular, una membrana o una micela. Si el reactivo
biológico ligante es un oligonucleótido o un polinucleótido, dicho
reactivo puede ser seleccionado del grupo que consiste en DNA, RNA,
cDNA, una matriz de cDNA, mRNA, PNA o un aptámero.
El analito puede ser un hapteno, un antígeno,
una hormona, una proteína, un péptido, un fármaco, un virus, una
secuencia de DNA, un RNA, un microbio, una toxina ambiental, una
célula, un fragmento celular, una membrana o una micela.
El producto de reacción de la operación b) puede
ser, por ejemplo, un inmunocomplejo, un complejo de
proteína-proteína, un complejo de
antígeno-anticuerpo, un híbrido de nucleótidos, un
producto enzimático final o un producto final de una reacción
celular.
El lantánido puede ser europio, terbio, samario
o disprosio.
Un reaccionante utilizado para medir el analito
puede ser, por ejemplo, un sustrato enzimático.
El método de acuerdo con el invento puede
comprender además dos o más ensayos de bioafinidad llevados a cabo
utilizando la misma muestra y la misma mezcla de ensayo, marcando
los reaccionantes de cada ensayo con un lantánido diferente. La
fluorescencia de los diferentes lantánidos puede ser medida
utilizando la misma disolución de intensificación.
El invento será ahora ilustrado por medio de la
síntesis de las adecuadas \beta-dicetonas
descritas en los Ejemplos 1 a 10. En el Ejemplo 11 se presenta la
influencia de la concentración de EDTA sobre las señales de los
lantánidos de las disoluciones de intensificación. En el Ejemplo 12
se muestra el tiempo de desarrollo de la fluorescencia en la
disolución de intensificación que contiene distintas cantidades de
1-(2-benzofuril)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona
(BFPP) y anti-HCG marcado con quelato de europio y
ácido
(S)-1-(4-isotiocianatobencil)dietilentriamina-N,N,N',N'',N''-pentaacético.
Se disolvió 2-acetiltiofeno (4,3
ml) en tolueno seco (40 ml). Se añadió lentamente hidruro de sodio
(60%, 3,2 g) y se agitó la mezcla durante 15 minutos. Se añadió
pentafluoropropionato de etilo (13,44 g) y se continuó la agitación
durante la noche. Se añadió ácido sulfúrico (10%, 50 ml) y se
separaron las fases. La fase orgánica fue lavada con agua (50 ml) y
fue sometida a evaporación hasta sequedad. El residuo fue destilado
(punto de ebullición de 92-94ºC/15 Pa) para obtener
el producto (9,0 g). Resonancia magnética nuclear (NMR; del inglés,
nuclear magnetic resonance) de ^{1}H
(CDCl_{3}): 6,50 (s, 1 H), 7,21 (dd, 1 H, J = 3,9 y 4,9 Hz), 7,77
(dd, 1 H, J = 1,1 y 4,9 Hz), 7,85 (dd, 1 H, J = 1,1 y 3,9 Hz). IR
(película): 1592 (C=O), 1202 (C-F).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto se sintetizó de acuerdo con el
Ejemplo 1 usando 2-acetiltiofeno y
heptafluorobutirato de etilo como materiales de partida.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 6,49 (s, 1 H), 7,21 (dd, 1
H, J = 3,8 y 5,1 Hz), 7,77 (dd, 1 H, J = 1,2 y 5,1 Hz), 7,85 (dd, 1
H, J = 1,2 y 3,8 Hz). IR (película): 1589 (C=O), 1230
(C-F).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto se sintetizó de acuerdo con el
Ejemplo 1 utilizando
2-acetil-5-cianotiazol
y pentafluoropropionato de etilo como materiales de partida. El
producto fue purificado utilizando cromatografía de resolución
rápida (sílice; acetato de etilo al 10% en éter de petróleo como
eluyente). ^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 6,53 (s, 1 H),
7,68 (d, 1 H, J = 4,2), 7,79 (d, 1 H, J = 4,2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo refluir durante 2 horas una mezcla de
1-(5-ciano-2-tienil)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona
(0,78 g), ácido sulfúrico (9 ml) y ácido acético (10 ml). La mezcla
enfriada fue vertida en 100 ml de agua. El precipitado fue separado
por filtración y fue lavado con agua. ^{1}H-NMR
(CDCl_{3}): 6,53 (s, 1 H), 7,57 (d, 1 H, J = 4,1), 7,78 (d, 1 H,
J = 4,1).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto se sintetizó de acuerdo con el
Ejemplo 1 usando 2-acetilfurano y
heptafluorobutirato de etilo como materiales de partida.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 6,54 (s, 1 H), 6,65 (dd, 1
H, J = 1,6 y 3,6 Hz), 7,37 (dd, 1 H, J = 0,6 y 3,6 Hz), 7,70 (dd, 1
H, J = 0,6 y 1,6 Hz). IR (película): 1616 (C=O), 1231
(C-F).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto se sintetizó de acuerdo con el
Ejemplo 1 utilizando
2-acetil-naftaleno y
pentafluoropropionato de etilo como materiales de partida. El
producto fue cristalizado en éter de petróleo.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 6,79 (s, 1 H),
7,57-7,67 (m, 2 H), 7,90 (d ancho, 1 H),
7,94-7,95 (m, 2 H), 7,99 (d ancho, 1 H), 8,53 (s, 1
H). IR (película): 1602 (C=O), 1201 (C-F).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto se sintetizó de acuerdo con el
Ejemplo 1 utilizando
2-acetil-naftaleno y
heptafluorobutirato de etilo como materiales de partida. El
producto fue cristalizado en éter de petróleo.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 6,76 (s, 1 H),
7,57-7,66 (m, 2 H), 7,90 (d ancho, 1 H),
7,93-7,94 (m, 2 H), 7,98 (d ancho, 1 H), 8,53 (s, 1
H). IR (película): 1602 (C=O), 1232 (C-F).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto se sintetizó de acuerdo con el
Ejemplo 1 utilizando
2-acetil-benzo[b]tienilo
y pentafluoropropionato de etilo como materiales de partida. El
producto fue cristalizado en etanol. ^{1}H-NMR
(CDCl_{3}): 6,63 (s, 1 H), 7,89-7,93 (m, 3 H),
8,12 (d, 1 H, J = 0,6 Hz). IR (película): 1589 (C=O), 1203
(C-F).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto se sintetizó de acuerdo con el
Ejemplo 1 utilizando
2-acetil-benzofurano y
pentafluoropropionato de etilo como materiales de partida. El
producto fue cristalizado en éter de petróleo.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 6,75 (s, 1 H), 7,35 (ddd,
1 H, J = 0,9 y 7,1 y 7,9 Hz), 7,51 (ddd, 1 H, J = 1,3 y 7,1 y 8,4
Hz), 7,58-7,60 (m, 1 H), 7,67 (d, 1 H, J = 0,9 Hz),
7,71-7,73 (m, 1 H). IR (película): 1614 (C=O); 1211,
1200 (C-F).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto se sintetizó de acuerdo con el
Ejemplo 1 utilizando
2-acetil-benzofurano y
heptafluorobutirato de etilo como materiales de partida. El
producto fue cristalizado en éter de petróleo.
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): 6,74 (s, 1 H), 7,35 (ddd,
1 H, J = 0,9 y 7,2 y 8,0 Hz), 7,52 (ddd, 1 H, J = 1,3 y 7,2 y 8,4
Hz), 7,58-7,61 (m, 1 H), 7,68 (d, 1 H, J = 0,9 Hz),
7,71-7,74 (m, 1 H). IR (película): 1614 (C=O), 1232
(C-F).
\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 1 se presenta la influencia de las
concentraciones de EDTA sobre las señales de los lantánidos de las
disoluciones de intensificación después de una agitación durante una
hora. ES-W corresponde a la disolución de
intensificación comercializada por Wallac; ES-BFPP y
ES-BFHH son las disoluciones de intensificación del
presente invento que contienen
1-(2-benzofuril)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona
(BFPP) y
1-(2-benzofuril)-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona
(BFHH), respectivamente. Los contenidos de las nuevas disoluciones
de intensificación son los siguientes:
\beta-dicetona 5 \muM, Triton
X-100 al 0,2%, óxido de trioctilfosfina 50 \muM y
tampón de glicocola-HCl, pH = 2,3.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 2 se presenta el tiempo de
desarrollo de la fluorescencia en la disolución de intensificación
que contiene distintas cantidades de
1-(2-benzofuril)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona
(BFPP) y un anticuerpo anti-HCG marcado con quelato
de europio y ácido
(S)-1-(4-isotiocianatobencil)dietilentriamina-N,N,N',N'',N''-pentaacético.
ES-W corresponde a la disolución de intensificación
comercializada por Wallac.
Se apreciará que el presente invento puede ser
incorporado en forma de una diversidad de realizaciones, de las
cuales sólo se describen aquí unas pocas.
Claims (25)
1. Una disolución de intensificación para una
tecnología de ensayo en que se usan iones de lantánidos o sus
quelatos como marcadores y una intensificación disociativa de la
fluorescencia como una herramienta para la detección,
caracterizada porque dicha disolución de intensificación es
un tampón que tiene un pH de 2,0 a 2,8 y dicha disolución de
intensificación comprende una \beta-dicetona de
fórmula I
en la
que
R_{1} es un arilo, opcionalmente
monosustituido o multisustituido, y
R_{2} es una cadena alquílica lineal o
ramificada con de 2 a 9 átomos de carbono, sustituida con cuatro o
más átomos de flúor, opcionalmente monosustituida o multisustituida
con otros sustituyentes distintos de flúor.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La disolución de intensificación de acuerdo
con la Reivindicación 1, caracterizada porque el arilo de
R_{1} es seleccionado del grupo que consiste en fenilo,
9H-fluoren-2-ilo,
1-naftilo, 2-naftilo,
2-fenantrolilo, 3-fenantrolilo,
4-fenantrolilo, 5-fenantrolilo,
2-furilo, 3-furilo,
2-benzofurilo, 3-benzofurilo,
2-tienilo, 3-tienilo,
2-piridilo, 3-piridilo,
4-piridilo, 2-tiazolilo,
4-tiazolilo, 5-tiazolilo,
2-benzotiazolilo,
2-benzo[b]tienilo,
3-benzo[b]tienilo,
2-pirimidilo, 4-pirimidilo y
5-pirimidilo.
3. La disolución de intensificación de acuerdo
con la Reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el arilo
de R_{1} está monosustituido o multisustituido y cada sustituyente
es independientemente seleccionado del grupo que consiste en
alquilo lineal o ramificado, alcoxilo, arilo, aroilo, ariloxilo,
nitro, amino, ciano, hidroxilo, carboxilo, cloro, bromo, flúor y
acilo.
4. La disolución de intensificación de acuerdo
con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque
la cadena alquílica R_{2} es una cadena alquílica lineal o
ramificada con de 2 a 5 átomos de carbono.
5. La disolución de intensificación de acuerdo
con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque
la cadena alquílica R_{2} está sustituida con de 4 a 9 átomos de
flúor.
6. La disolución de intensificación de acuerdo
con la Reivindicación 5, caracterizada porque la cadena
alquílica R_{2} está sustituida con de 5 a 7 átomos de flúor.
7. La disolución de intensificación de acuerdo
con la Reivindicación 6, caracterizada porque la cadena
alquílica R_{2} está sustituida con de 5 a 7 átomos de flúor que
son sustituciones de los primeros 2 a 5 carbonos de R_{2}.
8. La disolución de intensificación de acuerdo
con la Reivindicación 7, caracterizada porque la
\beta-dicetona es
4,4,5,5,5-pentafluoro-1-aril-1,3-pentanodiona
o
4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1-aril-1,3-hexanodiona.
9. La disolución de intensificación de acuerdo
con la Reivindicación 7, caracterizada porque la
\beta-dicetona es seleccionada del grupo que
consiste en
1-(2-benzofuril)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona,
1-(2-benzofuril)-4,4,
5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona, 1-(2-benzo[b]tienil)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona y 1-(2-benzo[b]
tienil)-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona.
5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona, 1-(2-benzo[b]tienil)-4,4,5,5,5-pentafluoro-1,3-pentanodiona y 1-(2-benzo[b]
tienil)-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoro-1,3-hexanodiona.
10. La disolución de intensificación de acuerdo
con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, caracterizada
porque R_{2} está monosustituido o multisustituido con
sustituyentes distintos de flúor y cada sustituyente es
independientemente seleccionado del grupo que consiste en alquilo
lineal o ramificado, alcoxilo, arilo, aroilo, ariloxilo, nitro,
amino, ciano, hidroxilo, carboxilo, cloro, bromo y acilo.
11. La disolución de intensificación de acuerdo
con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque
la disolución de intensificación es una disolución de 1 a 50 \muM
de dicha \beta-dicetona.
12. La disolución de intensificación de acuerdo
con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque
la disolución de intensificación comprende un detergente que es
a) un
alquil-aril-poliéter-alcohol,
b) un compuesto iónico dipolar, o
c) un compuesto de amonio cuaternario.
\vskip1.000000\baselineskip
13. La disolución de intensificación de acuerdo
con la Reivindicación 12, caracterizada porque la disolución
de intensificación comprende de 0,1% a 0,5% de un
alquil-aril-poliéter-alcohol.
14. La disolución de intensificación de acuerdo
con la Reivindicación 12, caracterizada porque la disolución
de intensificación comprende un detergente seleccionado del grupo
que consiste en Triton X-100,
3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato
y bromuro de cetiltrimetilamonio.
15. La disolución de intensificación de acuerdo
con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque
la disolución de intensificación comprende una base de Lewis que es
un óxido de trialquilfosfina o un óxido de triarilfosfina.
16. La disolución de intensificación de acuerdo
con la Reivindicación 15, caracterizada porque la base de
Lewis es óxido de trioctilfosfina y la disolución de intensificación
es una disolución de 10 a 100 \muM de óxido de
trioctilfosfina.
17. Un ensayo de bioafinidad en que se usan
iones de lantánidos o sus quelatos como marcadores y una
intensificación disociativa de la fluorescencia como una
herramienta para la detección, que comprende las operaciones de
- a)
- mezclar una muestra, que comprende un analito que se va a ensayar, con reaccionantes de dicho ensayo para obtener una mezcla de ensayo;
- b)
- hacer reaccionar dicho analito con dichos reaccionantes, por lo que tiene lugar una reacción de bioafinidad entre dicho analito y dichos reaccionantes de dicho ensayo para dar lugar a un producto de reacción en que
- i)
- el analito está fijado al menos a un reaccionante covalente o no covalentemente marcado con un lantánido o un quelato de lantánido, o
- ii)
- un compuesto análogo del analito u otro reaccionante cuya cantidad se correlaciona directa o inversamente con el analito está directamente marcado con el lantánido,
- en que a los lantánidos de los puntos i) y ii) anteriores se hace más adelante referencia como lantánidos marcadores;
- c)
- separar dicho producto de reacción obtenido en la operación b), producto que comprende dichos lantánidos marcadores anteriormente definidos, de los reaccionantes marcados libres no unidos;
- d)
- añadir la disolución de intensificación para
- i)
- disociar los lantánidos marcadores, de los quelatos de los productos de reacción de la operación b), y
- ii)
- crear un quelato de lantánido muy fluorescente con la \beta-dicetona de dicha disolución de intensificación, y
- e)
- medir por fluorometría la cantidad, que se correlaciona directa o inversamente con la cantidad de analito de la muestra en la operación a), de los lantánidos marcadores de la operación d) como complejos de \beta-dicetona,
caracterizado porque la
disolución de intensificación es de acuerdo con la Reivindicación
1.
\vskip1.000000\baselineskip
18. El método de acuerdo con la Reivindicación
17, caracterizado porque la operación c) de separación es
llevada a cabo usando, como captador, un reaccionante inmovilizado
en una fase sólida.
19. El método de acuerdo con la Reivindicación
17 ó 18, caracterizado porque la medición de la operación e)
es llevada a cabo usando resolución temporal.
20. El método de acuerdo con la Reivindicación
17, 18 ó 19, caracterizado porque los reaccionantes del
ensayo comprenden un reactivo biológico ligante seleccionado del
grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, policlonal o
diseñado, o un fragmento del mismo, un receptor, un ligando, una
proteína ligante natural, una enzima, un péptido, una lectina,
estreptavidina o avidina, un oligonucleótido, un polinucleótido, una
impresión plástica ligante, una célula, un fragmento celular, una
membrana y una micela.
21. El método de acuerdo con la Reivindicación
20, caracterizado porque el reactivo biológico ligante es un
oligonucleótido o polinucleótido seleccionado del grupo que consiste
en DNA, RNA, cDNA, una matriz de cDNA, mRNA, PNA o un aptámero.
22. El método de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 17 a 21, caracterizado porque el analito es
seleccionado del grupo que consiste en un hapteno, un antígeno, una
hormona, una proteína, un péptido, un fármaco, un virus, una
secuencia de DNA, un RNA, un microbio, una toxina ambiental, una
célula, un fragmento celular, una membrana o una micela.
23. El método de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 17 a 22, caracterizado porque el lantánido
es europio, terbio, samario o disprosio.
24. El método de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 17 a 23, caracterizado porque se llevan a
cabo dos o más ensayos de bioafinidad utilizando la misma muestra y
la misma mezcla de ensayo, marcando los reaccionantes de cada
ensayo con un lantánido diferente.
25. El método de acuerdo con la Reivindicación
24, caracterizado porque se mide la fluorescencia de los
diferentes lantánidos utilizando la misma disolución de
intensificación.
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