JP4326030B2 - リピッドａ類縁体含有注射用製剤及びその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【発明の背景及び従来技術】
リポポリサッカライド（以下ＬＰＳ）の活性発現中心であるリピッドＡは、マクロファージ刺激作用、抗腫瘍作用、発熱作用などさまざまな生物活性を有することが知られている（例えば、高田春比古、小谷尚三、蛋白質、核酸、酵素、３１（４）、３６１（１９８６））。
【０００３】
近年、リピッドＡ類縁体が種々合成され、その生物活性が調べられているが（小川祐示他、代謝、２６（５）、４１５（１９８９））、リピッドＡ類縁体は、本来、糖脂質構造を有し、その類縁体の多くは、水難溶性または不溶性であるため、特に注射剤とするのは困難であり、透明性の高い水溶液を得るために種々研究がなされてきた。その結果、可溶化剤として、トリエチルアミン、牛血清アルブミン、脂質などを添加することなどが提案されている（Y.B.Kim,et al,Eur.J.Biochem.31,230(1972)及びR.B.Ramsey,et al,Blood,56,307(1980)、J.Dijkstra,et al.,J.Immunol.,138,2663(1987))。
【０００４】
また、特開平４−１９８１９２号には 可溶化剤として、塩基性アミノ酸やポリアミンなどを利用する方法が開示されているが、水溶液のｐＨはいずれも１０付近と高いものである。
一方、レシチンなどの脂質を水に分散させ、リポソーム等の会合体を形成させるには、中性領域の緩衝液に脂質を入れて加熱し、超音波照射する方法が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
リピッドＡ類縁体を可溶化剤を用いて可溶化する方法は、水中での物理的安定性、化学的安定性、薬理効果及び安全性の面で十分なものとは言えず、実用化には至っていない。また、中性領域の緩衝液に分散し、超音波処理する方法によってもリピッドＡ類縁体の透明な溶液を得ることはできなかった。従って、リピッドＡ類縁体の実用に供しうる注射剤、すなわち水溶液とした時に澄明性が高く、ｐＨが注射剤として好ましい範囲であり、安定性も良好である注射剤が渇望されている。
以上のような状況に鑑み、本発明者らは、リピッドＡ類縁体を含有する澄明性が高くかつ安定な注射用製剤並びにそれらの製造方法を探索すべく鋭意研究を行った。その結果、以下に示す構成により所期の目的を達成できることを見いだし、本発明を完成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加してなることを特徴とする注射用製剤である。
本発明はまた、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加することを特徴とする注射用製剤の製造方法である。
さらに本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加して製する平均粒子径３０ｎｍ以下の会合体を含有する注射用製剤およびその製造方法である。
【０００７】
本発明によると、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩（以下単にリピッドＡ類縁体と称する）を透明で安定な注射用製剤とすることができるが、これが本発明の目的である。
本発明によるリピッドＡ類縁体の代表的な化合物は次の化学構造式（Ｉ）又は（II）を有し、例えば特開平５ー１９４４７０号公報またはＷＯ９６／３９４１１号によって開示される方法で製造することができる。
【０００８】
【化１７】
【０００９】
〔式中、R1，R2，R3又はR4の少なくとも１つは、
【００１０】
【化１８】
【００１１】
【化１９】
【００１２】
【化２０】
【００１３】
（式中、各 LはO ，N 又は Cであり；各 Mは O又は Nであり；各 Eは、独立して０から14までの整数であり；各 Gは、独立してN ，O ，S ，SO又はSO2 であり；各ｍは、独立して０から14までの整数であり；各ｎは、独立して、０から14までの整数であり；各ｐは、独立して０から10までの整数であり；各ｑは、独立して０から10までの整数である）であり；
残りのR1，R2，R3及びR4の各々は、独立して、
【００１４】
【化２１】
【００１５】
（式中、各 LはO ，N 又は Cであり；各 Mは O又は Nであり；各ｘは、独立して、０から14までの整数であり；各ｙは、独立して、０から14の整数であり；各ｚは、独立して、０から10までの整数であり；各 Gは、独立して、N ，O ，S ，SO又はSO2 である）であり；
各A1とA2は、独立して、H ，OH，OCH3,
【００１６】
【化２２】
【００１７】
｛式中、各ｄは、独立して、０から５までの整数であり；各ｆは、独立して、０から５までの整数であり；各ｇは、独立して、０から５までの整数であり；各A3は、独立して、
【００１８】
【化２３】
【００１９】
（式中、各ｊは、独立して、０から14までの整数である）である｝であり；
Xは H，(CH2)tCH3, (CH2)tOH, (CH2)tO(CH2)vCH3, (CH2)tOPO(OH)2,
(CH2)t−CH＝CH−(CH2)vCH3, (CH2)t−O−R5,
【００２０】
【化２４】
【００２１】
（式中、各ｔとｖは、それぞれ独立して、０から14までの整数であり；R5はR1〜R4に対する上記定義のいずれかである）であり；
Y は H，OH，O(CH2)wCH3, ハロゲン原子,
【００２２】
【化２５】
【００２３】
（式中、ｗは０から14までの整数である）
である〕
【００２４】
【化２６】
【００２５】
〔式中、R1は、
【００２６】
【化２７】
【００２７】
（式中、J, K及びQ は、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜15のアルキル基であり、L はO, NH2又はCH2 であり、M は O又はNHであり、G はNH，O ，S ，SO又はSO2 である）からなる群から選ばれる基であり；
R2は直鎖又は分枝の炭素数５〜15のアルキル基であり；
R3は、
【００２８】
【化２８】
【００２９】
（式中、E は、N ，O ，S ，SO又はSO2 であり、A, B及びD は、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜15のアルキル基である）からなる群から選ばれる基であり；R4は直鎖又は分枝の炭素数４〜20のアルキル基、及び
【００３０】
【化２９】
【００３１】
（式中、U 及びV は、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数２〜15のアルキル基であり、W は水素原子、あるいは直鎖又は分枝の炭素数１〜５のアルキル基である）からなる群から選ばれる基であり；
R5は水素原子、J', -J'-OH, -J'-O-K', -J'-O-K'-OH 及び -J'-0-P0(OH)2（式中J'及びK'はそれぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜５のアルキル基である）からなる群から選ばれる基であり；
R6は水酸基、ハロゲン原子、炭素数１〜５のアルコキシ基及び炭素数１〜５のアシルオキシ基からなる群から選ばれる基であり；
A1及びA2は、それぞれ独立して、
【００３２】
【化３０】
【００３３】
（式中、Z は直鎖又は分枝の炭素数１〜10のアルキル基である）からなる群から選ばれる基である。〕
本発明において、好ましいリピッドＡ類縁体として、6-O-[2-デオキシ-6-O-メチル-4-O-フォスフォノ-3-O-[(R)-3-Z-ドデク-5-エノイルオキシデシル]-2-[3-オキソ-テトラデカノイルアミド]-β-0-フォスフォノ-α-D-グルコピラノース]四ナトリウム、α-D-グルコピラノース,3-O-デシル-2-デオキシ-6-O-[2-デオキシ-3-O-(3-メトキシデシル)-6-O-メチル-2-[(1-オキソ-11-オクタデセニル)アミノ]-4-O-フォスフォノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[(1,3-ジオキソテトラデシル) アミノ]-,1-(ディハイドロジェンフォスフェイト),ジナトリウム[6(2Z,3R)]、及び α-D-グルコピラノース,3-O-デシル-2-デオキシ-6-O-[2-デオキシ-3-O-(3-メトキシデシル)-6-O-メチル-2-[(1-オキソ-11-オクタデセニル)アミノ]-4-O-フォスフォノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[(1,3-ジオキソテトラデシル) アミノ]-,1-(ディハイドロジェンフォスフェイト),テトラナトリウム[6(2Z,3R)] を挙げることができる。これらの化学構造式は次の式(III) 及び (IV) で表される。
【００３４】
【化３１】
【００３５】
【化３２】
【００３６】
本発明におけるアルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物の水溶液を使用できるが、好ましくは、水酸化ナトリウム水溶液である。その濃度は通常、０．０００１Ｍ〜０．１Ｍであり、好ましくは０．０００５Ｍ〜０．０１Ｍであり、より好ましくは０．００１Ｍ〜０．００５Ｍである。
【００３７】
本発明においては、リピッドＡ類縁体にアルカリ性水溶液を添加後、加温することができるが、加温温度はリピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩の相転移温度以上であればよく、通常３０℃〜６０℃であり、より好ましくは４５℃〜５５℃である。加温しながらの攪拌時間は通常１０分〜３時間である。攪拌は、通常用いられる装置により行うことができる。透明な液（濁度0.6NTU以下）を得るために必要な攪拌時間は、リピッドＡ類縁体により異なるが、上記式(III) で表される化合物の場合、通常、加温温度が４０℃以下の場合は９０分以上必要とするが、４０℃以上の場合は６０分以内でよい。加温アルカリ性水溶液に溶解する場合は、あらかじめ加温したアルカリ性水溶液にリピッドＡ類縁体を添加してもよいし、またはアルカリ性水溶液にリピッドＡを添加後加温してもよい。本発明において、加温する目的は、リピッドＡ類縁体の相転移温度以上にすることにより、リピッドＡ類縁体の水和を促進して分散性を向上させ、よって短時間の攪拌により澄明な溶液を得るためである。
【００３８】
また、本発明に用いる緩衝液の成分としては、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸塩またはグリシンなどを用いることができる。緩衝液の濃度は、通常、１ｍＭ〜２０ｍＭである。最終のリピッドＡ類縁体水溶液のｐＨは、好ましくは４〜９、より好ましくは６〜８、さらに好ましくは６．８〜７．８である。最終のｐＨは緩衝液を加えた後、さらに水酸化ナトリウム溶液や塩酸溶液等を添加することによって調製することができる。
【００３９】
緩衝液には、必要に応じて、糖類及び/またはアミノ酸を添加すると、より好ましい結果を得ることができる。この場合、添加する糖類及び／またはアミノ酸は１種類でもよく、２種類以上添加してもさしつかえない。使用できる糖類としては、乳糖（ラクトース）、ソルビトール、グルコース、トレハロース、マンニトール、デキストラン等を挙げることができ、また、アミノ酸の例としては、グリシン等の中性アミノ酸、アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、アルギニン等の塩基性アミノ酸を挙げることができる。
【００４０】
本発明においては、更に、得られたリピッドＡ類縁体水溶液を通常用いられる手段により凍結乾燥製剤とすることができる。すなわち、リピッドＡもしくはその類縁体を、アルカリ性水溶液に溶解し、必要に応じてさらに加温攪拌し、次いで緩衝液を添加してｐＨを調製し、滅菌濾過後、バイアル瓶等に充填し凍結・乾燥して凍結乾燥製剤とすることができる。
本発明のかかる注射用製剤を水溶液として供した場合の浸透圧比はヒトに投与するに適した値とすることが望ましく、通常は１前後である。
【００４１】
本発明のかかる注射用製剤は、リピッドＡ類縁体が会合し略球形の平均粒子径約３０ｎｍ以下の粒子となっている。この会合体は、注射用製剤製造直後と、凍結乾燥後復水した後とでその大きさが変化することはない。一般に、凍結乾燥することにより会合体が破壊されることが多いが、本発明において復水後も３０ｎｍ以下の平均粒子径を維持できることは本発明の顕著な効果の一つである。本発明にかかる会合体は詳細な研究によると、前記式(III) で表される化合物の場合、約0.196 リットル／mole（pH11.0) の内水相を有し、調製時に攪拌を続けることにより約１５ｎｍのほぼ一定の大きさの会合体となる。従って、本発明の平均粒子径の範囲は、通常の製造方法の場合、約１５ｎｍ〜３０ｎｍである。
【００４２】
また本発明におけるリピッドＡ類縁体による会合体は、粒子径、濁度等の点において共存するマグネシウムイオンまたはカルシウムイオンの影響を受けにくい。一方、膜流動性に対してはマグネシウムイオンまたはカルシウムイオンの影響を受けこれら金属イオンが存在すると膜流動性が低下する。膜流動性は、リピッドＡ類縁体を投与後の生体内動態に影響し、膜流動性が低下すると生体内からのリピッドＡ類縁体の消失が早くなる。
【００４３】
【実施例】
以下に実施例を挙げ本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４４】
実施例１
上記式(III) で示されるリピッドＡ類縁体６０mgを４５℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で３０分間攪拌した。このうちの５mlを採取し、濁度計で濁度を測定した。濁度は0.178NTUであった。このアルカリ水溶液７.５mlに１６．７％ラクトースを含む７．０８ｍＭリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７.３９に調整した後、注射用蒸留水を加えて全量を５０ｍｌとした。この水溶液の濁度は0.181NTUであった。この水溶液5.3mlをバイアルに入れ真空凍結乾燥装置（共和製作所製、TriomasterA04)を用いて凍結乾燥した。
【００４５】
実施例２
実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５５℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で６０分間攪拌した。このアルカリ水溶液５mlを採取し、濁度計で濁度を測定した。濁度は0.133NTUであった。このアルカリ水溶液７.５mlに１６．５％ラクトースを含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを7.41に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液の濁度は0.212NTUであった。
【００４６】
実施例３
実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５０℃の０．００１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で６０分間攪拌した。このアルカリ水溶液５mlを採取し、濁度計で濁度を測定した。濁度は0.142NTUであった。このアルカリ水溶液７.５mlに８．３５％マンニトールを含む7.08mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液３０ｍｌを加え、１Ｎ塩酸でｐＨを7.39に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液の濁度は0.133NTUであった。
【００４７】
実施例４
実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５０℃の０．００５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で６０分間攪拌した。このアルカリ水溶液５mlを採取し、濁度計で濁度を測定した。濁度は0.150NTUであった。このアルカリ水溶液７.５mlに１６．５％ラクトースを含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを7.37に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液の濁度は0.205NTUであった。
【００４８】
実施例５
実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを３５℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で１５０分間攪拌した。このアルカリ水溶液５mlを採取し、濁度計で濁度を測定した。濁度は0.669NTUであった。このアルカリ水溶液７.５mlに８．３５％デキストラン７０（平均分子量７００００）を含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを7.30に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液の濁度は1.25NTUであった。
【００４９】
実施例６
上記式 (IV) で示されるリピッドＡ類縁体６．０９mgを０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９.０mlに加えて６０分間攪拌した。このｐＨは１２．０８であった。この溶液にラクトースを含有するリン酸緩衝液３０ｍｌを加えた。ｐＨは７．４６であった。この溶液に注射用蒸留水を加え、全量を６０ｍｌとした。この溶液はリピッドＡ類縁体を０．１ｍｇ／ｍｌ,１０％ラクトース及び４．２５ｍＭリン酸緩衝液を含有するｐＨ７．５０の注射液であった。
【００５０】
実施例７
実施例６で得られた注射液を滅菌濾過後、バイアル瓶に３ｍｌずつ分注し、凍結乾燥して、リピッドＡ類縁体含有の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥条件は次のようであった（凍結乾燥装置：EDWARD Model Lyo fast S08)。
凍結温度：−４０℃、１次乾燥温度：２０℃、１次乾燥圧力：０．０７５±０．０２５ｍｂａｒ、２次乾燥温度：２７℃、２次乾燥圧力：（装置の最大能力）、２次乾燥時間：１８時間。
【００５１】
実施例８
実施例６で用いたリピッドＡ類縁体４０．１６ｍｇを０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９.０mlに加えて６０分間攪拌した。このｐＨは１１．４９であった。この溶液にラクトースを含有するリン酸緩衝液１０ｍｌを加えた。ｐＨは８．４４であった。さらに、４％リン酸溶液を加えてｐＨを７．４に調整し、注射用蒸留水を加え、全量を２０ｍｌとした。この溶液はリピッドＡ類縁体を２．０ｍｇ／ｍｌ,１０％ラクトース及び４．２５ｍＭリン酸緩衝液を含有するｐＨ７．５１の注射液であった。
【００５２】
実施例９
実施例８で得られた注射液を滅菌濾過後、バイアル瓶に３ｍｌずつ分注し、凍結乾燥して、リピッドＡ類縁体含有の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥条件は次のようであった（凍結乾燥装置：EDWARD Model Lyo fast S08)。
凍結温度：−４０℃、１次乾燥温度：２０℃、１次乾燥圧力：０．０７５±０．０２５ｍｂａｒ、２次乾燥温度：２７℃、２次乾燥圧力：（装置の最大能力）、２次乾燥時間：１８時間。
【００５３】
【発明の効果】
次に本発明にかかる効果を示すために実験例を掲げる。
実験例１
本発明にかかる製剤の澄明性の評価
１．実験方法
以下に示した比較例及び本法１で調製したリピッドＡ類縁体の水溶液の濁度を測定した。測定は、Hach 2100AN Turbidimeter を用いて行った。
【００５４】
比較例 実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５０℃の１０％ラクトースを含む４．２５mMリン酸緩衝液に加えて溶解し、同温度で攪拌を続け、３０分、６０分、１２０分、１８０分後に１２．５mlを採取した。そのうちの５ｍｌを用いて濁度を測定した。また、それぞれの溶液7.5ml に１０％ラクトースを含む4.25 mM リン酸緩衝液を加えて全量を５０ｍｌにした。これらの水溶液の濁度及びｐＨを測定した。
【００５５】
本法１ 実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５０℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で攪拌し、３０分、６０分、１２０分、１８０分後にアルカリ水溶液12.5mlを採取した。そのうちの５ｍｌを用いて濁度計で濁度を測定した。次いでそれぞれのアルカリ水溶液７．５mlに１６．５％ラクトースを含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを約7.4 に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。これらの水溶液の濁度及びｐＨを測定した。
【００５６】
２．実験結果
上記実験方法より得た結果を表１に示した。
【００５７】
【表１】
【００５８】
表１より、従来の代表的方法である比較例で調製されたリピッドＡ類縁体の水溶液よりも、本発明にかかる本法１で得られたものの方が、極めて澄明性に優れていることが明らかである。
【００５９】
実験例２
リピッドＡ類縁体の凍結乾燥製剤の復水性の評価
１．実験方法
本法２ 実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５０℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で攪拌し、３０分、６０分、１２０分、１８０分後にアルカリ水溶液12.5mlを採取した。そのうちの５ｍｌを用いて濁度計で濁度を測定した。次いでそれぞれのアルカリ水溶液７.５mlに１６．５％ラクトースを含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを約7.4に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液5.3mlをバイアル瓶に入れ、真空凍結乾燥機（共和製作所製、TriomasterA-04)を用いて凍結乾燥した。さらに、得られた凍結乾燥製剤に注射用蒸留水５ｍｌを加えて再溶解し、濁度をHach 2100AN Turbidimeter を用いて測定した。
【００６０】
本法３ 実施例１で用いたリピッドＡ類縁体２００mgを５０℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１００mlに加えて溶解し、同温度で攪拌し、３０分、６０分、１２０分、１８０分後にアルカリ水溶液7.5mlを採取した。そのうちの５ｍｌを用いて濁度計で濁度を測定した。次いでそれぞれのアルカリ水溶液２.５mlに１６．５％ラクトースを含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを約7.4に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液5.3mlをバイアル瓶に入れ、真空凍結乾燥機（共和製作所製、TriomasterA-04)を用いて凍結乾燥した。さらに、得られた凍結乾燥製剤に注射用蒸留水５ｍｌを加えて再溶解し濁度を測定した。濁度は、Hach 2100AN Turbidimeter を用いて測定した。
結果を表２に示した。
【００６１】
【表２】
【００６２】
表２より、本発明による凍結乾燥製剤は再溶解してもきわめて澄明性が優れていることが明らかである。
【産業上の利用分野】
本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【発明の背景及び従来技術】
リポポリサッカライド（以下ＬＰＳ）の活性発現中心であるリピッドＡは、マクロファージ刺激作用、抗腫瘍作用、発熱作用などさまざまな生物活性を有することが知られている（例えば、高田春比古、小谷尚三、蛋白質、核酸、酵素、３１（４）、３６１（１９８６））。
【０００３】
近年、リピッドＡ類縁体が種々合成され、その生物活性が調べられているが（小川祐示他、代謝、２６（５）、４１５（１９８９））、リピッドＡ類縁体は、本来、糖脂質構造を有し、その類縁体の多くは、水難溶性または不溶性であるため、特に注射剤とするのは困難であり、透明性の高い水溶液を得るために種々研究がなされてきた。その結果、可溶化剤として、トリエチルアミン、牛血清アルブミン、脂質などを添加することなどが提案されている（Y.B.Kim,et al,Eur.J.Biochem.31,230(1972)及びR.B.Ramsey,et al,Blood,56,307(1980)、J.Dijkstra,et al.,J.Immunol.,138,2663(1987))。
【０００４】
また、特開平４−１９８１９２号には 可溶化剤として、塩基性アミノ酸やポリアミンなどを利用する方法が開示されているが、水溶液のｐＨはいずれも１０付近と高いものである。
一方、レシチンなどの脂質を水に分散させ、リポソーム等の会合体を形成させるには、中性領域の緩衝液に脂質を入れて加熱し、超音波照射する方法が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
リピッドＡ類縁体を可溶化剤を用いて可溶化する方法は、水中での物理的安定性、化学的安定性、薬理効果及び安全性の面で十分なものとは言えず、実用化には至っていない。また、中性領域の緩衝液に分散し、超音波処理する方法によってもリピッドＡ類縁体の透明な溶液を得ることはできなかった。従って、リピッドＡ類縁体の実用に供しうる注射剤、すなわち水溶液とした時に澄明性が高く、ｐＨが注射剤として好ましい範囲であり、安定性も良好である注射剤が渇望されている。
以上のような状況に鑑み、本発明者らは、リピッドＡ類縁体を含有する澄明性が高くかつ安定な注射用製剤並びにそれらの製造方法を探索すべく鋭意研究を行った。その結果、以下に示す構成により所期の目的を達成できることを見いだし、本発明を完成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加してなることを特徴とする注射用製剤である。
本発明はまた、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加することを特徴とする注射用製剤の製造方法である。
さらに本発明は、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加して製する平均粒子径３０ｎｍ以下の会合体を含有する注射用製剤およびその製造方法である。
【０００７】
本発明によると、リピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩（以下単にリピッドＡ類縁体と称する）を透明で安定な注射用製剤とすることができるが、これが本発明の目的である。
本発明によるリピッドＡ類縁体の代表的な化合物は次の化学構造式（Ｉ）又は（II）を有し、例えば特開平５ー１９４４７０号公報またはＷＯ９６／３９４１１号によって開示される方法で製造することができる。
【０００８】
【化１７】
〔式中、R1，R2，R3又はR4の少なくとも１つは、
【００１０】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
（式中、各 LはO ，N 又は Cであり；各 Mは O又は Nであり；各 Eは、独立して０から14までの整数であり；各 Gは、独立してN ，O ，S ，SO又はSO2 であり；各ｍは、独立して０から14までの整数であり；各ｎは、独立して、０から14までの整数であり；各ｐは、独立して０から10までの整数であり；各ｑは、独立して０から10までの整数である）であり；
残りのR1，R2，R3及びR4の各々は、独立して、
【００１４】
【化２１】
（式中、各 LはO ，N 又は Cであり；各 Mは O又は Nであり；各ｘは、独立して、０から14までの整数であり；各ｙは、独立して、０から14の整数であり；各ｚは、独立して、０から10までの整数であり；各 Gは、独立して、N ，O ，S ，SO又はSO2 である）であり；
各A1とA2は、独立して、H ，OH，OCH3,
【００１６】
【化２２】
｛式中、各ｄは、独立して、０から５までの整数であり；各ｆは、独立して、０から５までの整数であり；各ｇは、独立して、０から５までの整数であり；各A3は、独立して、
【００１８】
【化２３】
（式中、各ｊは、独立して、０から14までの整数である）である｝であり；
Xは H，(CH2)tCH3, (CH2)tOH, (CH2)tO(CH2)vCH3, (CH2)tOPO(OH)2,
(CH2)t−CH＝CH−(CH2)vCH3, (CH2)t−O−R5,
【００２０】
【化２４】
（式中、各ｔとｖは、それぞれ独立して、０から14までの整数であり；R5はR1〜R4に対する上記定義のいずれかである）であり；
Y は H，OH，O(CH2)wCH3, ハロゲン原子,
【００２２】
【化２５】
（式中、ｗは０から14までの整数である）
である〕
【００２４】
【化２６】
〔式中、R1は、
【００２６】
【化２７】
（式中、J, K及びQ は、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜15のアルキル基であり、L はO, NH2又はCH2 であり、M は O又はNHであり、G はNH，O ，S ，SO又はSO2 である）からなる群から選ばれる基であり；
R2は直鎖又は分枝の炭素数５〜15のアルキル基であり；
R3は、
【００２８】
【化２８】
（式中、E は、N ，O ，S ，SO又はSO2 であり、A, B及びD は、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜15のアルキル基である）からなる群から選ばれる基であり；R4は直鎖又は分枝の炭素数４〜20のアルキル基、及び
【００３０】
【化２９】
（式中、U 及びV は、それぞれ直鎖又は分枝の炭素数２〜15のアルキル基であり、W は水素原子、あるいは直鎖又は分枝の炭素数１〜５のアルキル基である）からなる群から選ばれる基であり；
R5は水素原子、J', -J'-OH, -J'-O-K', -J'-O-K'-OH 及び -J'-0-P0(OH)2（式中J'及びK'はそれぞれ直鎖又は分枝の炭素数１〜５のアルキル基である）からなる群から選ばれる基であり；
R6は水酸基、ハロゲン原子、炭素数１〜５のアルコキシ基及び炭素数１〜５のアシルオキシ基からなる群から選ばれる基であり；
A1及びA2は、それぞれ独立して、
【００３２】
【化３０】
（式中、Z は直鎖又は分枝の炭素数１〜10のアルキル基である）からなる群から選ばれる基である。〕
本発明において、好ましいリピッドＡ類縁体として、6-O-[2-デオキシ-6-O-メチル-4-O-フォスフォノ-3-O-[(R)-3-Z-ドデク-5-エノイルオキシデシル]-2-[3-オキソ-テトラデカノイルアミド]-β-0-フォスフォノ-α-D-グルコピラノース]四ナトリウム、α-D-グルコピラノース,3-O-デシル-2-デオキシ-6-O-[2-デオキシ-3-O-(3-メトキシデシル)-6-O-メチル-2-[(1-オキソ-11-オクタデセニル)アミノ]-4-O-フォスフォノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[(1,3-ジオキソテトラデシル) アミノ]-,1-(ディハイドロジェンフォスフェイト),ジナトリウム[6(2Z,3R)]、及び α-D-グルコピラノース,3-O-デシル-2-デオキシ-6-O-[2-デオキシ-3-O-(3-メトキシデシル)-6-O-メチル-2-[(1-オキソ-11-オクタデセニル)アミノ]-4-O-フォスフォノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[(1,3-ジオキソテトラデシル) アミノ]-,1-(ディハイドロジェンフォスフェイト),テトラナトリウム[6(2Z,3R)] を挙げることができる。これらの化学構造式は次の式(III) 及び (IV) で表される。
【００３４】
【化３１】
【化３２】
本発明におけるアルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物の水溶液を使用できるが、好ましくは、水酸化ナトリウム水溶液である。その濃度は通常、０．０００１Ｍ〜０．１Ｍであり、好ましくは０．０００５Ｍ〜０．０１Ｍであり、より好ましくは０．００１Ｍ〜０．００５Ｍである。
【００３７】
本発明においては、リピッドＡ類縁体にアルカリ性水溶液を添加後、加温することができるが、加温温度はリピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩の相転移温度以上であればよく、通常３０℃〜６０℃であり、より好ましくは４５℃〜５５℃である。加温しながらの攪拌時間は通常１０分〜３時間である。攪拌は、通常用いられる装置により行うことができる。透明な液（濁度0.6NTU以下）を得るために必要な攪拌時間は、リピッドＡ類縁体により異なるが、上記式(III) で表される化合物の場合、通常、加温温度が４０℃以下の場合は９０分以上必要とするが、４０℃以上の場合は６０分以内でよい。加温アルカリ性水溶液に溶解する場合は、あらかじめ加温したアルカリ性水溶液にリピッドＡ類縁体を添加してもよいし、またはアルカリ性水溶液にリピッドＡを添加後加温してもよい。本発明において、加温する目的は、リピッドＡ類縁体の相転移温度以上にすることにより、リピッドＡ類縁体の水和を促進して分散性を向上させ、よって短時間の攪拌により澄明な溶液を得るためである。
【００３８】
また、本発明に用いる緩衝液の成分としては、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸塩またはグリシンなどを用いることができる。緩衝液の濃度は、通常、１ｍＭ〜２０ｍＭである。最終のリピッドＡ類縁体水溶液のｐＨは、好ましくは４〜９、より好ましくは６〜８、さらに好ましくは６．８〜７．８である。最終のｐＨは緩衝液を加えた後、さらに水酸化ナトリウム溶液や塩酸溶液等を添加することによって調製することができる。
【００３９】
緩衝液には、必要に応じて、糖類及び/またはアミノ酸を添加すると、より好ましい結果を得ることができる。この場合、添加する糖類及び／またはアミノ酸は１種類でもよく、２種類以上添加してもさしつかえない。使用できる糖類としては、乳糖（ラクトース）、ソルビトール、グルコース、トレハロース、マンニトール、デキストラン等を挙げることができ、また、アミノ酸の例としては、グリシン等の中性アミノ酸、アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、アルギニン等の塩基性アミノ酸を挙げることができる。
【００４０】
本発明においては、更に、得られたリピッドＡ類縁体水溶液を通常用いられる手段により凍結乾燥製剤とすることができる。すなわち、リピッドＡもしくはその類縁体を、アルカリ性水溶液に溶解し、必要に応じてさらに加温攪拌し、次いで緩衝液を添加してｐＨを調製し、滅菌濾過後、バイアル瓶等に充填し凍結・乾燥して凍結乾燥製剤とすることができる。
本発明のかかる注射用製剤を水溶液として供した場合の浸透圧比はヒトに投与するに適した値とすることが望ましく、通常は１前後である。
【００４１】
本発明のかかる注射用製剤は、リピッドＡ類縁体が会合し略球形の平均粒子径約３０ｎｍ以下の粒子となっている。この会合体は、注射用製剤製造直後と、凍結乾燥後復水した後とでその大きさが変化することはない。一般に、凍結乾燥することにより会合体が破壊されることが多いが、本発明において復水後も３０ｎｍ以下の平均粒子径を維持できることは本発明の顕著な効果の一つである。本発明にかかる会合体は詳細な研究によると、前記式(III) で表される化合物の場合、約0.196 リットル／mole（pH11.0) の内水相を有し、調製時に攪拌を続けることにより約１５ｎｍのほぼ一定の大きさの会合体となる。従って、本発明の平均粒子径の範囲は、通常の製造方法の場合、約１５ｎｍ〜３０ｎｍである。
【００４２】
また本発明におけるリピッドＡ類縁体による会合体は、粒子径、濁度等の点において共存するマグネシウムイオンまたはカルシウムイオンの影響を受けにくい。一方、膜流動性に対してはマグネシウムイオンまたはカルシウムイオンの影響を受けこれら金属イオンが存在すると膜流動性が低下する。膜流動性は、リピッドＡ類縁体を投与後の生体内動態に影響し、膜流動性が低下すると生体内からのリピッドＡ類縁体の消失が早くなる。
【００４３】
【実施例】
以下に実施例を挙げ本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４４】
実施例１
上記式(III) で示されるリピッドＡ類縁体６０mgを４５℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で３０分間攪拌した。このうちの５mlを採取し、濁度計で濁度を測定した。濁度は0.178NTUであった。このアルカリ水溶液７.５mlに１６．７％ラクトースを含む７．０８ｍＭリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７.３９に調整した後、注射用蒸留水を加えて全量を５０ｍｌとした。この水溶液の濁度は0.181NTUであった。この水溶液5.3mlをバイアルに入れ真空凍結乾燥装置（共和製作所製、TriomasterA04)を用いて凍結乾燥した。
【００４５】
実施例２
実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５５℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で６０分間攪拌した。このアルカリ水溶液５mlを採取し、濁度計で濁度を測定した。濁度は0.133NTUであった。このアルカリ水溶液７.５mlに１６．５％ラクトースを含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを7.41に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液の濁度は0.212NTUであった。
【００４６】
実施例３
実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５０℃の０．００１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で６０分間攪拌した。このアルカリ水溶液５mlを採取し、濁度計で濁度を測定した。濁度は0.142NTUであった。このアルカリ水溶液７.５mlに８．３５％マンニトールを含む7.08mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液３０ｍｌを加え、１Ｎ塩酸でｐＨを7.39に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液の濁度は0.133NTUであった。
【００４７】
実施例４
実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５０℃の０．００５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で６０分間攪拌した。このアルカリ水溶液５mlを採取し、濁度計で濁度を測定した。濁度は0.150NTUであった。このアルカリ水溶液７.５mlに１６．５％ラクトースを含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを7.37に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液の濁度は0.205NTUであった。
【００４８】
実施例５
実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを３５℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で１５０分間攪拌した。このアルカリ水溶液５mlを採取し、濁度計で濁度を測定した。濁度は0.669NTUであった。このアルカリ水溶液７.５mlに８．３５％デキストラン７０（平均分子量７００００）を含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを7.30に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液の濁度は1.25NTUであった。
【００４９】
実施例６
上記式 (IV) で示されるリピッドＡ類縁体６．０９mgを０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９.０mlに加えて６０分間攪拌した。このｐＨは１２．０８であった。この溶液にラクトースを含有するリン酸緩衝液３０ｍｌを加えた。ｐＨは７．４６であった。この溶液に注射用蒸留水を加え、全量を６０ｍｌとした。この溶液はリピッドＡ類縁体を０．１ｍｇ／ｍｌ,１０％ラクトース及び４．２５ｍＭリン酸緩衝液を含有するｐＨ７．５０の注射液であった。
【００５０】
実施例７
実施例６で得られた注射液を滅菌濾過後、バイアル瓶に３ｍｌずつ分注し、凍結乾燥して、リピッドＡ類縁体含有の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥条件は次のようであった（凍結乾燥装置：EDWARD Model Lyo fast S08)。
凍結温度：−４０℃、１次乾燥温度：２０℃、１次乾燥圧力：０．０７５±０．０２５ｍｂａｒ、２次乾燥温度：２７℃、２次乾燥圧力：（装置の最大能力）、２次乾燥時間：１８時間。
【００５１】
実施例８
実施例６で用いたリピッドＡ類縁体４０．１６ｍｇを０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９.０mlに加えて６０分間攪拌した。このｐＨは１１．４９であった。この溶液にラクトースを含有するリン酸緩衝液１０ｍｌを加えた。ｐＨは８．４４であった。さらに、４％リン酸溶液を加えてｐＨを７．４に調整し、注射用蒸留水を加え、全量を２０ｍｌとした。この溶液はリピッドＡ類縁体を２．０ｍｇ／ｍｌ,１０％ラクトース及び４．２５ｍＭリン酸緩衝液を含有するｐＨ７．５１の注射液であった。
【００５２】
実施例９
実施例８で得られた注射液を滅菌濾過後、バイアル瓶に３ｍｌずつ分注し、凍結乾燥して、リピッドＡ類縁体含有の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥条件は次のようであった（凍結乾燥装置：EDWARD Model Lyo fast S08)。
凍結温度：−４０℃、１次乾燥温度：２０℃、１次乾燥圧力：０．０７５±０．０２５ｍｂａｒ、２次乾燥温度：２７℃、２次乾燥圧力：（装置の最大能力）、２次乾燥時間：１８時間。
【００５３】
【発明の効果】
次に本発明にかかる効果を示すために実験例を掲げる。
実験例１
本発明にかかる製剤の澄明性の評価
１．実験方法
以下に示した比較例及び本法１で調製したリピッドＡ類縁体の水溶液の濁度を測定した。測定は、Hach 2100AN Turbidimeter を用いて行った。
【００５４】
比較例 実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５０℃の１０％ラクトースを含む４．２５mMリン酸緩衝液に加えて溶解し、同温度で攪拌を続け、３０分、６０分、１２０分、１８０分後に１２．５mlを採取した。そのうちの５ｍｌを用いて濁度を測定した。また、それぞれの溶液7.5ml に１０％ラクトースを含む4.25 mM リン酸緩衝液を加えて全量を５０ｍｌにした。これらの水溶液の濁度及びｐＨを測定した。
【００５５】
本法１ 実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５０℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で攪拌し、３０分、６０分、１２０分、１８０分後にアルカリ水溶液12.5mlを採取した。そのうちの５ｍｌを用いて濁度計で濁度を測定した。次いでそれぞれのアルカリ水溶液７．５mlに１６．５％ラクトースを含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを約7.4 に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。これらの水溶液の濁度及びｐＨを測定した。
【００５６】
２．実験結果
上記実験方法より得た結果を表１に示した。
【００５７】
【表１】
表１より、従来の代表的方法である比較例で調製されたリピッドＡ類縁体の水溶液よりも、本発明にかかる本法１で得られたものの方が、極めて澄明性に優れていることが明らかである。
【００５９】
実験例２
リピッドＡ類縁体の凍結乾燥製剤の復水性の評価
１．実験方法
本法２ 実施例１で用いたリピッドＡ類縁体６０mgを５０℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０mlに加えて溶解し、同温度で攪拌し、３０分、６０分、１２０分、１８０分後にアルカリ水溶液12.5mlを採取した。そのうちの５ｍｌを用いて濁度計で濁度を測定した。次いでそれぞれのアルカリ水溶液７.５mlに１６．５％ラクトースを含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを約7.4に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液5.3mlをバイアル瓶に入れ、真空凍結乾燥機（共和製作所製、TriomasterA-04)を用いて凍結乾燥した。さらに、得られた凍結乾燥製剤に注射用蒸留水５ｍｌを加えて再溶解し、濁度をHach 2100AN Turbidimeter を用いて測定した。
【００６０】
本法３ 実施例１で用いたリピッドＡ類縁体２００mgを５０℃の０．００３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１００mlに加えて溶解し、同温度で攪拌し、３０分、６０分、１２０分、１８０分後にアルカリ水溶液7.5mlを採取した。そのうちの５ｍｌを用いて濁度計で濁度を測定した。次いでそれぞれのアルカリ水溶液２.５mlに１６．５％ラクトースを含む7.08mMリン酸緩衝液３０ｍｌを加え、０．３％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを約7.4に調整後、注射用蒸留水を加えて全量を50mlとした。この水溶液5.3mlをバイアル瓶に入れ、真空凍結乾燥機（共和製作所製、TriomasterA-04)を用いて凍結乾燥した。さらに、得られた凍結乾燥製剤に注射用蒸留水５ｍｌを加えて再溶解し濁度を測定した。濁度は、Hach 2100AN Turbidimeter を用いて測定した。
結果を表２に示した。
【００６１】
【表２】
表２より、本発明による凍結乾燥製剤は再溶解してもきわめて澄明性が優れていることが明らかである。
Claims (4)
- 式(III) で表されるリピッドＡ類縁体を、アルカリ金属水酸化物の水溶液からなる加温アルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加してｐＨ４〜９に調整してなることを特徴とする注射用製剤。
- 式 (IV) で表されるリピッドＡ類縁体を、アルカリ金属水酸化物の水溶液からなるアルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加してｐＨ４〜９に調整してなることを特徴とする注射用製剤。
- 請求項１又は２記載の式（III）又は（IV）で表されるリピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ金属水酸化物の水溶液からなるアルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加してｐＨ４〜９に調整してなる平均粒子径３０ｎｍ以下の会合体を含有する注射用製剤。
- 請求項１又は２記載の式（III）又は（IV）で表されるリピッドＡ類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、アルカリ金属水酸化物の水溶液からなるアルカリ性水溶液に溶解し、次いで緩衝液を添加してｐＨ４〜９に調整する平均粒子径３０ｎｍ以下の会合体を含有する注射用製剤の製造方法。
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