CN107875446B - 金属材料表面共价接枝生物分子的方法及其产品和用途 - Google Patents

金属材料表面共价接枝生物分子的方法及其产品和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金属材料表面共价接枝生物分子的方法。首先在金属植入材料表面构建类金刚石薄膜，然后对薄膜进行活化，进而将材料浸入到含有促成骨功能的生物分子溶液中，即可将生物分子共价接枝在金属植入材料表面。另一方面，本发明技术操作简便，工艺简单，反应条件温和，可在常温下进行，效率高，成本低，可重复性好，后续清洗程序简单，并且不使用硅烷偶联剂及交联剂，不存在试剂残留风险，有利于工业化生产。因此，根据本发明的方法制备的产品在医用植入材料领域具有很高的应用前景。

Description

金属材料表面共价接枝生物分子的方法及其产品和用途
技术领域
本发明涉及医用金属材料的改性，具体涉及一种金属材料表面共价接枝生物分子的方法及其产品和用途。
背景技术
金属骨科植入材料因其良好的机械性能、耐蚀性以及优良的生物相容性，已在临床上广泛应用于人工关节、人工骨和牙科种植体等人体硬组织的修复、替代与再生。
植入体内的金属材料与机体骨组织在界面处良好的骨性结合是保证力学载荷稳定传递的前提，因此也是保证植入物长期、稳固地在人体行使功能的必要条件。虽然大多数金属植入材料都具有良好的生物相容性，但在体内仍表现为生物惰性而缺乏骨传导性和骨诱导能力，在人体内不能快速、有效地与骨组织形成牢固的骨性结合。
由于金属植入材料的生物学性能主要由其表面的物化性质所决定，对其进行表面改性可以在材料自身优点不受影响的前提下提高其生物学性能。
在众多表面改性方法中，对金属植入材料进行仿生化修饰，即将具有生物活性的大分子如蛋白质、多糖、多肽、细胞生长因子等，通过共价接枝的方式负载在材料表面，能够使其表面形成一个能与机体环境特异性相互作用的稳定的生物化过渡层，以进一步提高材料的生物学性能或者赋予其特殊的生物学功能[Xiao M,Chen Y M,Biao M N,et al.Bio-functionalization of biomedical metals.Materials Science and Engineering:C,2017,70:1057-1070]。因此，对金属植入材料进行仿生化修饰以提高其生物活性，使其与骨组织界面更快更好地进行骨整合，能够提高植入成功率，保证植入材料的使用效果及寿命。
通过对金属骨科植入材料进行表面仿生化修饰能够大大提高其生物学性能或者赋予其特殊的生物学功能。以往在金属材料表面想实现生物分子的接枝，一般通过硅烷偶联剂以化学交联(chemical crosslinking)的方式进行。然而硅烷偶联剂的使用不但存在化学试剂残留的风险，其本身带有的活性基团多含有氯、硅等元素和基团，会向材料表面过量引入元素和基团，植入体内后对人体造成伤害。另外，这种湿法化学交联技术很难同时在表面接枝多种生物活性分子，而顺序接枝多种生物分子又会使接枝过程极端繁琐甚至难以实现。
发明内容
本发明目的在于提供一种简单可行的在金属植入材料表面进行仿生化修饰的方法。本发明提供的改性方法在无需使用化学交联剂的情况下，仅需浸泡在含有生物分子的溶液中孵育一段时间，即可实现将具有生物活性的大分子共价接枝负载在金属植入材料表面，实现其仿生化表面修饰。
具体而言，本发明的目的在于提供一种基于乙炔(C2H2)气体等离子体浸没离子注入(Plasma immersion ion implantation，简称PIII)的处理方法，在医用金属植入材料表面构建类金刚石(Diamond-like Carbon，简称DLC)薄膜并进一步通过气体PIII处理引入活性自由基，进而实现生物活性分子的共价接枝改性。
本发明首先通过C2H2气体PIII在金属材料表面获得厚度为百微米的渐变过渡DLC薄膜，再通过气体PIII改性活化DLC薄膜表层，然后通过将改性后的表面浸入含有促成骨功能的生物分子溶液中并孵育一段时间以充分反应，即可将溶液中的生物分子共价接枝负载在材料表面，从而实现金属材料表面的生物分子修饰，并达到促成骨的功效。
因此，本发明的技术方案可分为三步：1.在金属植入材料表面构建类金刚石薄膜；2.利用等离子体浸没离子注入技术活化类金刚石薄膜；3.在含有生物分子溶液中的孵育以共价接枝生物分子。
金属植入材料表面类金刚石涂层的构建
金属植入材料表面类金刚石涂层的构建是通过乙炔气体等离子体浸没离子注入技术实现的。其工艺参数包括：本底真空度为0.01～0.6Pa，占空比为0.2％～0.5％，含乙炔气体的引入流量为10～200sccm(Standard Cubic Centimeter per Minute，标准状态毫升/分)，样品盘所加负偏压为5～30kV，注入脉宽为20～100微秒，注入脉冲频率为50～200Hz，产生等离子体的射频功率为100～300W，注入时间为30～180分钟。
优选地，通过等离子体浸没离子注入技术注入乙炔的工艺参数中的注入频率为80～120Hz；含乙炔气体的引入流量为20～100sccm。
通过等离子体浸没离子注入技术注入乙炔的工艺参数包括：本底真空度为0.3Pa，注入负偏压为12kV，注入脉宽为50微秒，注入脉冲频率为100Hz，射频功率为200W，注入时间为120分钟。
所述金属材料选自不锈钢、钴及其合金、钛及其合金、镍及其合金、镁及其合金。
根据该方法得到的类金刚石涂层的厚度为10-500微米，优选50-500微米。
类金刚石涂层的活化
在构建类金刚石涂层以后，利用气体等离子体浸没离子注入技术可以在类金刚石薄膜表层引入活性基团，即活化，为后续生物分子的接枝提供可能。气体等离子体浸没离子注入处理可以利用氩气、氮气、氨气、氧气等气体。气体等离子体浸没离子注入所使用的工艺参数包括：本底真空度为1×10-3～9×10-2Pa，气体引入流量为10～100sccm，样品盘所加负偏压为5～30kV，注入脉宽为20～200微秒，注入脉冲频率为50～500Hz，射频功率为100～1000W，注入时间为30～180分钟。
优选地，本底真空度为1×10-3～9×10-3Pa，气体引入流量为20～80sccm，样品盘所加负偏压为10～30kV。
含有生物分子溶液中的孵育
将以上经过两步PIII处理的试样浸入含有促成骨功能的生物分子溶液中并孵育一段时间，即可将溶液中含有的生物分子共价接枝在材料表面。生物分子的溶液为能够使生物分子保持活性的缓冲液体系，比如磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Solution，简称PBS)或生理盐水等；在含有生物分子的溶液中孵育的温度和时间需保证孵育期间生物分子能够保持生物活性，比如在含有生物分子的溶液中于4℃条件下保存12小时以上。
所述能够促进成骨功能的生物分子选自RGD多肽、骨钙素、骨钙蛋白、骨形态发生蛋白、成骨生长肽；优选骨形态发生蛋白-2。
所述生物分子的溶液的pH值在6.5-8.5之间，优选7.4。
并且本领域技术人员可以理解，可以通过在相应生物分子的共混合溶液中孵育一段时间来实现同时负载两种及以上的生物分子；也可以通过本发明的方法在金属材料的不同部位接枝不同的生物分子以实现材料的多功能化。
本发明的另一方面进一步涉及了根据上述方法制备得到的表面共价接枝生物分子的金属材料。所述金属材料具有三层结构，底层为金属材料层，其表面涂覆有一层类金刚石薄膜，该薄膜的的厚度为10-500微米，优选50-500微米。以及所述金刚石薄膜的外表面以共价连接的方式连接生物分子；所述生物分子优选前述具有促成骨功能的生物分子。
本发明的有益效果
本发明采用两步气体等离子体浸没离子注入技术处理金属骨科植入材料，在无需使用化学交联剂的情况下即可实现将具有促成骨功能的生物活性分子共价接枝负载在材料表面，实现其表面仿生化修饰。与现有技术相比，本发明具备以下优点：
1.以往金属材料表面想实现接枝，只能通过硅烷偶联剂实现，而硅烷偶联剂在使用过程中需要通过化学交联的方式连接到金属材料表面，存在化学试剂残留的风险。另外，硅烷偶联剂本身带有的活性基团多含有氯、硅等元素和基团，会向材料表面过量引入元素和基团，植入体内后对人体造成伤害。本发明以DLC涂层代替传统使用的硅烷偶联剂，DLC成分为人体大量含有的碳元素，可避免伤害。
2.本发明通过C2H2气体等离子体浸没离子注入的处理方式获得类金刚石薄膜渐变涂层。由于处理过程中存在离子的加速与注入作用，所获得的薄膜与基底结合力比单纯用等离子沉积的方式获得的类金刚石薄膜更强。
3.运用气体等离子体浸没离子注入技术对类金刚石薄膜进行活化，在其表层引入活性自由基，这些自由基能够长时间地存在于材料表层并不断扩散迁移。当活性自由基迁移到材料表面会与周围环境中的分子发生反应并将后者共价固定在材料上[Gao A,HangR,Li W,et al.Linker-free covalent immobilization of heparin,SDF-1α,and CD47on PTFE surface for antithrombogenicity,endothelialization and anti-inflammation.Biomaterials,2017,140:201-211.]。基于此原理，将经过活化的材料浸入到含有生物分子的溶液中，即可将溶液中的生物分子共价接枝在材料表面。本处理方法避免了毒性化学交联剂的使用，不存在试剂残留风险，同时操作简单方便，有利于其大批量、工业化生产。
4.本发明对接枝的生物分子无特殊要求。由于本发明基于以上所述特殊的生物分子接枝原理，对所接枝的生物分子无特殊要求，因此具有成骨促进功能的生物活性分子，如RGD多肽、骨钙素、骨钙蛋白、骨形态发生蛋白等，都可以通过本发明处理负载在材料表面，从而实现植入材料促进成骨的功能。
本发明提供的金属植入材料表面仿生化修饰方法在骨科植入材料、功能性材料、生物活性材料等领域具有广泛的应用前景，并且其工艺过程简单、成本低廉、适用于批量及工业化成产。
附图说明
图1a是实施例1中未构建类金刚石薄膜的纯钛表面的扫描电镜图。
图1b是实施例1中在纯钛表面经乙炔气体PIII注入技术构建类金刚石薄膜的表面扫描电镜图。
图2是纯钛(Pure Ti)及实施例1和2中构建类金刚石薄膜(DLC)后、以及气体等离子体浸没离子注入处理活化(DLC+N2和DLC+NH3)后表面的静态接触角结果。
图3是实施例3中，各处理表面在HRP溶液中孵育后，经受2％SDS洗脱以后其表面HRP的留存量。
图4是实施例4中，各处理表面在BMP-2溶液中孵育后，经受PBS洗脱或者2％SDS洗脱以后其表面BMP-2的负载量；其中“+”表示试样经受过2％SDS的洗脱，“-”表示试样未经受2％SDS的洗脱，而是经受PBS洗脱。
图5是实施例5中，小鼠前成骨细胞MC3T3-E1在各处理表面培养7天后细胞内碱性磷酸酶(ALP)的相对活性。
具体实施方式
下面以医用纯钛作为金属植入材料的代表证明本发明的可行性。
同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
将长宽高为50mm×50mm×2mm的纯钛(99.95％)经打磨抛光处理后，用氢氟酸混合液清洗去除表面污垢，然后用去离子水超声清洗干净，干燥备用。采用乙炔气体等离子体浸没离子注入技术，在钛片表面构建类金刚石薄膜，其具体的工艺参数为：基底真空度0.3Pa，产生等离子体的射频功率为200W，注入偏压-12kV，注入脉冲频率100Hz，脉冲持续时间50μs，通入乙炔和氩气的混合气，且乙炔/氩气气流比4:1sccm，处理时间120min。
通过扫描电子显微镜对构建DLC前后的纯钛表面进行观察，得到图1所示的表面微观形貌照片。由图可知，纯钛表面类金刚石薄膜的构建消除了原有的划痕等形貌，降低了材料的表面粗糙度。
实施例2
继续利用气体等离子体浸没离子注入技术，对实施例1中在纯钛表面构建的类金刚石薄膜进行活化处理。具体处理工艺为：所使用气体为氮气，本底真空度为5×10-3Pa，氮气的引入流量为30sccm，样品盘所加负偏压为15kV，注入脉宽为20微秒，注入脉冲频率为500Hz，产生等离子体的射频功率为1000W。注入处理时间为180分钟。
同时，活化处理可以采用其他气体或者参数。具体处理工艺为：所使用气体为氨气，本底真空度为5×10-3Pa，氨气引入流量为50sccm，样品盘所加负偏压为20kV，注入脉宽为50微秒，注入脉冲频率为200Hz，产生等离子体的射频功率为1000W，处理时间为180分钟。
采用静态水接触角测试仪(Rame’-Hart instrument)测试材料表面润湿性，通过注射器将5μL超纯水垂直慢速悬滴到样品表面，使用机器自带成像系统拍摄液滴照片并分析接触角大小。每组材料3片，在每个样品上取5个测量数据求平均值。
未处理的纯钛表面以Pure Ti标示；构建类金刚石薄膜后的表面以DLC标示；利用氮气等离子体浸没离子注入处理活化后的表面以DLC+N2标示；利用氨气等离子体浸没离子注入处理活化后的表面以DLC+NH3标示。
图2是实施例1及2中构建类金刚石薄膜以后，以及活化后表面的静态接触角实验图，横坐标为样品名称，纵坐标为接触角的度数。由图2可知，未经处理的纯钛表面的接触角为53°，构建类金刚石薄膜后接触角降至35°。利用氮气等离子体浸没离子注入处理后表面的接触角降至27°左右，而利用氨气等离子体浸没离子注入处理后的表面更加亲水，接触角进一步降至18°左右。
实施例3
利用辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,简称HRP)易显色的特性，我们选择HRP作为代表物来研究生物活性分子与等离子体浸没离子注入活化处理后表面的相互作用。将实施例2中改性处理后的各样品浸入到含有HRP的磷酸盐缓冲溶液(PhosphateBuffered Solution，简称PBS)中，并在4℃条件下保存12小时。其中HRP的浓度为50μg/mL。然后将试样从溶液中取出，用2％十二烷基硫酸钠(2％SDS)溶液洗脱试样1小时。然后将洗脱后的试样放入24孔细胞培养板，每孔添加500微升3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液并在室温中孵育3分钟，随后添加500微升2mol/L的盐酸溶液以终止反应。从每孔中取出200微升放入96孔培养板中并通过在酶标仪上测量其在450nm波长处的吸光度来反映各试样表面HRP的负载量。实验结果如图3所示，图中：横坐标为各试样名称，纵坐标为450nm下的吸光度(与HRP在试样表面的负载量呈正比)。
由图3可知，只有经过氮气或者氨气等离子体浸没离子注入活化处理以后的表面，才能仅通过浸泡孵育的方式有效地负载生物分子HRP，并且这种负载效果是能够经受住SDS溶液洗脱的。SDS是一种阴离子活性剂，能够破坏蛋白与材料之间物理吸附作用力。所以以上结果证明HRP在材料表面的负载是通过共价接枝的形式实现的。这种负载形式对于生物分子在材料表面的长期留存以及生物分子的活性都是很有帮助的。
实施例4
将实施例2中改性处理后的各样品浸入到含有骨形态发生蛋白-2(BoneMorphogenetic protein-2，简称BMP-2)的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate BufferedSolution，简称PBS)中，并在4℃条件下保存12小时。其中BMP-2的浓度为1μg/mL。然后将试样从溶液中取出，用不含BMP-2的PBS洗脱试样1小时，或者用2％十二烷基硫酸钠(2％SDS)溶液洗脱试样1小时。运用改良的酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay，简称ELISA)技术检测经过洗脱以后试样表面的BMP-2的量，得到图3所示结果。其中横坐标为样品名称，纵坐标为BMP-2的负载密度。“+”表示试样经受过2％SDS的洗脱，“-”表示试样未经受2％SDS的洗脱，而是经受PBS洗脱。
由图4可知，仅通过在BMP-2溶液中孵育的方式，未经处理的纯钛试样Pure Ti和类金刚石薄膜DLC试样都不能有效负载BMP-2，而明显有较大量的BMP-2负载在经过活化的DLC+N2试样表面。另一方面，SDS是一种阴离子活性剂，能够破坏蛋白与材料之间物理吸附作用力，而不能破坏它们之间的化学连接。由图3可知，接枝在DLC+N2试样表面的BMP-2能够经受2％SDS的洗脱，说明BMP-2与材料之间的相互作用是化学键的连接，也就是证明BMP-2是以共价接枝的方式负载在材料表面的。
实施例5
通过在各处理表面接种、培养细胞并检测细胞的成骨分化趋势，评价各处理表面在体内对成骨的促进作用。本实验采用小鼠前成骨细胞MC3T3-E1，接种密度为2×104cells/cm2.在培养7天以后，取出试样并裂解试样上的细胞，运用商用试剂盒检测细胞裂解液中碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，简称ALP)的活性。由于碱性磷酸酶是细胞成骨分化的标志，在负载BMP-2的材料表面培养的细胞碱性磷酸酶的活性显著比其他处理组高(图5)，说明BMP-2的负载显著提高了材料的生物活性，具有促进金属植入材料成骨功能的潜能。
本领域技术人员可以理解，由于利用本发明在金属植入材料表面所构建的类金刚石涂层是一个包裹在材料表面的连续的涂层，因此使用不同的金属作为基底的情况下，处理后的效果基本无太大差别。除了金属本身的静态接触角会有所不同以外，其他处理后材料的接触角也不会有很大差异。因此根据本发明的方法可以广泛应用于金属材料的表面修饰。

Claims (6)

1.一种金属材料表面共价接枝生物分子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）采用气体等离子体浸没离子注入法（PIII）通过含乙炔的气体在金属材料表面涂覆类金刚石（DLC）薄膜；
2）采用PIII在DLC薄膜表层引入活性基团；
3）将处理过的金属材料在含有生物分子的溶液中进行孵育；
所述生物分子选自RGD多肽、骨钙素、骨钙蛋白、骨形态发生蛋白、成骨生长肽；
所述步骤2）中PIII所使用的气体选自氩气、氮气、氨气、氧气、氢气；
所述金属材料选自不锈钢、钴及其合金、钛及其合金、镍及其合金、镁及其合金。
2.根据权利要求1所述的一种金属材料表面共价接枝生物分子的方法，其特征在于，所述生物分子选自骨形态发生蛋白-2。
3.根据权利要求1或2所述的一种金属材料表面共价接枝生物分子的方法，其特征在于，所述步骤1）中在金属材料表面涂覆DLC薄膜的方法工艺包括：本底真空度为0.01 ~ 0.6Pa，占空比为0.2% ~ 0.5%，含乙炔气体的引入流量为10 ~ 200 sccm，样品盘所加负偏压为5 ~ 30 kV，注入脉宽为20 ~ 100微秒，注入脉冲频率为50 ~ 200 Hz，产生等离子体的射频功率为100 ~ 300 W，注入时间为30 ~ 180分钟。
4.根据权利要求1所述的一种金属材料表面共价接枝生物分子的方法，其特征在于，所述含有生物分子的溶液为溶解了生物分子并能使其保持活性的缓冲液体系，在含有生物分子的溶液中孵育的温度和时间需保证孵育期间生物分子能够保持生物活性。
5.一种表面共价接枝生物分子的金属材料，其特征在于，所述金属材料的表面涂覆有一层类金刚石薄膜，并且所述类金刚石薄膜的外表面以共价连接的方式连接生物分子；所述生物分子选自RGD多肽、骨钙素、骨钙蛋白、骨形态发生蛋白、成骨生长肽；所述金属材料选自不锈钢、钴及其合金、钛及其合金、镍及其合金、镁及其合金；以及，所述金属材料是根据权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的。
6.权利要求5所述的一种表面共价接枝生物分子的金属材料在医用植入材料或医疗器械中的用途。
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