JP4284187B2 - 表面コーティング方法およびコーティングされたデバイス - Google Patents

Description

本発明は、基材表面上にコーティングを形成するための方法、およびこの方法を実施する際に有用なデバイスに関する。

（参考文献）

（発明の背景）
脈管内デバイス（例えば、ステント、ステント移植片、および脈管移植片）は、新規な脈管損傷および再狭窄脈管損傷を処置するために、広範に使用されている。これらのデバイスは、血管形成術単独よりも結果を改善しているが、失敗率は高いままである（Ｙｕｔａｎｉら、１９９９；Ｓｃｈｗａｒｚ、１９９７）。このことは、小さい直径の脈管および伏在静脈移植片において、特に当てはまる。ほとんどデバイスに対する血栓応答により引き起こされる、短期間の失敗（１〜２週間）は、投薬により管理され得、傷害、炎症応答、および内膜肥厚という複合的カスケードから生じる長期再狭窄（３〜６ヶ月）は、小さい直径の脈管デバイスに関するチャレンジに寄与する。

移植されたデバイスの表面上の機能的内皮の再生は、血栓症および内膜肥厚の減少および予防のための長期的解決策であることを約束する（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＤｉｃｈｅｋ，１９９７）。一連の細胞マトリックスタンパク質（例えば、コラーゲンまたはラミニン）でコーティングされたバイオミメティック表面を有するデバイスは、内皮再生を改善および加速し得た。しかし、このようなデバイス（例えば、ｅＰＴＦＥ移植片）の表面を改変またはコーティングすることは、困難であり、しばしば不成功であった（ＥＰ−Ｂ ９１０５８４）。フッ化炭素ポリマーおよび多くの炭化水素ポリマーの骨格の極端な科学的不活性に起因して、非常にエネルギー性の種類の反応が、これらの物質の骨格を変化させて、その上に化学的に反応性の有機部分を生成するために使用された。これらの反応を使用する以前に記載されたコーティング方法は、最適には満たなかった（米国特許第５，４６２，７８１号；Ｐｏｉｎｔｅｒら、１９９４；およびＫａｎａｚａｗａら、１９９５）。多くは、処理プロセスの間に真空中でその基材を維持することが必要である。

コーティングプロセスとしての大気プラズマの使用は、真空プラズマプロセスを超える多数の利点を提供する。これらとしては、（１）装置、設備、操作および維持のための低いコスト−例えば、緊密シールした真空システム（ポンプ、トラップ、およびオイル蒸気バックラッシュを防ぐための冷却、シーリングなど）についての必要性がない；（２）従来の製造装置（例えば、コンベア）を使用して、高スループットで非常に自動化されたプロセスを実施する能力；ならびに（３）基材温度を有意に増加することなく基材表面に大気プラズマを向けることによって、長く狭く円筒状の基材の内側を処理する能力が、挙げられる。対照的に、狭いチューブの内側は、従来の真空プラズマチャンバでは処理され得ない。なぜなら、プラズマグローが生成もされず、受動拡散によりその狭いチューブ中に容易に拡散することも可能ではないからである。このグローが無理やりチューブに入れられた場合、そのエネルギーはほとんどすぐに高まり、プラスチックチューブを変形および融解する。さらに、このプラズマフロー中にさらなるガスまたは蒸気を追加することはより容易であり安価である。従って、大気プラズマプロセスにおいて、種々の物質についての処理を変化させる。

従って、真空槽内部での処理を必要とせずかつ基材上で選択された化学基の所望の表面密度を達成し得る、表面コーティング方法を提供することが有益である。この様式で処理される医療用デバイスは、生理学的環境において非常に有効である。本発明は、これらの要件を満たすように設計される。

（発明の要旨）
１つの実施形態において、本発明は、選択された化学基の選択された表面密度を有するコーティングを基材表面上に形成する方法を包含する。この方法は、以下の工程を包含する：大気圧または大気圧近くで形成されるプラズマを用いて表面を処理し、この表面上に１種以上の活性種を形成する工程；所望の表面密度の活性種が形成されるまで処理を続ける工程；および、この活性種を安定な官能基に転換するのに有効な条件下で、この処理した表面を選択された気体または液体に曝露する工程。この曝露された表面は、表面修飾基（ｓｕｒｆａｃｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）またはリンカーと、この表面修飾基を上記官能基に共有結合させるのに有効な条件下で、接触され得る。従って、この表面上の選択された化学基は、この化学基に共有結合される安定な官能基または表面修飾基である。この表面修飾基またはリンカーは、生物学的に活性な成分とさらに反応し得、その結果、生物活性表面を有する基材または生物活性成分の局所性放出および持続性放出を与える基材を生じる。

処理は、基材表面を介してかもしくは基材表面に対してプラズマを流すことによって、または大気圧もしくは大気圧近くにて活性プラズマ種の豊富な空間にこの基材を維持することによって、達成され得る。この基材は、管状形状であり得、プラズマは、この基材の外面と周囲基材の内面との間を流動して、閉じ込められ得、そして拡張され得る。

１つの実施形態において、この表面は、非多孔性ポリマーまたは多孔性ポリマーであり得る。好ましい表面は、多孔性の発泡ＰＴＦＥである。

別の実施形態において、このプラズマは、キャリアガスおよび１０％未満のガスまたは蒸気から形成され、これらは、酸素、水、アンモニア、水酸化アンモニウム、有機アミン、アルコール、アルデヒド、カルボン酸およびエステルからなる群より選択される。なお別の実施形態において、このプラズマは、キャリアガスおよび０．１％を超えるガスまたは蒸気から形成され、これらは、酸素、水、アンモニア、水酸化アンモニウム、有機アミン、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、およびエステルからなる群より選択される。関連する実施形態において、プラズマ放電を消滅させるのに十分な量の反応性ガスが、添加される。

なお別の実施形態において、この基材は、第一の電極であり得る導電性金属であり、この処理は、金属表面の周りで、この金属表面とこの金属表面に近接した第二のプラズマ発生電極とを接触させて、プラズマを形成する工程を包含する。この金属基材は、好ましくは、円柱である。この実施形態において、第二のプラズマ発生電極は、この基材の近くに位置決めされ得る。あるいは、この金属基材は、長手方向軸に沿ってこの金属表面を通じて延びるボアを規定する円柱であり、この第二のプラズマ発生電極は、上記長手方向軸に沿って上記ボアを通じて位置決めされる。

曝露工程は、空気、アンモニア、酸素（全て気体形態）、ならびに水、水酸化アンモニウム、およびヒドラジン（全て液体形態）からなる群より選択される物質と、この表面を接触させることによって実施され得る。

この表面修飾基は、以下からなる群より選択される多官能性リンカーであり得る：無水物、アルコール、酸、アミン、エポキシ、イソシアネート、シラン、ハロゲン化基および重合可能な基。これらの多官能性リンカーは、ハロゲン化したカルボン酸からなる群より選択され得る。このハロゲン化されたカルボン酸は、クロロ酢酸、クロロ酪酸、およびクロロ吉草酸からなる群より選択され得る。多官能性リンカーは、好ましくは、骨格に２〜２０個の炭素原子を有する、少なくとも１つの分子を含む。１実施形態において、多官能性リンカーは、ヘテロ官能分子形状をしているストリング（ｓｔｒｉｎｇ）である。あるいは、この多官能性リンカーは、代替のホモ官能分子の形状をしているストリングである。

別の実施形態において、表面修飾基は、プラズマ活性化表面と活性剤（例えば、トシルクロリド、トレシルクロリド（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）またはメシルクロリド（ｍｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））との間に形成される１つ以上の反応基であり得、これは、穏やかな条件下で、生活性／生体適合性コーティングの十分な共有結合を促進する。

なお別の実施形態において、本発明は、以下の工程を含むプロセスによって調製される選択された化学基の、選択された表面密度のコーティングを有する基材を包含する：この表面上で１つ以上の活性種を形成するために、大気圧でかまたは大気圧付近で形成されるプラズマを用いてこの表面を処理する工程；所望の表面密度の活性種が形成されるまで上記の処理を継続する工程；活性種と安定な官能基とを変換するのに有効な条件下で、選択された気体または液体に、この処理された表面を曝露する工程；および必要に応じて、上記官能基に表面修飾基を共有結合させるのに有効な条件下で、この曝露された表面と表面修飾基とを接触させる工程を包含し、ここで、この表面上の選択された化学基は、上記安定な官能基または官能基に共有結合された表面修飾基である。

別の局面において、この表面はさらに、生体活性薬剤または生体適合性薬剤との間に共有結合または非共有結合を形成するために、生体活性薬剤または生体適合性薬剤と接触され得、そしてこの基材表面に生体活性薬剤または生体適合性薬剤を結合させるために、安定な官能基１６または表面修飾基１８と接触され得る。この生体活性因子または生体適合性薬剤は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、および核酸からなる群より選択され得、これらの各々は、分子または細胞の特異的部分および相補的部分に対して、共有結合または非共有結合し得る。生体活性薬剤または生体適合性薬剤はまた、細胞接着因子、レセプター、リガンド、増殖因子、抗血栓剤、抗生物質および酵素からなる群より選択され得る。

細胞接着因子は、表面接着分子および細胞−細胞接着分子からなる群より選択され得る。表面接着分子は、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、テネイシン、フィブリノゲン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、フォン・ビルブラント因子、および骨シアロタンパク質、ならびにそれらの活性ドメインからなる群より選択され得る。１つの実施形態において、細胞−細胞接着分子は、Ｐ１５（コラーゲンＩの細胞接着ドメイン（配列番号１））である。細胞−細胞接着分子は、Ｎ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリン、ならびにそれらの活性ドメインからなる群より選択され得る。

増殖因子は、線維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子、血管内皮増殖因子、骨形態形成タンパク質、および神経成長因子からなる群より選択され得る。リガンドまたはレセプターは、抗体、抗原、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ヘパリン、ＩＶ型コラーゲン、プロテインＡ、およびプロテインＧからなる群より選択され得る。１つの実施形態において、抗生物質は、抗生物質ペプチドである。生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、酵素であり得る。あるいは、生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、相補的配列に選択的に結合し得る核酸配列を含む。

抗血栓剤は、ヘパリン、ヒルジン、溶解素（例えば、プラスミンフィブリノリジンまたはトロンボリジン（ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｎ）、プラスミノゲン活性化因子、プロスタグランジン、ストレプトキナーゼ、およびウロキナーゼからなる群より選択され得る。

１つの実施形態において、生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、０．０１〜１０００ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の密度で表面に共有結合される。好ましくは、生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、０．５〜３０ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の密度で表面に結合される。より好ましくは、生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、２〜２０ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の密度で表面に結合される。本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を添付の図面とともに読めば、より完全に理解される。

（発明の詳細な説明）
（１．定義）
他に示されない場合、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明に関する当業者が、理解するのと同様の意味を有する。本発明は、変化し得るので、記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないことは、理解されるべきである。

本明細書中で使用される場合、用語「移植片」および「移植される」は、身体の中に移植されるデバイスおよび基材（例えば、ステントおよび移植片）ならびに患者の皮膚表面に適用されるデバイス（例えば、創傷包帯）を含む。

本明細書中で使用される場合、用語「固定する」、およびその派生語は、基材への直接的な、または少なくとも一つの中間成分を通じる基材への生物活性種の結合を示す。

本明細書中で使用される場合、用語「生物活性」または「生物適合性」または「生物活性／生物適合性」は、所望の特定の生物学的活性（例えば、結合または酵素的活性）を有する分子または所望の生物学的特性を有する表面（例えば、非トロンボゲン表面）を示す。

本明細書中で引用される全ての刊行物および特許は、本発明に関連して使用され得る組成物および方法論を記載し、そして開示する目的のため、参考として本明細書中で明白に援用される。

（ＩＩ．本発明の方法）
一つの局面において、本発明は、基材の表面上にコーティングを形成する方法を包含する。選択された化学基の選択された表面密度を有するコーティングは、多くの利益ある生物学的用途を有することが発見された。以下に考察されるのは、本発明を実施する際に図１において示されるような工程である。

（Ａ．基材）
図１において参照されるように、本発明の方法は、コーティングが、形成される基材１０を使用する。コーティングされるべき基材の性質は、広く変化し得る。基材１０の少なくとも一つの表面の少なくとも一つの部分は、本発明の官能基１６または表面修飾基１８でコーティングされる。好ましくは、表面全体は、官能基１６または表面修飾基１８でコーティングされる。適切な基材材料としては、全ての非多孔性ポリマー基材または多孔性ポリマー基材（例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリエステルおよびポリエーテル、ポリエーテル−ブロックアミド、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリカルボネート、ポリオルガノシロキサン、ポリオレフィン、ポリスルホン、ポリイソプレン、ポリクロロプレン、ポリテトラフルオロチレン（ＰＴＦＥ）、ポリシロキサン、フッ化エチレンプロピレン、ヘキサフルオロプロピレン、ポリエチレン、ポリプロピエン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｉｅｎｅ）、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、シリコーンゴム、ポリスルホン、ポリヒドロキシ酸、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミノ酸、再生セルロース、対応するコポリマーおよび対応する混合物、ならびにまた天然ゴムおよび合成ゴム）が挙げられる。本発明についての特定の目的の基材は、延伸ＰＴＦＥ（ｅＰＴＦＥ）である。延伸ポリテトラフルオロエチレン物質を作成する方法は、各々が参考として本明細書中で援用される、米国特許第３，９５３，５６６号および同第４，１８７，３９０号に記載されている。

本発明に従う方法はまた、金属、セラミックおよび金属ポリマー複合物（Ｍａｎｎｅｒｓ、２００１）ならびに塗布されたかまたは他の方法でポリマーコーティングされたガラス構造物または木製構造物の表面に適用され得る。支持メンバーについて適切な金属としては、例えば、チタン、ステンレス鋼、金、銀、ロジウム、亜鉛、白金、ルビジウムおよび銅が挙げられるが、これらに限定されない。セラミック支持メンバーについて適切な材料としては、例えば、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、アルミナ、シリカ、ヒドロキシアパタイト、ガラス、酸化カルシウム、ポリシラノールおよび酸化リンが挙げられるが、これらに限定されない。基材材料の表面は、コーティングプロセスの前に公知の様式で、接着する油状物、グリースおよび他の混入物を有利に含まない。

（Ｂ．基材活性化）
本方法の第１工程は、基材１０の表面を、図１中の工程１４に示されるように大気圧または大気圧付近で形成されたプラズマで処理する工程を包含する。「大気圧または大気圧付近で」とは、約１０％の大気圧（例えば、７６トル）の減圧を越えかつ大気圧の約２倍の高圧より低い、任意の圧力を意味する。好ましくは、「大気圧または大気圧付近で」とは、大気圧に解放されているチャンバ内の圧力のことをいい、その実際の圧力は、海抜および大気圧条件に依存する。好ましい圧力は、７００トルと８００トルとの間である。

図２〜４に示されるように、処理工程は、基材２２、３０または４０の表面を介してかまたはそれらに対してプラズマを流すことによって実施され得る。このような処理は、解放空間または閉じ込められた空間のいずれかにおいて実施され得る。例えば、図４に示されるように、管形状基材４０の外側を処理するために、プラズマ４２は、基材４０の外側の表面と取り囲む基材４４の内側表面との間を流れ得る。この様式において、プラズマ４２は、閉じ込められ、そして／または延長される。

プラズマ処理プロセスパラメーターは、官能基の所望の濃度および基材の機械的特性に依存して変化し得る。処理時間の長さおよびプラズマチャンバを通過するプラズマの１分あたりの容積は、しかるべく変化し得る。例えば、基材がｅＰＴＦＥである場合、より長い処理時間は、形成された活性種の密度を増加させ得るが、受容可能な範囲より低いレベルへと基材を弱め得る。プラズマ処理のための電圧は、使用される装置に従って変化し得、そして当業者により容易に決定される。８ｃｍ ｅＰＴＦＥシリンダーの処理についての例示的なパラメーターのセットは、１２Ｖであり、３０ｓｃｆｍプラズマが３０秒間基材を通過するかまたは基材に対する。

再度図２〜４を参照して、本発明は、プラズマ４２を形成するためのプラズマノズル２７を有するプラズマチャンバ２５を提供する。当業者に公知の任意の大気圧プラズマ発生器は、本発明において使用され得る。例示的なプラズマ発生器は、米国特許第５，７９８，１４６号に記載される。これは、本明細書中で参考として援用される。

基材の活性化を達成するために使用されるプラズマは、キャリア気体単独またはキャリア気体および１０％未満の酸素、水、アンモニア、水酸化アンモニウム、有機アミン、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、もしくはエステルのような気体もしくは蒸気で形成され得る。１つの実施形態において、プラズマは、キャリア気体ならびに酸素、水、アンモニア、水酸化アンモニウム、有機アミン、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、およびエステルからなる群より選択される０．１％以上の気体または蒸気から形成される。１つの実施形態において、プラズマは、キャリア気体ならびに０．１％〜１０％の酸素、水、アンモニア、水酸化アンモニウム、有機アミン、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、および／またはエステルから形成される。キャリア気体は、気体流におけるプラズマのグローを維持するその能力について選択され得る。例示のキャリア気体としては、窒素、二酸化炭素、および不活性気体（例えば、アルゴン、クリプトン、ネオン、ゼノン、およびヘリウム）が挙げられる。好ましいキャリア気体は、アルゴンである。この様式において、１つ以上の活性種が、表面上に形成される。この処理は、活性種の所望の表面密度が形成されるまで継続される。

基材活性化工程１４は、本明細書中にその全体が参考として援用される米国特許第６，１５９，５３１号に記載される連続プラズマ処理またはパルスプラズマ処理として実施され得る。プラズマを発生させる力は、パルス形態で供給され得るかまたは段階様式もしくは勾配様式（より高い力が最初に供給され、その後、その力はプラズマ蓄積処理の終わりに向かって減少していくかまたは先細りになっていく）で供給され得る。

プラズマ支援活性化は、化学的に最も安定なフルオロポリマー（例えば、延伸ＰＴＦＥ（ｅＰＴＦＥ））を含むほとんど全ての基材を活性化し得る清潔な、溶媒を用いない処理なので、好ましい。プラズマは、前駆気体分子から高エネルギー種（すなわち、イオンまたはラジカル）を生じる。これらの高エネルギー種は、基材１０を活性化し、基材１０と表面修飾基１８および／または生体活性／生体適合性コーティング２０との間の安定な結合を可能にする。

１つの実施形態において、基材は、第１の電極であり得る導電性材料（例えば、金属）であり、そして処理は、金属表面およびそれに隣接する第２のプラズマ発生電極付近におよびそれと接してプラズマを形成する工程を含む。金属基材は、好ましくは、円柱である。この実施形態において、第２のプラズマ発生電極は、基材付近に配置され得る。あるいは、金属基材は、長手軸にそって延びる穴を規定する円柱であり、そして第２のプラズマ発生電極は、長手軸に沿って穴を通って配置される。基材および第２の電極は、チャンバ内に閉じ込められていても、そうでなくともよい。

（Ｃ．安定な官能基の変換）
表面は、処理された後、活性種を安定な官能基１６に変換するのに有効な条件下で選択された気体または液体に曝露され得る（図１）。変換の時間範囲は、約１秒と約６秒との間であり得る。変換のためには、５分間が最も好ましい時間である。曝露工程は、表面と、気体空気、アンモニア、または酸素を接触させることによって実施され得る。あるいは、表面は、液体形態の水、水酸化アンモニウム、またはヒドラジンと接触され得る。

安定官能基の変換工程１６、あるいは先の工程１４、または次の工程１８もしくは２０の完了後、得られる表面のぬれ挙動、表面張力、および他の物理的特性が分析され得る。分析方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：時間飛行型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）、中性小角散乱、小角光散乱、透過型電子顕微鏡法、走査型電子顕微鏡法、位相差顕微鏡法、偏光顕微鏡法、化学分析用電子分光法（ＥＳＣＡ）、フーリエ変換赤外偏光法（ＦＴＩＲ）、個別超分解能核磁気共鳴法（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）（ＮＭＲ）、パルスＮＭＲ、機械的緩和（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）、誘電緩和（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、ＤＳＣ、ＤＴＡ、ＴＯＡ、蛍光法、スピンプローブ法、陽電子消滅、ＳＩＭＳ、微視的ラマンなど。

（Ｄ．表面修飾基結合）
その後、露出表面は、必要に応じて、表面修飾基を官能基１６またはプラズマ活性化表面１４に共有結合させるに有用な条件下で、表面修飾基１８と接触させられる。従って、表面上の選択された化学基は、それに共有結合した安定官能基１６または表面修飾基１８である。１つの実施形態では、表面修飾基１８は、フィブロネクチン吸着の増加および／またはアルブミン吸着の減少をもたらし得る、それゆえ、この表面への細胞の結合およびこの表面での増殖を改善する、カルボン酸基である。

必要に応じて、表面修飾基の結合は、湿潤剤の存在下で実施されて、より均質なコーティング塗布に関してこの基材のぬれが増強される。湿潤剤の有用な例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルコール、エーテル、エステル、アミド（例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１−ブタノール、ｎ−ブチルアセテート、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ならびにそれらの混合物および組み合わせ。

好ましい湿潤剤としては、エタノール（ＥｔＯＨ）またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）が挙げられる。実施例１に記載される例示的な方法は、活性化プラズマ（例えば、クロロ酢酸／水酸化ナトリウム（Ｃｌ−Ｈａｃ／ＮａＯＨ）と接触させる前に、１００％ ＴＨＦまたは５０：５０ ＥｔＯＨ：ＮａＯＨ溶液で基材を予めぬらすことを包含する。この実施例では、ｅＰＴＦＥを基材として用いた。図５に示すように、試験した異なるエタノール容積百分率のうち、ｅＰＴＦＥの表面上での最高濃度のＰ−１５は、最大過剰のＣｌ−ＨａｃおよびＮａＯＨ（５％ ＥｔＯＨ、１．８５Ｍ Ｃｌ−Ｈａｃ、および４．５Ｍ ＮａＯＨ）にて達成された。図６は、表１に示すパラメーターを用いた、Ｃｌ−Ｈａｃ活性化プロセスにおけるＥｔＯＨおよびＴＨＦの比較の結果を示す。図６からわかり得るように、ＴＨＦを用いたＣｌ−Ｈａｃ活性化は、ｅＰＴＦＥ表面において５０％よりも高い濃度のＰ−１５をもたらした。湿潤剤としてのＴＨＦは、Ｃｌ−Ｈａｃと反応しないという利点を提供する。それゆえ、ＥｔＯＨと比較して大過剰のＣｌ−ＨａｃおよびＮａＯＨの下で、ＴＨＦの存在下で反応を行うことは一般により容易である。

いくつかの状況において、生理学的環境内で安定な官能基と、以下に記載される固定された生体活性薬剤／生体適合性薬剤との相互作用は、最適ではないかもしれない。安定な官能基は、生物学的活性を減少させ得る厳しい条件下で、生体活性コーティング／生体適合性コーティングの共有結合を必要とし得る。例えば、メシルクロリド、トシルクロリド、およびトレシルクロリドは、基板上のさほど反応性ではない基（例えば、ヒドロキシル基）と非常に効率的に反応する。さらに、これらはまた、非常に良好な脱離基であり、従って、穏やかな条件下で、感受性であるかまたは安定性の低い生体活性薬剤／生体適合性薬剤を用いて、表面のコーティングを改善する能力を有する。

別の局面において、官能基と固定された生体活性薬剤／生体適合性薬剤との間の立体障害が、官能基への、生体活性薬剤／生体適合性薬剤の接近を制限し得る。さらに、物理的塊、静電的反発、または生体活性薬剤／生体適合性薬剤の不適切な配置もまた、固定された生体活性薬剤／生体適合性薬剤の減少した効率に寄与し得る。さらに、多くの遊離アミン基を有する表面は、トロンボゲン応答を引き起こし得る。従って、１つ以上の更なる化合物を、多官能性リンカーとして、化学的官能基と生体活性薬剤／生体適合性薬剤との間に配置して、層と生体活性薬剤／生体適合性薬剤との間の間隔を増加させるか、または所望でない応答を減少させることが、望ましくあり得る。

多官能性リンカーとして使用するために適切な化合物としては、無水物、アルコール、酸、アミド、エポキシド、イソシアネート、シラン、ハロゲン化基、および重合性基が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、多官能性リンカーは、ハロゲン化カルボン酸（例えば、クロロ酢酸、クロロ酪酸、およびクロロ吉草酸）である。遊離カルボキシル基を有する、適合性表面を作製する例示的な方法は、米国特許第６，１５６，５３１号（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、遊離アミン基を無水コハク酸と反応させることによって、達成され得る。多官能性リンカーは、好ましくは、骨格中に２〜２０個の炭素原子を有する少なくとも１つの分子からなる。１つの実施形態において、多官能性リンカーは、ヘテロ官能性分子から形成されるストリングである。あるいは、多官能性リンカーは、代替のホモ官能性分子から形成されるストリングである。官能基は、別個の多官能性基の化合物の使用を必要とせずに、それ自体が、スペーサーアームとして働き得ることが理解されるべきである。

（Ｅ．生体活性／生体適合性コーティング）
選択された化学基１６または１８で、選択された表面密度での、表面１０のコーティングに続いて、この表面は、図１に示され、そして上に記載されるように、生体活性薬剤または生体適合性薬剤２０と、さらに接触され得る。この工程において、利用可能な官能基１６または表面修飾基１８は、基板１０のために望ましい特性を保有する生体活性薬剤／生体適合性薬剤を共有結合または非共有結合するために、使用される。

本発明の基材部材に対する生体活性薬剤／生体適合性薬剤の共有結合性固定は、一般的に非可逆的である（すなわち、この生体活性薬剤／生体適合性薬剤は、官能基または表面修飾基から容易に放出されない）。しかし、固定された生体活性薬剤／生体適合性薬剤（治療薬を含む）を選択的に放出し得る多官能基は、レセプター／リガンド相互作用、分子同定、および抗体／抗原複合体の分子同定および特徴付け、ならびに細胞の部分集合の選択的精製などにおける有用性を有している。さらに、選択的切断された多官能性リンカーは、生体活性薬剤／生体適合因子をその基材から予測可能かつ制御可能に放出することを提供する。

従って、本発明は、１つの局面において、切断可能な多官能性リンカーを含む。この実施形態において、その生体活性薬剤／生体適合性薬剤の選択的放出は、適切な反応条件下でそのスペーサーを切断することによって実施され、その反応条件としては、例えば、光子照射、酵素性分解、酸化／還元、または加水分解が挙げられる。この固定された因子の選択的な切断および放出は、当業者に公知の技術を使用して達成され得る。例えば、ＨｏｒｔｏｎおよびＳｗａｉｓｇｏｏｄ，１９８７；Ｗｏｎｇ，１９９１；ならびに米国特許第４，７４５,１６０号（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。切断可能な多官能性リンカーとしての使用のための適切な化合物としては、ポリヒドロキシ酸、ポリ無水物、ポリアミノ酸、タータラート、およびシステインリンカー（例えば、Ｌｏｍａｎｔ試薬）が挙げられるがこれらの限定されない。

生体活性薬剤／生体適合性薬剤は、当業者にとって公知である生体結合体化技術を使用して基材に固定され得る。例えば、Ｍｏｓｂａｃｈ，１９８７；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら，１９９２；ならびにＢｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２を参照のこと。穏やかな生物結合体化スキームは、基材の構造、官能基、表面修飾基、および／または生体活性薬剤／生体適合性薬剤に対する損傷を除去または最小化するために生体活性薬剤／生体適合性薬剤の固定化に好適である。

本発明の生体活性薬剤／生体適合性薬剤は、代表的には、特定の基材の機能または性能を増強もしくは変更すること、またはその周辺組織の反応および機能を変更することが意図される生体活性薬剤／生体適合性薬剤である。１つの実施形態において、生理環境における用途のための生物医学デバイスが、本発明によって企図される基材である。特定の好ましい実施形態において、生物活性基／生体適合性基は、細胞接着因子、増殖因子、抗血栓症因子、結合レセプター、リガンド、酵素、抗生物質、および核酸からなる群より選択される。基材における生体活性薬剤／生体適合性薬剤の使用は、ここでは、好ましい。しかし、基材上の２以上の生体活性薬剤／生体適合性薬剤はまた、本発明の１実施形態において企図される。

関連の実施形態において、本発明は、ゆっくりと放出され得る第一の生体活性／生体適合性薬剤と、例えば、物理的脱離によって、より速く放出され得る第二の生体活性／生体適合性薬剤とを含む。この組み合わせは、疾患処置、創傷治癒または移植可能デバイスの組み込みの過程において、異なる相の利点を有する。例示的な緩徐放出因子は、生体活性薬剤上のＯＨ基と基材表面上に形成されたＣＯＯＨとの間で形成されるエステル結合の加水分解によって放出される。

所望の細胞結合因子としては、結合ペプチド、ならびにそのネイティブな状態が、基材または隣接細胞に強固に結合され得、特異的細胞表面レセプターに結合し、そして基材または隣接細胞に細胞を機械的に結合させる、代表的には１００〜１０００キロダルトンの大きさの、大きいタンパク質または糖タンパク質の活性ドメインが挙げられる。結合因子は、特異的細胞表面レセプターに結合し、そして細胞を基材または隣接細胞に機械的に結合する。このような事象は、代表的には、結合因子の十分規定された活性ドメイン内で生じる。細胞を基材に結合させる因子は、本明細書中で、基材結合分子とも称される。細胞を隣接細胞に結合させる因子は、本明細書中で、細胞−細胞接着分子とも称される（Ａｌｂｅｒｔｓら、１９９４）。細胞結合の促進に加えて、各型の結合因子は、細胞の移動および分化を含む他の細胞応答を促進し得る。本発明に適切な結合因子としては、例えば、タンパク質のラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、テネイシン、フィブリノゲン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、フォン・ビルブラント因子および骨シアロタンパク質、またはこれらの活性ドメインのような、基質接着分子が挙げられる。他の適切な結合因子としては、カドヘリン（例えば、Ｎ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリン）とも称される、細胞−細胞接着分子が挙げられる。

本発明において有用な結合因子は、代表的に、ネイティブな結合因子の特定のドメインの生物学的活性を有するアミノ酸配列またはその機能的アナログを含み、この結合ペプチドは、代表的に、約３〜約２０アミノ酸長である。ネイティブな細胞結合因子は、代表的に、細胞表面レセプターに結合し、そして親分子の細胞接着活性、細胞移動活性および細胞分化活性を生じる、１つ以上のドメインを有する。これらのドメインは、特定のアミノ酸配列からなり、そのうちいくつかは、合成され、そして細胞の結合、広がりおよび／または増殖を促進することが報告されている。これらのドメインおよびこれらのドメインの機能的アナログは、結合ペプチドと称される。

フィブロネクチン由来の例示的な結合ペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＧＤまたはＡｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ（配列番号２；Ｋｌｅｉｎｍａｎら，１９９３）、ＲＥＤＶまたはＡｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ（配列番号３；Ｈｕｂｂｅｌｌら、１９９２）、およびＣ／Ｈ−Ｖ（ＷＱＰＰＲＡＲＩまたはＴｒｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ Ｉｌｅ）（配列番号４；Ｍｏｏｒａｄｉａｎら、１９９３）
ラミニン由来の例示的な結合ペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＹＩＧＳＲまたはＴｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ（配列番号５）およびＳＩＫＶＡＶまたはＳｅｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ（配列番号６）（Ｋｌｅｉｎｍａｎら，１９９３）およびＦ−９（ＲＹＶＶＬＰＲＰＶＣＦＥＫＧＭＮＹＴＶＲまたはＡｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ）（配列番号７；Ｃｈａｒｏｎｉｓら，１９８８）。

コラーゲン由来の例示的な結合ペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＥＰ−ＩＩＩ（ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫまたはＧｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ）（配列番号８；Ｋｏｌｉａｋｏｓら，１９８９）およびＰ−１５（ＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶ；配列番号１）。望ましくは、本明細書中で使用される結合ペプチドは、それらのアミノ酸配列中に約３と約３０との間のアミノ酸残基を有する。好ましくは、結合ペプチドは、それらのアミノ酸配列中に約１５以下のアミノ酸残基を有する。１つの実施形態において、結合ペプチドは、そのアミノ酸配列中に正確に１５のアミノ酸残基を有する。

本発明の実施形態は、Ｐ−１５の全てまたはいくらかの部分の生物学的活性と機能的に同等である生物学的活性を有する合成的組成物を含む。「機能的に同等である」とは、化合物の形状、サイズ、および可撓性が、その化合物の生物学的活性がＰ−１５領域またはその一部と類似であるような形状、サイズ、および可撓性であることを意味する。このペプチドの生物学的活性は、コラーゲン合成の阻害、コラーゲン結合の阻害、および溶液中のペプチドの存在下での、コラーゲンゲル上の細胞移動の阻害を含む、異なる試験によって評価され得る。本発明の特定の目的は、増強された細胞結合特性である。有用な化合物は、Ｐ−１５またはその一部と比較して類似の空間的特性および電気的特性に基づいて選択することができた。これらの化合物は、典型的には、５０未満のアミノ酸である低分子であるかまたは約２，５００ダルトン、より典型的には、約１０００ダルトンまでの分子量である。本発明の発明化合物は、合成ペプチドを含むが、コラーゲン結合種の認識およびドッキングについての必要なコンフォメーションを模倣する非ペプチドもまた、本発明の範囲内として企図される。例えば、非ペプチド（例えば、チオエステル）によって必要なコンフォメーションが安定化される他の化合物上の環状ペプチドは、本発明を達成する１つの手段である。

Ｐ−１５領域のコア配列を形成する中心位置は、コラーゲン様活性を有するとして同定される。従って、本発明の生体活性／生体適合性薬剤は、配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号９）を含み得る。−Ｉｌｅ−Ａｌａ−によって形成される、折り畳みまたは蝶番に隣接する２つのグリシン残基は、生理学的条件において水素結合し、従って、［β］折り畳みを安定化させる。グリシン間の水素結合の安定化は、容易に加水分解されるので、この配列に隣接する２つのさらなる残基は、折り曲がりコンフォメーションをさらに安定化させることによって、細胞結合活性を顕著に改善し得る。各末端にグルタミンを有する（Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ；配列番号１０）、本発明によって企図される有利な特性を有する例示的な生体活性／生体適合性薬剤は、２００１年７月３１日に発行された米国特許第６，２６８，３４８号（その全体が本明細書で参考として援用される）に記載されている。

実施例２は、本発明の方法に従って処理された基材が、インビトロで増強された内皮細胞増殖を提供する能力を有することを示す。実施例は、ｅＰＴＦＥ移植片材料上でのＰ−１５表面処理を特徴付けし、そしてインビトロでの内皮細胞の接着、移動および増殖に対する生物学的活性を測定した。シミュレーションされた加齢後のＰ−１５処理分解のレベルもまた、示される。結果は、細胞接着ペプチドの共有結合によって特徴付けされた、この処理方法が、明確かつ安定であることが示されたことを示す。ｅＰＴＦＥ移植片上での表面処理は、健常な内皮細胞の移動および増殖を促進した。従って、本発明のコーティング方法は、内皮化の速度および質を改善し得、そして脈管デバイスの血栓および再狭窄によって引き起こされる誘導性デバイス欠陥における有用性を見出す。

例示的な抗増殖剤としては、アンギオペプチン（イブセン由来のソマトスタチンアナログ）、アンギオテンシン変換酵素インヒビター（例えば、ＣＡＰＴＯＰＲＩＬ（Ｓｑｕｉｂｂから入手可能）、ＣＩＬＡＺＡＰＲＩＬ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅから入手可能）、またはＬＩＳＩＮＯＰＲＩＬ（Ｍｅｒｃｋから入手可能））；カルシウムチャネルブロッカー（例えば、ニフェジピン）、コルヒチン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）アンタゴニスト、魚脂（ω−３−脂肪酸）、ヒスタミンアンタゴニスト、ＬＯＶＡＳＴＡＴＩＮ（Ｍｅｒｃｋからのコレステロール低下薬物である、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのインヒビター）、モノクローナル抗体（例えば、ＰＤＧＦレセプター）、ニトロプルシド、ホスホジエステラーゼインヒビター、プロスタグランジンインヒビター（Ｇｌａｚｏから入手可能）、Ｓｅｒａｍｉｎ（ＰＤＧＦアンタゴニスト）、セロトニンブロッカー、ステロイド、チオプロテアーゼインヒビター、トリアゾロピリミジン（ＰＤＧＦアンタゴニスト）、および酸化窒素が挙げられる。特に関心があるのは、ラパマイシンであり、これは、移植片移植、ステント移植、またはステント移植片移植後の炎症性応答を阻害し得る。ＴＡＸＯＬもまた好ましい。さらなる例示的な生体活性／生体適合性薬剤は、米国特許第６，２９９，６０４号（本明細書で参考として援用される）に見出され得る。

本発明に存在する他の所望の生体活性／生体活性薬剤としては、成長因子（例えば、線維芽細胞増殖因子、表皮増殖因子、血小板誘導型成長因子、形質転換成長因子、脈管内皮増殖因子、骨形成タンパク質および他の骨増殖因子、天然増殖因子など）が挙げられる。

本発明のまた他の所望される生体活性／生物適合性薬剤は、血栓形成または血液に接触するデバイスの蓄積を阻害する抗血栓剤を含む。所望される抗血栓剤としては、ヘパリンおよびヒルジン（これらは、トロンビンのような凝固カスケードタンパク質を阻害する）、ならびに溶解素が挙げられる。他の所望される抗血栓剤は、ＰＧＩ２、ＰＧＥ１、およびＰＧＤ２のようなプロスタグランジンを含み、これらは、血小板の付着および活性化を阻害する。さらに他の所望される抗血栓剤は、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、そしてプラスミノーゲンアクチベーターのような線維素溶解性酵素を含み、これらは、フィブリン凝塊を分解する。別の所望される生体活性／生物適合性薬剤は、溶解素からなり、これは、特異的にプラスミノーゲンに結合し、順々にフィブリン凝塊を分解する。

他の所望される本発明における生体活性／生物適合性薬剤は抗体および抗原のような結合レセプターを含む。基材上に存在する抗体は、特定の抗原を結合し得、そして固定化抗体と接触する水性媒体からこの抗原を除去し得る。同様に、基材上に存在する抗原は、特定の抗体を結合し得、そして固定化抗原と接触する水性媒体から抗体を除去し得る。

他の所望される生体活性／生物適合性薬剤は、レセプターおよびそれらの対応するリガンドからなる。例えば、アビジンおよびストレプトアビジンは、特異的にビオチンを結合し、アビジンおよびストレプトアビジンがレセプターであり、そしてビオチンがリガンドである。同様に、線維芽細胞増殖因子および血管内皮増殖因子はヘパリンと高い親和性で結合し、そしてトランスホーミング増殖因子βおよび特定の骨形態形成タンパク質は、ＩＶ型コラーゲンに結合する。さらに含まれるものは、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇのような、細菌供給原由来の免疫グロブリン特異的結合タンパク質、ならびにそれらの合成的アナログである。

本発明のさらに他の所望される生体活性／生物適合性薬剤は、固定化酵素に接触した水性媒体に存在する基質分子に結合し得、そしてこの基質分子における特定の変化を触媒し得る酵素を含む。他の所望される生体活性／生物適合性薬剤は、核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡ）からなり、これは、相補的な核酸配列に選択的に結合する。特定の核酸配列でコーティングした基材表面は、試験サンプル中の相補的な核酸配列の存在を同定するための診断的アッセイにおいて使用される。

本発明におけるさらに他の所望される生体活性／生物適合性薬剤は、基材表面上の微生物の増殖を阻害する抗生物質を含む。特定の所望される抗生物質は、微生物上の特定の成分に結合することによって微生物の増殖を阻害し得る。特に所望される抗生物質の分類は、抗生物質タンパク質であり、これは、少なくとも一部分、特異的な相補的リガンド−レセプター結合を包含しないかもしれないメカニズムを介して原形質膜の浸透性を変えることによって微生物の増殖を阻害するようである（Ｚａｚｌｏｆｆ，１９９２）。

１実施形態において、その生体活性薬剤または生物適合性因子は、０．０１〜１０００ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の密度でその表面に結合している。好ましくは、その生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、０．５〜３０ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の密度でその表面に結合している。より好ましくは、その生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、２〜２０ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の密度でその表面に結合している。

ＡＡＡ（アミノ酸分析）、ＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィー／質量分析法）、加速エージング、インビトロ細胞培養後のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）およびインビボ試験のような化学試験／生物学的試験は、以下の実施例２および３において記載されるように本発明のコーティングを評価するのに使用され得る。当業者にとって公知である生物適合性試験（例えば、細胞傷害性、インビトロ溶血、筋肉移植、および遺伝毒性（ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（例えば、細菌性復帰変異）、生理食塩水およびＤＭＳＯ抽出物、染色体異常、およびマウス骨髄小核）がまた、使用され得る。

（ＩＩＩ 例示的デバイス）
１つの局面において、本発明は、上記の方法に従って調製されるコーティングを有する基材を備える。この基材は、好ましくは、処理されてその表面上に所望の生物学的効果を達成する少なくとも１つの表面またはそれらの部分を有する、医学的移植片または医療デバイスの一部分である。例示的デバイスとしては、ステント、グラフト（移植片）、カテーテル、カテーテルガイドワイヤ、創傷ドレナージデバイス、外傷用医薬材料、眼内レンズ、ペースペーカー、心臓弁が挙げられる。これらの基材／デバイスは、生体医学移植片の分野において慣用的に使用され得る周知の手順に従ってそれを必要とする患者に移植され得る。例示的なデバイスとしては、支持なしの血管移植片および支持ありのステント移植片が挙げられる。

上述の内容から、いかにして、基材コーティング発明の種々の目的および特徴が満たされるかということが理解され得る。

（ＩＶ．実施例）
以下の実施例は、本明細書中で記載された発明をさらに例証するものであり、かつ本発明の範囲を決して限定するものでない。

（実施例１）
（湿潤剤を使用するクロロ酢酸活性化）
本実施例は、反応性湿潤剤としてＥｔＯＨを使用するか、または非反応性湿潤剤としてＴＨＦを使用して、Ｃｌ−Ｈａｃを用いたｅＰＴＦＥ表面のプラズマ活性化を特徴付けた。内径３ｍｍおよび壁厚０．００３’’を有するｅＰＴＦＥ移植片の内表面を、記載のように処理した。湿潤剤の存在下でＣｌ−Ｈａｃ／ＮａＯＨを用いて活性化を実施した。移植片を、Ｃｌ−Ｈａｃ／ＮａＯＨとの接触前に、１００％ＴＨＦ溶液または５０：５０のＥｔＯＨ：ＮａＯＨ溶液を用いて予め湿潤化した。次いで、移植片を、ＤＭＳＯ／水溶液中のＰ−１５ペプチド／ＥＤＣで処理した。次いで、移植片を水でリンスし、次いで、１０％ＥｔＯＨ水溶液でリンスして、そして、乾燥した。次いで、表面処理した移植片を、アミノ酸解析およびガス放出（Ｏｕｔｇａｓｓｉｎｇ）ＧＣ／ＭＳによって２ｃｍのピースで分析した。

図５は、湿潤剤としてＥｔＯＨを使用することにより生じるＰ−１５の濃度を示す。５％−Ａは、５％ ＥｔＯＨ＋１．３５Ｍ Ｃｌ−Ｈａｃ＋３Ｍ ＮａＯＨを示す。５％−Ｂは、５％ ＥｔＯＨ＋１．８５Ｍ Ｃｌ−Ｈａｃ＋４Ｍ ＮａＯＨを示す。５％−Ｃは、５％ ＥｔＯＨ＋１．８５Ｍ Ｃｌ−Ｈａｃ＋４．５Ｍ ＮａＯＨを示す。１０％−Ｄは、１０％ ＥｔＯＨ＋２．２Ｍ Ｃｌ−Ｈａｃ＋５Ｍ ＮａＯＨを示す。１０％−Ｅは、１０％ ＥｔＯＨ＋２．４Ｍ Ｃｌ−Ｈａｃ＋５．４Ｍ ＮａＯＨを示す。

図６は、Ｃｌ−Ｈａｃ活性化プロセスにおけるＥｔＯＨおよびＴＨＦの比較、ならびに生じたＰ−１５の濃度を示す。１５％ ＴＨＦまたは５％ ＥｔＯＨを使用するＣｌ−Ｈａｃ活性化を比較した。表１は、移植片を処理するために使用された３つのプラズマ設定のパラメーターを示す。

（表１）
移植片を処理するためのプラズマ設定

（実施例２）
（Ｐ−１５で処理されたｅＰＴＦＥ表面上におけるインビトロでの促進された内皮増殖）
（Ａ．材料および方法）
（１．ペプチドコーティング）
ＧＬＰグレードのＰ−１５ペプチド（配列番号１）を、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）から特注し、そしてコーティングプロセスの前に４℃で貯蔵した。小さい直径（３ｍｍ）の延伸ＰＴＦＥ（ｅＰＴＦＥ）移植片を、プラズマで活性化し、そして実施例３に従って表面改変し、そして米国特許第６，１５９，５３１号に記載されるようにして、Ｐ−１５ペプチドで共有結合的にコーティングした。全ての反応を、水溶液中で行った。少量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはエタノール（ＥｔＯＨ）を添加して、化学反応およびリンスプロセスの効率を上げた。水溶液中での最終のリンスおよび窒素ガスでの乾燥の後、処理したｅＰＴＦＥ移植片を、透明なフッ素製容器（ｆｌｕｏｒｏｗａｒｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）中で貯蔵した。

（２．アミノ酸分析（ＡＡＡ））
ｅＰＴＦＥ移植片の表面上のペプチドを、アミノ酸分析（ＡＡＡ）によって定量した。この方法において、ペプチドおよびタンパク質を、移植片から分離し、そして６ＮのＨＣｌ中での１１０℃で２２〜２４時間の加水分解によって単一アミノ酸に完全に破壊した。個々のアミノ酸の量を、イオン交換クロマトグラフィーによって定量した。Ｐ−１５の総量、およびペプチドの純度（実際のアミノ酸比を推定のアミノ酸比と一致させる）を計算した。

ＡＡＡ前のいくつかの場合において、移植片を、アミノ酸分析の前に、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で３回、超音波的にリンスして、物理的に吸着したペプチドまたはペプチドセグメントを除去した。

（３．ガス放出ガスクロマトグラフィー／質量分光法（ＧＣ／ＭＳ））
ＴＨＦまたはエタノールのような揮発性の溶媒の残留レベルを、Ｈｅａｄｓｐａｃｅ分析によって決定した。サンプルを、石英チューブ中で密閉し、そして８５℃で２時間脱気した。この脱気した物質を、ＧＣカラムに入れる前に、−１０℃の冷却キャピラリー中で濃縮した。標準化は、コーティングプロセスに使用される純粋な溶媒を使用して行った。

（４．非パージ可能全有機炭素（ＮＰＯＣ））
不揮発性溶媒および化学物質（例えば、ＤＭＳＯまたはカルボジイミド）の残渣を、３日間、３７℃で水を用いて動的抽出することによって決定した。有機炭素を、ＵＶパースルフェートＴＯＣ分析機を用いて引き続いて測定した。

（５．加速エージング試験）
処理された移植片をエチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌し、そして加速エージング試験を、ある範囲の湿度で５５℃で実行して、室温で、２年６ヶ月の保存を刺激した。

（６．インビトロ内皮細胞培養を使用する生物学的活性の測定）
２ｃｍ長のｅＰＴＦＥ移植片（Ｐ−１５ペプチド（Ｐ−１５）で外側を処理した）、および未処理（コントロール）移植片を、ステンレス鋼フレームを用いて内側に支持した。組み立てられた移植片を、ＥｔＯを用いて滅菌した。

組織培養マルチウェルプレートのウェルを、滅菌アガロースゲルを用いて層化した。滅菌移植片は、これらのウェルに垂直に配置された。ダルベッコ改変イーグル培地および１０％の胎仔ウシ血清中の形質転換されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＥＣＶ３０４）の懸濁液を、移植片の底に播種した。インキュベーター内で３時間の最初の接着後に、培地を、ウェルの頂部に添加して、頂部に細胞移動させた。６または１３日後、移植片を取り出し、そして滅菌リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で注意深くリンスした。次いで、サンプルを乾燥し、ＳＥＭ分析のために調製した。

移植片上への内皮細胞の移動および形態学を、ＳＥＭを使用して、定性的に評価した。Ｐ−１５処理移植片およびコントロール移植片における内皮細胞の増殖を、トリプシン処理後に、回収される細胞の数によって定量的に評価した。

（Ｂ．結果および考察）
（１．ペプチド処理の特徴付け）
Ｐ−１５ペプチドとの共有結合の前および後に移植片についての有機アミノ酸分析データを表２に示した。Ｎｌｅｕを、イオン交換カラムへのアミノ酸混合物の注入のための内部標準として使用した。血清処理および他の活性化プロセスは、比較的透明な基材を導くことが明らかである。Ｐ−１５ペプチド処理された移植片から回収されたアミノ酸は、大部分ペプチド自身に由来した。

表３は、加水分解されたペプチドコーティングの組成物が、遊離Ｐ−１５ペプチドの組成物に良好に対応することを示した。Ｐ−１５ペプチドに存在する個々のアミノ酸の回収された組成物と理論的組成物との間の差に基づく、一致スコアは、遊離Ｐ−１５ペプチド粉末および移植片上にコーティングされたＰ−１５について類似した。

表面上の全ペプチド濃度および一致スコアは、界面活性剤リンスの前後で新規にコーティングされた移植片ならびに６ヶ月および２年に相当するエージング試験に供された移植片について同じ範囲のままであった。このことは、延長された期間にわたって、共有結合されたＰ−１５ペプチドが、ｅＰＴＦＥ移植片の表面上で安定であることを示す。

（２．残存溶媒）
Ｐ−１５処理ｅＰＴＦＥ移植片は、ガス放出ＧＣ／ＭＳ分析によって示されるように、窒素ガスならびに０．２ｐｐｍエタノールおよび０．２ｐｐｍ ＤＭＳＯを含有する空気によって乾燥した。ガス放出ＧＣ／ＭＳ分析において各溶媒に対する検出限界は、０．１ｐｐｍである。アルコール飲用後の血中のエタノール痕跡は、共通であり、一方で、少量のＤＭＳＯを、凍結サイクルからのインビトロ細胞を保護するために使用する。０．２ｐｐｍレベルのこれら２つの溶媒（エタノールおよびＤＭＳＯ）は、ここで、受容可能であるようである。わずかに可能性のある有害な溶媒（ＴＨＦ）は、全く検出され得ない。

水中３７℃で３日間Ｐ−１５処理された移植片の激しい振盪は、ブランクサンプルについての０．００４ｍｇに比べて、０．００６ｍｇのパージ可能でない有機炭素（ＮＰＯＣ）のみを抽出し得る。ｅＰＴＦＥ移植片に対するＰ−１５ペプチド処理の種々のこれらの特徴付けは、Ｐ−１５ペプチドが、ｅＰＴＦＥの表面に対して安定かつ清潔に付着され得ることを示す。

（表２）
（コントロールについてのアミノ酸分析データおよびＰ−１５ペプチド処理ｅＰＴＦＥについてのアミノ酸分析データ）

（表３）
（Ｐ−１５ペプチド処理ｅＰＴＦＥ移植片についてのアミノ酸分析の概要）

（３．インビトロ内皮細胞培養物を使用するＰ−１５ペプチドコーティングの生物学的活性）
バイオマテリアルと細胞との間の相互作用を試験するための共通の方法は、平坦な基材表面上に直接細胞を播種する工程ならびに細胞接着および増殖を観察する工程を包含する。しかし、多孔性かつ薄壁ｅＰＴＦＥ移植片材料は、非常に柔らかく、平坦さを維持することは困難である。播種の直後、細胞は、しばしば、より深いひだおよびへこみに濃縮されたままであった。この場合の細胞接着は、細胞と基材との間の相互作用ではなく、基材トポグラフィーの結果であった。基材トポグラフィーのこの効果を避けるためには、本発明者らは、細胞を、垂直に位置決めされたｅＰＴＦＥ移植片の底部に播種し、垂直上方に移動させた。さらに、ｅＰＴＦＥ移植片に沿う移動は、移植された脈管内移植片の２つの端部から内皮細胞の移動によりぴったりと対応した。

６日後および１３日後の、内皮細胞を含む培養物中の移植片のＳＥＭ分析は、細胞分布および細胞形態の有意な差を明らかにした。６日後、内皮細胞は、主にコントロールｅＰＴＦＥの底部にとどまり、一方で、これらは、ほとんど、Ｐ−１５処理ｅＰＴＦＥの頂部まで移動した。コントロールｅＰＴＦＥ上の内皮細胞は、よりまるみがあるように見えた。対照的に、細胞は、Ｐ−１５処理ｅＰＴＦＥに対して平坦に見えた。このより平坦な細胞形態は、より健康的な細胞に特徴的である。

培養１３日後、コントロールとＰ−１５処理との差は、より有意になった。低倍率（図７Ａおよび７Ｂ）で、高密度の内皮細胞集団を示す暗領域は、コントロール（図７Ａ）に対してより、Ｐ−１５処理移植片（図７Ｂ）に対しての方がより大きかった。移動性細胞を示す小さな暗スポットは、Ｐ−１５処理移植片に対して、高密度播種株からさらに広がった。個々の細胞の形態は、より高倍率および移動の末端でより良好に観察され得る（図８Ａおよび８Ｂ）。コントロール移植片上の細胞（図８Ａ）は、代表的にまるく、一方で、Ｐ−１５処理ｅＰＴＦＥ上の全ての細胞（図８Ｂ）は、平坦であり、より大きな範囲の多孔性のｅＰＴＦＥ表面を提供した。

培養１５日後、移植片上で増殖した細胞を、トリプシン処理によってはずし、計数した。コントロールに対してよりも、Ｐ−１５処理移植片に対して、約５倍多くの細胞が存在した。インビトロでの内皮細胞の分布、形態および数は、Ｐ−１５処理が、ｅＰＴＦＥ移植片に対する内皮管壁の形成に都合が良いことを示唆した。

（実施例３）
（基材処理）
（Ａ．血漿処理）
移植片（３ｍｍ ＩＤ；厚さ０．００３”；５０〜６０μｍ ＩＮＤ）を、アルゴンガスが流れる下で、プラズマノズルに取り付けて接着した（電力なし）。アルゴンガスを、２８〜３２ｓｃｆｈで、２０〜３０秒間、流し、次いで停止する。アルゴンガスおよび血漿を、電力（１１．５〜１４．５Ｖ；０．３５〜０．６５Ａ）を用いてに３０秒間程流す。血漿から移植片を取り出し、そして清潔な表面上に置く。次の工程の前に少なくとも５分間おく。

（Ｂ．クロロ酢酸活性化）
移植片を、５０ｍｌのポリプロピレン管の中に配置する。５ｍｌのＴＨＦを遠心管にピペットで取り、次いで４０ｍｌの新たに調製したクロロ酢酸（３Ｍ ＮａＯＨ中の１Ｍ Ｃｌ−Ｈａｃ）を添加する。この最終溶液を混合するために、手で揺さぶり、次いで室温で１６〜２４時間、プラットフォームシェイカーに配置する。全ての化学物質残留物を取り除くために移植片を徹底的に洗浄し、そして米国特許第６，１５９，５３１号（これは、参考として上で援用した）に記載のカルボジマイド化学を使用するペプチドコーティング工程に進む。

本発明は、特定の実施形態に関して記載されているが、本発明のから逸脱することなく種々の変化および改変がなされ得ることは、当業者に明白である。

図１は、本発明の方法を示すフローチャートである。 図２は、本発明の１つの実施形態に従う円筒状基材の内表面の処理を示す。 図３は、本発明の別の実施形態に従う平坦な基材の表面処理を示す。 図４は、本発明のなお別の実施形態に従う円筒状基材の外表面の処理を示す。 図５は、湿潤剤組成の関数としてＰ−１５濃度の変化を示す。 図６は、プラズマ活性化条件および組成の関数としてのＰ−１５濃度の変化を示す。 図７Ａ〜７Ｂは、培養１３日後のコントロール（７Ａ）および処理した（７Ｂ）ｅＰＴＦＥ移植片上の内皮細胞の移動の２０倍拡大写真を示す。 図８Ａ〜８Ｂは、培養１３日後のコントロール（８Ａ）および処理した（８Ｂ）ｅＰＴＦＥ移植片上の内皮細胞の移動の５００倍拡大写真を示す。

Claims (28)

1. 導電性管状基材を有しかつ選択された化学基の選択された表面密度を有するコーティングを該管状基材の表面に形成する医療用デバイスを形成する方法であって、該方法は、以下の工程：
   （ａ）該表面を、該導電性管状基材を第１の電極として使用し、該導電性管状基材に隣接して第２のプラズマ発生電極を配置することによって、大気圧または大気圧付近で形成されたプラズマで処理して、該表面上に１以上の活性種を形成する工程；
   （ｂ）該処理を連続して行って、該活性種の表面密度を増加させる工程；
   （ｃ）該処理した表面を選択された気体または液体に曝して、該活性種を安定な官能基に変換する、工程；および
   （ｄ）該曝された表面を、表面修飾基を該官能基に共有結合させるに有効な条件下で、該表面修飾基に接触させる工程、
   を包含する方法であって、
   ここで該表面上の該選択された化学基は、該安定な官能基であるか、または該安定な官能基に共有結合された該表面修飾基である、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記処理する工程は、前記管状基材の表面を通してまたは該表面に対して前記プラズマを流動させるか、または該プラズマで濃縮された半拘束空間内に該基材を維持することにより行われる、方法。
3. 請求項２に記載の方法であって、前記導電性管状基材に隣接して第２のプラズマ発生電極を配置することは、該導電性管状基材内に配置して、前記プラズマを、該基材の内表面に対して流動させることを包含する、方法。
4. 請求項２〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記プラズマは、キャリアガスと、酸素、水、アンモニア、水酸化アンモニウム、有機アミン、アルコール、アルデヒド、カルボン酸およびエステルからなる群より選択される、１０％未満の気体または蒸気とから形成される、方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記表面を、生体活性薬剤または生体適合性薬剤と接触させて、共有結合または非共有結合を介して該生体活性薬剤または生体適合性薬剤を該表面に結合する工程をさらに包含する、方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、前記生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、および核酸からなる群より選択され、各々は、分子または細胞の特異的部分および相補的部分に非共有結合的に結合され得る、方法。
7. 請求項５に記載の方法であって、前記生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、抗血栓因子、細胞接着因子、レセプター、リガンド、増殖因子、抗生物質、および酵素からなる群より選択される、方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、前記抗血栓因子は、ヘパリン、ヒルジン、リジン、プロスタグランジン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、およびプラスミノゲン活性化因子からなる群より選択される、方法。
9. 請求項７に記載の方法であって、前記細胞接着因子は、表面接着分子および細胞−細胞接着分子からなる群より選択される、方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、前記表面接着分子は、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、テネイシン、フィブリノゲン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、フォン・ビルブラント因子、および骨シアロタンパク質、ならびにそれらの活性ドメインからなる群より選択される、方法。
11. 請求項９に記載の方法であって、前記細胞−細胞接着分子は、Ｐ１５である、方法。
12. 請求項９に記載の方法であって、前記細胞−細胞接着分子は、Ｎ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリン、ならびにそれらの活性ドメインからなる群より選択される、方法。
13. 請求項７に記載の方法であって、前記増殖因子は、線維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子、血管内皮増殖因子、骨形態形成タンパク質、および神経成長因子からなる群より選択される、方法。
14. 請求項７に記載の方法であって、前記リガンドまたはレセプターは、抗体、抗原、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ヘパリン、ＩＶ型コラーゲン、プロテインＡ、およびプロテインＧからなる群より選択される、方法。
15. 請求項７に記載の方法であって、前記抗生物質は、抗生物質ペプチドからなる群より選択される、方法。
16. 請求項５に記載の方法であって、前記生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、酵素を含む、方法。
17. 請求項５に記載の方法であって、前記生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、相補的配列に選択的に結合し得る核酸配列を含む、方法。
18. 請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、前記生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、０．０１〜１０００ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の密度で前記表面に結合される、方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、前記生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、０．５〜３０ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の密度で前記表面に結合される、方法。
20. 請求項１８または１９に記載の方法であって、前記生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、２〜２０ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の密度で前記表面に結合される、方法。
21. 請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法であって、前記生体活性薬剤または生体適合性薬剤は、８〜１５ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の密度で前記表面に結合される、方法。
22. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記曝す工程は、前記表面を、全て気体形態にある空気、アンモニア、酸素、ならびに全て液体形態にある水、水酸化アンモニウム、およびヒドラジンからなる群より選択される物質と接触させる工程により行われる、方法。
23. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、前記表面修飾基は、無水物、アルコール、酸、アミン、エポキシ、イソシアネート、シラン、ハロゲン化基、および重合可能な基からなる群より選択される多官能性リンカーである、方法。
24. 請求項２３に記載の方法であって、前記多官能性リンカーは、ハロゲン化カルボン酸である、方法。
25. 請求項２４に記載の方法であって、前記ハロゲン化カルボン酸は、クロロ酢酸、クロロ酪酸、およびクロロ吉草酸からなる群より選択される、方法。
26. 請求項２３に記載の方法であって、前記多官能性リンカーは、その骨格中に２〜２０個の炭素原子を有する少なくとも１つの分子から構成される、方法。
27. 請求項２６に記載の方法であって、前記多官能性リンカーは、ヘテロ官能性分子から形成されるストリングである、方法。
28. 請求項２６に記載の方法であって、前記多官能性リンカーは、交互のホモ官能性分子から形成されるストリングである、方法。

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