JP4281947B2 - ガストロカインおよびインヒビターによる、胃腸組織の増殖および修復の調節 - Google Patents
ガストロカインおよびインヒビターによる、胃腸組織の増殖および修復の調節 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4281947B2 JP4281947B2 JP2002576908A JP2002576908A JP4281947B2 JP 4281947 B2 JP4281947 B2 JP 4281947B2 JP 2002576908 A JP2002576908 A JP 2002576908A JP 2002576908 A JP2002576908 A JP 2002576908A JP 4281947 B2 JP4281947 B2 JP 4281947B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- peptide
- cells
- seq
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 title claims abstract description 64
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 title abstract 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 title abstract 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 314
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 222
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 200
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 188
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 38
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 23
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 22
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 21
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 17
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 9
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 9
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 claims description 3
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 claims 1
- 101710205777 Gastrokine-1 Proteins 0.000 abstract description 163
- 102100035965 Gastrokine-1 Human genes 0.000 abstract description 161
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 93
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 74
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 73
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 55
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 27
- 210000004203 pyloric antrum Anatomy 0.000 abstract description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 7
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 182
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 69
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 55
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 54
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 54
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 43
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 43
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 39
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 36
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 35
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 33
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 28
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 28
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 25
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 25
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 25
- BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N benzocaine Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 230000006870 function Effects 0.000 description 22
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 17
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 16
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 16
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 16
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 15
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 15
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 101001075218 Homo sapiens Gastrokine-1 Proteins 0.000 description 14
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 14
- 102000049676 human GKN1 Human genes 0.000 description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 11
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 11
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000003940 Occludin Human genes 0.000 description 9
- 108090000304 Occludin Proteins 0.000 description 9
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 9
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 8
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 1-(2-azaniumylacetyl)pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101100383179 Arabidopsis thaliana CDS5 gene Proteins 0.000 description 7
- 101000980996 Arabidopsis thaliana Phosphatidate cytidylyltransferase 3 Proteins 0.000 description 7
- 101000980998 Arabidopsis thaliana Phosphatidate cytidylyltransferase 4, chloroplastic Proteins 0.000 description 7
- 101000623713 Homo sapiens Motile sperm domain-containing protein 3 Proteins 0.000 description 7
- 102100023091 Motile sperm domain-containing protein 3 Human genes 0.000 description 7
- 102100033126 Phosphatidate cytidylyltransferase 2 Human genes 0.000 description 7
- 101710178746 Phosphatidate cytidylyltransferase 2 Proteins 0.000 description 7
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 7
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 7
- 108010007389 Trefoil Factors Proteins 0.000 description 7
- 102000007641 Trefoil Factors Human genes 0.000 description 7
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 7
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 7
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 7
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 6
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 6
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 6
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 6
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 5
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 5
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 4
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 4
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 4
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003100 Magainin Proteins 0.000 description 3
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 102000018568 alpha-Defensin Human genes 0.000 description 3
- 108050007802 alpha-defensin Proteins 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 108010017357 cryptdin 3 Proteins 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 3
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 3
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 3
- 101710194912 18 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 2
- 102100034808 CCAAT/enhancer-binding protein alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710124086 Envelope protein UL45 Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- 101000945515 Homo sapiens CCAAT/enhancer-binding protein alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 2
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 2
- 230000008952 bacterial invasion Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 2
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 2
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000008556 epithelial cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000004783 epithelial tight junction Anatomy 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=CC(O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FJACZYDXMHRUJF-WCCKRBBISA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical group NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H]1CCCN1 FJACZYDXMHRUJF-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004162 Claudin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000600 Claudin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004056 Claudin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000580 Claudin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004057 Claudin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000582 Claudin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101000876610 Dictyostelium discoideum Extracellular signal-regulated kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 102000000579 Epigen Human genes 0.000 description 1
- 108010016906 Epigen Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 102000034354 Gi proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006101 Gi proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101001052493 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000785523 Homo sapiens Tight junction protein ZO-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100395023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 102000000395 SH3 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008861 SH3 domains Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100026637 Tight junction protein ZO-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004922 colonic epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000007821 culture assay Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- 210000003104 cytoplasmic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000010393 epithelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 1
- 201000006972 gastroesophageal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007661 gastrointestinal function Effects 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 1
- 230000004677 mucosal permeability Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000000263 nonmitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000035409 positive regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 210000001187 pylorus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
胃幽門洞粘膜タンパク質の新規グループであるガストロカイン(gastrokine)が特徴付けられる。ガストロカイングループの1つのメンバーは、AMP−18と呼ばれる。AMP−18ゲノムDNA、およびcDNA分子は、ヒトおよびマウスで配列決定され、そしてタンパク質配列がヌクレオチド配列から予測される。ブタAMP−18のcDNA分子が配列決定され、そして天然タンパク質の部分的配列決定によって確認される。AMP−18タンパク質およびその配列から得られる活性ペプチドは、細胞増殖因子である。驚くべきことに、完全なタンパク質の効果を阻害し得るペプチドも、AMP−18タンパク質配列から得られる。哺乳動物胃腸組織の増殖および修復の調節は、そのタンパク質またはペプチドの使用によって促進され、そのタンパク質および誘導ペプチドは治療の候補となる。
幽門洞粘膜タンパク質18(「AMP−18」)と呼ばれる新規遺伝子産物は、ガストロカインである。そのタンパク質は、ヒト、ブタ、およびマウスから得られたcDNAクローンの分析によって、胃幽門洞粘膜細胞で発見された。そのタンパク質は細胞増殖因子またはサイトカイン、より具体的にはガストロカインのグループのメンバーである。AMP−18cDNA配列は、ブタおよびヒトの両方で、長さが185アミノ酸のタンパク質を予測する。ヌクレオチド配列はまた、分泌タンパク質のための20アミノ酸のN−末端シグナル配列を予測する。前駆体(プレAMP−18)からのこのN−末端ペプチドの切断は、ブタタンパク質で確認された;この切断は長さが165アミノ酸、そして大きさが約18,000ダルトン(18kD)の分泌タンパク質を産生する。ヒトおよびマウスゲノムDNA配列も得られ、そして配列決定された。ヒトゲノムDNAは、大きさがそれぞれ1.6kb、3kb、3.3kb、および1.1kbの4つの互いに重なる断片で単離された。マウスゲノムDNA配列は、単一のBACクローンで単離された。
(a)アミノ酸置換または欠失によって、未修飾ペプチドアミノ酸配列の主要なプロテアーゼ部位を排除する;および/または
(b)未修飾ペプチド中のアミノ酸の修飾アミノ酸アナログを導入する。
(a)図2に示したような配列を有する単離cDNA分子を得る;
(b)組換えDNA発現ベクターにその分子を配置する;
(c)組換えDNA発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする;
(d)トランスフェクトされた宿主細胞がcDNA分子によってコードされるタンパク質を産生するのを可能にする環境条件を提供する;および
(e)宿主細胞からタンパク質を精製する。
(a)上皮細胞を、ガストロカインタンパク質またはそのグループのタンパク質から得られたペプチドを含む組成物と接触させる;および
(b)上皮細胞の増殖を刺激する環境条件を提供する。
(a)タンパク質をインヒビターと接触させる;および
(b)タンパク質の細胞増殖刺激活性に適当な環境条件を提供する。
(a)不活性なまたは空白のガストロカインタンパク質を有するマウスを得る;
(b)マウスにおけるタンパク質の欠如の影響を決定する;
(c)マウスに増加するレベルのタンパク質を投与する;および
(d)胃腸管上皮の変化を、上皮中のタンパク質レベルと関連付ける。
(a)上皮細胞を、タンパク質から得られたペプチドを含む組成物と接触させる;および
(b)上皮細胞の遊走を可能にする環境条件を提供する。
(a)損傷した上皮細胞を、ガストロカイングループのタンパク質またはタンパク質から得られたペプチドを含む組成物と接触させる;および
(b)上皮細胞の修復を可能にする環境条件を提供する。
(1.概要)
新規遺伝子産物、ガストロカイングループのメンバーを、ブタ胃の異なる領域から得たcDNAライブラリーの差次的スクリーニングによって、哺乳動物の胃幽門洞粘膜において検出した。cDNA配列は、シグナルペプチドリーダー配列を含む185アミノ酸のタンパク質を予測した。cDNAをヒトライブラリーからも単離した。ブタおよびヒト間の、予測されたアミノ酸配列同一性は76.3%である。その配列は、分泌タンパク質に特徴的な20アミノ酸のシグナルペプチドを予測した。このN−末端シグナルペプチドの切断は、ブタタンパク質で確認された。細菌で発現したヒトcDNAの産物に対する抗体を、ウサギで産生した;これらの抗体は、試験した全ての哺乳動物種(ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラットおよびマウス)の18−20kD幽門洞抗原と反応した。mRNAレベルと一致して、AMP−18タンパク質は、胃幽門洞においてのみ高レベルに発現する;胃の残りの部分または十二指腸ではほとんど検出されず、そして様々な他の試験した組織では検出されなかった。AMP−18は、管腔表面粘膜細胞で合成される;免疫電子顕微鏡検査は、これらの細胞の分泌顆粒中にAMP−18の位置を突きとめる。マウスおよびブタの幽門洞組織由来の部分的に精製されたAMP−18調製物は、培養細胞においてコンフルエントな胃および腎臓上皮細胞に対して分裂促進性である;この効果は、特異的抗血清によって阻害され、AMP−18、すなわちその産物は増殖因子であることを意味する。
AMP−18アミノ酸配列の中央領域に相当する合成ペプチド(42アミノ酸、「42マー」)も、増殖因子活性を有し、それは特異的抗血清によって阻害される;いくつかの関連するより短いペプチドも刺激活性を有するが、他は42マーの活性を阻害し得る。この結果は、飽和可能な上皮レセプターがAMP−18のために存在し、そしてタンパク質の生物活性領域を分析し、そして推定レセプターを同定する直接的な道を開く。AMP−18は、公知のサイトカインまたは細胞保護タンパク質(トレフォイルペプチドのような)のいずれとも構造が類似していないので、タンパク質、ならびにその活性および阻害性の関連ペプチドの、細胞との相互作用の分析は、細胞増殖調節に関与する新規分子相互作用を明らかにする機会を提供する。
マウスまたはブタ幽門洞細胞抽出物によって刺激された上皮細胞の増殖は、完全、組換えヒトAMP−18前駆体タンパク質に対するウサギ抗血清によって阻害された;BSC−1細胞のコンフルエントな培養物を調製した;マウスまたはブタの幽門洞細胞抽出物を調製し、そしてそのタンパク質濃度を測定した;細胞抽出物単独および異なる希釈の抗血清、または抗血清単独(1:100希釈)を培養培地に加え、そして細胞数を4日後に計測した。マウス幽門洞ガストロカインによる増殖刺激は、1:400の希釈の抗血清によって最大阻害され(93%)、一方ブタ幽門洞タンパク質抽出物による刺激は1:100の希釈で完全に阻害された。記録した値は3つの培養の平均であった;平均の標準誤差(SE)は平均の10%より低かった。
おそらく遺伝子が活性であり得る組織における遺伝子発現レベルの大きな違いを決定する、遺伝子調節エレメントの分析に対する前置きとして、ゲノムAMP−18DNA配列が、ヒトおよびマウスでクローニングされた。上流および下流側面配列を、遺伝子ノックアウトの準備としてマウスゲノムDNAから単離した。側面ゲノム配列が、おそらく胃およびそれが発現し得る少数の他の組織における非常に異なる遺伝子発現レベルを決定する。異なる調節エレメントの関与によって、ガストロカイン遺伝子は他の組織において増殖因子として発現され得る。
AMP−18タンパク質およびそれ由来のあるペプチドは、胃および腸上皮細胞(および腎臓)による増殖および創傷修復を刺激し得るので、これらのガストロカイン分子は、薬剤学的介入、放射線治療、または手術の後の損傷されたGI管の修復を速める治療的薬剤の候補である。それに加えて、ガストロカインに対して発達させた抗体を、多様な病理学的状態における血液組織のAMP−18タンパク質またはペプチドのレベルを測定するためにキットで使用し得る。これらの新規分子は、胃潰瘍、および炎症性腸疾患の治療において大きな治療的可能性を有し、一方その機能を阻害する新規薬剤は、GI管の癌の治療に有用であることを示し得る。
ヒトAMP−18タンパク質に対する抗血清を使用して、ブタ幽門洞粘膜の抽出物からタンパク質を精製するのを補助した。全組織抽出物に適用した免疫親和性方法はあまり効果的でないことが判明したが、細胞画分をモニターするためのイムノブロット、勾配遠心分離およびゲル電気泳動を使用することによって、十分な量のブタ18kDaポリペプチドを精製して、天然N−末端は、シグナルペプチドの除去のために正確に予測されるアラニン−アスパラギン酸部位における、ORFのN−末端からの20アミノ酸の切断によって予測されるものであることを、配列決定によって確認した。成熟タンパク質におけるアスパラギン残基が豊富さにもかかわらず、糖鎖付加に特徴的なコンセンサスな状況に合うものは存在しない。タンパク質のかなり長い領域が、両親媒性ヘリックス(helix)形成傾向を有し得る。後者は、処理後に生物活性ペプチドを産生するタンパク質内のユニットに相当し得る。円二色性を用いて、ヒトプレAMP配列(図3)のアミノ酸126−143に相当する合成ペプチドは、マガイニン型の抗菌ペプチドを含むいくつかの生物活性ペプチドのヘリックス傾向を評価するために使用される、中程度のトリフルオロエタノール濃度の条件で、容易にヘリックスになるよう誘導される(例えばParkら、1997を参照のこと)。
20アミノ酸の疎水性シグナルペプチド配列を、6ヒスチジン残基のスターチ(starch)を含むN−末端12アミノ酸ペプチドで置換した、ヒトAMP−18をコードするcDNAを設計した(図13、左のパネル)。この改変cDNA配列の発現は、His−6タグ(配列番号16)に結合するNi−NTA樹脂を用いて容易に精製し得る177アミノ酸タンパク質産物(Mr19,653)を産生することが予測された。N−末端シグナルペプチドをコードする領域を欠くcDNA配列(図14を参照のこと)を、QE30発現ベクター(QIAGEN)のBamHI部位へ産物を挿入する適当なリンカーを提供するオリゴヌクレオチドを用いて、PCRによって増幅した;組換えベクターの配列を確認した。His−6タグ(配列番号16)で操作した組換えヒト(rh)AMP−18を、続いてE.coli細胞で発現した。それを回収するために、細菌を溶解し、そして可溶性および不溶性画分のアリコートをSDS−PAGEにかけ、その後rhAMP−18前駆体に対する特異的ウサギ抗血清を用いてイムノブロットを行なった。発現したタンパク質は、溶解物の可溶性画分にはほとんど検出されなかった。
AMP−18に反応する胃および腸細胞の能力を特徴付けるために、AGS胃腺癌細胞、SV40ラージT抗原で形質転換したHAEヒト胃幽門洞粘膜初代培養物、IEC−6(図15)およびIEC−18系統のラット二倍体小腸上皮細胞、NCIN−87胃癌腫細胞、およびSK−GT5胃食道腺癌細胞を研究した;ヒトWI−38線維芽細胞およびHeLa細胞を非GIコントロール細胞系統として扱った。細胞を目的の薬剤に曝露して3〜4日後に細胞数計測を行ない、単一細胞を調製するために培養をトリプシン処理し、そして血球計算器でそれらを計測しながらこれを確認することによって、分裂促進をアッセイした。
細胞表面におけるAMPペプチドおよびその結合部位の間の相互作用についてさらなる情報を得るために、非形質転換ラットIEC−18細胞を研究した。非分裂促進性ペプチド67−85の濃度を徐々に増加させることは、もしこの分裂促進性42マーがレセプターによるメカニズムによってその効果を発揮するならば、ペプチド58−99による増殖刺激を阻害する。3日間のアッセイで、ペプチド58−99は、ビヒクルによる290%と比較して、細胞数の407%の増加を刺激した。ペプチド67−85の濃度を約0.1μg/mlまで徐々に増加させると、ペプチド58−99の増殖刺激効果はほとんど消失した(図17)。この結果は、その2つのペプチドは同じ表面「レセプター」部位に対して競合することを示唆する。
進行中の研究は、AMP−18前駆体に対するウサギ抗血清は、イムノブロットでrhAMP−18を認識することを明らかにする。その抗血清はまた、ブタ幽門洞組織抽出物(図11)およびAMPペプチド58−99の分裂促進効果も阻害し、そしてヒトおよびマウスの胃幽門洞組織の細胞においてAMP−18を免疫学的局在決定する。図18は、抗血清がIEC−18細胞のコンフルエントな培養物において、rhAMP−18の分裂促進効果を中和化することを示し、それによってネイティブなタンパク質と同様に組換え体を研究するためにその有用性を広げる。
図19に示したデータは、分裂促進効果が細胞数の増加によって検出され得る前の時間、AMPペプチドへの曝露の24から48時間後に得られた。その結果は、AMPペプチドが引っかき傷をつけたHAE系統のヒト胃腺癌由来の細胞、およびIEC−18系統の非形質転換ラット腸細胞における回復を刺激することを示す。従ってAMPペプチドは、培養物中で胃および腸の上皮細胞の回復を迅速に刺激し、そしておそらくインビボで損傷した胃粘膜の再舗装(resurface)を速め得る。
AMP−18の生理学的効果は特異的であり、そしてレセプター媒介性であるという証拠を得るために、AMPペプチドを試験して、それがGI上皮細胞においてチロシンリン酸化を誘導するかどうかをみた。
バリア機能の維持は、胃管腔から外来性の抗原および細菌の侵入を防ぐために、および電解質、水および栄養素の特定の方向への輸送のような他の機能のために必要不可欠である。単独でまたは他の薬剤と協同で作用して、AMP−18は粘膜損傷後の迅速なバリア機能の復帰を媒介し得る。AMPペプチド77−97がバリア機能の発達を促進し得るかどうか、および反応性酸素代謝物、インドメタシン、またはデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)が、粘膜の透過性を増加させ、そして上皮密着結合を維持するために必要な細胞の完全さを傷つけた場合に、機能の損失を防止する細胞保護剤として作用し得るかどうかを決定するために、上皮密着結合のマーカーとして比較的高い値のTERを示すことが知られている細胞系統を使用した。最初に、ペプチド77−97は、よく特徴づけされた、非形質転換MDCK細胞の単層培養においてTERの成熟を調節する。図20は、ペプチドへの曝露は、24時間までに、そしてその後より高い程度まで単層におけるTERを増加させることを示す。この観察は、AMP−18またはAMPペプチドが損傷後のGI上皮の回復を速め、そしてバリア機能の発達を増強し得ることを示唆する。
AMPペプチドの、インビボで大腸炎において細胞保護効果を発揮する潜在的な能力を評価するために、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の溶液を、結腸上皮のモデルに使用したC2細胞単層の培養培地に加えた。バリア機能のDSS媒介損傷を、これらの単層培養におけるTERを測定することによって定量した。図22は、DSS(4%)が45分後にTERをコントロール値の約30%に抑制したこと、そしてAMPペプチドが細胞保護的であったことを示す。この観察は、AMPペプチドを、DSS媒介大腸炎のマウスモデルにおいて治療薬として評価する、強力な生理学的原理を提供する。
図21Bは、AMPペプチド77−97が、酸化損傷後のCaco2/bbe(C2)細胞における経上皮電気抵抗(TER)の減少を鈍らせることを示す。そのペプチドがどのようにその細胞保護効果を発揮するのか調査するために、C2細胞単層を、AMPペプチドで処理し、そして18時間後にモノクロラミンで酸化損傷を誘発した。特異的密着接合(TJ)タンパク質のレベルの変化をチェックした。細胞を溶解し、そして不溶性/微粒子画分のタンパク質を、イムノブロッティングによって研究した。図23は、0時、および酸化剤誘発損傷の60分後において、ビヒクルで処理した細胞よりもAMPペプチドで処理した細胞においてより多くの免疫反応性ZO−1およびオクルディンが存在することを示し、これらTJタンパク質がより豊富にあり、それによって単層におけるTERの損失を鈍らせ、そしてバリア機能を保持することを示唆する。これらの観察は、AMPペプチドは、細胞が酸化損傷を受ける前の18時間にTJタンパク質の蓄積を増強したことを示した。非損傷細胞を研究し、そしてAMPペプチド(またはrhAMP−18)は、未処理細胞と比較して、免疫反応性ZO−1およびオクルディンの量を迅速に増加させたことを示した(図24)。これらの変化は、いくつかの他のTJタンパク質(ZO−2、クローディン−1、クローディン−2、クローディン−5)または熱ショックタンパク質(HSC)73で観察されなかったので、ZO−1およびオクルディンに比較的特異的なようである。
十分な量の精製rhAMP−18を調製して、モノクロラミン媒介酸化損傷後のCaco2/bbe(C2)細胞における経上皮電気抵抗(TER)の減少を鈍らせたAMPペプチド77−97と比較して、rhAMP−18が細胞保護的であるかどうかを試験した(図21B)。図25は、モノクロラミンへの曝露が、45分でTERを約35%に抑制し、一方rhAMP−18またはペプチド77−97で前処理した細胞が約10%のTERの減少しか示さなかったことを示す。図26は、8時間のrhAMP−18によるC2細胞の処理が、ビヒクルで処理した細胞と比較して、免疫反応性ZO−1およびオクルディンの量を増加させることを示す。これらの結果は、AMP−18はその細胞保護効果を、特異的TJタンパク質の蓄積を増強することによって媒介し得、そしてそれによって粘膜損傷後のGI管に沿ったバリア機能を保持し得ることを示唆する。
AMPペプチドの治療的有効性を評価するために、マウス(各12−15グラム)に飲料水中3%のDSS(Mr36−44kDa)を与えることによって、DSS大腸炎をC57/BL6オスマウスで誘発した。大腸炎の証拠(糞中の血液)は、早くて1日目に(図27、左のパネル)、そして4日目までに全ての動物で見出された。毎日皮下(s.c.)注射によって投与されたAMPペプチドは、潜血(hemoccult)−陽性糞の出現を遅らせ、そしてまた体重減少の程度も抑制した(図27、右のパネル)。これらの肯定的な発見は、大腸炎およびGI管の粘膜表面を傷つける他の疾患における有用な治療薬としてのAMPペプチドを強力に支持する。
(1.幽門洞特異的cDNAクローンの単離)
胃酸分泌ならびに粘膜および膵臓細胞の増殖を調節する(Yooら、1982)胃腸(GI)ペプチドガストリンのcDNAクローンを単離した。これらのスクリーニングから、胃の幽門洞において比較的特異的に発現されるいくつかの他のmRNAを発見した。これらRNAの1つにおけるオープンリーディングフレーム(ORF)は、ブタおよびヒトの間で高度に保存されており、そしてすぐに明らかな機能を持たない新規保存タンパク質を予測した。特異的抗体を使用して、同様のタンパク質種が、試験した全ての哺乳動物の胃幽門洞粘膜に存在することを示した。これらの配列の発現に組織特異性が存在し、そしてそれらは明らかに哺乳動物種の幽門洞粘膜に普遍的に存在する。
cDNAクローンの単離が、胃幽門洞の粘膜における選択的な発現について予測され、そしてこれは、最初にcDNA配列でプローブした様々な組織由来のRNAのノーザンブロットハイブリダイゼーションによって、そして続いてタンパク質分析によって確認された。ノーザンブロットは、ブタの胃腸管内におけるmRNA発現の特異性を示した。最も高いmRNA発現は、幽門洞粘膜であり、隣接する体の粘膜では変動する量、そして底、食道および十二指腸では検出不可能なレベルであった。幽門洞および体の非粘膜組織は、cDNAプローブに反応するRNAをほとんど含んでいなかった。
ヒトおよびブタcDNAクローンのオープンリーディングフレーム(ORF)は、非常によく似た比較的低分子量(MW)のタンパク質を予測し、それはコンピューターデータベースの公知のタンパク質と近いホモログを有さず、そして従って可能性のある機能についてほとんど示さない。推定タンパク質の生物学的役割を研究するアプローチとして、N−末端His6タグ(配列番号16)もコードするベクターを用いて、全cDNA配列をE.coliで発現させた。不運なことに、細菌で発現した場合、そのポリペプチド産物は不溶性であり、そして生化学的研究のために容易に分析できない。しかし、ヒトcDNAの細菌産物を、抗血清を誘発するためにウサギで免疫原として使用したドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲルで分離した。その血清を、多くの哺乳動物種由来の幽門洞組織のタンパク質抽出物に対してスクリーニングした。この手順は、免疫原と試験した哺乳動物の幽門洞に発現する約18kDaのタンパク質とのどちらも認識し得る、いくつかの高力価、低バックグラウンドの抗血清を産生するのに成功した。細菌で発現したタンパク質は、シグナルペプチド配列およびHis6タグ(配列番号16)を含むので、よりゆっくり移動する。免疫前血清は、有意な18kDa反応性を示さなかった。ヒトcDNAクローンから発現したタンパク質に対して産生された抗血清の、様々な哺乳動物(ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラットおよびマウス;最後はSDSゲルにおいて常にわずかにより速く移動する)由来の幽門洞抽出物の非常によく似たMWのタンパク質との交差反応性は、ヒトおよびブタcDNAのORFの比較によって予測されたアミノ酸配列の保存のレベルを支持する(図10を参照のこと)。続く実験において、シグナルペプチドを有するヒトAMP−18を細菌で産生した。
全RNAを電気泳動し、膜に移動させてそして標識したブタAMP−18cDNAプローブとハイブリダイズした。各レーンのRNA試料の供給源は以下の通りである:1.遠位十二指腸;2.近位十二指腸;3.幽門洞;4.隣接する体;5.底;6.食道。等量のRNAを負荷した。幽門洞に隣接する体のRNAからのシグナルは変動した。サイズマーカー(ヌクレオチド)を、比較のために同じゲルに流した。
全組織タンパク質を、SDS緩衝液に溶解し、電気泳動し、そして膜に移動させて免疫血清(1:50000)と反応させた。結合した抗体分子を、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を用いて検出した。免疫前血清は、1:200希釈で同時に行なったブロットの特異的染色を与えなかった。レーン:1、6、13、17はマーカーを含んでいた。2HeLa細胞。3マウスTLT細胞。4発現ヒトタンパク質+HeLa細胞。7マウス体。8マウス幽門洞。9マウス十二指腸。10マウス腸。11マウス肝臓。12発現ヒトタンパク質+TLT細胞。14マウス幽門洞。15マウス脳。16マウス腎臓。18ブタ幽門洞。19マウス幽門洞。
ヒトおよびブタの予測アミノ酸配列は76%同一である。予測されるシグナルペプチドは目立たない;天然ブタAMPのN−末端は、アスパラギン酸であることが示された(図10)。
ヒトおよびブタcDNAのORFは、同様の一般的構造を有するポリペプチドを予測した(図10)。他に未修飾のヒトおよびブタタンパク質の予測される分子量は、それぞれ18.3および18.0であった;これらの値は、本発明の抗血清と反応する幽門洞タンパク質のSDSにおける電気泳動移動度とよく一致する。
AMP−18に対する抗血清は、マウス幽門洞領域の切片と強力に反応するが底、十二指腸、または腸と反応せず、優れた組織化学的プローブであることが証明され、イムノブロットの結果を確認した。免疫前血清はより高い濃度ででもわずかな反応を与える。AMP−18タンパク質は、胃管腔を裏打ちする粘膜上皮細胞に集中しているようであるが、組織のより深部の細胞および上部陰窩領域におけるより少ないシグナルは、細胞が、管腔層に向けて移動するにつれてタンパク質を発現し始め得ることを示唆する。組織化学的調製物のより高い倍率は、このレベルの解像度では、一般的な細胞質染色しか示さない;光学顕微鏡の、電子顕微鏡(EM)によって見られるいくつかの管腔表面細胞の顆粒が詰まった領域と同じものであり得る、強力な染色のパッチがいくつか存在する。従って幽門洞粘膜におけるAMP−18の局在は、粘膜層の深部にあるガストリンを合成する細胞とは非常に異なっている。
組織片を4%のホルムアルデヒドで固定し、そしてUnicrylにおける包埋のために処理した。薄片をウサギ抗ヒトAMP−18抗血清(1:200)と反応させた;結合した抗体を、10nmの金コロイドに結合したプロテインAによって検出した。反応した切片を見る(20,000×)前にクエン酸鉛で染色した。金粒子は半透明の分泌顆粒の上に見え、それは免疫反応性の必要条件のために、標準的なグルタルアルデヒド−オスミウム−エポン(epon)手順(11,400×)よりもここで半透明であるようであった。他の細胞質構造に対してわずかなバックグラウンドが見えた。
AMP−18の機能は、それが幽門洞およびおそらく胃の他の場所における機能的粘膜上皮の維持を少なくとも部分的に司る増殖因子であるということである。最初に、胃上皮細胞系統はすぐに入手可能でなかったが、腎臓上皮細胞システム(Karthaら、1992;Aithalら、1994;Lieskeら、1994)を使用した。分画した幽門洞粘膜細胞抽出物を、これらの実験のために使用した。分画をフォローするためにプローブとしてイムノブロッティングを使用して、ブタまたはマウス幽門洞のいずれかからけずった粘膜細胞の溶解時に、AMP−18抗原はスクロース密度勾配の35S画分に回収された。そのような高速上清画分が、細胞増殖に関する研究のための開始材料となった。予期しないことに、これらの抽出物は、コンフルエントなサルの腎臓上皮細胞(BSC−1細胞)において50%の増加を刺激したが、HeLaまたはWI−38線維芽細胞に影響を及ぼさなかった。BSC−1細胞の刺激は、少なくともその最適な濃度でアッセイした、EGF、IGF−I、aFGF、bFGF、およびバソプレシンを含む多様なポリペプチド分裂促進因子で観察されるものと同じくらい有効であった。DNA合成を、[3H]チミジンの酸不溶性物質への組込みを測定することによって評価した場合、幽門洞抽出物による同様の増殖刺激が観察された。幽門洞抽出物の生物学的活性は、65℃で5分間の加熱、およびほとんどのオリゴペプチドを除去する10kDaのMrカットオフを有する膜を用いた透析を耐える;この処理は60−70%のポリペプチド物質を除去するが、イムノブロットによってアッセイしたようにAMP−18を容赦した。より重要なことに、マウスまたはブタ幽門洞抽出物によるBSC−1細胞の分裂促進刺激は、ヒト組換えプレAMP−18(細菌で発現した)に対する2つの異なる抗血清のいずれかを培養培地に加えた場合に阻害される。免疫前血清(1:100から1:800)は、細胞増殖に影響を与えず、幽門洞抽出物の分裂促進効果も変化させなかった。これらの観察は、胃粘膜細胞AMP−18は、通常このタンパク質を発現しない腎臓上皮細胞の強力な分裂促進因子として機能することを示唆する。
本発明の合成ペプチドの活性は予期しないものである。ヒトcDNAクローンペプチドのORFに基づくペプチドを、University of Chicago Cancer Center Peptide Core Facilityで合成し、そこで産物の配列および質量スペクトルをチェックする。ペプチドをHPLCによってさらに精製した。シグナルペプチドを含まずに、およそタンパク質の長さに広がる5つの比較的大きなオリゴペプチド(それぞれ約40アミノ酸)を分析した。予測されるヘリックスおよびグリシン−プロリン(GP)ターンを含む、プレAMP配列のアミノ酸lys−78からleu−119まで広がる42アミノ酸長の1つのペプチド(タンパク質の成熟型のペプチド58−99;表1を参照のこと)は、高い分裂促進活性を有していた。この反応は、特異的抗血清によって阻害されたが、免疫前血清によって阻害されなかった。
(12.ガストロカイン(AMP−18)の増殖刺激ドメイン)
新規幽門洞粘膜細胞タンパク質AMP−18の中央領域に相当する42アミノ酸ペプチドが、ブタおよびマウス幽門洞抽出物中のそのままのタンパク質と特徴が同様の分裂促進活性を有する(表1)という発見は、分子の生物活性領域の特徴付けを促進した。78位−119位のアミノ酸を含むペプチドが、組織抽出物によって与えられるものと同様の、BSC−1上皮細胞系統の増殖の最大刺激を与え、そして細菌で発現した完全幽門洞タンパク質に対してウサギで惹起されたいくつかの異なる抗血清によって同様に阻害された。ペプチド「78−119」に関連する多くの合成「欠失」ペプチドの分裂促進活性を、表1にまとめる。増殖活性の決定は、今まで腎臓上皮細胞系統およびいくつかの胃および腸系統で達成された。
これからの結論は、より小さいペプチドは、おそらく正しいコンフォメーションを形成する能力が低いために、またはあるいは補助的な結合領域の喪失のために、細胞レセプターに関してより低い結合親和性を有するということである。後者の考えは、ペプチド「78−88」および「87−105」が、インタクトな42マーペプチド78−119の活性に拮抗し得るという観察によって支持される;これらのペプチドは幽門洞抽出物の活性にも拮抗し、新規タンパク質の生物学的機能を分析する手段としての合成ペプチドの妥当性をさらに支持する。本発明のさらなる局面は、ペプチド87−105はペプチド104−117の活性に拮抗するが、68−88はしないことである;ペプチド87−105は隣接する104−117配列と2残基重複することに注意する。
(a)E.coli。組換え構築物を、一般的に、PT/CEBPベクター中の全長cDNA配列の適当な領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、遺伝子工学で操作し、そして標準的なベクターポリリンカーへの容易な挿入を可能にするのに便利な制限酵素部位まで延長する。細菌システムにおけるAMP ORFの発現を用いた最初の実験は、Ni−NTA樹脂(Qiagen)における発現タンパク質の精製の促進を意図して、N−末端His6タグ(配列番号16)を含む(Jeonら、1994)、発現ベクターPT/CEBPを採用した。宿主BL21(DE3)pLySにおけるこのベクター中の全長ヒトcDNAの発現は、不溶性タンパク質の高い収率を与え、それは変性条件下の電気泳動後に、特異的高力価抗体を得るためにウサギで免疫原として使用するために適当であったが、それはそのタンパク質の天然構造および機能を分析するために有用ではなかった。この不溶性は、おそらく発現タンパク質における、疎水性シグナルペプチドの上流にHis6タグ(配列番号16)を有する、非天然N−末端の存在のためである。疎水性シグナルペプチド配列なしにORFを発現するエンジニアリングベクターも有用である。これらをN−またはC−末端Hisタグありおよびなしで、細菌発現ベクターを用いて構築する。20アミノ酸のシグナルペプチドを欠き、そしてHis6タグ(配列番号16)を含むヒトAMP−18配列も、細菌で発現させた。
「野生型」AMP−18の産生の効率的な発現システムが与えられれば、欠失または置換のいずれかを含む一連の変異タンパク質を作成し得、それは機能的ドメインの分析を可能にする。両親媒性ヘリックス、保存されたシステイン(C)残基および切断部位であり得る塩基性アミノ酸ダブレットが、魅力的な標的である。酵素アッセイと同じくらい単純ではないが、有糸分裂誘発アッセイは慣用的かつ反復可能であり、そしてそれらが構築されるのと同じくらい迅速な「変異体」の特徴付けを可能にする。ドミナントネガティブ(またはポジティブ)「変異体」は、潜在的な細胞レセプターを含む他の因子との相互作用を示すので、機能の単純な喪失を示す変異体と同じくらい重要である。
ガストロカインAMP−18のいくつかの発現形式の場合に、組換えタンパク質は、可溶性タンパク質の迅速な精製を可能にするペプチドタグを含む。これらのタグの存在は、もしそれらがタンパク質の通常の機能を著しく阻害しなければ、他の関連する高分子との相互作用の分析も可能にする。His6タグ(配列番号16)は、組換えタンパク質をNi−NTA樹脂ビーズへ結合させることによって精製を可能にする(Janknechtら、1991;QiagenのNi−NTA樹脂)。タグ化タンパク質は、ほとんどの抗原−抗体複合体よりも高い親和性で結合し、そしてNi2+−ヒスチジンキレート化複合体を過剰なイミダゾールで分裂させて精製タンパク質を放出する前に激しく洗浄され得る。GST−タグ化組換えタンパク質を、グルタチオン−アガロースで精製し、洗浄し、次いで還元グルタチオンで溶出する(SmithおよびJohnson、1988)。全ての提案された発現システムと同様に、各タンパク質調製物を、その増殖因子活性に関してできるだけ早い段階で試験し得る。
AMP−18は、1つまたはいくつかの生物活性ペプチドの前駆体であり得る。合成ペプチドは、タンパク質の機能を調査する簡便な道を提供する;ペプチドは機能の局面を模倣し得るか、またはそれに拮抗し得る。ペプチドがタンパク質の活性を再現または阻害するならば、それはもとのタンパク質の機能的ドメインのアイデンティティーを示唆し、そしてタンパク質−細胞相互作用を調査するために特異的にタグ化したプローブを合成する可能性も提供する。
非形質転換サル腎臓上皮細胞株BSC−1および他の上皮細胞株を使用して、増殖に対する影響を評価した。一般的に、増殖のために最小限のウシ(または胎児)血清を添加した増殖培地中で、プラスチックディッシュでコンフルエントになるまで細胞が増殖するように、各株に関して条件を選択した(Lieskeら、1997);BSC−1細胞は1%ウシ血清を含む60mmディッシュあたり106でコンフルエントになった。増殖アッセイの開始時に、コンフルエントな培養の培地を吸引および細胞の生存可能性を維持するために最小限の血清(BSC−1に関しては0.01%)を含む新しい培地と交換した。AMP−18調製物を培地に加え、そして4日後に細胞単層を洗浄し、トリプシンで分離し、そして細胞を、血球計算器を用いて計測した。AMP−18のDNA合成を開始する能力の決定を、[3H]チミジンの組込みによって測定した(Toback、1980);DNA合成アッセイを確認するために、平らにした細胞のオートラジオグラムを計測した(KarthaおよびToback、1985)。
AMP−18の標的細胞レセプターの特徴付けは、このタンパク質に接触することが予期されない細胞におけるレセプターの明らかな存在のために、興味深い。最初の増殖反応アッセイを、胃因子によく反応する腎臓由来の上皮細胞系統で行なった。胃細胞株、および非形質転換ラット腸上皮IEC−6細胞を使用して、幽門洞抽出物の真の生理学的標的であろう細胞上のレセプターに注意を向けた。インビボにおけるこのタンパク質の作用の特異性は、おそらくそのレセプターよりも、その発現の非常な組織特異的性質から生ずる。AMP−18が他の増殖因子と共通のレセプターと相互作用し得ることが可能である。しかし、EGFおよび幽門洞抽出物の相加的増殖刺激は、AMP−18が新規レセプターを有し得ることを示唆する。
AMP−18の機能的分子形式は未知である。確かに、約18kDaは幽門洞粘膜細胞に蓄積するタンパク質形式であり、そしてそれらは約10kDaまでのペプシン断片および生物活性ペプチド78−119(42アミノ酸しか有さない)とも反応するが、実質的な量のより低いMWのポリペプチドは抗血清で検出されない。標識またはタグ化AMP−18の利用手段を有することは、タンパク質が幽門洞粘膜抽出物中で処理されるのか、またはそれに反応する上皮細胞によるのかという質問を調査することを可能にする。
ヒトcDNAクローンの配列に基づくプライマーを用いたPCR技術を用いて、ヒトおよびマウスプレAMP−18のゲノムクローンを得た。エキソン/イントロン構造(図13)は完全である。マウスAMPエキソンは、マウス遺伝子の配列を組み立てるのを可能にするために十分ヒトおよびブタのものと類似している。ヒトおよびマウス遺伝子は、非常に類似した構造を有し、マウス遺伝子はわずかに小さい。マウス遺伝子のエキソンに含まれるORFは、ヒトおよびブタタンパク質に対して65%の同一性を有するタンパク質を予測する。2kbの配列はヒト遺伝子の上流である。
マウスマップから標的構築物を設計する。構築物は、好ましくは[5’−TK(機能的チミジンキナーゼ遺伝子)−AMP−18DNAの5’末端の約5kb−ホスホグリセリン酸塩キナーゼ(PGK)プロモーターの調節下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子−遺伝子の3’末端の約3kb−3’]を含む。内在性AMP−18遺伝子と構築物のかなり長い相同性が、効率的な標的化のために必要である。全体の相同性を1.7から6.8kbに増加させることは、hrpt遺伝子の相同的標的化の効率を約200倍増加させる(Hastyら、1991)。その全体の長さを超えても、効率はわずかにしか増加しない。PCR反応による相同的成分の検出を促進するために、ベクターの一端の近くにneo遺伝子を有することが有用である。できた形質転換体を、2つのプライマー(1つはneo遺伝子中、そして他はAMP−18遺伝子座中標的化ベクターのすぐ外側)を用いてPCRによって提供し得る。マウス遺伝子の4kb5’および4.5kb3’に伸びる隣接配列を得た。完全な遺伝子のノックアウトが既にクローニングされたことを保証するために、相同的組換えによって、コード領域をneo遺伝子と置換する。プラスミド配列を切断した後、標的化カセットをES細胞にトランスフェクトして、ネオマイシンのアナログであるG418およびガンシクロビルによる選択によって安定なトランスフェクタントを得る(Mansourら、1988)。隣接配列由来のプローブを用いたサザンブロットを使用して、標的化相同的組換え体をスクリーニングする。正しく標的化されたES細胞クローンを、C57BL/6マウスの胚盤胞に注入する。
Claims (6)
- 胃腸障害の処置のために使用される薬学的組成物であって、該組成物が、ガストロカインタンパク質由来の、胃腸管上皮細胞の細胞増殖刺激用ペプチドを含む、薬学的組成物。
- 前記ガストロカインタンパク質が、以下:
VKE(K/Q)KLQGKGPGG(P/A)PPK(配列番号25)およびVKE(K/Q)KGKGPGG(P/A)PPK(配列番号26)
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の薬学的組成物。 - 以下のアミノ酸配列:
KKLQGKGPGGPPPK(配列番号11)、LDALVEKKLQGKGPGGPPPK(配列番号12)、およびLDALVEKKLQGKGPGGPPPKGLMY(配列番号13)からなる群より選択される、胃腸管上皮細胞の細胞増殖刺激用ペプチドを含む、請求項2に記載の薬学的組成物。 - 哺乳動物の胃腸管への損傷後に上皮細胞の遊走を刺激するための組成物であって、該組成物が、ガストロカインタンパク質由来のタンパク質、または該タンパク質由来のペプチドを含む、組成物。
- 哺乳動物の胃腸管の損傷した上皮細胞の細胞保護のための組成物であって、該組成物が、
VKE(K/Q)KLQGKGPGG(P/A)PPK(配列番号25)および
VKE(K/Q)KGKGPGG(P/A)PPK(配列番号26)
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含むガストロカインタンパク質を含む、組成物。 - 前記損傷した細胞が潰瘍である、請求項5に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/821,726 US6734289B2 (en) | 2001-03-29 | 2001-03-29 | Gastrokines and derived peptides including inhibitors |
PCT/US2002/009885 WO2002078640A2 (en) | 2001-03-29 | 2002-03-29 | Control of growth and repair of gastro-intestinal tissues by gastrokines and inhibitors |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007121196A Division JP2007217422A (ja) | 2001-03-29 | 2007-05-01 | ガストロカインおよびインヒビターによる、胃腸組織の増殖および修復の調節 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004537284A JP2004537284A (ja) | 2004-12-16 |
JP2004537284A5 JP2004537284A5 (ja) | 2005-08-18 |
JP4281947B2 true JP4281947B2 (ja) | 2009-06-17 |
Family
ID=25234151
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002576908A Expired - Fee Related JP4281947B2 (ja) | 2001-03-29 | 2002-03-29 | ガストロカインおよびインヒビターによる、胃腸組織の増殖および修復の調節 |
JP2002589626A Expired - Fee Related JP4295516B2 (ja) | 2001-03-29 | 2002-03-29 | ガストロカインおよびインヒビターを含むその誘導ペプチド |
JP2007121196A Pending JP2007217422A (ja) | 2001-03-29 | 2007-05-01 | ガストロカインおよびインヒビターによる、胃腸組織の増殖および修復の調節 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002589626A Expired - Fee Related JP4295516B2 (ja) | 2001-03-29 | 2002-03-29 | ガストロカインおよびインヒビターを含むその誘導ペプチド |
JP2007121196A Pending JP2007217422A (ja) | 2001-03-29 | 2007-05-01 | ガストロカインおよびインヒビターによる、胃腸組織の増殖および修復の調節 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US6734289B2 (ja) |
EP (2) | EP1423409A4 (ja) |
JP (3) | JP4281947B2 (ja) |
AT (1) | ATE446510T1 (ja) |
AU (2) | AU2002258663B2 (ja) |
CA (2) | CA2442635A1 (ja) |
DE (1) | DE60234103D1 (ja) |
ES (1) | ES2332882T3 (ja) |
MX (2) | MXPA03008855A (ja) |
WO (2) | WO2002092758A2 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6734289B2 (en) * | 2001-03-29 | 2004-05-11 | The University Of Chicago | Gastrokines and derived peptides including inhibitors |
US7629317B2 (en) | 2001-03-29 | 2009-12-08 | The University Of Chicago | Control of growth and repair of gastro-intestinal tissues by gastrokines and inhibitors |
DE102004047968A1 (de) * | 2004-10-01 | 2006-04-06 | B.R.A.H.M.S Ag | Bestimmung von Gastrokine 1 (GKN1) als Biomarker für Entzündungen und Infektionen |
AU2006244080C1 (en) * | 2005-05-10 | 2012-02-02 | The University Of Chicago | Use of peptides derived from the growth factor AMP-18 for the treatment of mucositis |
US8017576B2 (en) * | 2005-05-10 | 2011-09-13 | The University Of Chicago | Methods and compositions to treat mucositis |
ATE526983T1 (de) * | 2005-05-10 | 2011-10-15 | Univ Chicago | Verwendung von peptiden aus dem wachstumsfaktors amp-18 zur behandlung von stomatitis |
EP2522717B1 (en) | 2006-01-04 | 2014-04-02 | Baxter International Inc | Oligopeptide-free cell culture media |
EP2082674A1 (en) | 2008-01-22 | 2009-07-29 | Trelleborg Building Systems AB | Waterproof sealing profile |
CN101945613B (zh) * | 2008-02-18 | 2014-08-13 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 为患者用药 |
EP3284476B1 (en) | 2012-12-19 | 2019-09-25 | Lumen Bio LLC | Uses of a gastrokine protein |
AU2018215245B2 (en) * | 2017-02-06 | 2024-07-11 | Resiliun B.V. | Interaction between C-peptides and elastin receptor, a model for understanding vascular disease |
KR102590757B1 (ko) * | 2020-12-11 | 2023-10-17 | 가톨릭대학교 산학협력단 | GKN1(Gastrokine 1) 특이적 항체 및 이의 용도 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5135856A (en) | 1987-06-24 | 1992-08-04 | Arch Development Corp. | Production of autocrine growth factors |
US5476922A (en) | 1987-06-24 | 1995-12-19 | Arch Development Corporation | Methods and compositions for the preparation and use of autocrine growth factors |
US5102870A (en) * | 1989-04-14 | 1992-04-07 | Schering Ag | Treatment and prevention of oral mucositis with growth factors |
JP2938129B2 (ja) | 1989-05-02 | 1999-08-23 | 武田薬品工業株式会社 | 虚血性腎疾患の予防・治療剤 |
US5644026A (en) * | 1994-05-03 | 1997-07-01 | La Jolla Cancer Research Foundation | Epitaxin, a cell motility factor |
JPH08231413A (ja) | 1994-12-29 | 1996-09-10 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 臓器障害に基づく疾患の予防・治療剤 |
CA2218864A1 (en) | 1995-04-21 | 1996-10-24 | Tsutomu Yonehana | Agent for preventing and/or treating ischemic diseases |
JP3681405B2 (ja) * | 1997-02-21 | 2005-08-10 | タカラバイオ株式会社 | 癌関連遺伝子 |
US20030054359A1 (en) * | 1997-06-16 | 2003-03-20 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
WO1999007840A1 (en) * | 1997-08-06 | 1999-02-18 | Genetics Institute, Inc. | Secreted proteins and polynucleotides encoding them |
AU4834999A (en) * | 1998-06-26 | 2000-01-17 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human signal peptide-containing proteins |
BR0008188A (pt) | 1999-01-21 | 2002-02-13 | Metamorphix Inc | Inibidores de fator de diferenciação de crescimento e usos para os mesmos |
ATE478145T1 (de) * | 1999-06-02 | 2010-09-15 | Genentech Inc | Sekretierte und transmembran polypeptide und dafür kodierende nukleinsäuren |
PT1185648E (pt) * | 1999-06-22 | 2007-06-29 | Genentech Inc | Métodos e composições para a inibição do crescimento de células neoplásicas. |
US6734289B2 (en) * | 2001-03-29 | 2004-05-11 | The University Of Chicago | Gastrokines and derived peptides including inhibitors |
US7629317B2 (en) * | 2001-03-29 | 2009-12-08 | The University Of Chicago | Control of growth and repair of gastro-intestinal tissues by gastrokines and inhibitors |
US8017576B2 (en) * | 2005-05-10 | 2011-09-13 | The University Of Chicago | Methods and compositions to treat mucositis |
-
2001
- 2001-03-29 US US09/821,726 patent/US6734289B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-03-29 EP EP02731209A patent/EP1423409A4/en not_active Withdrawn
- 2002-03-29 JP JP2002576908A patent/JP4281947B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-29 WO PCT/US2002/010148 patent/WO2002092758A2/en active Application Filing
- 2002-03-29 JP JP2002589626A patent/JP4295516B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-29 MX MXPA03008855A patent/MXPA03008855A/es active IP Right Grant
- 2002-03-29 CA CA002442635A patent/CA2442635A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-29 US US10/473,571 patent/US8278269B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-29 EP EP02728619A patent/EP1415154B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-29 CA CA2442684A patent/CA2442684C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-29 US US10/473,524 patent/US7557083B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-29 AU AU2002258663A patent/AU2002258663B2/en not_active Ceased
- 2002-03-29 MX MXPA03008861A patent/MXPA03008861A/es active IP Right Grant
- 2002-03-29 DE DE60234103T patent/DE60234103D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-29 AU AU2002303199A patent/AU2002303199B2/en not_active Ceased
- 2002-03-29 ES ES02728619T patent/ES2332882T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-29 AT AT02728619T patent/ATE446510T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-03-29 WO PCT/US2002/009885 patent/WO2002078640A2/en active Application Filing
-
2007
- 2007-05-01 JP JP2007121196A patent/JP2007217422A/ja active Pending
-
2012
- 2012-08-30 US US13/599,417 patent/US8791068B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8791068B2 (en) | Control of growth and repair of gastro-intestinal tissues by gastrokines and inhibitors | |
US8741838B2 (en) | Control of growth and repair of gastro-intestinal tissues by gastrokines and inhibitors | |
US6221840B1 (en) | Intestinal trefoil proteins | |
CA2848368C (en) | Compositions and methods for brown fat induction and activity using fndc5 | |
US20090227513A1 (en) | Treating eye disorders using intestinal trefoil proteins | |
AU2002258663A1 (en) | Control of growth and repair of gastro-intestinal tissues by gastrokines and inhibitors | |
AU2002303199A1 (en) | Gastrokines and derived peptides including inhibitors | |
JP2006507804A (ja) | 単一ドメインtdf関連化合物およびその類似体 | |
JP2002530064A (ja) | Egf様核酸およびポリペプチド、ならびにその使用 | |
KR20020013477A (ko) | 염색체 17p 연관된 전립선암 감수성 유전자 | |
Lee | Transforming Growth Factor α: Expression and Biological Activities of the Secreted and Integral Membrane Forms | |
WO2004080485A1 (ja) | 上部消化管疾患の予防・治療剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050328 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070129 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070501 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080603 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080828 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090127 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090216 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090312 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120327 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120327 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120327 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120327 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120327 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130327 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |