JP4288352B2 - 細胞の分離回収装置および分離回収方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、フローサイトメトリーは元来分子生物学の研究用として開発されたものであり、分離精度は極めて高いものの、処理速度は試験管レベルである。そのため、極めて短時間に大量の細胞が必要な場合が多い臨床用途に適しているとは言い難い。例えば、救命率が30%前後と言われる劇症肝炎の患者にハイブリッド型肝臓を適用する場合、どんなに遅くとも数日以内に所定量(例えば数百mg〜数kg)の肝細胞を準備しなければならない。あるいは、重度の熱傷患者を救うための人工皮膚についても、患者の細胞を数日〜数週間で必要量培養しなければならない。
このように、臨床の場で動物細胞を用いた医療を実用化するためには、目的に応じた細胞を短時間に細胞源から分離回収する装置(セル・セパレータ)が必要不可欠である。
従来、細胞分離に関して、例えば下記の特許文献(1)〜(17)に見られるように、種々の方法及び装置が提案されている。
そこで、直径数十〜数百μmの多糖ビーズの表面に抗体、ホルモン、あるいはレクチンなどの蛋白質を固定し、アフィニティー吸着によって特定の細胞を捕捉させ、溶離液によって細胞を回収するアフィニティカラムが開発されている。あるいは、表面に生理活性物質を物理吸着、あるいは共有結合させたナイロン繊維を用い、カラムと同様のメカニズムによって細胞を回収する技術も開発されている。
ところが、これらの技術では溶離液のpHや塩濃度を生理的条件から極端にシフトさせねばならず、それによって生じる回収される細胞への影響は無視することができない。また、カラムでは圧力損失が大きいので、流量を高く設定できず、また繊維では単位体積当たりの表面積を上げることができないため、いずれにおいても単位時間当たりの処理量の点でさらなる改善が必要である。
ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)は下限臨界溶解温度(LCST:Lower critical solution temperature)が約32℃付近に存在し、37℃では疎水性、32℃以下では親水性となる。そして、一般的に細胞は親水性表面には接着しないため、LCSTより高い温度で細胞を培養し、LCSTより低い温度へ冷却することによりシート状に培養された細胞が自然に剥離する。こうしたシート状培養物の回収は、細胞同士が協調するする現象、例えば心筋細胞の同期拍動などを再現することが可能となった。
また、ポリプロピレン不織布にプラズマ後重合を用いて繊維表面にポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)を導入し、下限臨界溶解温度を境に水の透過性が変わる材料に関しても研究されている(例えば、S.Y.Kim,et al.,:J.Appl.Polym.Sci.,84,1168(2002)参照)。
本発明は、このような技術的課題に基づいてなされたもので、目的に応じた細胞を傷つけることなく、細胞源から大量に短時間で分離回収する細胞の分離回収装置および分離回収方法を提供することを目的とする。
本発明は、前記目的を達成するため、所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが結合された不織布を有する処理部と、前記所定温度より高い温度で、前記生理活性物質を前記ポリマーに疎水結合させた状態で、細胞を含む液を前記処理部に導入する液導入部と、前記処理部の液温を調節する液温調節部と、前記処理部から液を排出する液排出部とを備え、前記ポリマーには、対象となる細胞と結合する生理活性物質が疎水結合可能であり、前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、前記処理部は、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、前記ポリマーを前記所定温度より低い温度にして親水化させることによって、前記捕捉細胞および前記生理活性物質を前記ポリマーから離脱させることができ、前記液排出部は、前記離脱した細胞を回収可能に構成され、前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収装置を提供する。
本発明は、所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが結合された不織布を有する処理部と、前記所定温度より低い温度で、細胞を含む液を前記処理部に導入する液導入部と、前記処理部の液温を調節する液温調節部と、前記処理部から液を排出する液排出部とを備え、前記ポリマーには、対象となる細胞と結合する生理活性物質が共有結合され、前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、前記処理部は、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、前記ポリマーを前記所定温度より高い温度にして疎水化させ、収縮させて前記生理活性物質を非露出状態とすることによって、前記捕捉細胞を前記生理活性物質から離脱させることができ、前記液排出部は、前記離脱した細胞を回収可能に構成され、前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収装置を提供する。
本発明は、所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが結合された不織布を有し、この不織布に、対象となる細胞と結合する生理活性物質が結合された処理部と、前記所定温度より高い温度で、前記ポリマーを疎水化させ、収縮させた状態で、細胞を含む液を前記処理部に導入する液導入部と、前記処理部の液温を調節する液温調節部と、前記処理部から液を排出する液排出部とを備え、前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、前記処理部は、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、前記ポリマーを前記所定温度より低い温度にして前記ポリマーを親水化させ、伸展させることによって、前記捕捉細胞を前記生理活性物質から離脱させることができ、前記液排出部は、前記離脱した細胞を回収可能に構成され、前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収装置を提供する。
本発明は、所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが、不織布に結合され、前記ポリマーには、対象となる細胞と結合する生理活性物質が共有結合され、前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、前記所定温度より低い温度で、細胞を含む液を前記不織布に接触させ、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、次いで前記ポリマーを前記所定温度より高い温度にして疎水化させ、収縮させて前記生理活性物質を非露出状態とすることによって、前記捕捉細胞を前記生理活性物質から離脱させ、離脱した細胞を回収することを含み、前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収方法を提供する。
本発明は、所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが、不織布に結合され、前記不織布には、対象となる細胞と結合する生理活性物質が結合され、前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、前記所定温度より高い温度で、前記ポリマーを疎水化させ、収縮させた状態で、細胞を含む液を前記不織布に接触させ、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、次いで前記ポリマーを前記所定温度より低い温度にして前記ポリマーを親水化させ、伸展させることによって、前記捕捉細胞を前記生理活性物質から離脱させ、離脱した細胞を回収することを含み、前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収方法を提供する。
したがって、本発明は、例えば生体組織工学や細胞治療等において所定の細胞を分離回収する場合等に適用することが可能である。
第1図は、本発明における細胞を分離するための不織布の形成方法を説明する模式図である。
第1図(a)では、ポリマー2の下限臨界溶解温度(以下、LCSTと記す)より低い温度の水中において、ポリマー2がグラフトされている不織布1が図示されている。このポリマー2は、感温性ポリマーであるポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)(以下、ポリNIPAAmと記す)からなっている。
以上のようにして得られる不織布1は、温度によって親水性の度合が異なる性質を有する。したがって、所定温度において特定の生理活性物質を疎水結合または親水結合させ、さらに前記所定温度とは異なる温度においてその結合を分離させることができる。したがって、この性質を利用し、所定の細胞に特異的に結合する性質を有する生理活性物質を結合させた不織布1を用い、細胞の結合後に温度を変えることで、生理活性物質に結合した所定の細胞を分離回収することができる。
不織布1の表面にはポリNIPAAmからなるポリマー2が結合されており、該ポリマー2と抗体3とはLCSTより高い液温において疎水結合している。そこへ抗体3を認識する表面抗原5を有する細胞4を含む細胞浮遊液(混合液)を流し、第2図(a)に示すように表面抗原5と抗体3とを抗原抗体反応させる。ここで、抗体3がIgGの場合、細胞4は例えばCD34発現幹細胞とすることができる。
以上のようにして、生理活性物質(抗体3)を吸脱着することができる不織布1を用いれば、目的とする細胞を、短時間で他の細胞から分離して、傷つけることなく大量に回収することができる。
第3図は、実施の形態2において細胞を回収する状態を説明するための模式図である。
この実施の形態2では、前述した第1図に示す方法と処理温度条件を変更した以外は、ほぼ同様にして細胞の分離回収を実施できる。ここで用いる不織布1は、表面にポリNIPAAmからなるポリマー2が結合し、該ポリマー2に生理活性物質として抗体3が結合されている構造を有し、この不織布1においては、ポリマー2と抗体3とが共有結合により結合されている。
第4図は、実施の形態3における細胞を回収する状態を説明する模式図である。
実施の形態3では、実施の形態1と同様、不織布1上にポリNIPAAmからなるポリマー2が結合されている。そして、第4図(a)に示すように、抗体3がポリマー2を介さず、スペーサ6を介して不織布1の表面に結合された構造になっている。ここで、スペーサ6は、抗体3を不織布1に保持するために機能するものであり、例えばポリエチレングリコールである。本構造においては、不織布2から延びるポリマー2の長さより、不織布1からスペーサ6を介して抗体3までの長さの方が短くなるようにすることが好ましい。また、スペーサなしに不織布1に直接抗体が結合していてもよい。さらに、ポリマー2は適宜設定された密度で不織布1に重合されていることが好ましい。
第5図は、本発明に係る細胞の分離回収装置の一例を示す説明図である。
第5図に示す細胞の分離回収装置10は、前記実施の形態1〜3において用いた、ポリNIPAAmからなるポリマー2と、抗原3のような生理活性物質とを結合した不織布1を有する処理部11と、該処理部11に細胞を含む液を導入する液導入部12と、該処理部11から液を排出する液排出部13と、該処理部11内の液温を調節する液温調節部14とを備え、液温調節部14によって処理部11の液温をLCSTを境に変更することで、前記不織布1に捕捉された細胞を該不織布1から離脱させ回収するように構成されている。なお、細胞の分離回収装置10には、液温調節部14を制御する制御部やその他必要な構成を備えることができる。
なお、本発明の主旨を逸脱しない限り、上記実施の形態で挙げた構成を取捨選択したり、他の構成に適宜変更することが可能であることは言うまでもない。
基材として平均ポアサイズ5,10,30μmのPP製不織布を用いた。この不織布に対しアルゴンガス(10Pa)雰囲気下、出力10Wで1分間プラズマ照射を行った。プラズマ照射後、NIPAAmモノマー水溶液(1−10wt%)を反応容器中に入れた。その後、60℃のシェイキングバスに入れ、グラフト重合を行った。重合の確認は全反射型フーリエ変換赤外分光測定(ATR/FT−IR)を用いて行った。ポリNIPAAmを繊維表面に導入したPP製不織布(以下、ポリNIPAAm−g−PP製不織布という)のグラフト収率は、重合前後の不織布の重量変化から求めた。
ポリNIPAAm−g−PP製不織布および未修飾PP製不織布の水の透過量(Lp)は、透過セル装置を用いて測定した。測定に用いた不織布の有効膜面積は17.3cm2であった。ポリNIPAAmのLCSTより高い温度と低い温度で水の透過量を測定し、温度による透過量変化を調べた。
直径1.5cmに切り抜いたポリNIPAAm−g−PP製不織布をフルオレセインイソチオシアネート標識IgG(FITC−IgG)(50μg/mL)を含むダルベッコリン酸緩衝液(Dulbecco’s phosphate−buffer saline(PBS))(以下、抗体液という)中37℃で3時間インキュベートし、IgGの捕捉の様子を蛍光顕微鏡で観察した。
次に、1mLのPBSを加え、4℃に15分間曝した。その後、再び蛍光顕微鏡でポリNIPAAm−g−PP製不織布の様子を観察した。
第6図は、反応時間に対するポリNIPAAImのグラフト収率の結果を示した図である。第6図に示すように、ポリNIPAAImのグラフト収率は、重合反応時間の増加にともなって増加した。また、モノマー濃度が高い方がポリNIPAAmのグラフト収率が高かった。
第7図は、ポリNIPAAm−g−PP製不織布のポアサイズに対するグラフト収率の結果を示した図である。第7図に示すように、ポリNIPAAm−g−PP製不織布の平均ポアサイズもグラフト収率に影響した。
ポリNIPAAm−g−PP製不織布の水の透過量(Lp)に与える温度の影響を観察した。第8図は温度に対する水の透過量の結果を示した図である。第8図に示すように、LCSTより低い温度におけるポリNIPAAm−g−PP製不織布の水の透過量は、未修飾のPP製不織布よりも大きかった。また、LCSTより高い温度では、温度の上昇とともにポリNIPAAm−g−PP製不織布の水の透過量は減少した。ポリNIPAAm−g−PP製不織布の水の透過量には、重合によるポアサイズの変化だけでなく、ミクロな表面の親疎水性変化も影響すると考えられた。
ポリNIPAAm−g−PP製不織布へのFITC標識IgGの捕捉脱着の様子を蛍光顕微鏡により観察した。LCST(37℃)より高い温度では、ポリNIPAAm−g−PP製不織布はFITC−IgGを捕捉していた。
温度をLCSTより下げると、捕捉したFITC−IgGはポリNIPAAm−g−PP製不織布から脱着した。未修飾のPP製不織布についても同様の実験を行った。ポリNIPAAm−g−PP製不織布には、抗体液が容易に浸透したが、未修飾のPP製不織布には殆ど浸透しなかった。抗体液が浸透したわずかな部分には抗体が大量に捕捉し、温度をLCSTより下げても抗体は脱着しなかった。
24ウェルプレートの10個のウェルに直径1.5cmのポリNIPAAm−g−PP製不織布を1枚ずつ入れ、ガラスのリングで不織布が浮上しないように押さえた。
各ウェルに濃度0および1,5,10、25μg/mLの抗マウスCD80モノクローナル抗体を含むダルベッコリン酸緩衝液(Dulbecco’s phosphate−buffer saline(PBS))(以下、抗体液という)を添加し、37℃で8時間以上インキュベートした。次にポリNIPAAm−g−PP製不織布を37℃のPBSで2回洗浄した。RPMI−1640培地(シグマアルドリッチジャパン(株))に懸濁したCD80ハイブリドーマ懸濁液5×105/mLを調製し、各ウェルに1mLずつ添加し、37℃で60分間インキュベートした。これらポリNIPAAm−g−PP製不織布をPBSで2回洗浄した後メタノール固定とギムザ染色を行い、捕捉された細胞数を顕微鏡観察により数えた。抗体濃度に依存したCD80ハイブリドーマ細胞の細胞接着促進効果が認められた(第9図)。特に抗体液の濃度が10μg/mL以上では、顕著な細胞捕捉性が認められた。
24ウェルプレートの8個のウェルに直径1.5cmのポリNIPAAm−g−PP製不織布を1枚ずつ入れ、ガラスのリングで不織布が浮上しないように押さえた。
4個のウェルに濃度10μg/mLの抗マウスCD80モノクローナル抗体を含むダルベッコリン酸緩衝液(以下、抗体液という)を、4個のウェルに濃度10μg/mLの抗マウスCD86モノクローナル抗体液を1mLずつ添加し、37℃で8時間以上インキュベートした。
インキュベート後、ポリNIPAAm−g−PP製不織布を37℃のPBSで2回洗浄した後、メタノール固定とギムザ染色を行い、捕捉された細胞数を顕微鏡観察により数えた。
抗マウスCD86モノクローナル抗体液よりも抗マウスCD80モノクローナル抗体液でインキュベートしたポリNIPAAm−g−PP製不織布に、より顕著な細胞捕捉促進効果が認められた(第10図)。また、インキュベートの時間が45分よりも60分において、より選択的細胞捕捉効果が認められた。
ポリNIPAAm−g−PP製不織布を用い、2種類の細胞(CD86ハイブリドーマとCD80ハイブリドーマ)の懸濁液から、一方の細胞(CD80ハイブリドーマ)を回収する実験を行い、この不織布の細胞分離性能を確認した。
・不織布:直径1.5cmのポリNIPAAm修飾不織布、12枚
・抗体濃度:抗CD80、10μg/mL(PBSに懸濁)
・細胞懸濁液:5×105/mL(CD80/CD86=50/50)を細胞用培地に懸濁したもの
・細胞用培地:RPMI−1640培地(シグマアルドリッチジャパン(株))
・細胞の接触時間:45分間あるいは60分(37℃)
(1)24ウェルプレートの各ウェルにポリNIPAAm−g−PP製不織布を入れ、ガラスのリングで不織布が浮上しないように押さえた。
(2)抗CD80の抗体液を0.5mLずつウェルに入れ、37℃で3時間インキュベートしてポリNIPAAm−g−PP製不織布に抗体を結合させた。
(3)余分な抗体を洗い流すため、ポリNIPAAm−g−PP製不織布を37℃のPBSで2回洗浄した。
(4)CD80ハイブリドーマとCD86ハイブリドーマをRPMI−1640培地に懸濁した。濃度は5×105/mL(CD80/CD86=50/50)とした。
(5)この細胞懸濁液を1mLずつ各ウェルに入れ、37℃で45分間インキュベートした。
(6)ポリNIPAAm−g−PP製不織布を取り出し、余分な細胞を洗い流すため37℃のPBSで2回洗浄した。
(7)捕捉した細胞を回収するため、ポリNIPAAm−g−PP製不織布をRPMI−1640培地10mL中に入れ、4℃に15分間曝した。
(8)回収した細胞を蛍光標識した抗CD80と抗CD86抗体で染色した。
(9)染色した細胞を血球計算盤に撒き、細胞の回収率を計算した。
(10)レーザー共焦点顕微鏡観察により、回収した細胞中のCD80ハイブリドーマとCD80ハイブリドーマ(目的の細胞)の割合を求めた。
ポリNIPAAm−g−PP製不織布に捕捉された細胞は約90%回収できる(第11図)。
回収した細胞は、CD80ハイブリドーマ/CD86ハイブリドーマ=約70/30であった。
Claims (6)
- 所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが結合された不織布を有する処理部と、
前記所定温度より高い温度で、前記生理活性物質を前記ポリマーに疎水結合させた状態で、細胞を含む液を前記処理部に導入する液導入部と、
前記処理部の液温を調節する液温調節部と、
前記処理部から液を排出する液排出部とを備え、
前記ポリマーには、対象となる細胞と結合する生理活性物質が疎水結合可能であり、
前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、
前記処理部は、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、前記ポリマーを前記所定温度より低い温度にして親水化させることによって、前記捕捉細胞および前記生理活性物質を前記ポリマーから離脱させることができ、
前記液排出部は、前記離脱した細胞を回収可能に構成され、
前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収装置。 - 所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが結合された不織布を有する処理部と、
前記所定温度より低い温度で、細胞を含む液を前記処理部に導入する液導入部と、
前記処理部の液温を調節する液温調節部と、
前記処理部から液を排出する液排出部とを備え、
前記ポリマーには、対象となる細胞と結合する生理活性物質が共有結合され、
前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、
前記処理部は、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、前記ポリマーを前記所定温度より高い温度にして疎水化させ、収縮させて前記生理活性物質を非露出状態とすることによって、前記捕捉細胞を前記生理活性物質から離脱させることができ、
前記液排出部は、前記離脱した細胞を回収可能に構成され、
前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収装置。 - 所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが結合された不織布を有し、この不織布に、対象となる細胞と結合する生理活性物質が結合された処理部と、
前記所定温度より高い温度で、前記ポリマーを疎水化させ、収縮させた状態で、細胞を含む液を前記処理部に導入する液導入部と、
前記処理部の液温を調節する液温調節部と、
前記処理部から液を排出する液排出部とを備え、
前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、
前記処理部は、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、前記ポリマーを前記所定温度より低い温度にして前記ポリマーを親水化させ、伸展させることによって、前記捕捉細胞を前記生理活性物質から離脱させることができ、
前記液排出部は、前記離脱した細胞を回収可能に構成され、
前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収装置。 - 所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが、不織布に結合され、
前記ポリマーには、対象となる細胞と結合する生理活性物質が疎水結合可能であり、
前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、
前記所定温度より高い温度で、前記生理活性物質を前記ポリマーに疎水結合させた状態で、細胞を含む液を前記不織布に接触させ、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、
次いで前記ポリマーを前記所定温度より低い温度にして親水化させることによって、前記捕捉細胞および前記生理活性物質を前記ポリマーから離脱させ、離脱した細胞を回収することを含み、
前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収方法。 - 所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが、不織布に結合され、
前記ポリマーには、対象となる細胞と結合する生理活性物質が共有結合され、
前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、
前記所定温度より低い温度で、細胞を含む液を前記不織布に接触させ、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、
次いで前記ポリマーを前記所定温度より高い温度にして疎水化させ、収縮させて前記生理活性物質を非露出状態とすることによって、前記捕捉細胞を前記生理活性物質から離脱させ、離脱した細胞を回収することを含み、
前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収方法。 - 所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが、不織布に結合され、
前記不織布には、対象となる細胞と結合する生理活性物質が結合され、
前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、
前記所定温度より高い温度で、前記ポリマーを疎水化させ、収縮させた状態で、細胞を含む液を前記不織布に接触させ、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、
次いで前記ポリマーを前記所定温度より低い温度にして前記ポリマーを親水化させ、伸展させることによって、前記捕捉細胞を前記生理活性物質から離脱させ、離脱した細胞を回収することを含み、
前記ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であることを特徴とする細胞の分離回収方法。
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