JP2007217422A - ガストロカインおよびインヒビターによる、胃腸組織の増殖および修復の調節 - Google Patents

Abstract

【課題】哺乳動物の胃腸組織の増殖および修復（回復）の制御ならびに細胞保護
【解決手段】胃幽門洞粘膜タンパク質と呼ばれる、新規グループのガストロカインが特徴付けられる。このグループの１つのメンバーは、ＡＭＰ−１８と呼ばれる。ＡＭＰ−１８のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＡＭＰ−１８タンパク質は、ヒト、マウスおよびブタについて配列決定されている。ＡＭＰ−１８タンパク質およびこのＡＭＰ−１８タンパク由来の活性ペプチドは、細胞増殖因子である。驚くべきことに、完全なタンパク質の効果を阻害し得るペプチドもまた、ＡＭＰ−１８タンパク質由来である。哺乳動物の胃腸組織の増殖および修復（回復）の制御ならびに細胞保護は、このタンパク質の使用によって促進され、このタンパク質を炎症性腸疾患および胃潰瘍の治療の候補とする。
【選択図】なし

Description

（背景）
胃幽門洞粘膜タンパク質の新規グループであるガストロカイン（ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ
）が特徴付けられる。ガストロカイングループの１つのメンバーは、ＡＭＰ−１８と呼ば
れる。ＡＭＰ−１８ゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡ分子は、ヒトおよびマウスで配列決定
され、そしてタンパク質配列がヌクレオチド配列から予測される。ブタＡＭＰ−１８のｃ
ＤＮＡ分子が配列決定され、そして天然タンパク質の部分的配列決定によって確認される
。ＡＭＰ−１８タンパク質およびその配列から得られる活性ペプチドは、細胞増殖因子で
ある。驚くべきことに、完全なタンパク質の効果を阻害し得るペプチドも、ＡＭＰ−１８
タンパク質配列から得られる。哺乳動物胃腸組織の増殖および修復の調節は、そのタンパ
ク質またはペプチドの使用によって促進され、そのタンパク質および誘導ペプチドは治療
の候補となる。

哺乳動物胃腸（ＧＩ）管に影響する因子の探索は、診断的および治療的薬剤の必要性に
よって動機付けられる。タンパク質はムチン層の一部に留まり、下にある組織の機械的（
例えば潤滑剤またはゲル安定化剤）および化学的（例えば胃酸に対して、おそらく粘液ｐ
Ｈ勾配および／または疎水性バリアを維持するのを助ける）保護を提供し得る。トレフォ
イル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ペプチドファミリーは、そのような一般的な細胞保護の役割を有
すると示唆された（ＳａｎｄｓおよびＰｏｄｏｌｓｋｙ、１９９６を参照のこと）。ある
いは、サイトカイン様の活性が、傷ついた上皮の修復を助け得る。トレフォイルペプチド
が他の因子と共同で作用して、上皮を維持および修復し得るという示唆は、胃腸管で起こ
る相互作用の複雑さをさらに強調する（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、１９９７）。ＧＩ上皮の完全
さの維持は、哺乳動物の持続した安寧のために必要不可欠であり、そして損傷後の創傷閉
鎖は通常非常に迅速に起こり（Ｌａｃｙ、１９８８）、その後すぐに増殖および分化が続
いて起こって上皮の完全さを再確立する（Ｎｕｒｓａｔら、１９９２）。従って、保護お
よび回復は、健康な胃腸管の２つの重要な特徴であり、そして胃の比較的厳しい細胞外環
境において重要であり得る。

ＧＩタンパク質の探索は、いくらかの成功をおさめた。ヒトおよびブタ胃細胞から単離
したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列が、他の
発明者と共に研究した本発明者の一人による、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａ
ｇｏ Ｐｈ．Ｄ．論文、「新規メッセンジャーＲＮＡの特徴付けおよびブタ胃粘膜からの
そのタンパク質の免疫化学的検出」１９８７年１２月において記載された。しかし、いく
つかのｃＤＮＡ配列決定の誤りがあり、それは本明細書中で開示されるＡＭＰ−１８タン
パク質から有意なアミノ酸変化を引き起こした。タンパク質自身は、本発明の１つの局面
としてのみ単離および精製され、そして有用性を決定するために機能的分析を行なった。
核酸配列が探索された。

（本発明の概要）
幽門洞粘膜タンパク質１８（「ＡＭＰ−１８」）と呼ばれる新規遺伝子産物は、ガスト
ロカインである。そのタンパク質は、ヒト、ブタ、およびマウスから得られたｃＤＮＡク
ローンの分析によって、胃幽門洞粘膜細胞で発見された。そのタンパク質は細胞増殖因子
またはサイトカイン、より具体的にはガストロカインのグループのメンバーである。ＡＭ
Ｐ−１８ｃＤＮＡ配列は、ブタおよびヒトの両方で、長さが１８５アミノ酸のタンパク質
を予測する。ヌクレオチド配列はまた、分泌タンパク質のための２０アミノ酸のＮ−末端
シグナル配列を予測する。前駆体（プレＡＭＰ−１８）からのこのＮ−末端ペプチドの切
断は、ブタタンパク質で確認された；この切断は長さが１６５アミノ酸、そして大きさが
約１８，０００ダルトン（１８ｋＤ）の分泌タンパク質を産生する。ヒトおよびマウスゲ
ノムＤＮＡ配列も得られ、そして配列決定された。ヒトゲノムＤＮＡは、大きさがそれぞ
れ１．６ｋｂ、３ｋｂ、３．３ｋｂ、および１．１ｋｂの４つの互いに重なる断片で単離
された。マウスゲノムＤＮＡ配列は、単一のＢＡＣクローンで単離された。

ＡＭＰ−１８タンパク質と呼ばれるガストロカインは、胃幽門洞の細胞で高レベルに発
現される。そのタンパク質は胃の他の部分または十二指腸でほとんど検出されず、そして
試験した他の体組織で見出せないか、または低レベルで見出された。ＡＭＰ−１８は管腔
表面粘膜細胞で合成され、そしてムチン顆粒と共に分泌される。

ヒトにおける研究によって、ヒト胃粘膜におけるＡＭＰ−１８ペプチドの位置および発
現を確認される。

マウスおよびブタ幽門洞組織から単離されたＡＭＰ−１８の組成物は、培養中のコンフ
ルエントな胃、腸、および腎臓上皮細胞の増殖を刺激する；ヒト、サル、イヌおよびラッ
ト細胞も反応することが示される。この分裂促進的（増殖刺激）効果は、ＡＭＰ−１８に
対する特異的抗血清（抗体）によって阻害され、ＡＭＰ−１８、またはその産物、例えば
タンパク質の断片の単離または合成によってタンパク質から得られたペプチドは、増殖因
子であるという結論を支持する。実際、アミノ酸配列がＡＭＰ−１８タンパク質の中央領
域に相当するある合成ペプチドも、増殖因子活性を有する。そのペプチドはまた、組織培
養アッセイにおいて創傷修復を速め、胃粘膜損傷の回復を媒介する過程である、細胞遊走
に対する刺激効果を示す。従って、そのタンパク質およびその活性ペプチドは、細胞遊走
促進因子である。予期しないことに、親分子のサブドメインから得られたペプチドが、生
物活性合成ペプチド、および胃抽出物に存在するそのままの天然タンパク質の分裂促進効
果を阻害し得る。

本発明のガストロカインタンパク質およびペプチドの３つの活性が存在する。それらは
細胞が遊走するのを刺激するので、そのタンパク質は細胞遊走促進因子である。それらは
細胞分裂を刺激するので、分裂促進因子である。それらは上皮の完全さを維持するので（
酸化剤または非ステロイド性抗炎症剤、ＮＳＡＩＤのような損傷を与える薬剤で処理した
組織培養における、電気抵抗上皮細胞層に与えられる保護によって示されるように）、細
胞保護剤として機能する。

ＡＭＰ−１８の合成は、ヒトおよび他の哺乳動物の、胃幽門洞の管腔粘膜裏打ち上皮細
胞に限られる。細胞内で、タンパク質は分泌顆粒のムチンと同時局在しており、そして先
端の原形質膜の上にある粘液へ分泌されるようである。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えヒト
ＡＭＰ−１８は、成熟タンパク質の中央から得た増殖促進ペプチドよりも、１オーダー低
い程度の濃度で、その分裂促進性効果を発揮する。最も強力な分裂促進ペプチドである、
ペプチド７７−９７は、アミノ酸配列特異的なＡＭＰペプチドであり、それは線維芽細胞
またはＨｅＬａ細胞の増殖を刺激しないので、細胞型特異的であるようである。活性な分
裂促進因子でないあるペプチドが、濃度依存的な様式で、ペプチド５８−９９および幽門
洞細胞抽出物の増殖刺激効果を競合的に阻害し得るので、特異的ＡＭＰペプチドによる分
裂促進は、細胞表面レセプターによって媒介されるようである。ＡＭＰ−１８およびその
誘導ペプチドは、胃および腸上皮細胞に対して多様な効果を示し、それはそれらが胃粘膜
損傷後の修復に決定的な役割を果たし得ることを示唆する。これらは、細胞保護、分裂促
進、回復、および酸化剤および／またはインドメタシンによる損傷後のバリア機能の成熟
を含む。ＡＭＰ−１８またはそのペプチド誘導体がその多面発現性の効果を媒介する、可
能性のあるメカニズムは、タンパク質チロシンキナーゼ活性の刺激、細胞ストレス後の熱
ショックタンパク質発現の延長、および密着結合関連タンパク質ＺＯ−１およびオクルデ
ィンの蓄積の増強を含む。これらの生理学的効果のあるものは、トレフォイルペプチドま
たはα−デフェンシン、クリプトジン３（ｃｒｙｐｔｄｉｎ３）（＞１００μＭ）のよう
な他の胃ペプチドメディエーターの濃度と比較して、ｒｈＡＭＰ−１８（＜５０ｎＭ）で
比較的低い濃度で起こり得る。免疫反応性ＡＭＰ−１８は、明らかにインドメタシン胃管
栄養後にマウス幽門洞細胞によって、およびフォルスコリンに接触させた一次培養中のイ
ヌ幽門洞細胞によって放出され、そのタンパク質は調節を受けることを示唆する。これら
の結果は、ＡＭＰ−１８は、インビボにおける胃粘膜上皮の創傷治癒のような生理学的お
よび病理学的過程で役割を果たし得ることを意味する。

本発明は、ガストロカインと呼ばれる単離された相同的細胞増殖刺激タンパク質のグル
ープに関連し、それは胃上皮細胞によって産生され、そしてコンセンサスアミノ酸配列Ｖ
ＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫを含む。ここでＸＸはＬＱまたは空
白であり得る。そのグループの単離されたタンパク質は、図７に示したようなアミノ酸配
列を有する。シグナルペプチド配列を構成する２０アミノ酸を欠く、処理された形式でブ
タ胃上皮に存在するタンパク質は、１６５アミノ酸およびポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって測定された約１８ｋＤの推定分子量を有する。シグナルペプチドは、小胞体（
ＥＲ）を通過した後に切断される。そのタンパク質は分泌され得る。図３に示したアミノ
酸配列は、ヒトｃＤＮＡ配列から導かれた。そのタンパク質の１つの実施態様を、マウス
ＲＮＡおよびＤＮＡから予測される配列である、図６のアミノ酸配列で示す。

増殖刺激（生物活性）ペプチドを、ガストロカイングループのタンパク質から得ること
ができる。生物活性ペプチドは、より小さく、従ってタンパク質全体よりそれらを合成す
るコストが低いために、タンパク質より使用に好ましい。

さらに、以下の方法によって修飾ペプチドを産生し得る：
（ａ）アミノ酸置換または欠失によって、未修飾ペプチドアミノ酸配列の主要なプロテ
アーゼ部位を排除する；および／または
（ｂ）未修飾ペプチド中のアミノ酸の修飾アミノ酸アナログを導入する。

本発明の１つの局面は、図３に示した位置７８から１１９までのアミノ酸配列を有する
、合成増殖刺激ペプチドである。

別のペプチドは、図３に示した位置９７から位置１１７までのアミノ酸配列を有する。

別のペプチドは、図３に示した位置９７から位置１２１までのアミノ酸配列を有する。

別のペプチドは、図３に示した位置１０４から位置１１７までのアミノ酸配列を有する
。

単離された生物活性ペプチドの１つの実施態様は、以下の配列のうち１つを有する：Ｋ
ＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ、ＬＤＡＬＶＫＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ、またはＬ
ＤＡＬＶＫＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫＧＬＭＹ。ガストロカイングループのタンパ
ク質のインヒビターの１つの実施態様は、アミノ酸配列ＫＫＴＣＩＶＨＫＭＫＫまたはＫ
ＫＥＶＭＰＳＩＱＳＬＤＡＬＶＫＥＫＫを有する（表１も参照のこと）。

本発明はまた、少なくとも１つの増殖刺激ペプチドを含む薬学的組成物に関連する。

胃上皮の過剰増殖に関連する疾患を治療するための薬学的組成物は、ガストロカインの
グループのタンパク質、またはガストロカインタンパク質から得られた増殖刺激ペプチド
のインヒビターを含む。

結腸および小腸の疾患を治療するための薬学的組成物は、少なくとも１つの本発明の増
殖刺激ペプチドを含む。そのような疾患の例は、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む。

細菌で発現されるヒトｃＤＮＡによってコードされるタンパク質産物ＡＭＰ−１８に対
する抗体を、ウサギで産生した；これらの抗体は試験した全ての哺乳動物種（ヒト、ブタ
、ヤギ、ヒツジ、ラットおよびマウス）の１８ｋＤの幽門洞抗原と反応し、ガストロカイ
ンを検出する有用な方法を提供する。グループのタンパク質に対する抗体は、タンパク質
のペプチド内のエピトープを認識し、それは図３の位置７８から位置１１９までのアミノ
酸配列を含む。

本発明はまた、図１で示したヒトのヌクレオチド配列を有する単離されたゲノムＤＮＡ
分子、およびヌクレオチド配列が図２で示された、ヒトタンパク質をコードする単離され
たｃＤＮＡ分子にも向けられる。

本発明の別の局面は、図４で示したような、マウス由来のＤＮＡで見出されるゲノム配
列を有する単離されたＤＮＡ分子である。

ゲノムＤＮＡは、遺伝子の胃発現のために調節エレメントを含むので重要であり、従っ
て調節エレメントを単離し、そして胃組織でガストロカイン以外の遺伝子配列を発現する
ために使用し得る。

本発明の１つの局面は、欠失無しに発現した場合、本発明のガストロカイングループの
タンパク質をコードする、マウスゲノムのヌクレオチド配列に標的化された欠失を有する
マウスである。

本発明の１つの局面は、ガストロカインタンパク質またはガストロカインタンパク質か
ら得られるペプチドを作成する方法である。その方法は以下のものを含む：
（ａ）図２に示したような配列を有する単離ｃＤＮＡ分子を得る；
（ｂ）組換えＤＮＡ発現ベクターにその分子を配置する；
（ｃ）組換えＤＮＡ発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする；
（ｄ）トランスフェクトされた宿主細胞がｃＤＮＡ分子によってコードされるタンパク
質を産生するのを可能にする環境条件を提供する；および
（ｅ）宿主細胞からタンパク質を精製する。

発現が成功した宿主細胞は、バキュロウイルスを含み、それは商業的および研究使用の
ために大量のガストロカインを提供することを可能にする。例えば、シグナルペプチドを
持たないヒトＡＭＰ−１８タンパク質を産生した。

Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換えヒトタンパク質ＡＭＰ−１８は、図１４、左パネルの配
列を有する。

本発明の１つの局面は、哺乳動物の胃腸管において上皮細胞の増殖を刺激する方法であ
る。その方法は、以下の工程を含む：
（ａ）上皮細胞を、ガストロカインタンパク質またはそのグループのタンパク質から得
られたペプチドを含む組成物と接触させる；および
（ｂ）上皮細胞の増殖を刺激する環境条件を提供する。

そのグループのタンパク質の細胞増殖刺激活性を阻害する方法は、以下の工程を含む：
（ａ）タンパク質をインヒビターと接触させる；および
（ｂ）タンパク質の細胞増殖刺激活性に適当な環境条件を提供する。

インヒビターは、タンパク質の少なくとも１つのエピトープ、例えば図３の推定アミノ
酸配列の位置７８から位置１１９までのアミノ酸配列を有するエピトープに対して産生さ
れた抗体、または表１のもののようなインヒビターペプチドであり得る。

哺乳動物胃腸管上皮に対するタンパク質の異なるレベルの発現の影響を試験する方法は
、以下の工程を含む：
（ａ）不活性なまたは空白のガストロカインタンパク質を有するマウスを得る；
（ｂ）マウスにおけるタンパク質の欠如の影響を決定する；
（ｃ）マウスに増加するレベルのタンパク質を投与する；および
（ｄ）胃腸管上皮の変化を、上皮中のタンパク質レベルと関連付ける。

ガストロカインに対する抗体を使用して、定量的免疫学によってそのレベルを測定する
キットが企図される。レベルを、疾患の状態および治療効果と関連付け得る。

哺乳動物の胃腸管に対する損傷後の上皮細胞の遊走を刺激する方法は、以下の工程を含
む：
（ａ）上皮細胞を、タンパク質から得られたペプチドを含む組成物と接触させる；およ
び
（ｂ）上皮細胞の遊走を可能にする環境条件を提供する。

哺乳動物の胃腸管の傷ついた上皮細胞の細胞保護の方法は、以下の工程を含む：
（ａ）損傷した上皮細胞を、ガストロカイングループのタンパク質またはタンパク質か
ら得られたペプチドを含む組成物と接触させる；および
（ｂ）上皮細胞の修復を可能にする環境条件を提供する。

傷ついた細胞は、潰瘍を形成し得る。
本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
タンパク質のインヒビターであって、該タンパク質は、ガストロカインと呼ばれる、単
離された相同な細胞増殖刺激タンパク質の群から選択され、該タンパク質は、胃上皮細胞
によって産生され、そして以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧ
ＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、該インヒビターは、ＫＫＴ
ＣＩＶＨＫＭＫＫおよびＫＫＥＶＭＰＳＩＱＳＬＤＡＬＶＫＥＫＫからなるアミノ酸配列
を有するペプチドの群から選択される、インヒビター。
（項目２）
胃腸障害の処置に使用される薬学的組成物であって、該組成物が、ガストロカインタン
パク質由来の増殖刺激ペプチドを含む、薬学的組成物。
（項目３）
前記ガストロカインタンパク質が、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧ
ＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含む、項目２に記載の薬学的組
成物。
（項目４）
以下のアミノ酸配列：
ＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ、ＬＤＡＬＶＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ、およびＬ
ＤＡＬＶＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫＧＬＭＹからなる群より選択される増殖刺激ペ
プチドを含む、項目２に記載の薬学的組成物。
（項目５）
胃上皮の過剰増殖に関連する疾患を処置するための医薬品組成物であって、該組成物が
、項目１に記載のインヒビターを含む、薬学的組成物。
（項目６）
前記疾患が、結腸および小腸の疾患であり、該疾患が、潰瘍性大腸炎およびクローン病
からなる群より選択される、項目５に記載の薬学的組成物。
（項目７）
ヒトタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子であって、該タンパク質が図２に
示されるアミノ酸配列を有する、単離されたｃＤＮＡ分子。
（項目８）
マウス由来のＤＮＡ中に見出されるゲノム配列を含む単離されたＤＮＡ分子であって、
ヌクレオチド配列が図４に示される、単離されたＤＮＡ分子。
（項目９）
欠失無しに発現した場合、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧ
ＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含むガストロカインタンパク質群
のタンパク質をコードするマウスゲノムのヌクレオチド配列中に、標的化された欠失を有
する、マウス。
（項目１０）
ガストロカインタンパク質由来のペプチドまたはタンパク質を作製するための方法であ
って、該ガストロカインタンパク質は、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧ
ＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、該方法は、以下：
（ａ）該タンパク質またはペプチドをコードする配列を含む、単離されたｃＤＮＡ分子
を得る工程；
（ｂ）組み換えＤＮＡ発現ベクター中に該分子を配置する工程；
（ｃ）該組換えＤＮＡ発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程；
（ｄ）トランスフェクトされた宿主細胞が、該ｃＤＮＡ分子によってコードされるタン
パク質を産生するのを可能にする環境条件を提供する工程；および
（ｅ）該宿主細胞から該タンパク質を精製する工程、
を包含する、方法。
（項目１１）
ガストロカインタンパク質由来のタンパク質の細胞増殖刺激活性を阻害する方法であっ
て、該ガストロカインタンパク質は、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧ
ＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、該方法は、以下：
（ａ）該タンパク質をインヒビターと接触させる工程；および
（ｂ）該タンパク質の細胞増殖刺激活性に適切な環境条件を提供する工程、
を包含する、方法。
（項目１２）
前記インヒビターが、前記タンパク質の少なくとも１つのエピトープに対する抗体であ
り、該エピトープは、図３の推定アミノ酸配列の７８位から１１９位までのアミノ酸配列
を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記インヒビターが、ＫＫＴＣＩＶＨＫＭＫＫおよびＫＫＥＶＭＰＳＩＱＳＬＤＡＬＶ
ＫＥＫＫからなるインヒビターペプチドの群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
哺乳動物の胃腸管上皮に対する、ガストロカインタンパク質の異なるレベルの発現の影
響を試験する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）項目９に記載のマウスを得る工程；
（ｂ）該マウスにおける該タンパク質の欠如の影響を決定する工程；
（ｃ）該マウスに漸増レベルのタンパク質を投与する工程；および
（ｄ）該胃腸管上皮の変化を、該上皮中の該タンパク質のレベルと関連付ける工程、
を包含する、方法。
（項目１５）
哺乳動物の胃腸管への損傷後に上皮細胞の遊走を刺激する方法であって、該方法は、以
下：
（ａ）該上皮細胞を、ガストロカインタンパク質由来のタンパク質、または該タンパク
質由来のペプチドを含む組成物と接触させる工程；および
（ｂ）該上皮細胞の遊走を可能にする環境条件を提供する工程、
を包含する、方法。
（項目１６）
哺乳動物の胃腸管の損傷した上皮細胞の細胞保護のための方法であって、該方法は、以
下：
（ａ）該損傷した上皮細胞を、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよび
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含むガストロカインタンパク質を
含む組成物と接触させる工程；および
（ｂ）該上皮細胞の修復を可能にする環境条件を提供する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）
前記損傷した細胞が潰瘍である、項目１６に記載の方法。

（発明の詳細な説明）
（１．概要）
新規遺伝子産物、ガストロカイングループのメンバーを、ブタ胃の異なる領域から得た
ｃＤＮＡライブラリーの差次的スクリーニングによって、哺乳動物の胃幽門洞粘膜におい
て検出した。ｃＤＮＡ配列は、シグナルペプチドリーダー配列を含む１８５アミノ酸のタ
ンパク質を予測した。ｃＤＮＡをヒトライブラリーからも単離した。ブタおよびヒト間の
、予測されたアミノ酸配列同一性は７６．３％である。その配列は、分泌タンパク質に特
徴的な２０アミノ酸のシグナルペプチドを予測した。このＮ−末端シグナルペプチドの切
断は、ブタタンパク質で確認された。細菌で発現したヒトｃＤＮＡの産物に対する抗体を
、ウサギで産生した；これらの抗体は、試験した全ての哺乳動物種（ブタ、ヤギ、ヒツジ
、ラットおよびマウス）の１８−２０ｋＤ幽門洞抗原と反応した。ｍＲＮＡレベルと一致
して、ＡＭＰ−１８タンパク質は、胃幽門洞においてのみ高レベルに発現する；胃の残り
の部分または十二指腸ではほとんど検出されず、そして様々な他の試験した組織では検出
されなかった。ＡＭＰ−１８は、管腔表面粘膜細胞で合成される；免疫電子顕微鏡検査は
、これらの細胞の分泌顆粒中にＡＭＰ−１８の位置を突きとめる。マウスおよびブタの幽
門洞組織由来の部分的に精製されたＡＭＰ−１８調製物は、培養細胞においてコンフルエ
ントな胃および腎臓上皮細胞に対して分裂促進性である；この効果は、特異的抗血清によ
って阻害され、ＡＭＰ−１８、すなわちその産物は増殖因子であることを意味する。

ＡＭＰ−１８は、おそらく粘液とともに分泌され、おそらくペプチド誘導体として、粘
液ゲル中で機能して上皮の完全さを直接的に維持する、そしておそらく病原体に対して作
用する。培養中で上皮細胞系統に対して観察される増殖因子活性を考慮して、ＡＭＰ−１
８またはそのペプチド誘導体は、胃上皮のオートクリン（そしておそらくパラクリン）因
子として作用するようである。ＡＭＰ−１８の機能は、単純に分裂促進因子としてだけで
なく、それに加えて成熟管腔表面細胞を補充するシグナルを提供する分化因子として作用
し得る。ＡＭＰ−１８タンパク質またはその誘導体は、高度に機能的な胃粘膜の正常な維
持におそらく重要であり、および損傷後の幽門洞上皮の回復に決定的な役割を果たしてい
るようである。このタンパク質はどの出版物においても特徴付けられていないが、関連す
る核酸配列がＥＳＴとしておよび同様の全長遺伝子として報告された。ＥＳＴデータの限
界が、本発明で開示されたような、開始配列、シグナルペプチド、または生物活性を担う
タンパク質の配列についての情報を産生できない。多くのこれらＥＳＴが哺乳動物の胃ｃ
ＤＮＡに関して報告されたが、関連するＥＳＴが膵臓および妊娠子宮のライブラリーに関
しても報告された。これら他の組織におけるＡＭＰ−１８ＲＮＡの発現は低いようである
が（膵臓に関してＰＣＲ分析によって示されたように）、これらの結果は、この増殖因子
は胃で見出される特異的な高レベルの発現によって示されるよりも広い発達的役割および
生理学的役割を有し得ることを示唆する。

ＡＭＰ−１８タンパク質は、胃腸（ＧＩ）管の細胞層の表面に発現しているようである
。発現細胞は、貯蔵された増殖因子を必要な場所−表面損傷に起因して、細胞修復が必要
なＧＩ管の陰窩および割れ目に放出し得る。

ＡＭＰ−１８は、漿膜側の基底外側細胞表面レセプターを通して作用するプロスタグラ
ンジンおよび他の増殖因子と共同で、上皮細胞の粘膜、先端表面に作用し得る。そのタン
パク質またはその誘導体は、おそらく胃の機械的ストレスおよび高酸性にもかかわらず、
高度に活動的な胃粘膜の正常な維持に重要である。ＡＭＰ−１８は、アルコール、非ステ
ロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、または病原体、特に、主に幽門洞に優勢に感染しそ
して胃潰瘍およびおそらく癌の原因であるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉのよ
うな因子による損傷後の胃上皮の修復に決定的な役割を果たし得る。

（２．生物活性）
ＡＭＰ−１８アミノ酸配列の中央領域に相当する合成ペプチド（４２アミノ酸、「４２
マー」）も、増殖因子活性を有し、それは特異的抗血清によって阻害される；いくつかの
関連するより短いペプチドも刺激活性を有するが、他は４２マーの活性を阻害し得る。こ
の結果は、飽和可能な上皮レセプターがＡＭＰ−１８のために存在し、そしてタンパク質
の生物活性領域を分析し、そして推定レセプターを同定する直接的な道を開く。ＡＭＰ−
１８は、公知のサイトカインまたは細胞保護タンパク質（トレフォイルペプチドのような
）のいずれとも構造が類似していないので、タンパク質、ならびにその活性および阻害性
の関連ペプチドの、細胞との相互作用の分析は、細胞増殖調節に関与する新規分子相互作
用を明らかにする機会を提供する。

ＢＳＣ−１細胞の増殖は、ゲル画分ブタ幽門洞抽出物によって刺激された；ブタ抽出物
タンパク質（２５０μｇ）を、２つのレーンそれぞれに負荷し、そしてポリアクリルアミ
ドゲル（１２．５％）で電気泳動を行なった；Ｍ_ｒ１４ｋＤａおよび２１．５ｋＤａの間
の各領域から５つの薄切片（２−３ｍｍ）を、実験的レーンから切り取った。切片の各対
を、２００μｌの滅菌ＰＢＳ、３％のアセトニトリル、および１％のＢＳＡを含むシラン
処理マイクロチューブに入れ、そして浸軟した；タンパク質を２２℃で１８時間、激しく
振とうしてゲルから溶出した；試料を次いでマイクロ遠心し、そして上清の試料を、ＢＳ
Ｃ−１細胞のコンフルエントな培養物に加えた；細胞数を４日後に計測した；最大の増殖
刺激が、約１８ｋＤａのＭ_ｒに対応するゲル切片から溶出された抽出物を加えた培養物で
観察された；培養培地に加えた組換えヒトＡＭＰ−１８に対する抗血清は、１８ｋＤａ画
分による増殖刺激を完全に阻害した（＋Ａｂ）；値は２つの培養の平均である；ＳＥは平
均の１０％より少ない。

ＡＭＰ−１８の生物活性（胃腸管の上皮細胞に関して分裂促進性）は、タンパク質のＣ
−末端側の半分に位置する。エピトープ配列は、分裂促進性配列のすぐＮ−末端側にある
ようである。

増殖因子である生物活性は、全長タンパク質配列の位置７８位から１１９位までの少な
くとも４２アミノ酸からなるペプチドによって示される。この領域に対する抗体は、分裂
促進活性を阻害した。１０４から１１７までのアミノ酸配列を有するペプチドは分裂促進
活性を有していたが、この領域に対する抗体はその活性を阻害（阻害）しなかった。位置
９７位−１１７位までのアミノ酸配列を有するペプチドは、４２アミノ酸配列を有するペ
プチドと同じ分裂促進活性を有するが、合成ペプチドとして産生するのにより安価である
。

（３．生物活性の阻害）
マウスまたはブタ幽門洞細胞抽出物によって刺激された上皮細胞の増殖は、完全、組換
えヒトＡＭＰ−１８前駆体タンパク質に対するウサギ抗血清によって阻害された；ＢＳＣ
−１細胞のコンフルエントな培養物を調製した；マウスまたはブタの幽門洞細胞抽出物を
調製し、そしてそのタンパク質濃度を測定した；細胞抽出物単独および異なる希釈の抗血
清、または抗血清単独（１：１００希釈）を培養培地に加え、そして細胞数を４日後に計
測した。マウス幽門洞ガストロカインによる増殖刺激は、１：４００の希釈の抗血清によ
って最大阻害され（９３％）、一方ブタ幽門洞タンパク質抽出物による刺激は１：１００
の希釈で完全に阻害された。記録した値は３つの培養の平均であった；平均の標準誤差（
ＳＥ）は平均の１０％より低かった。

ＡＭＰ−１８タンパク質に対する抗体は、インビボで胃腸管における異なるレベルのタ
ンパク質を決定する診療的な使用法を有する。もし通常より低いレベルのＡＭＰ−１８タ
ンパク質が存在するなら、潰瘍が発達する可能性がある。当業者に公知の技術によって正
常値を決定する、すなわち試験する人々の代表的な試料を得て（年齢、性別、臨床状態カ
テゴリー）、そしてタンパク質定量の標準的な技術を適用する。ＡＭＰ−１８レベルに対
するアスピリンおよびインドメタシンの効果も、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ
）を含む薬物の有害なレベルをモニターするために有用である。胃癌細胞系統は、少なく
とも本明細書中で開示される検出方法によっては、ＡＭＰ−１８タンパク質を発現しない
。

（４．ゲノムＤＮＡ）
おそらく遺伝子が活性であり得る組織における遺伝子発現レベルの大きな違いを決定す
る、遺伝子調節エレメントの分析に対する前置きとして、ゲノムＡＭＰ−１８ＤＮＡ配列
が、ヒトおよびマウスでクローニングされた。上流および下流側面配列を、遺伝子ノック
アウトの準備としてマウスゲノムＤＮＡから単離した。側面ゲノム配列が、おそらく胃お
よびそれが発現し得る少数の他の組織における非常に異なる遺伝子発現レベルを決定する
。異なる調節エレメントの関与によって、ガストロカイン遺伝子は他の組織において増殖
因子として発現され得る。

（５．本発明のガストロカインの使用）
ＡＭＰ−１８タンパク質およびそれ由来のあるペプチドは、胃および腸上皮細胞（およ
び腎臓）による増殖および創傷修復を刺激し得るので、これらのガストロカイン分子は、
薬剤学的介入、放射線治療、または手術の後の損傷されたＧＩ管の修復を速める治療的薬
剤の候補である。それに加えて、ガストロカインに対して発達させた抗体を、多様な病理
学的状態における血液組織のＡＭＰ−１８タンパク質またはペプチドのレベルを測定する
ためにキットで使用し得る。これらの新規分子は、胃潰瘍、および炎症性腸疾患の治療に
おいて大きな治療的可能性を有し、一方その機能を阻害する新規薬剤は、ＧＩ管の癌の治
療に有用であることを示し得る。

胃は、多くの細菌にとって生来の場所ではなく、そして酸性で生存し得る細胞はそこに
定着しない（Ｒｏｔｉｍｉら、１９９０）。従って、幽門洞領域が、ヒト人口の大部分に
感染し（７０年目までに＞６０％）、そして胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍（Ｇｏｏｄ
ｗｉｎら、１９８６；Ｂｌａｓｅｒ、１９８７）、および胃腺癌（Ｎｏｍｕｒａら、１９
９１；Ｐａｒｓｏｎｎｅｔら、１９９１）に関連する原因である、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｃ
ｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの接着、侵入、および細胞溶解効果の好ましい部位であることは興
味深い。従って上皮細胞増殖因子として、ＡＭＰ−１８は細菌の侵入および細胞溶解によ
って引き起こされた損傷を改善するために作用し得る。ＡＭＰ−１８の特異的幽門洞発現
およびＨ．ｐｙｌｏｒｉの好ましい結合部位を合わせて考慮すれば、その細菌はＡＭＰ−
１８を刺激因子（ｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ）として使用することが可能である。Ｈ．
ｐｙｌｏｒｉはフコースを含むムチン顆粒を有する幽門洞細胞に結合する（Ｆａｌｋら、
１９９３；Ｂａｃｚａｋｏら、１９９５）。これらの顆粒はまた、ＡＭＰ−１８も含み得
る。両生類Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓの胃で、抗菌ペプチドが発見された（Ｍｏｏｒ
ｅら、１９９１）。ＡＭＰ−１８構造のいくつかのドメインは、マガイニンのものと類似
しており、そしておそらくＡＭＰ−１８は腸細菌と相互作用する。

（６．ブタＡＭＰ−１８の単離）
ヒトＡＭＰ−１８タンパク質に対する抗血清を使用して、ブタ幽門洞粘膜の抽出物から
タンパク質を精製するのを補助した。全組織抽出物に適用した免疫親和性方法はあまり効
果的でないことが判明したが、細胞画分をモニターするためのイムノブロット、勾配遠心
分離およびゲル電気泳動を使用することによって、十分な量のブタ１８ｋＤａポリペプチ
ドを精製して、天然Ｎ−末端は、シグナルペプチドの除去のために正確に予測されるアラ
ニン−アスパラギン酸部位における、ＯＲＦのＮ−末端からの２０アミノ酸の切断によっ
て予測されるものであることを、配列決定によって確認した。成熟タンパク質におけるア
スパラギン残基が豊富さにもかかわらず、糖鎖付加に特徴的なコンセンサスな状況に合う
ものは存在しない。タンパク質のかなり長い領域が、両親媒性ヘリックス（ｈｅｌｉｘ）
形成傾向を有し得る。後者は、処理後に生物活性ペプチドを産生するタンパク質内のユニ
ットに相当し得る。円二色性を用いて、ヒトプレＡＭＰ配列（図３）のアミノ酸１２６−
１４３に相当する合成ペプチドは、マガイニン型の抗菌ペプチドを含むいくつかの生物活
性ペプチドのヘリックス傾向を評価するために使用される、中程度のトリフルオロエタノ
ール濃度の条件で、容易にヘリックスになるよう誘導される（例えばＰａｒｋら、１９９
７を参照のこと）。

（７．Ｅ．ｃｏｌｉにおける活性組換えヒトＡＭＰ−１８の調製）
２０アミノ酸の疎水性シグナルペプチド配列を、６ヒスチジン残基のスターチ（ｓｔａ
ｒｃｈ）を含むＮ−末端１２アミノ酸ペプチドで置換した、ヒトＡＭＰ−１８をコードす
るｃＤＮＡを設計した（図１３、左のパネル）。この改変ｃＤＮＡ配列の発現は、１７７
アミノ酸タンパク質産物（Ｍ_ｒ１９，６５３）を産生することが予測され、それをＨｉｓ
−６タグに結合するＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて容易に精製し得る。Ｎ−末端シグナルペプ
チドをコードする領域を欠くｃＤＮＡ配列（図１４を参照のこと）を、ＱＥ３０発現ベク
ター（ＱＩＡＧＥＮ）のＢａｍＨＩ部位へ産物を挿入する適当なリンカーを提供するオリ
ゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによって増幅した；組換えベクターの配列を確認した。
Ｈｉｓ−６タグで操作した組換えヒト（ｒｈ）ＡＭＰ−１８を、続いてＥ．ｃｏｌｉ細胞
で発現した。それを回収するために、細菌を溶解し、そして可溶性および不溶性画分のア
リコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その後ｒｈＡＭＰ−１８前駆体に対する特異的ウサ
ギ抗血清を用いてイムノブロットを行なった。発現したタンパク質は、溶解物の可溶性画
分にはほとんど検出されなかった。

尿素（６Ｍ）を採用して、不溶性画分からタンパク質を放出し、Ｈｉｓ６−タグを含む
ｒｈＡＭＰ−１８を可溶化し、そしてＮｉ^２＋荷電樹脂への結合に利用可能にして、続い
てそれからイミダゾールの勾配（０〜２００ｍＭ）で溶出した。溶出されたｒｈＡＭＰ−
１８の量を、ＢＣＡアッセイを用いて測定し、そして予測された１９−２０ｋＤａの大き
さにおける単一バンドの出現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてイムノブロッティングによっ
て確認した。溶出されたｒｈＡＭＰ−１８が復元して分裂促進性の構造をとるかどうか決
定するために、溶出物のアリコートを（透析によって尿素およびイミダゾールを除去した
後）、ＩＥＣ−１８細胞の培養物に加え、そして細胞数を４日後に計測した。図１３（右
のパネル）は、組換えタンパク質は、分裂促進性ＡＭＰペプチド７７−９７（または図１
１に示したブタ由来の可溶性幽門洞組織抽出物）を刺激するのと同じ最大程度細胞の増殖
を刺激するが、ペプチド７７−９７より１オーダー低い程度の最大半減濃度で刺激するこ
とを示す。ＡＭＰペプチド７７−９７は成熟タンパク質を指す；ヒト前駆体タンパク質の
ペプチド９７−１１７と同じである：表１。これらの観察は、多様な臨床的状況で利用し
得る生物学的に活性な組換えヒトＡＭＰ−１８が入手可能であることを示す。ｒｈＡＭＰ
−１８の分裂促進能力は、インビボで胃の維持および修復に関与するネイティブな胃細胞
増殖因子で予測されるナノモルの範囲である。

（８．ＡＭＰ−１８および誘導ペプチドによる胃および腸上皮細胞の増殖および回復の
刺激）
ＡＭＰ−１８に反応する胃および腸細胞の能力を特徴付けるために、ＡＧＳ胃腺癌細胞
、ＳＶ４０ラージＴ抗原で形質転換したＨＡＥヒト胃幽門洞粘膜初代培養物、ＩＥＣ−６
（図１５）およびＩＥＣ−１８系統のラット二倍体小腸上皮細胞、ＮＣＩＮ−８７胃癌腫
細胞、およびＳＫ−ＧＴ５胃食道腺癌細胞を研究した；ヒトＷＩ−３８線維芽細胞および
ＨｅＬａ細胞を非ＧＩコントロール細胞系統として扱った。細胞を目的の薬剤に曝露して
３〜４日後に細胞数計測を行ない、単一細胞を調製するために培養をトリプシン処理し、
そして血球計算器でそれらを計測しながらこれを確認することによって、分裂促進をアッ
セイした。

ＡＭＰ−１８を含む幽門洞抽出物、ペプチド７７−９７、またはＥＧＦはそれぞれＡＧ
Ｓ細胞の増殖を刺激し、そして予測されたように、組換えヒトＡＭＰ−１８前駆体タンパ
ク質に対するウサギ抗血清は、幽門洞抽出物の活性を阻害したが、エピトープを欠くペプ
チド７７−９７の活性は阻害しなかった（図１１）。ペプチド７７−９７による増殖刺激
は、ＥＧＦのものと相加的であった。ＡＧＳ細胞の増殖は、スクランブルペプチド７７−
９７またはペプチド６７−８５によって刺激されず、そしてペプチド６７−８５はペプチ
ド５８−９９による増殖刺激を完全に阻害する。ＨＡＥ細胞を使用して、ＡＭＰ−１８が
その合成の局所環境に存在する上皮細胞に対して効果を発揮し得るかどうかを試験した。
Ｄｒ．Ｄｕａｎｅ Ｓｍｏｏｔ、Ｈｏｗａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって提供されたこれらの細胞は、完全に不死化されておら
ず、そして従って限られた継代数を有する。ペプチド７７−９７によるＨＡＥ細胞の増殖
刺激は、明らかにＥＧＦのものと相加的である（図１６、左のパネル）。ＡＭＰペプチド
は増殖を刺激するだけでなく、遊走促進因子としても作用し、コンフルエントな培養物に
おいて作られた引っかき傷に、より迅速な細胞の遊走（回復）を引き起こす。この創傷回
復の増強も、ＥＧＦと高い相加性を示した（図１６、右のパネル）。相乗作用が存在する
かどうかにかかわらず、観察された相加性は、ＡＭＰ−１８がインタクトなまま胃粘膜上
皮の維持、および損傷後の修復の促進に重要な役割を果たし得ることを支持する。ラット
二倍体ＩＥＣ−６細胞の増殖もまた、幽門洞抽出物、ペプチド７７−９７、およびＥＧＦ
によって刺激されたが、ペプチドはＥＧＦより強力な分裂促進因子であるようであった（
図１５）。最大に近い増殖刺激が、０．５μｇ／ｍｌ（０．２３μＭ）のＡＭＰペプチド
濃度で検出され（図１５、中央のパネル）、それは培養物中でその効果を発揮するのにト
レフォイルペプチド（１μｇ／μｌ）（約１５０μＭ）またはα−デフェンシン、クリプ
トジン３（ｃｒｙｐｔｄｉｎ３）（６６０μｍ／ｍｌ）（約１４０μＭ）で必要な濃度よ
りも非常に低い値であった。ＩＥＣ−１８細胞に対するｒｈＡＭＰ−１８の最大分裂促進
効果は、５ナノモルで観察された（図１８）。ペプチド７７−９７の分裂促進効果を、Ｉ
ＥＣ−６細胞における［^３Ｈ］チミジンのＤＮＡへの組込みを測定することによって確証
し、それはペプチドによって１６，６６８±６１６から２８，０３６±８８２まで６８％
（Ｐ＜０．００１）刺激された。創傷回復の刺激は、ＥＧＦと匹敵し、そして明らかにそ
れと相加性であった。スクランブルペプチド７７−９７は、８μｇ／ｍｌまでの濃度で、
ＩＥＣ−１８細胞またはＢＳＣ−１細胞の増殖を刺激しなかった。胃ＮＣＩＮ−８７細胞
および胃ＳＫ−ＧＴ５細胞もまた、ペプチド７７−９７、幽門洞抽出物、またはＥＧＦに
よって濃度依存的な様式で刺激された。ＡＭＰ−１８抗血清は、幽門洞抽出物またはＥＧ
Ｆの分裂促進効果を、濃度依存的な様式で阻害した。ＡＭＰ−１８抗血清は、これら２つ
の胃上皮細胞系統に対する幽門洞抽出物の分裂促進効果を阻害したが、ペプチド７７−９
７またはＥＧＦの増殖効果は阻害しなかった。免疫前の血清は、増殖に影響しなかった。
これらの結果は、ＡＭＰ−１８およびそのペプチド誘導体は、インビボで機能して損傷後
の修復の間に増殖および回復を刺激し得ることを示唆する。ＡＭＰペプチド７７−９７は
、８μｇ／ｍｌまでの濃度において、ヒト線維芽細胞（ＷＩ−３８）または類表皮細胞（
ＨｅＬａ）の増殖を刺激せず、その分裂促進効果は比較的上皮細胞特異的であることを示
唆する。

（９．ＡＭＰ誘導ペプチドによるＩＥＣ−１８細胞増殖の競合的阻害）
細胞表面におけるＡＭＰペプチドおよびその結合部位の間の相互作用についてさらなる
情報を得るために、非形質転換ラットＩＥＣ−１８細胞を研究した。非分裂促進性ペプチ
ド６７−８５の濃度を徐々に増加させることは、もしこの分裂促進性４２マーがレセプタ
ーによるメカニズムによってその効果を発揮するならば、ペプチド５８−９９による増殖
刺激を阻害する。３日間のアッセイで、ペプチド５８−９９は、ビヒクルによる２９０％
と比較して、細胞数の４０７％の増加を刺激した。ペプチド６７−８５の濃度を約０．１
μｇ／ｍｌまで徐々に増加させると、ペプチド５８−９９の増殖刺激効果はほとんど消失
した（図１７）。この結果は、その２つのペプチドは同じ表面「レセプター」部位に対し
て競合することを示唆する。

（１０．ＡＭＰ−１８に対する抗血清は、ｒｈＡＭＰ−１８の分裂促進効果を中和化す
る）
進行中の研究は、ＡＭＰ−１８前駆体に対するウサギ抗血清は、イムノブロットでｒｈ
ＡＭＰ−１８を認識することを明らかにする。その抗血清はまた、ブタ幽門洞組織抽出物
（図１１）およびＡＭＰペプチド５８−９９の分裂促進効果も阻害し、そしてヒトおよび
マウスの胃幽門洞組織の細胞においてＡＭＰ−１８を免疫学的局在決定する。図１８は、
抗血清がＩＥＣ−１８細胞のコンフルエントな培養物において、ｒｈＡＭＰ−１８の分裂
促進効果を中和化することを示し、それによってネイティブなタンパク質と同様に組換え
体を研究するためにその有用性を広げる。

ＧＩ上皮細胞を用いて、結果は、ｒｈＡＭＰ−１８の細胞保護効果は、密着結合（ＴＪ
）タンパク質の蓄積を促進する能力によって媒介され得ること、およびそれは強力な分裂
促進因子であることを示唆する。その結果はまた、ＡＭＰペプチド７７−９７は、その生
理的効果を発揮するのに比較的より高い濃度を必要とするが、そのペプチドはｒｈＡＭＰ
−１８の適切な代理であることを意味する（図１３）。

ｒｈＡＭＰ−１８の収率を改善するために、ＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビター
カクテルを使用し、リゾチームを加えてＥ．ｃｏｌｉ細胞の破片を消化し、そして組換え
タンパク質を１ＭのイミダゾールでＮｉ^２＋ビーズから溶出する。

（１１．ＡＭＰペプチドは、引っかいて傷つけた後の胃および腸の上皮細胞の回復を刺
激する）
図１９に示したデータは、分裂促進効果が細胞数の増加によって検出され得る前の時間
、ＡＭＰペプチドへの曝露の２４から４８時間後に得られた。その結果は、ＡＭＰペプチ
ドが引っかき傷をつけたＨＡＥ系統のヒト胃腺癌由来の細胞、およびＩＥＣ−１８系統の
非形質転換ラット腸細胞における回復を刺激することを示す。従ってＡＭＰペプチドは、
培養物中で胃および腸の上皮細胞の回復を迅速に刺激し、そしておそらくインビボで損傷
した胃粘膜の再舗装（ｒｅｓｕｒｆａｃｅ）を速め得る。

（１２．ＡＭＰペプチドはチロシンキナーゼ活性を誘導し、このことは、その機能的効
果が細胞表面レセプターによって媒介されることを示唆する）
ＡＭＰ−１８の生理学的効果は特異的であり、そしてレセプター媒介性であるという証
拠を得るために、ＡＭＰペプチドを試験して、それがＧＩ上皮細胞においてチロシンリン
酸化を誘導するかどうかをみた。

ＩＥＣ−１８細胞をＡＭＰペプチド７７−９７で、以前に、６０分までの異なる時間で
最大増殖刺激のために必要なものより多いことが示された濃度で処理した。次いで細胞を
溶解し、タンパク質を抽出し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ブロット
し、そしてブロットを４Ｇ１０抗ホスホチロシンモノクローナル抗体でプローブした。そ
のブロットは、細胞をＡＭＰペプチド（８μｇ／ｍｌ）に曝露させることが、２分後に、
いくつかのタンパク質（４２ｋＤａおよび５５ｋＤａの分子量を有するものを含む）のチ
ロシンリン酸化を引き起こすことを示し、このことは、ＡＭＰ−１８シグナル伝達におけ
る活性化ＥＲＫ１および活性化ＥＲＫ２の役割を示唆する。５分後に、いくつかのタンパ
ク質のチロシンリン酸化の程度が減少し、そして他は６０分まで持続した。

ＡＭＰペプチドおよびおそらくＡＭＰ−１８は、その分裂促進、遊走促進、および細胞
保護効果を、細胞表面レセプターを通してシグナル伝達し、そして特異的細胞タンパク質
のチロシンリン酸化を刺激する可能性がある。

（１３．ＡＭＰペプチド７７−９７は、上皮細胞のバリア機能の発達を増強し、そして
細胞保護的である）
バリア機能の維持は、胃管腔から外来性の抗原および細菌の侵入を防ぐために、および
電解質、水および栄養素の特定の方向への輸送のような他の機能のために必要不可欠であ
る。単独でまたは他の薬剤と協同で作用して、ＡＭＰ−１８は粘膜損傷後の迅速なバリア
機能の復帰を媒介し得る。ＡＭＰペプチド７７−９７がバリア機能の発達を促進し得るか
どうか、および反応性酸素代謝物、インドメタシン、またはデキストラン硫酸ナトリウム
（ＤＳＳ）が、粘膜の透過性を増加させ、そして上皮密着結合を維持するために必要な細
胞の完全さを傷つけた場合に、機能の損失を防止する細胞保護剤として作用し得るかどう
かを決定するために、上皮密着結合のマーカーとして比較的高い値のＴＥＲを示すことが
知られている細胞系統を使用した。最初に、ペプチド７７−９７は、よく特徴づけされた
、非形質転換ＭＤＣＫ細胞の単層培養においてＴＥＲの成熟を調節する。図２０は、ペプ
チドへの曝露は、２４時間までに、そしてその後より高い程度まで単層におけるＴＥＲを
増加させることを示す。この観察は、ＡＭＰ−１８またはＡＭＰペプチドが損傷後のＧＩ
上皮の回復を速め、そしてバリア機能の発達を増強し得ることを示唆する。

ＡＭＰペプチドが、粘膜酸化損傷の組織培養モデルにおいてバリア機能を保護するかど
うかを決定するために、細胞単層に、モノクロラミンを用いて反応性酸素代謝物損傷を与
えた。図２１の結果（パネルＡ）は、モノクロラミンに曝露し６０分後、ビヒクルまたは
ＥＧＦで処理したＭＤＣＫ細胞は、ＴＥＲのかなりの損失を示し、一方ペプチド７７−９
７で処理した培養物のＴＥＲは、損傷していない単層と同様であることを示す。それは、
ＡＭＰペプチドはこのセットの条件下で細胞保護的であるがＥＧＦはそうではないことを
示唆し、一方以前に、これら２つの分子は胃および腸の上皮細胞に同等および相加的な分
裂促進因子および遊走促進因子であることが見出されたので、これらの結果は非常に興味
深い。ペプチド７７−９７の細胞保護効果はまた、酸化剤（図２２、パネルＢ）またはイ
ンドメタシン媒介性（パネルＣ）損傷の設定で、ヒト結腸腺癌系統由来のＣａｃｏ２／ｂ
ｂｅ（Ｃ２）細胞においても明らかであった。

（１４．ＤＤＳ損傷後のＡＭＰペプチドの細胞保護効果）
ＡＭＰペプチドの、インビボで大腸炎において細胞保護効果を発揮する潜在的な能力を
評価するために、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の溶液を、結腸上皮のモデルに
使用したＣ２細胞単層の培養培地に加えた。バリア機能のＤＳＳ媒介損傷を、これらの単
層培養におけるＴＥＲを測定することによって定量した。図２２は、ＤＳＳ（４％）が４
５分後にＴＥＲをコントロール値の約３０％に抑制したこと、そしてＡＭＰペプチドが細
胞保護的であったことを示す。この観察は、ＡＭＰペプチドを、ＤＳＳ媒介大腸炎のマウ
スモデルにおいて治療薬として評価する、強力な生理学的原理を提供する。

ＡＭＰペプチドが、ＩＢＤを治療するために設計された薬剤の非常に求められている機
能的特徴である、ＤＳＳ誘導結腸細胞損傷後のＴＥＲの回復を速め得るかどうか決定する
ために、Ｃ２細胞単層をＤＳＳ（５％）に１０分間接触させ、これは、ＴＥＲをコントロ
ール値の３３±６％に抑制した。ＤＳＳを、培地を吸引し、そして新しい培地と交換する
ことによって除去した。ＡＭＰペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）またはビヒクルを培
養培地に加え、そして１８時間後にＴＥＲを測定した。ビヒクルの存在下で、ＴＥＲはコ
ントロール値の３３％から６６±７％まで増加し、一方ＡＭＰペプチドに曝した細胞はコ
ントロールの１１２±４％の値に達した。ＤＳＳ媒介大腸炎の組織培養モデルにおけるそ
の有益な結果は、ＡＭＰペプチドがインビボで損傷結腸上皮におけるバリア機能の回復を
速め得ることを示唆する。

（１５．結腸上皮細胞におけるＡＭＰペプチドの細胞保護効果は、増加した密着結合タ
ンパク質の蓄積によって媒介され得る）
図２１Ｂは、ＡＭＰペプチド７７−９７が、酸化損傷後のＣａｃｏ２／ｂｂｅ（Ｃ２）
細胞における経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）の減少を鈍らせることを示す。そのペプチドがど
のようにその細胞保護効果を発揮するのか調査するために、Ｃ２細胞単層を、ＡＭＰペプ
チドで処理し、そして１８時間後にモノクロラミンで酸化損傷を誘発した。特異的密着接
合（ＴＪ）タンパク質のレベルの変化をチェックした。細胞を溶解し、そして不溶性／微
粒子画分のタンパク質を、イムノブロッティングによって研究した。図２３は、０時、お
よび酸化剤誘発損傷の６０分後において、ビヒクルで処理した細胞よりもＡＭＰペプチド
で処理した細胞においてより多くの免疫反応性ＺＯ−１およびオクルディンが存在するこ
とを示し、これらＴＪタンパク質がより豊富にあり、それによって単層におけるＴＥＲの
損失を鈍らせ、そしてバリア機能を保持することを示唆する。これらの観察は、ＡＭＰペ
プチドは、細胞が酸化損傷を受ける前の１８時間にＴＪタンパク質の蓄積を増強したこと
を示した。非損傷細胞を研究し、そしてＡＭＰペプチド（またはｒｈＡＭＰ−１８）は、
未処理細胞と比較して、免疫反応性ＺＯ−１およびオクルディンの量を迅速に増加させた
ことを示した（図２４）。これらの変化は、いくつかの他のＴＪタンパク質（ＺＯ−２、
クローディン−１、クローディン−２、クローディン−５）または熱ショックタンパク質
（ＨＳＣ）７３で観察されなかったので、ＺＯ−１およびオクルディンに比較的特異的な
ようである。

（１６．ｒｈＡＭＰ−１８の細胞保護効果）
十分な量の精製ｒｈＡＭＰ−１８を調製して、モノクロラミン媒介酸化損傷後のＣａｃ
ｏ２／ｂｂｅ（Ｃ２）細胞における経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）の減少を鈍らせたＡＭＰペ
プチド７７−９７と比較して、ｒｈＡＭＰ−１８が細胞保護的であるかどうかを試験した
（図２１Ｂ）。図２５は、モノクロラミンへの曝露が、４５分でＴＥＲを約３５％に抑制
し、一方ｒｈＡＭＰ−１８またはペプチド７７−９７で前処理した細胞が約１０％のＴＥ
Ｒの減少しか示さなかったことを示す。図２６は、８時間のｒｈＡＭＰ−１８によるＣ２
細胞の処理が、ビヒクルで処理した細胞と比較して、免疫反応性ＺＯ−１およびオクルデ
ィンの量を増加させることを示す。これらの結果は、ＡＭＰ−１８はその細胞保護効果を
、特異的ＴＪタンパク質の蓄積を増強することによって媒介し得、そしてそれによって粘
膜損傷後のＧＩ管に沿ったバリア機能を保持し得ることを示唆する。

（１７．ＡＭＰペプチドの投与は、ＤＳＳ誘発大腸炎を有するマウスにおいて糞中の血
液の出現を遅らせ、そして体重減少を抑制する）
ＡＭＰペプチドの治療的有効性を評価するために、マウス（各１２−１５グラム）に飲
料水中３％のＤＳＳ（Ｍ_ｒ３６−４４ｋＤａ）を与えることによって、ＤＳＳ大腸炎をＣ
５７／ＢＬ６オスマウスで誘発した。大腸炎の証拠（糞中の血液）は、早くて１日目に（
図２７、左のパネル）、そして４日目までに全ての動物で見出された。毎日皮下（ｓ．ｃ
．）注射によって投与されたＡＭＰペプチドは、潜血（ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ）−陽性糞の
出現を遅らせ、そしてまた体重減少の程度も抑制した（図２７、右のパネル）。これらの
肯定的な発見は、大腸炎およびＧＩ管の粘膜表面を傷つける他の疾患における有用な治療
薬としてのＡＭＰペプチドを強力に支持する。

ＡＭＰ−１８の合成は、ヒトおよび他の哺乳動物の、胃幽門洞の管腔粘膜裏打ち上皮細
胞に限られている。細胞内で、そのタンパク質は分泌顆粒中でムチンと同時局在しており
、そして先端の原形質膜の上にある粘液に分泌されるようである。Ｅ．ｃｏｌｉで調製さ
れた組換えヒトＡＭＰ−１８は、成熟タンパク質の中央由来の増殖促進ペプチドよりも１
オーダー低い程度の濃度で分裂促進効果を発揮する。最も強力な分裂促進ペプチドである
ペプチド７７−９７は、アミノ酸配列特異的であり、そしてそれは線維芽細胞またはＨｅ
Ｌａ細胞の増殖を刺激しないので、細胞型特異的であるようである。特異的ＡＭＰペプチ
ドによる分裂促進は、活性分裂促進因子ではないあるペプチドが、ペプチド５８−９９お
よび幽門洞細胞抽出物の増殖刺激効果を、濃度依存的な様式で競合的に阻害し得るので、
細胞表面レセプターによって媒介されるようである。ＡＭＰ−１８およびその誘導ペプチ
ドは、胃および腸上皮細胞に対して多様な効果を示し、それはそれらが胃粘膜損傷後の修
復に決定的な役割を果たし得ることを示唆する。これらは細胞保護、分裂促進、回復、お
よび酸化剤、ＤＳＳ、および／またはインドメタシン媒介損傷後のバリア機能の成熟を含
む。ＡＭＰ−１８またはそのペプチド誘導体がその多面発現性の効果を媒介する可能性の
あるメカニズムは、タンパク質チロシンキナーゼ活性の刺激、細胞ストレス後の熱ショッ
クタンパク質発現の延長、ならびに／または密着結合関連タンパク質ＺＯ−１およびオク
ルディンの増強された蓄積を含む。これら生理学的効果のあるものは、トレフォイル（ｔ
ｒｅｆｏｉｌ）ペプチドまたはα−デフェンシン、クリプトジン３（＞１００μＭ）のよ
うな他の胃ペプチドメディエーターの濃度と比較して、ｒｈＡＭＰ−１８（＜５０ｎＭ）
で比較的低い濃度で起こり得る。免疫反応性ＡＭＰ−１８が、明らかにインドメタシン胃
管栄養後にマウス幽門洞の細胞によって、およびフォルスコリンに接触させた一次培養中
のイヌ幽門洞細胞によって放出され、これは、そのタンパク質は調節を受けることを示唆
する。ＡＭＰ−１８は、インビボで胃粘膜上皮における創傷治癒のような生理学的過程お
よび病理学的過程で役割を果たしているようである。マウス大腸炎のＤＳＳモデルにおい
て血液性糞の出現を遅らせ、そして体重減少の程度を抑制するＡＭＰペプチドの能力は、
ＧＩ管の粘膜を損傷する多様な疾患（炎症性腸疾患、胃潰瘍等）における治療的有効性を
示唆する。

（材料および方法）
（１．幽門洞特異的ｃＤＮＡクローンの単離）
胃酸分泌ならびに粘膜および膵臓細胞の増殖を調節する（Ｙｏｏら、１９８２）胃腸（
ＧＩ）ペプチドガストリンのｃＤＮＡクローンを単離した。これらのスクリーニングから
、胃の幽門洞において比較的特異的に発現されるいくつかの他のｍＲＮＡを発見した。こ
れらＲＮＡの１つにおけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ブタおよびヒト
の間で高度に保存されており、そしてすぐに明らかな機能を持たない新規保存タンパク質
を予測した。特異的抗体を使用して、同様のタンパク質種が、試験した全ての哺乳動物の
胃幽門洞粘膜に存在することを示した。これらの配列の発現に組織特異性が存在し、そし
てそれらは明らかに哺乳動物種の幽門洞粘膜に普遍的に存在する。

（２．ＲＮＡ発現）
ｃＤＮＡクローンの単離が、胃幽門洞の粘膜における選択的な発現について予測され、
そしてこれは、最初にｃＤＮＡ配列でプローブした様々な組織由来のＲＮＡのノーザンブ
ロットハイブリダイゼーションによって、そして続いてタンパク質分析によって確認され
た。ノーザンブロットは、ブタの胃腸管内におけるｍＲＮＡ発現の特異性を示した。最も
高いｍＲＮＡ発現は、幽門洞粘膜であり、隣接する体の粘膜では変動する量、そして底、
食道および十二指腸では検出不可能なレベルであった。幽門洞および体の非粘膜組織は、
ｃＤＮＡプローブに反応するＲＮＡをほとんど含んでいなかった。

（３．発現されたタンパク質に対する抗体）
ヒトおよびブタｃＤＮＡクローンのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、非常
によく似た比較的低分子量（ＭＷ）のタンパク質を予測し、それはコンピューターデータ
ベースの公知のタンパク質と近いホモログを有さず、そして従って可能性のある機能につ
いてほとんど示さない。推定タンパク質の生物学的役割を研究するアプローチとして、Ｎ
−末端Ｈｉｓ６タグもコードするベクターを用いて、全ｃＤＮＡ配列をＥ．ｃｏｌｉで発
現させた。不運なことに、細菌で発現した場合、そのポリペプチド産物は不溶性であり、
そして生化学的研究のために容易に分析できない。しかし、ヒトｃＤＮＡの細菌産物を、
抗血清を誘発するためにウサギで免疫原として使用したドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）ゲルで分離した。その血清を、多くの哺乳動物種由来の幽門洞組織のタンパク質抽出物
に対してスクリーニングした。この手順は、免疫原と試験した哺乳動物の幽門洞に発現す
る約１８ｋＤａのタンパク質とのどちらも認識し得る、いくつかの高力価、低バックグラ
ウンドの抗血清を産生するのに成功した。細菌で発現したタンパク質は、シグナルペプチ
ド配列およびＨｉｓ６タグを含むので、よりゆっくり移動する。免疫前血清は、有意な１
８ｋＤａ反応性を示さなかった。ヒトｃＤＮＡクローンから発現したタンパク質に対して
産生された抗血清の、様々な哺乳動物（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラットおよびマウス；最後
はＳＤＳゲルにおいて常にわずかにより速く移動する）由来の幽門洞抽出物の非常によく
似たＭＷのタンパク質との交差反応性は、ヒトおよびブタｃＤＮＡのＯＲＦの比較によっ
て予測されたアミノ酸配列の保存のレベルを支持する（図１０を参照のこと）。続く実験
において、シグナルペプチドを有するヒトＡＭＰ−１８を細菌で産生した。

免疫前血清は、全ての組織抽出物のウェスタンブロットでわずかな反応を与えるが、２
つの免疫血清（１：５００００希釈までで）はどちらも１８−２０ｋＤａの主なバンドの
みを与え、それらは胃幽門洞抽出物においてのみであり、そして隣接する体抽出物におい
てはより少ない程度である。その血清は、細菌で発現したタンパク質に対して産生したの
で、動物起源の他の外来性免疫原の可能性は存在しない。

イムノブロットによって決定されたように、幽門洞に対する発現の特異性は、ノーザン
ブロットが示唆するよりも大きく、そして幽門洞抽出物からのシグナルの強度は、タンパ
ク質が比較的豊富にあることを意味するが、定量的推定は行なわなかった。試験した非胃
組織において有意な抗原は検出されなかった。

免疫組織化学は、両方の免疫前血清による幽門洞組織のわずかな染色を示し、一方両方
の免疫血清は、表面粘膜細胞をかなりの希釈で非常に強力に染色した。免疫前血清は、免
疫電子顕微鏡研究における免疫金染色を引き起こさなかった。幽門洞抽出物の増殖因子活
性は、両方の免疫血清によって阻害されるが、免疫前血清によって阻害されない。最後に
、増殖因子活性を有し、免疫血清によって阻害されるが免疫前血清によって阻害されず、
そして免疫血清によって認識されるが免疫前血清によって認識されないエピトープを有す
る合成ペプチドの結果は、これら試薬の特異性をさらに確認する。

（４．ブタ胃粘膜組織由来のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション）
全ＲＮＡを電気泳動し、膜に移動させてそして標識したブタＡＭＰ−１８ｃＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイズした。各レーンのＲＮＡ試料の供給源は以下の通りである：１．遠
位十二指腸；２．近位十二指腸；３．幽門洞；４．隣接する体；５．底；６．食道。等量
のＲＮＡを負荷した。幽門洞に隣接する体のＲＮＡからのシグナルは変動した。サイズマ
ーカー（ヌクレオチド）を、比較のために同じゲルに流した。

（５．ヒト幽門洞特異的ｃＤＮＡクローンによって指示された、細菌で発現したタンパ
ク質に対して産生されたウサギ抗血清を用いたイムノブロット）
全組織タンパク質を、ＳＤＳ緩衝液に溶解し、電気泳動し、そして膜に移動させて免疫
血清（１：５００００）と反応させた。結合した抗体分子を、ペルオキシダーゼ標識抗ウ
サギ抗体を用いて検出した。免疫前血清は、１：２００希釈で同時に行なったブロットの
特異的染色を与えなかった。レーン：１、６、１３、１７はマーカーを含んでいた。２Ｈ
ｅＬａ細胞。３マウスＴＬＴ細胞。４発現ヒトタンパク質＋ＨｅＬａ細胞。７マウス体。
８マウス幽門洞。９マウス十二指腸。１０マウス腸。１１マウス肝臓。１２発現ヒトタン
パク質＋ＴＬＴ細胞。１４マウス幽門洞。１５マウス脳。１６マウス腎臓。１８ブタ幽門
洞。１９マウス幽門洞。

高パーセントアクリルアミドゲルのイムノブロットは、抗血清が合成ペプチド７８−１
１９のエピトープを認識したことを示した。配列のこの領域は、タンパク質の表面に露出
しており、そして抗原性であることが予測されたので、ペプチド７８−１１９の抗体との
反応は予期しないものではなかった。これは、ＡＭＰ−１８またはその直前の前駆体が上
皮細胞の増殖因子であるという考えをさらに実証するだけでなく、ＡＭＰ−１８の生物活
性（および抗原性）領域の分析の基礎、および細胞レセプター数および同一性を評価する
道具を提供する。ペプチドの化学合成はまた、さらなる細胞研究のために、かなりの量の
精製「野生型」および「変異」試薬の簡便および迅速な供給源を利用可能にする。それら
の最大効果は相加的でないので、合成ペプチド７８−１１９は、明らかに幽門洞タンパク
質と同じメカニズムで作用する。

（６．プレＡＭＰオープンリーディングフレームの配列および予測される構造）
ヒトおよびブタの予測アミノ酸配列は７６％同一である。予測されるシグナルペプチド
は目立たない；天然ブタＡＭＰのＮ−末端は、アスパラギン酸であることが示された（図
１０）。

（７．天然タンパク質の構造）
ヒトおよびブタｃＤＮＡのＯＲＦは、同様の一般的構造を有するポリペプチドを予測し
た（図１０）。他に未修飾のヒトおよびブタタンパク質の予測される分子量は、それぞれ
１８．３および１８．０であった；これらの値は、本発明の抗血清と反応する幽門洞タン
パク質のＳＤＳにおける電気泳動移動度とよく一致する。

抗血清を使用して、ブタ幽門洞粘膜の抽出物からのタンパク質の精製を助けた。全組織
抽出物に適用した免疫親和性方法は、あまり有効でないことが示されたが、細胞分画をモ
ニターするためのイムノブロット、勾配遠心、およびゲル電気泳動を使用することによっ
て、十分な量のブタ１８ｋＤａポリペプチドを精製し、配列決定によって、天然Ｎ−末端
が、正確にシグナルペプチドの除去のために予測されるアラニン−アスパラギン酸部位に
おけるＯＲＦのＮ−末端から約２０アミノ酸の切断によって予測されたものであることを
確認した。アスパラギン残基は豊富にあるが、糖鎖付加のコンセンサスコンテキストにあ
うものはなかった。両親媒性ヘリックス形成傾向を有し得るかなり長い領域。後者は、タ
ンパク質内のユニットまたは処理後のペプチドに相当し得る。円二色性を用いて、ヒトプ
レＡＭＰ配列（図３）のアミノ酸１２６−１４３に相当する合成ペプチドは、マガイニン
型の抗菌ペプチドを含むいくつかの生物活性ペプチドのヘリックス傾向を評価するために
使用される、トリフルオロエタノール条件の中程度の濃度においての、ヘリックスになる
よう容易に誘導される（例えばＰａｒｋら、１９９７を参照のこと）。

（８．ＡＭＰ−１８の位置推定）
ＡＭＰ−１８に対する抗血清は、マウス幽門洞領域の切片と強力に反応するが底、十二
指腸、または腸と反応せず、優れた組織化学的プローブであることが証明され、イムノブ
ロットの結果を確認した。免疫前血清はより高い濃度ででもわずかな反応を与える。ＡＭ
Ｐ−１８タンパク質は、胃管腔を裏打ちする粘膜上皮細胞に集中しているようであるが、
組織のより深部の細胞および上部陰窩領域におけるより少ないシグナルは、細胞が、管腔
層に向けて移動するにつれてタンパク質を発現し始め得ることを示唆する。組織化学的調
製物のより高い倍率は、このレベルの解像度では、一般的な細胞質染色しか示さない；光
学顕微鏡の、電子顕微鏡（ＥＭ）によって見られるいくつかの管腔表面細胞の顆粒が詰ま
った領域と同じものであり得る、強力な染色のパッチがいくつか存在する。従って幽門洞
粘膜におけるＡＭＰ−１８の局在は、粘膜層の深部にあるガストリンを合成する細胞とは
非常に異なっている。

（９．マウス胃幽門洞粘膜細胞におけるＡＭＰ−１８抗原の免疫電子顕微鏡位置推定）
組織片を４％のホルムアルデヒドで固定し、そしてＵｎｉｃｒｙｌにおける包埋のため
に処理した。薄片をウサギ抗ヒトＡＭＰ−１８抗血清（１：２００）と反応させた；結合
した抗体を、１０ｎｍの金コロイドに結合したプロテインＡによって検出した。反応した
切片を見る（２０，０００×）前にクエン酸鉛で染色した。金粒子は半透明の分泌顆粒の
上に見え、それは免疫反応性の必要条件のために、標準的なグルタルアルデヒド−オスミ
ウム−エポン（ｅｐｏｎ）手順（１１，４００×）よりもここで半透明であるようであっ
た。他の細胞質構造に対してわずかなバックグラウンドが見えた。

タンパク質の一般的な構造は、潜在的な分泌役割を示すので、正確な細胞内局在化が貴
重である。これはＥＭ免疫細胞化学手順を必要とする。標準的な包埋および染色方法が、
以前に他の多くによって報告されたように、幽門洞領域（例えばＪｏｈｎｓｏｎおよびＭ
ｃＭｉｎｎ、１９７０）は分泌顆粒が非常に豊富である粘膜上皮細胞を含むことを明らか
にする。予備的な免疫ＥＭデータは、１：２００−１：８００の希釈で使用された免疫血
清が、分泌顆粒と特異的に反応することを示す。後者は、いくらか膨張して、そして標準
的固定条件よりも電子不透明ではないようであり、そして密度の違いは識別困難であるが
、全体として細胞構造は、免疫反応性を保存するために必要なよりストリンジェントでな
い条件下で固定および包埋した胃組織でかなりよく保存される。１：１００の希釈で、免
疫前血清は、分泌顆粒に選択的でなくわずかなバックグラウンドを示した。

（１０．上皮細胞培養における増殖因子活性）
ＡＭＰ−１８の機能は、それが幽門洞およびおそらく胃の他の場所における機能的粘膜
上皮の維持を少なくとも部分的に司る増殖因子であるということである。最初に、胃上皮
細胞系統はすぐに入手可能でなかったが、腎臓上皮細胞システム（Ｋａｒｔｈａら、１９
９２；Ａｉｔｈａｌら、１９９４；Ｌｉｅｓｋｅら、１９９４）を使用した。分画した幽
門洞粘膜細胞抽出物を、これらの実験のために使用した。分画をフォローするためにプロ
ーブとしてイムノブロッティングを使用して、ブタまたはマウス幽門洞のいずれかからけ
ずった粘膜細胞の溶解時に、ＡＭＰ−１８抗原はスクロース密度勾配の３５Ｓ画分に回収
された。そのような高速上清画分が、細胞増殖に関する研究のための開始材料となった。
予期しないことに、これらの抽出物は、コンフルエントなサルの腎臓上皮細胞（ＢＳＣ−
１細胞）において５０％の増加を刺激したが、ＨｅＬａまたはＷＩ−３８線維芽細胞に影
響を及ぼさなかった。ＢＳＣ−１細胞の刺激は、少なくともその最適な濃度でアッセイし
た、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、およびバソプレシンを含む多様なポリペ
プチド分裂促進因子で観察されるものと同じくらい有効であった。ＤＮＡ合成を、［^３Ｈ
］チミジンの酸不溶性物質への組込みを測定することによって評価した場合、幽門洞抽出
物による同様の増殖刺激が観察された。幽門洞抽出物の生物学的活性は、６５℃で５分間
の加熱、およびほとんどのオリゴペプチドを除去する１０ｋＤａのＭ_ｒカットオフを有す
る膜を用いた透析を耐える；この処理は６０−７０％のポリペプチド物質を除去するが、
イムノブロットによってアッセイしたようにＡＭＰ−１８を容赦した。より重要なことに
、マウスまたはブタ幽門洞抽出物によるＢＳＣ−１細胞の分裂促進刺激は、ヒト組換えプ
レＡＭＰ−１８（細菌で発現した）に対する２つの異なる抗血清のいずれかを培養培地に
加えた場合に阻害される。免疫前血清（１：１００から１：８００）は、細胞増殖に影響
を与えず、幽門洞抽出物の分裂促進効果も変化させなかった。これらの観察は、胃粘膜細
胞ＡＭＰ−１８は、通常このタンパク質を発現しない腎臓上皮細胞の強力な分裂促進因子
として機能することを示唆する。

部分的に分画した幽門洞抽出物における増殖促進活性は、ＡＭＰ−１８タンパク質によ
って媒介されたというさらなる証拠を得るために、マウス抽出物のアリコートを、以前に
天然タンパク質のＮ−末端配列を決定するために使用した方法である、ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルを２ｍｍの切片に切断し、そして各切片を、１％Ｂ
ＳＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水中３％のアセトニトリルで抽出した。抽出上清を、分
裂促進活性に関してアッセイした。その結果は、１６−１９ｋＤａの範囲のタンパク質を
含む１つの切片が、増殖促進活性を有することを示した。有意に、この増殖反応は免疫血
清によって阻害されたが免疫前血清では阻害されなかった。タンパク質の比較的低い沈降
速度とあわせて、これらの発見は、ＡＭＰ−１８は上皮細胞分裂促進因子であり、そして
それはモノマーとして、またはおそらく同型ダイマーとして機能するという結論を支持す
るさらなる証拠を提供する。それはまた、タンパク質の構造が、ＳＤＳ−ゲル電気泳動の
変性条件後にネイティブなコンフォメーションを容易に再獲得し得るような構造であるこ
とを意味する。

幽門洞増殖因子活性と他のサイトカインとの相互作用を評価するために、その活性を試
験して、それが上皮細胞培養においてＥＧＦと相加的であるかどうかを決定した。未処理
マウス幽門洞抽出物（１０μｇ／ｍｌ）、または加熱、透析ブタ抽出物（１０μｇ／ｍｌ
）と共に加えたＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は、細胞数の静止レベルから７４％の増加まで
、分裂促進の相加的刺激を示した；それはＢＳＣ−１細胞アッセイを用いたあらゆる因子
で今までに観察された最も大きい刺激であった。この相加性の例を図１１にＡＧＳ細胞に
対するＡＭＰペプチドおよびＥＧＦに関して示す。この観察は、ＡＭＰ−１８およびＥＧ
Ｆが、異なる細胞表面レセプターに作用することによって増殖を開始することを示唆する
。それはまたＡＭＰ−１８増殖因子活性が、上皮の維持および回復において、通常他のオ
ートクリンおよびパラクリン因子と協同作用し得ることを意味する。ＥＧＦの結果を考慮
して、他の因子（ＥＧＦがその例となり得る）は基底表面から作用するが、ＡＭＰ−１８
は上皮細胞層の先端面（すなわち胃管腔面）で分泌され、そしてそこで作用するようであ
る。

（１１．ガストロカイン（ＡＭＰ−１８）関連ペプチドの生物活性）
本発明の合成ペプチドの活性は予期しないものである。ヒトｃＤＮＡクローンペプチド
のＯＲＦに基づくペプチドを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで合成し、そこで産
物の配列および質量スペクトルをチェックする。ペプチドをＨＰＬＣによってさらに精製
した。シグナルペプチドを含まずに、およそタンパク質の長さに広がる５つの比較的大き
なオリゴペプチド（それぞれ約４０アミノ酸）を分析した。予測されるヘリックスおよび
グリシン−プロリン（ＧＰ）ターンを含む、プレＡＭＰ配列のアミノ酸ｌｙｓ−７８から
ｌｅｕ−１１９まで広がる４２アミノ酸長の１つのペプチド（タンパク質の成熟型のペプ
チド５８−９９；表１を参照のこと）は、高い分裂促進活性を有していた。この反応は、
特異的抗血清によって阻害されたが、免疫前血清によって阻害されなかった。

（表１：プレ−ガストロカイン（プレ−ＡＭＰ−１８）の配列に基づく合成ペプチドの
生物活性）

表１：ヒトおよびマウスプレ−ガストロカイン（プレ−ＡＭＰ−１８）配列から得た分
裂促進ペプチドの分析。１４アミノ酸の分裂促進ドメインは太字である。^＊ペプチドはプ
レ−ガストロカイン（プレＡＭＰ−１８）のアミノ酸配列におけるその位置によって同定
される。＃ＡＡ；ペプチド中のアミノ酸の数。Ｋ_１／２；最大半減増殖刺激の濃度。

重複する不活性ペプチドが、分裂促進ペプチドの活性を阻害し得る：すなわち、ヒトペ
プチド７８−８８および８７−１０５は、ペプチド７８−１１９の活性を阻害し、そして
ペプチド８７−１０５はペプチド１０４−１１７の活性を阻害するが、ペプチド７８−８
８は阻害しない。ペプチド７８−８８および８７−１０５は胃抽出物中のタンパク質の活
性を阻害する。

^＊＊スクランブル
（１２．ガストロカイン（ＡＭＰ−１８）の増殖刺激ドメイン）
新規幽門洞粘膜細胞タンパク質ＡＭＰ−１８の中央領域に相当する４２アミノ酸ペプチ
ドが、ブタおよびマウス幽門洞抽出物中のそのままのタンパク質と特徴が同様の分裂促進
活性を有する（表１）という発見は、分子の生物活性領域の特徴付けを促進した。７８位
−１１９位のアミノ酸を含むペプチドが、組織抽出物によって与えられるものと同様の、
ＢＳＣ−１上皮細胞系統の増殖の最大刺激を与え、そして細菌で発現した完全幽門洞タン
パク質に対してウサギで惹起されたいくつかの異なる抗血清によって同様に阻害された。
ペプチド「７８−１１９」に関連する多くの合成「欠失」ペプチドの分裂促進活性を、表
１にまとめる。増殖活性の決定は、今まで腎臓上皮細胞系統およびいくつかの胃および腸
系統で達成された。

ペプチド７８−１１９のもとの４２アミノ酸配列を、リシン（Ｋ）残基が境界となる３
つの部分に分割した；Ｎ−末端からＣ−末端へ、これらは７８位−８８位、８７位−１０
５位、および１０４位−１１７位のアミノ酸を有するペプチドである。これらのうちペプ
チド１０４−１１７のみが、同様の増殖刺激のプラトーを与えるが、もとのペプチド「７
８−１１９」より高いモル濃度を必要とする分裂促進活性を有していた；これはより高い
Ｋ_１／２値に反映され、それは、１４アミノ酸ペプチドが４２アミノ酸ペプチドの活性の
３０−４０％を有することを示唆する。
これからの結論は、より小さいペプチドは、おそらく正しいコンフォメーションを形成す
る能力が低いために、またはあるいは補助的な結合領域の喪失のために、細胞レセプター
に関してより低い結合親和性を有するということである。後者の考えは、ペプチド「７８
−８８」および「８７−１０５」が、インタクトな４２マーペプチド７８−１１９の活性
に拮抗し得るという観察によって支持される；これらのペプチドは幽門洞抽出物の活性に
も拮抗し、新規タンパク質の生物学的機能を分析する手段としての合成ペプチドの妥当性
をさらに支持する。本発明のさらなる局面は、ペプチド８７−１０５はペプチド１０４−
１１７の活性に拮抗するが、６８−８８はしないことである；ペプチド８７−１０５は隣
接する１０４−１１７配列と２残基重複することに注意する。

まとめると、これらの結果は、ＡＭＰ−１８の増殖刺激領域の比較的単純な直線モデル
を示唆する；すなわち、Ｎ−末端の拡大した結合ドメイン（大部分がヘリックスであるこ
とが予測され、それの相対的な剛性が、細胞増殖研究で決定されたような関連配列の直線
的構成を説明し得る）、次にターンの可能性の他は予測される構造を持たないグリシンお
よびプロリンの豊富な領域が続く。増殖刺激の引き金を含むのはこの後者の領域である。
ペプチド７８−８８および８７−１０５による拮抗の特異性は、それらがアゴニストペプ
チド７８−１１９および１０４−１１７と重複するかどうかに基づき得る；例えば７８−
８８は７８−１１９と重複および阻害するが、１０４−１１７と重複または阻害しない。
７８−１１９スクランブルペプチドの不活性と合わせて、これらのペプチドによる競合の
特異性は、ＡＭＰ−１８が特異的な細胞成分と相互作用するという結論を強化する。レセ
プター結合領域はペプチド１０４−１１７からＮ−末端に伸びるというさらなる証拠が、
１０４−１１７の７アミノ酸のＮ−末端延長を含むペプチド９７−１１７の増強された活
性によって提供される。Ｃ−末端方向へ４アミノ酸の延長を有するペプチド（ペプチド１
０４−１２１）は、親１０４−１１７よりわずかに低い活性を有するようであるが、天然
チロシンを含み、それは放射活性ヨウ素による標識を可能にし、それはまず結合部位の数
の評価、および続いてレセプタータンパク質の検出によって、細胞に対するＡＭＰ−関連
ペプチドの結合の決定を可能にする。

その活性（４２マーと同等）およびその相対的経済性（２１アミノ酸の長さ）のために
、ペプチド９７−１０７をほとんどの試験で使用した。しかし、ｔｙｒ−１２１までのＣ
−末端延長は、おそらくそれは二次構造を安定化させるために、今までで最も活性なペプ
チドを与える。このペプチドは例えばＥＧＦのナノモル活性に匹敵しないが、トレフォイ
ルペプチドで報告されたものより非常に強力である（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、１９９７）。イ
ンタクトなＡＭＰタンパク質の推定活性は約１−１０ｎＭである。

（１３．組換えタンパク質の発現）
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ。組換え構築物を、一般的に、ＰＴ／ＣＥＢＰベクター中の全長ｃ
ＤＮＡ配列の適当な領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反
応によって、遺伝子工学で操作し、そして標準的なベクターポリリンカーへの容易な挿入
を可能にするのに便利な制限酵素部位まで延長する。細菌システムにおけるＡＭＰ ＯＲ
Ｆの発現を用いた最初の実験は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）における発現タンパ
ク質の精製の促進を意図して、Ｎ−末端Ｈｉｓ６タグを含む（Ｊｅｏｎら、１９９４）、
発現ベクターＰＴ／ＣＥＢＰを採用した。宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳにおけるこの
ベクター中の全長ヒトｃＤＮＡの発現は、不溶性タンパク質の高い収率を与え、それは変
性条件下の電気泳動後に、特異的高力価抗体を得るためにウサギで免疫原として使用する
ために適当であったが、それはそのタンパク質の天然構造および機能を分析するために有
用ではなかった。この不溶性は、おそらく発現タンパク質における、疎水性シグナルペプ
チドの上流にＨｉｓ６タグを有する、非天然Ｎ−末端の存在のためである。疎水性シグナ
ルペプチド配列なしにＯＲＦを発現するエンジニアリングベクターも有用である。これら
をＮ−またはＣ−末端Ｈｉｓタグありおよびなしで、細菌発現ベクターを用いて構築する
。２０アミノ酸のシグナルペプチドを欠き、そしてＨｉｓ６タグを含むヒトＡＭＰ−１８
配列も、細菌で発現させた。

（ｂ）Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ。単純な真核生物の中で、発芽酵母Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓが、機能的組換えタンパク質の産生および分泌のために選択される発現システ
ムとして広く知られている（Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２；Ｃｒｅｇｇら、１９９３）。
このシステムにおいて、外来性タンパク質の分泌は、それ自身のシグナルペプチドか、ま
たは高度に適合性の酵母接合型アルファシグナルのいずれかを利用し得る。この有機体は
、ＡＭＰ−１８タンパク質を正しく処理および分泌および少なくとも部分的に修飾する。
外来性遺伝子の構成的および調節性発現のためのベクターが、Ｐｉｃｈｉａで開発された
（Ｓｅａｒｓら、１９９８）。ポリリンカークローニング部位に加えて、これらのベクタ
ーは、高発現構成的グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）または
メタノール調節アルコールオキシダーゼプロモーター（ＡＯＸ１）のいずれかを含む。後
者は、正常培養条件下で不十分な産物を産生するが、メタノールの存在下で、細胞タンパ
ク質の３０％までに達する、試験したベクターの最も高い発現を与える非常にストリンジ
ェントなプロモーターである。酵母Ｐｉｃｈｉａが哺乳動物および昆虫の代替物に対して
有する利点は、それが無タンパク質培地で連続的に増殖し、従って発現タンパク質の精製
を単純化し、そして血清または宿主動物細胞由来の無関係の生物活性を排除することであ
る。ｐＩＢ４構築物（メタノール含有培地によって誘導可能）は、完全ヒトプレＡＭＰ−
１８ｃＤＮＡ配列を含む。

（ｃ）バキュロウイルス／昆虫細胞。代替の、多くの場合成功する、非哺乳動物真核生
物発現システムは、昆虫細胞培養システムにおいてＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉｃａのような組換えバキュロウイルスを使用するものである。Ｐｉｃｈｉａと同様
に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＨｉｓ６タグ（Ｐｈａｒｍｉ
ｎｇｅｎ）を両方含む、簡便なベクターの大きなレパートリーがこのシステムにおいて利
用可能である。トランスフェクションをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（
Ｓｆ）細胞に対して行なう；これらの細胞を、分泌タンパク質の精製に有利なように、タ
ンパク質を含まない培地にゆっくりと適応させ得る。内因性のシグナルペプチドがこれら
の細胞で機能しない場合は、クローニング部位の上流にウイルスｇｐ６７分泌シグナルを
含むベクターを用いて、外来性タンパク質の分泌を強要し得る。組換えタンパク質を、全
細胞タンパク質の０．１−５０％の範囲のレベルで発現し得る。いくつかのタンパク質修
飾が、酵母と比較してこの昆虫細胞システムにおいて有利であり得るが、依然として哺乳
動物システムを再現し得ない。昆虫発現システムはＰｉｃｈｉａよりいくらか面倒であり
、そして哺乳動物細胞における発現の完全な代用にはならないようである。２０アミノ酸
のシグナルペプチドを欠き、そしてＨｉｓ６タグを含むヒトＡＭＰ−１８配列を、バキュ
ロウイルスで発現した。

（ｄ）哺乳動物細胞。イムノブロット分析によって検出できない修飾が、哺乳動物細胞
において起こり得、それは他の真核生物の細胞で再現されない。原核生物および単純な真
核生物システムと同じくらい簡便ではないが、哺乳動物細胞は今や外来性タンパク質の一
過性および持続的発現の両方にしばしば使用される。いくつかの増殖因子が、これらのシ
ステムを使用して有意な量で発現および分泌された。

プラスミドｐｃＤＮＡ３／ヒト腎臓２９３システム：ｐｃＤＮＡ３は、強力な構成的サ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡシグナルに隣接するポ
リリンカークローニング部位を含む（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。実験室での経験では、６
０−９０％の一過性トランスフェクションレベルを達成し得る。このために、ヒトプレＡ
ＭＰｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅を、開始コドンおよびネイティブリボソーム結合部位
（コザック配列）およびｐｃＤＮＡ３への正しい方向性のために適当な制限酵素リンカー
を含むオリゴヌクレオチドを用いて行なう。強力な抗生物質ブラストサイジンＳおよび耐
性遺伝子を含むベクターを用いた一過性アッセイにおいて好ましい構築物を同定し、安定
な哺乳動物トランスフェクタント細胞株を「１週間以内に」確立し得る（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）。利用可能なベクターはまた、構成的ＣＭＶプロモーター、ポリリンカークロー
ニング部位、選択的Ｖ５−エピトープ／Ｈｉｓ６タグおよびＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル
を含む（ＰｃＤＮＡ６／Ｖ５−Ｈｉｓ）。

（１４．ＡＭＰ−１８の変化した（修飾）形式の発現および分析）
「野生型」ＡＭＰ−１８の産生の効率的な発現システムが与えられれば、欠失または置
換のいずれかを含む一連の変異タンパク質を作成し得、それは機能的ドメインの分析を可
能にする。両親媒性ヘリックス、保存されたシステイン（Ｃ）残基および切断部位であり
得る塩基性アミノ酸ダブレットが、魅力的な標的である。酵素アッセイと同じくらい単純
ではないが、有糸分裂誘発アッセイは慣用的かつ反復可能であり、そしてそれらが構築さ
れるのと同じくらい迅速な「変異体」の特徴付けを可能にする。ドミナントネガティブ（
またはポジティブ）「変異体」は、潜在的な細胞レセプターを含む他の因子との相互作用
を示すので、機能の単純な喪失を示す変異体と同じくらい重要である。

（１５．発現したおよびネイティブガストロカイン（ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ）タンパク
質の生化学的および免疫親和性分画）
ガストロカインＡＭＰ−１８のいくつかの発現形式の場合に、組換えタンパク質は、可
溶性タンパク質の迅速な精製を可能にするペプチドタグを含む。これらのタグの存在は、
もしそれらがタンパク質の通常の機能を著しく阻害しなければ、他の関連する高分子との
相互作用の分析も可能にする。Ｈｉｓ６タグは、組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂ビ
ーズへ結合させることによって精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１；Ｑ
ｉａｇｅｎのＮｉ−ＮＴＡ樹脂）。タグ化タンパク質は、ほとんどの抗原−抗体複合体よ
りも高い親和性で結合し、そしてＮｉ^２＋−ヒスチジンキレート化複合体を過剰なイミダ
ゾールで分裂させて精製タンパク質を放出する前に激しく洗浄され得る。ＧＳＴ−タグ化
組換えタンパク質を、グルタチオン−アガロースで精製し、洗浄し、次いで還元グルタチ
オンで溶出する（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８）。全ての提案された発現
システムと同様に、各タンパク質調製物を、その増殖因子活性に関してできるだけ早い段
階で試験し得る。

従来の分画手順は、特に組織から天然タンパク質を単離する場合に、望ましい純度を達
成するために使用される。後者に関してブタ幽門洞粘膜が好ましい開始点であり、最初に
遠心および熱処理プロトコールを用いて、続いてサイズ排除カラムを使用する：１８ｋＤ
ａタンパク質は、抽出物中でおそらくモノマーとして存在するという証拠を考慮して、Ｂ
ｉｏＧｅｌ Ｐ６０が適当である。溶出物を、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａで精製
した抗ＡＭＰ抗体を、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に
架橋することによって作成した免疫親和性マトリックスに負荷する。過去に有用であるこ
とが証明されたマトリックスに対するリンカーの延長によるか（Ａｉｔｈａｌら、１９９
４）、または抗体を固定化プロテインＡに架橋することによる、免疫親和性マトリックス
のさらなる修飾が有用であり得る。活性タンパク質をＳＤＳ−ゲル溶出によって回収し得
るので、活性タンパク質を抗原−抗体複合体からも回収し得る。さらなる分画を、Ｃ８逆
相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムによって達成し得る。最終的な工程は
、Ｎ−末端配列決定による性質の確認を伴う、ＳＤＳ−ゲル溶出技術の使用である。これ
らの工程の全てにおいて、免疫検出可能なＡＭＰ−１８および増殖因子活性は、一緒に分
画される。

（１６．ＡＭＰ−１８関連合成ペプチド）
ＡＭＰ−１８は、１つまたはいくつかの生物活性ペプチドの前駆体であり得る。合成ペ
プチドは、タンパク質の機能を調査する簡便な道を提供する；ペプチドは機能の局面を模
倣し得るか、またはそれに拮抗し得る。ペプチドがタンパク質の活性を再現または阻害す
るならば、それはもとのタンパク質の機能的ドメインのアイデンティティーを示唆し、そ
してタンパク質−細胞相互作用を調査するために特異的にタグ化したプローブを合成する
可能性も提供する。

ヒトタンパク質の中央領域に相当する合成４２アミノ酸ペプチドは、部分的に分画され
た幽門洞粘膜抽出物の増殖因子活性を模倣し得るという発見は、ＡＭＰ−１８機能の分析
に近道を提供した。リシン対におけるいくつかの潜在的なタンパク質処理部位に加えて、
このペプチド（ペプチド５８−９９と呼ばれる；アミノ酸は、シグナルペプチドを除去し
た後の成熟タンパク質の５８位−９９位である）は、拡大したヘリックス形成可能な領域
の１つおよびグリシン−プロリンループを含む。このペプチドのさらなる利点は、それは
本明細書中で開示される抗血清の両方によって認識されるエピトープを含むことである。
この配列由来のいくつかのより小さいペプチドを合成し、生物活性領域に焦点をあわせた
。それらはこの領域の抗原性によって見られるように、タンパク質の表面に露出されるこ
とによって、タンパク質構造内の区別できるドメインを示し得るので、およびインビボで
生物活性ペプチドへの切断部位であり得るので、まずリシン残基が境界となる配列を研究
した。グリシン−プロリン領域が重要である（ＡＭＰ−１８の生物活性ドメインを示す表
１を参照のこと）。グリシン−プロリン配列は、ＳＨ３（ｓｒｃ相同性ドメイン３型）リ
ガンドに関与することが知られている（Ｃｏｈｅｎら、１９９５；Ｎｇｕｙｅｎら、１９
９８）；ＳＨドメインはタンパク質−タンパク質相互作用に関与するので、ＡＭＰ−１８
のＧＰ領域はタンパク質の細胞表面レセプターとの相互作用に関与し得る。ＡＭＰ−１８
で見出される正確なＧＰＧＧＰＰＰ配列は、細胞内で作用するＳＨ３ドメインで報告され
ていないので、それは細胞外リガンドのための新規タンパク質相互作用ドメインに相当す
るという興味深い可能性が存在する。成熟配列の９７位−１１７位のアミノ酸から得られ
た２１マーは、４２マーと同様の活性を有する。このより短いペプチドは、様々な上皮細
胞系統における増殖アッセイに有用である。このペプチドは、本明細書中で開示される抗
血清によって認識されるエピトープを発現しない。

ＡＭＰ−１８誘導ペプチドの全ては、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏの
Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで合成され
、そこでＨＰＬＣによって単離された精製ペプチドの分子量およびアミノ酸配列も確認し
た。ペプチド７８−１１９の生物学的活性は、有糸分裂誘発活性を有するより小さなペプ
チドを探索する基礎を与えるだけでなく、正のまたは負の影響を有するアミノ酸置換を迅
速に発見するのを可能にする。不活性なペプチドを、活性ペプチドまたはインタクトのＡ
ＭＰ−１８の機能を阻害する能力に関して試験した。ペプチドにおける潜在的なＤ−アミ
ノ酸の含有（通常のまたは逆の順序で）は、生物学的機能の保持を可能にしながら、分解
に対してそれらを安定化し得る。さらに活性ペプチドを合成する能力は、細胞レセプター
の性質、組織分布、および数の研究を促進するタグを可能にする。そのようなタグは、Ｈ
ｉｓ６ビオチンまたはペプチド配列に追加したヨウ化チロシン残基を含む（いくつかの生
物活性ペプチドは、Ｃ−末端に天然に存在するチロシンを有する）。

合成ペプチドはまた、機能に対する潜在的な２次構造の役割の評価を可能にする。イン
タクトのＡＭＰ−１８配列のものと同様のヘリックスを促進することが予測される、活性
ペプチド９７−１１７の４アミノ酸Ｃ−末端延長は、より活性なペプチド９７−１２１を
生じたという発見は興味深い。これら活性ペプチド、例えば抗菌性マガイニンペプチドと
類似したペプチド１２６−１４３のヘリックス傾向は、有用な情報を提供する。抗菌性ペ
プチドに関して、マガイニンの種類の機能は、両親媒性ヘリックスを形成する能力に関連
する（Ｂｏｍａｎ、１９９５）。ラクタム橋によってヘリックス形式に固定し得る合成ペ
プチドは（Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９９６）、生物学的活性を増強した；ラクタム形成のた
めに少なくとも１対の適当な酸性および塩基性アミノ酸残基が、ＡＭＰ−１８の潜在的な
ヘリックス領域に既に存在する。

ペプチド研究の別の同様に重要な局面は、その生物学的機能に拮抗する、特異的抗ＡＭ
Ｐ−１８ペプチドの潜在的な利用可能性である。組織培養研究は、増殖促進ペプチド７８
−１１９のサブペプチドが、インタクトなペプチドの活性に拮抗し得ることを示す（表１
を参照のこと）。細胞結合部位を占有し得るが活性に必要不可欠ないくつかの残基を欠く
ペプチドは、ＡＭＰ−１８およびその活性ペプチドの作用を阻害し得る。これは、細胞レ
セプターの分析、およびレセプター−リガンド親和性定数の評価のために別の試薬のセッ
トを利用可能にする。規定されたペプチドアンタゴニストの利用可能性は、動物全体の研
究において有用であり、そして最終的にはヒトにおける天然タンパク質の活性を調節する
ために役立ち得る。

（１７．ＡＭＰ−１８および関連ペプチドの細胞との相互作用：細胞増殖の評価）
非形質転換サル腎臓上皮細胞株ＢＳＣ−１および他の上皮細胞株を使用して、増殖に対
する影響を評価した。一般的に、増殖のために最小限のウシ（または胎児）血清を添加し
た増殖培地中で、プラスチックディッシュでコンフルエントになるまで細胞が増殖するよ
うに、各株に関して条件を選択した（Ｌｉｅｓｋｅら、１９９７）；ＢＳＣ−１細胞は１
％ウシ血清を含む６０ｍｍディッシュあたり１０^６でコンフルエントになった。増殖アッ
セイの開始時に、コンフルエントな培養の培地を吸引および細胞の生存可能性を維持する
ために最小限の血清（ＢＳＣ−１に関しては０．０１％）を含む新しい培地と交換した。
ＡＭＰ−１８調製物を培地に加え、そして４日後に細胞単層を洗浄し、トリプシンで分離
し、そして細胞を、血球計算器を用いて計測した。ＡＭＰ−１８のＤＮＡ合成を開始する
能力の決定を、［^３Ｈ］チミジンの組込みによって測定した（Ｔｏｂａｃｋ、１９８０）
；ＤＮＡ合成アッセイを確認するために、平らにした細胞のオートラジオグラムを計測し
た（ＫａｒｔｈａおよびＴｏｂａｃｋ、１９８５）。

タンパク質ＡＭＰ−１８は、幽門洞粘膜および隣接する体粘膜により少ない程度発現す
る。しかし、幽門洞抽出物および活性合成ペプチドはいずれも最も単純な上皮細胞株の増
殖を刺激する。ＡＭＰ−１８またはそのペプチドの天然の標的であり得る細胞の他に、使
用した主な基準は、増殖の制御、特に細胞密度制限のものであった。ヒト癌患者由来の多
くの形質転換胃株が、様々な供給源から入手可能であるが、これらのほとんどは増殖制御
を示さない。例えば、Ｄｒ．Ｄｕａｎｅ Ｓｍｏｏｔ（Ｈｏｗａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）からの胃ＡＧＳ腺癌細胞サブ亜株は、
より高い程度の接触阻害を示し、そしてＡＭＰ−１８およびその誘導ペプチドによく反応
した。これらの細胞は天然にはＡＭＰ−１８を合成しない。同様の反応が、非形質転換ラ
ットＩＥＣ腸上皮細胞（Ｄｒ．Ｍａｒｋ Ｍｕｓｃｈ、Ｄｅｐｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏによって提供された）で観察された；後者は
、培養中ですぐれた上皮細胞の特徴を示す（Ｑｕａｒｏｎｉら、１９７９；Ｄｉｇａｓｓ
ら、１９９８）。

（１８．上皮細胞表面のＡＭＰ−１８レセプター）
ＡＭＰ−１８の標的細胞レセプターの特徴付けは、このタンパク質に接触することが予
期されない細胞におけるレセプターの明らかな存在のために、興味深い。最初の増殖反応
アッセイを、胃因子によく反応する腎臓由来の上皮細胞系統で行なった。胃細胞株、およ
び非形質転換ラット腸上皮ＩＥＣ−６細胞を使用して、幽門洞抽出物の真の生理学的標的
であろう細胞上のレセプターに注意を向けた。インビボにおけるこのタンパク質の作用の
特異性は、おそらくそのレセプターよりも、その発現の非常な組織特異的性質から生ずる
。ＡＭＰ−１８が他の増殖因子と共通のレセプターと相互作用し得ることが可能である。
しかし、ＥＧＦおよび幽門洞抽出物の相加的増殖刺激は、ＡＭＰ−１８が新規レセプター
を有し得ることを示唆する。

ＡＭＰ−１８と相互作用する細胞膜中のタンパク質分子を、いくつかの異なる方法で探
索し得る。例えばビオチンまたは放射活性ヨウ素で標識した純粋ＡＭＰ−１８または関連
ペプチドを使用して、細胞表面の飽和可能な部位の数を推定する。結合値のスキャッチャ
ード分析を使用して、レセプターの数および親和性を決定した。定量的研究に関しては、
結合を増加するＡＭＰリガンドの濃度で測定し、そして非特異的成分を過剰な非標識因子
の存在下で結合を測定することによって同定する。ヨウ化増殖因子を細胞レセプターと架
橋し、その同定を可能にした（Ｓｅｇａｒｉｎｉら、１９８７）。標識ＡＭＰリガンドを
細胞とインキュベートし、そして結合したリガンドをジスクシンイミジルスベレート（ｄ
ｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）によってレセプターと架橋する。標識
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてオートラジオグラフィーを使用し
て架橋した複合体を視覚化し、レセプターのＭＷの推定を可能にする。合成ペプチド模倣
物およびアンタゴニストは、細胞レセプターの研究を可能にし、そしてその性質は、おそ
らくクローニング技術による将来の決定的な同定の前に、正当に推測される。

架橋研究に加えて、抗体、またはｈｉｓ６タグ化ＡＭＰ−１８またはペプチドを使用し
て、ＡＭＰ−１８に結合する細胞または粘液タンパク質を単離する。さらなるアプローチ
として、固定化ＡＭＰ−１８親和性マトリックスを、ＣＮＭＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅを用いることによって作成し得る。あらゆる細胞レセプターによって媒介されるシグ
ナル伝達経路を分析する簡単な発端として、親和性単離物におけるタンパク質チロシンキ
ナーゼ活性をアッセイする試験が利用可能である（ＹａｒｄｅｎおよびＵｌｌｒｉｃｈ、
１９８８；ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９９２）。

（１９．ＡＭＰ−１８は生物活性ペプチドに処理されるか）
ＡＭＰ−１８の機能的分子形式は未知である。確かに、約１８ｋＤａは幽門洞粘膜細胞
に蓄積するタンパク質形式であり、そしてそれらは約１０ｋＤａまでのペプシン断片およ
び生物活性ペプチド７８−１１９（４２アミノ酸しか有さない）とも反応するが、実質的
な量のより低いＭＷのポリペプチドは抗血清で検出されない。標識またはタグ化ＡＭＰ−
１８の利用手段を有することは、タンパク質が幽門洞粘膜抽出物中で処理されるのか、ま
たはそれに反応する上皮細胞によるのかという質問を調査することを可能にする。

（２０．ヒトおよびマウスにおけるＡＭＰ−１８の遺伝子）
ヒトｃＤＮＡクローンの配列に基づくプライマーを用いたＰＣＲ技術を用いて、ヒトお
よびマウスプレＡＭＰ−１８のゲノムクローンを得た。エキソン／イントロン構造（図１
３）は完全である。マウスＡＭＰエキソンは、マウス遺伝子の配列を組み立てるのを可能
にするために十分ヒトおよびブタのものと類似している。ヒトおよびマウス遺伝子は、非
常に類似した構造を有し、マウス遺伝子はわずかに小さい。マウス遺伝子のエキソンに含
まれるＯＲＦは、ヒトおよびブタタンパク質に対して６５％の同一性を有するタンパク質
を予測する。２ｋｂの配列はヒト遺伝子の上流である。

（２１．マウスにおけるＡＭＰ−１８遺伝子のノックアウト）
マウスマップから標的構築物を設計する。構築物は、好ましくは［５’−ＴＫ（機能的
チミジンキナーゼ遺伝子）−ＡＭＰ−１８ＤＮＡの５’末端の約５ｋｂ−ホスホグリセリ
ン酸塩キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの調節下のネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼ（ｎｅｏ）遺伝子−遺伝子の３’末端の約３ｋｂ−３’］を含む。内在性ＡＭＰ−１８
遺伝子と構築物のかなり長い相同性が、効率的な標的化のために必要である。全体の相同
性を１．７から６．８ｋｂに増加させることは、ｈｒｐｔ遺伝子の相同的標的化の効率を
約２００倍増加させる（Ｈａｓｔｙら、１９９１）。その全体の長さを超えても、効率は
わずかにしか増加しない。ＰＣＲ反応による相同的成分の検出を促進するために、ベクタ
ーの一端の近くにｎｅｏ遺伝子を有することが有用である。できた形質転換体を、２つの
プライマー（１つはｎｅｏ遺伝子中、そして他はＡＭＰ−１８遺伝子座中標的化ベクター
のすぐ外側）を用いてＰＣＲによって提供し得る。マウス遺伝子の４ｋｂ５’および４．
５ｋｂ３’に伸びる隣接配列を得た。完全な遺伝子のノックアウトが既にクローニングさ
れたことを保証するために、相同的組換えによって、コード領域をｎｅｏ遺伝子と置換す
る。プラスミド配列を切断した後、標的化カセットをＥＳ細胞にトランスフェクトして、
ネオマイシンのアナログであるＧ４１８およびガンシクロビルによる選択によって安定な
トランスフェクタントを得る（Ｍａｎｓｏｕｒら、１９８８）。隣接配列由来のプローブ
を用いたサザンブロットを使用して、標的化相同的組換え体をスクリーニングする。正し
く標的化されたＥＳ細胞クローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に注入する。

少なくとも５０％の野ねずみ色の毛皮（胚幹（ＥＳ）細胞由来）を有する代理母から得
たオスの子孫を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配する。野ねずみ色であるＦ１マウスは、Ｅ
Ｓ細胞由来の父性成分を有する（野ねずみ色は黒色より優性である）。これらのマウスの
５０％は、ノックアウトプレＡＭＰ−１８対立遺伝子を有する。これらのヘミ接合体マウ
スを、減少した遺伝子供与量のあらゆる影響に関してモニターする。ホモ接合体ノックア
ウトが好ましい。ＡＭＰ−１８の唯一の機能が誕生後の胃におけるものならば、生存可能
なホモ接合体が予想される。もしそれらが得られなければ、胎児致死性の欠損が示され、
そして流産の胎児の段階を確かめる。この結果は、正常な発達におけるタンパク質の予期
しない役割を示唆する。

ホモ接合体ＡＭＰ−１８ノックアウトマウスは、胃の形態学および機能の調査に有用で
ある。そのようなノックアウトは、ＡＭＰ−１８が必要不可欠であるかどうか、そして胃
腸発達のどの段階でそれが生物活性であるか示すことが期待される。ＡＭＰ−１８ノック
アウトヘミ接合体マウスが既に表現型を示している可能性がある。タンパク質の抑制され
た供与量がその機能を抑制または消去するならば、または父性インプリンティングまたは
無作為単一対立遺伝子発現が重要な影響を有するならば、これが起こり得る。マウスにお
けるＡＭＰ−１８ノックアウトの可能性のある結果の範囲は以下を含む：ｉ）生存可能な
ホモ接合体なし、予期しない必要不可欠な発達的役割を意味する；ｉｉ）生存可能なホモ
接合体、しかし明らかに胃腸機能が損なわれている；ｉｉｉ）強力な表現型なし、すなわ
ちタンパク質は実験室マウスの発達および生命に重要ではない。もし適当なら、過剰発現
マウスにおけるＡＭＰ−１８の産生を追究する。マウスにおいて産生される短縮ＡＭＰ−
１８タンパク質は、潜在的にドミナントネガティブ表現型を作成し得る；実験から得られ
た知識が、タンパク質の機能的ドメインをさらに規定する。

（アミノ酸略号）

図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。 図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。 図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。 図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。 図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。 図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。 図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。 図２は、ヒトｃＤＮＡ配列である；ＤＮＡクローンをヒト胃ｃＤＮＡライブラリーから差次的発現クローニングによって得た。 図３は、Ｐｏｗｅｌｌ（１９８７）に基づき、そして本発明者によって修正された、ｃＤＮＡクローンから予測されたヒトプレＡＭＰ−１８タンパク質配列である；Ｎ−２１は、成熟タンパク質の予期されるＮ−末端である。 図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である； 予測プロモーター：１８７４ 実験的転写開始部位：１９０６ 翻訳開始部位：１９４５ ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。 図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である； 予測プロモーター：１８７４ 実験的転写開始部位：１９０６ 翻訳開始部位：１９４５ ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。 図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である； 予測プロモーター：１８７４ 実験的転写開始部位：１９０６ 翻訳開始部位：１９４５ ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。 図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である； 予測プロモーター：１８７４ 実験的転写開始部位：１９０６ 翻訳開始部位：１９４５ ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。 図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である； 予測プロモーター：１８７４ 実験的転写開始部位：１９０６ 翻訳開始部位：１９４５ ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。 図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である； 予測プロモーター：１８７４ 実験的転写開始部位：１９０６ 翻訳開始部位：１９４５ ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。 図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である； 予測プロモーター：１８７４ 実験的転写開始部位：１９０６ 翻訳開始部位：１９４５ ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。 図５は、プレＡＭＰ−１８のマウスｃＤＮＡ配列である。 図６は、マウスプレＡＭＰ−１８アミノ酸配列である；マウス胃幽門洞から単離されたＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを行なった；Ｙ−２１は、成熟タンパク質の予期されるＮ−末端である；．．によって示される空間は、図１１の他の配列と整列するヌクレオチドがそこに存在しないことを意味する。 図７は、ブタＡＭＰ−１８を発現するｃＤＮＡである。 図８は、Ｐｏｗｅｌｌ（１９８７）に基づいてｃＤＮＡクローンから予測されたブタプレ−ガストロカイン（プレ−ＡＭＰ−１８）タンパク質配列である。Ｄ−２１は、成熟タンパク質のＮ−末端である−ブタ胃から単離されたタンパク質の配列決定によって確認された。 図９は、ヒト 対 ブタにおける、プレ−ガストロカインのアミノ酸配列の比較である。 図１０は、ヒトおよびブタＡＭＰ−１８のｃＤＮＡクローンの配列決定から、そしてマウスＲＮＡおよびＤＮＡのプレＡＭＰ−１８特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって決定された、ヒト、ブタおよびマウス予測タンパク質配列のコンピューターによる整列比較を示す；各場合において、最初の２０アミノ酸はシグナルペプチドを構成し、小胞体膜の通過後切断される。 図１１は、ブタ胃幽門洞粘膜抽出物、成熟ペプチドのヒトＡＭＰペプチド７７−９７（ヒト前駆体タンパク質のペプチド９７−１１７と同じ：表１）、およびＥＧＦの、胃上皮細胞の増殖に対する効果を示す；ＡＧＳ細胞を、６０ｍｍディッシュで胎児ウシ血清（５％）を含むＤＭＥＭ中で増殖させた；異なる量のブタ幽門洞抽出物、ＨＰＬＣ精製ペプチド７７−９７、および／またはＥＧＦを加えた；４日後細胞を分散し、そして血球計算器で計測した；幽門洞抽出物およびペプチドはそれぞれ濃度依存的な様式で細胞増殖を刺激した；棒グラフは飽和用量でペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は分裂促進性であったことを示す；あわせるとそれらは相加的であり、２つの分裂促進因子は異なるレセプターおよび／またはシグナル伝達経路を使用して作用することを示唆した；抗ＡＭＰ抗体は幽門洞抽出物を阻害したがペプチド７７−９７は阻害しなかった。 図１２は、ヒトおよびマウスプレＡＭＰ−１８遺伝子の構造を示す；イントロン中の塩基対の数をバーの上に示す；エキソンはＥ１−Ｅ６およびイントロンはＩ１−Ｉ５で示す；イントロンの長さにわずかな違いが存在する。 図１３は以下のものを示す。左のパネル。Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換えヒトＡＭＰ−１８のアミノ酸配列。Ｎ−末端の１２アミノ酸ドメイン内のＨｉｓ６タグが推定疎水性シグナルペプチドを置換したことに注意する。右のパネル。ＩＥＣ−１８細胞のコンフルエントな培養の増殖に対するｒｈＡＭＰ−１８およびＡＭＰペプチド７７−９７の効果。最大の増殖刺激は同様であるが、ｒｈＡＭＰ−１８（〜３０ｎＭ）の最大半減濃度（Ｋ_１／２）はペプチド（〜３００ｎＭ）より約１オーダー程度低い。 図１４は以下のものを示す。左のパネル。ヒトおよびブタ幽門洞の前駆体タンパク質のＡＭＰ−１８ｃＤＮＡクローンから得られたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の整列。類似性は７８．５０％、および同一性は７５．２７％であった。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（ＧＣＧ）のＧＡＰおよびＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥプログラムを用いてコンピューター分析を行なった。右のパネル。ヒトプレＡＭＰ ＯＲＦの予測された二次構造のモデル。アスパラギンリッチなＮ−末端ドメイン、短いトリプトファン（Ｗ）−リッチおよびグリシン−プロリン（ＧＰ）領域、および４つのシステイン（Ｃ）残基の保存された位置に留意のこと。可能性のある両親媒性ヘリックスが示される。 図１５は、ブタ幽門洞細胞抽出物、ペプチド７７−９７、およびＥＧＦの腸上皮細胞の増殖に対する効果を示す。ＩＥＣ−６細胞を６０ｍｍディッシュで増殖させた。幽門洞細胞抽出物（左のパネル）およびペプチド７７−９７（中央のパネル）はそれぞれ濃度依存的な様式で増殖を刺激した。ペプチド７７−９７（１μｇ／ｍｌ）は、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）より強力であるようであった（右のパネル）。値は３つの培養の平均±ＳＥである。 図１６は、ＡＭＰペプチド７７−９７およびＥＧＦの、ヒト幽門洞上皮細胞による増殖および創傷回復に対する効果を示す。増殖（左のパネル）を測定するために、ＨＡＥ細胞を６０ｍｍディッシュにまいた。ペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）、またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、または両方を培地に加え、そして４日後に細胞の数を計測した。ペプチド７７−９７およびＥＧＦはそれぞれ増殖を刺激し、そして相加的であるようであった。値は３つの培養の平均±ＳＥである。遊走（右のパネル）を測定するために、細胞を６０ｍｍディッシュに増殖させてコンフルエントな単層を調製した。培地を吸引、および０．０１％の子牛血清（ＣＳ）を含む新しい培地と交換した。単層を、剃刀の刃でひっかくことによって機械的に傷つけた。分離した細胞を、培地を吸引し、そして残った細胞を０．０１％のＣＳを含む新しい培地で２回洗浄することによって除去した。ＣＳ（０．０１％）およびインスリン（１００Ｕ／Ｌ）を含む新しい培地（５ｍｌ）を、傷つけた培養に加えた。ペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、または両方のいずれかを加えて培養を２倍にした。顕微鏡接眼レンズの網線（１０ｍｍの長さ；０．１ｍｍのしるし）を用いて、細胞が傷の端から遊走した距離（ｍｍ）を測定することによって、創傷後２４、４８、および７２時間後に遊走を評価した。０．２５ｍｍの長さの傷の端にそって無作為に選択した１２の部位の遊走細胞を、４０倍の倍率で測定した。２つの異なる部位の遊走を、各培養で作成した２つの別々の傷それぞれで測定した。値は２つの培養における４つの異なる傷の端から露出した領域へ細胞が移動した平均距離±ＳＥである。ペプチド７７−９７に接触させた細胞は、７２時間で、ビヒクルに接触させたものよりも傷の端から遠くへ遊走した。ＥＧＦも細胞の移動を刺激し、そして２つの薬剤は一緒に作用して著しく遊走を増強した。 図１７は、ＡＭＰペプチド６７−８５の、ペプチド５８−９９によって刺激された腸上皮細胞の増殖に対する効果を示す。ＩＥＣ−１８細胞のコンフルエントな培養を調製した。１日後、培地を吸引し、そして分裂促進性ペプチド５８−９９（８μｇ／ｍｌ）なし（コントロール）、またはそれと共に、ＣＳ（０．５％）およびインスリンを含む５ｍｌのＤＭＥＭと交換した。１ｍｌの培地および異なる量のペプチド６７−８５を加えた姉妹プレートを、ＣＯ_２インキュベーターで、３８℃で１時間インキュベートし、そして次いでさらに４ｍｌの培地を各ディッシュに加えた。ペプチド５８−９９を、ペプチド６７−８５の各濃度で４つの姉妹プレートのうち２つに加え、そして細胞の数の計測した。次の３日間の間に、ペプチド６７−８５の非存在下では、細胞数は２９０％増加し、一方ペプチド５８−９９に接触させた細胞は数が４０７％増加し、そしてＥＧＦで処理した（５０ｎｇ／ｍｌ）細胞は４０２％（示していない）増加した。分裂促進性ペプチド５８−９９による細胞増殖の刺激は、細胞を０．２５μｇ／ｍｌのペプチド６７−８５とプレインキュベーションすることによって完全に消失した。単独で加えた場合、ペプチド６７−８５（０．２５から８μｇ／ｍｌ）は分裂促進因子ではなかった。培養あたりの細胞数の値は、同じ期間にビヒクルと接触させた細胞の増加と相対的に示す。 図１８は、ＡＭＰ−１８に対するウサギ抗血清の、コンフルエントなＩＥＣ−１８細胞に対するｒｈＡＭＰ−１８の分裂促進効果に対する効果を示す。ｒｈＡＭＰ−１８（５０ナノモル）を抗血清（１：１００希釈）およびＡｂと３０分間プレインキュベートした場合、増殖刺激は〜９５％抑制された；免疫前血清は細胞増殖に影響しなかった。この最近精製されたｒｈＡＭＰ−１８の増殖刺激の最大半減濃度（Ｋ_１／２）は、約５ナノモルである。 図１９は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、ヒト幽門洞（ＨＡＥ）およびラット腸（ＩＥＣ−１８）上皮細胞の創傷回復に対する効果を示す。コンフルエントな単層培養を、剃刀の刃でひっかくことによって機械的に傷つけ、そして傷の端から細胞が遊走した距離を顕微鏡接眼レンズの網腺を用いて測定した。細胞は、調査した各時点で、ＡＭＰペプチドの存在下でより遠くに遊走した（Ｐ＜０．００５）。 図２０は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、ＴＥＲの成熟に対する効果を示す。ＭＤＣＫ細胞の単層培養を、透過可能なポリカーボネートフィルター（０．４μｍの孔サイズ）（Ｔｒａｎｓｅｌｌ）上に、ペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）なし（コントロール）またはありでＦＢＳ（２％）を含むＤＭＥＭ中で８日間増殖させた。ＴＥＲを、細胞をまいてから２４時間後、およびその後指定の時間に上皮電圧抵抗計（ＥＶＯＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定した。各測定の後、ペプチドなしまたありでＦＢＳを含む培地を交換し（０、４８、および１４４時間）、そしてさらなるペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）を３０および７２時間に加えた。７２時間に、ペプチド７７−９７を加えた培養におけるＴＥＲは、コントロール培養の２倍高かった。値は３つの培養の平均である；分散は平均の＜１０％である。ＴＥＲをフィルターの３つの異なる領域から測定した。 図２１は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、酸化剤モノクロラミンまたはインドメタシンで損傷した単層におけるＴＥＲに対する効果を示す。パネルＡ：ＭＤＣＫ細胞単層で安定なＴＥＲ（３３０Ω・ｃｍ^２）に達したら、培地を、ＦＢＳ（０．２％）およびペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを含むＤＭＥＭに交換した。１８時間後、ペプチド７７−９７またはＥＧＦを、指定のウェルに加えた。１時間後、モノクロラミン（０．１ｍＭ）を、他の薬剤と同様に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの先端および基底区画に加えた。ビヒクルまたはＥＧＦで処理したモノクロラミン損傷培養は、酸化剤への接触から９０分後に〜３０−４０％のＴＥＲの損失を維持したが、ペプチド７７−９７で処理した酸化剤損傷細胞のＴＥＲは、酸化剤に接触させていないコントロール培養と同様であった。パネルＢ、Ｃ：Ｃａｃｏ２／ｂｂｅ（Ｃ２）サブクローン単層を、コラーゲンでコートしたポリカーボネートフィルターに、安定なＴＥＲに達するまで（２２５Ω・ｃｍ^２）増殖させた。消費した培地をＦＢＳ（０．１％）単独またはペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）とともに含む新しい培地と交換した。１８時間後、モノクロラミン（０．３ｍＭ、Ｂ）またはインドメタシン（０．１ｍＭ、Ｃ）をＴｒａｎｓｗｅｌｌの両方の区画に加えた。０時間に、ビヒクル（コントロール）、ビヒクルプラス酸化剤またはインドメタシン、またはペプチド７７−９７および酸化剤またはインドメタシンを培養に加えた。ビヒクルで処理した損傷培養のＴＥＲは、９０分で〜３５％減少したが、ペプチドで処理した培養は〜１０％減少した。ペプチドは、非損傷細胞のＴＥＲを変化させなかった（示していない）。 図２２は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、ＤＳＳによる損傷後のＴＥＲに対する効果を示す。Ｃ２細胞単層を、ＦＢＳ（５％）およびトランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ中で、コラーゲンでコートしたポリカーボネートフィルター上に、安定なＴＥＲに達するまで（２２５Ωｃｍ^２）増殖させた。０時に、細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌの上部区画においてＤＳＳに曝露させない（コントロール）、またはＤＳＳ（４％）に曝露させた。ＡＭＰペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）を、０時にＤＳＳを加える１日前に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上部および下部区画に加えた。ビヒクルで処理したＤＳＳ−損傷培養物のＴＥＲは、４５分で約７０％減少したが、ペプチドで処理した培養物はその時点で約１０％減少した。ペプチドは非損傷細胞のＴＥＲを変化させなかった。値は≧６の培養物の平均である。 図２３は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、Ｃ２細胞の酸化剤損傷後のＺＯ−１およびオクルディンに対する効果を示す。このイムノブロットは、不溶性画分のタンパク質レベルが、細胞のビヒクルに対するよりもＡＭＰペプチドに対する曝露後の方が約２倍より高いことを示す。 図２４は、ＡＭＰペプチドのＣ２細胞に対する効果を示す。培養物を異なる時間、ペプチドに曝露させ、そして不溶性画分を得た。タンパク質を分離し、イムノブロットを特異的抗血清でプローブし、そして各タンパク質の量を、レーザーデンシトメトリーを用いて定量した。 図２５は、ｒｈＡＭＰ−１８の、酸化剤損傷を受けた単層のＴＥＲに対する効果を示す。コンフルエントなＣ２細胞単層を、安定なＴＥＲが確立するまでＴｒａｎｓｗｅｌｌに調製した。培地を、ＦＢＳ（０．１％）単独（コントロール）またはｒｈＡＭＰ−１８（１００ナノモル）またはペプチド７７−９７（３．７マイクロモル）のいずれかとともに含む新しい培地と交換した。１８時間後、モノクロラミン（０．３ｍＭ）をＴｒａｎｓｗｅｌｌの両方の区画に加え、そして培養物にビヒクル（コントロール）、ビヒクルプラス酸化剤、ｒｈＡＭＰ−１８および酸化剤、またはペプチド７７−９７および酸化剤を加え、その後ＴＥＲを測定した。 図２６は、ｒｈＡＭＰ−１９の、Ｃ２細胞におけるＺＯ−１およびオクルディンのレベルに対する効果を示す。単層培養を、ｒｈＡＭＰ−１９（１００ナノモル）またはビヒクルで８時間処理した。細胞溶解の後、細胞膜および細胞骨格結合ＴＪタンパク質に相当する不溶性（微粒子）画分を調製し、そして次いでイムノブロッティングを行なった。免疫反応性ＺＯ−１およびオクルディンの量は、同じイムノブロットのレーザーデンシトメトリーによって推定されるように、ビヒクルで処理した（１）細胞よりもｒｈＲＭＰ−１８で処理した（＋）細胞で約２倍より高い。各レーンにおける同量のタンパク質の装填は、これらの細胞で恒常的に発現される熱ショックタンパク質７３に対する抗体を用いてブロットを再プローブすることによって証明した。 図２７は以下のものを示す。左のパネル。マウス（ｎ＝１０）に３％のＤＳＳを与え、そして糞を毎日アッセイした。ビヒクルよりもＡＭＰペプチド（３ｍｇ／ｋｇ体重／日、ｓ．ｃ．）を与えたより少ない動物およびホモカルト（ｈｏｍｏｃｕｌｔ）陽性糞。右のパネル。動物にＤＳＳを４日間与えた後、水に切り換えた（グラフの０日）。ＡＭＰペプチドを毎日与えたマウスは、５日までにビヒクルを与えたマウスよりも体重減少が少なかった（Ｐ＜０．０４）。ペプチドで処理した４日目および５日目の動物の体重は増加したようであった；ビヒクルを与えたものは減少した。

Claims (1)

1. 本明細書中に記載される、ガストロカインタンパク質由来の増殖刺激ペプチドを含む、薬学的組成物。

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