JP4236376B2

JP4236376B2 - ヒト株化細胞が産生するヒトトロンボポエチン、その製造方法およびそれを含む医薬組成物

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Publication number: JP4236376B2
Application number: JP2000508703A
Authority: JP
Inventors: 晴彦森田; 篤志松本; 尚志加藤; 秀哉大橋
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 1997-09-01
Filing date: 1998-08-31
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2018-08-31
Also published as: AU8888198A; TWI235158B; KR20010023238A; WO1999011665A1; CN1278267A; KR100562929B1

Description

発明の背景
発明の分野
本発明は、ヒト株化細胞が産生する新規なヒトトロンボポエチン糖タンパク質に関し、特に抗原性の低下や体内動態の改善等が認められる新規のヒトトロンボポエチン糖タンパク質、その製造方法、およびそれを含む医薬組成物に関する。
関連技術の開示
ヒトトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；「ＴＰＯ」と称する）は、サイトカインのレセプタースーパーファミリーの一つであるＭｐｌのリガンドとしてクローニングされた糖タンパク質である（ｄｅＳａｕｖａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６９巻、５３３−５６５頁、（１９９４）；Ｂａｒｔｌｅｙ，Ｔ．Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ７７巻、１１１７−１１２４頁、（１９９４））。これらのＭｐｌリガンドはいずれも血小板減少症の動物（例えばヒト、マウス、イヌなど）の血清や血漿中に検出され、巨核球形成や血小板形成への関与が確認されている。
血小板減少症の治療剤の開発を念頭において、本発明者らも、ラット骨髄より高度に純化した巨核球前駆細胞からの巨核球生成を促進する活性を指標にして、血小板減少症のラット血漿よりラットＴＰＯを精製し、その部分アミノ酸配列に基づいて、ラットＴＰＯｃＤＮＡ、さらにはヒトＴＰＯｃＤＮＡをクローニングし、遺伝子組換え技術によって大量に均一なヒトＴＰＯを取得することに成功した（Ｈ．Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２２巻、８３８頁、（１９９４））。本発明者らが取得に成功したこのヒトＴＰＯは、前述のヒトＭｐｌリガンドとして取得された因子と同一のアミノ酸配列であることが判明している（後記の配列表：配列番号１参照）。
本発明者らは、該ヒトＴＰＯを制ガン剤や免疫抑制剤の投与、あるいは放射線照射やＢＭＴによって骨髄抑制の起きた血小板減少症のマウスに投与したところ、血小板減少阻止効果、血小板増加促進効果、さらには、造血機能の亢進が認められ、該ヒトＴＰＯがこれらの血小板減少症に有効であることを見いだしている。
ヒトＴＰＯについてはこれまでに、ヒト血漿中のＴＰＯについて報告がなされている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．ら、３８ｔｈＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇｏｆｔｈｅＡＳＨ（１９９６））が、いまだ単離・精製されたものはないため、その構造、機能等については知られていない。
また、各種細胞でＴＰＯを産生するものもｍＲＮＡおよびＥＬＩＳＡレベルでは検出されている。ヒト肝臓由来細胞（ＨｅｐＧ２）では（Ｈｉｎｏ，Ｍ．ら、ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ２１７巻、４７５−４８１頁、（１９９５））、構成的なｍＲＮＡの発現が検出されている。また、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ）ではｍｐｌ発現細胞（ＭＯ−７ｅ，ＢａＦ３／ｍｐｌ）を増殖させる活性とＴＰＯｍＲＮＡを検出している。しかしながらこれも単離・精製されてはおらず、ｉｎｖｉｖｏの活性も含めてその構造、機能等については知られていない。
一方、遺伝子組換え技術を用いた組換えヒトＴＰＯとしては、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ−１）において発現させたもの（Ｋａｔｏ，Ｔ．ら、Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ１１８巻２２９−２３６頁、（１９９５））、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において発現させたもの（Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３９５巻２２８−３３４頁、（１９９５）；Ｋａｔｏ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４巻４６６９−４６９７頁、（１９９７））、大腸菌にて発現させたもの（Ａｎｎ，Ｍ．Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ８６巻５４−５９頁、（１９９５））、ＢａｂｙＨａｍｓｔｅｒ腎臓細胞（ＢＨＫ）で発現させたもの（Ｒｏｓｓ，Ｃ．Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５巻１４８４９−１４８６１頁（１９９６））、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）で発現させたもの（ｄｅＳａｕｖａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ３６９巻、５３３−５３８頁（１９９４）；Ｂａｒｔｌｅｙ，Ｔ．Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ７７巻、１１１７−１１２４頁、（１９９４））等が知られている。
しかし、これまでにＴＰＯ産生臓器由来ヒト株化細胞で発現させたＴＰＯについての報告はない。
また、上記の種々の非ヒト株化細胞が産生するＴＰＯと、ヒト株化細胞が産生するヒトＴＰＯやヒト血中で認められるＴＰＯとの構造の異同等については何等知られていない。ましてや、その構造の異同とＴＰＯの機能との関係については何等報告されていないのが現状である。
一般に、ＴＰＯのような生理活性糖タンパク質の場合、主要ＴＰＯ産生臓器以外にも該タンパク質を産生している臓器があり、その臓器／臓器由来細胞の種類によって、産生されている該糖タンパク質の構造が異なる場合がある。
同様に、遺伝子組換え技術を用いた組換え糖タンパク質の場合、用いる宿主細胞によって産生される糖鎖構造が異なることが知られている。特に動物細胞を用いる場合はその種類（動物種、あるいは由来する臓器の種類、細胞株等）によって付加される糖鎖構造は様々であり、その差異がタンパク質の機能、主に、抗原性、体内動態等に影響を与えることも少なくない。事実、これまでに多くの遺伝子組み換え蛋白医薬品に対する抗体産生の報告（Ｓｔｅｉｓら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８巻、１４０９−１４１３頁（１９８８）など）があるが、これは体内をめぐる天然体蛋白と構造的、機能的な差があるからに他ならない。
抗原性、体内動態に関してより優れた性質を有するヒトＴＰＯ糖タンパク質であれば、医薬品としての価値を一層高めることが期待できる。
発明の要約
本発明は、ヒト株化細胞が産生するヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を提供する。
本発明の実施態様において、ＴＰＯは、内在性又は外来性のヒトＴＰＯ遺伝子のヒト株化細胞における発現産物であって、単離・精製されたものである。また、ヒト株化細胞としては、ＴＰＯ産生臓器由来ヒト株化細胞、例えばＪＨＨ７（ＦＥＲＭＢＰ−６０４９）、ＨｕＨ７（ＦＥＲＭＢＰ−６０４８）等のヒト肝臓由来細胞やヒト骨髄ストローマ細胞を挙げることができる。
本発明のＴＰＯは、ＳＳＡ−レクチンカラムに親和性を有する糖鎖構造をもつものか、あるいは、少なくともα２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつものであることができる。そのアミノ酸配列は、例えば配列表の配列番号１に示す１位〜３３２位のアミノ酸を有するものである。
本発明はまた、上記定義のヒトＴＰＯを有効成分とする医薬組成物を提供する。具体的には、該ＴＰＯは血小板増加剤、血小板障害治療剤、血小板減少症治療剤として用いることができる。本発明のＴＰＯは、薬剤として使用されるとき、抗原性の低下や体内動態の改善などの利点を付与することができる。
本発明はさらに、ＴＰＯ産生臓器由来ヒト株化細胞において外来性のヒトＴＰＯ遺伝子を発現させることを含む、ヒトＴＰＯの製造方法を提供する。ヒト株化細胞として、上記のヒト肝臓由来細胞（例えばＪＨＨ７（ＦＥＲＭＢＰ−６０４９）等）やヒト骨髄ストローマ細胞を用いることができる。このような方法によって得ることができるヒトＴＰＯも本発明に包含される。
本発明はさらにまた、少なくともα２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒトＴＰＯを提供する。ここで、ヒトＴＰＯは外来性のヒトＴＰＯ遺伝子の株化細胞における発現産物であって、単離・精製されたものとすることができ、また株化細胞としては、α２，６−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子が導入されたＣＨＯ細胞であることができる。
本発明はまた、ＣＨＯ細胞にα２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを導入し、該ＣＨＯ細胞においてヒトＴＰＯ遺伝子を発現させることを含む、少なくともα２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒトＴＰＯの製造方法、あるいは、ＣＨＯ細胞においてヒトＴＰＯ遺伝子を発現させ、該ＣＨＯ、細胞にα２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを導入することを含む、少なくともα２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒトＴＰＯの製造方法を提供する。
発明の詳細な説明
本発明者らは、ヒトＴＰＯの主要産生臓器が肝臓であることがｍＲＮＡレベルで確認されている（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｙ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ２３巻、１３８８−１３９６頁、（１９９５）；Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ２５巻、５６５−５７２頁、（１９９５））ことから、ヒト肝臓由来株化細胞に注目した。そこで、ヒト血漿から部分精製したＴＰＯ（ｎａｔｉｖｅＰｌａｓｍａＴＰＯ）、ヒトＴＰＯ産生肝臓由来株化細胞から精製したＴＰＯ（ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ）、並びに該ヒトＴＰＯ産生肝臓由来株化細胞で発現させた組換えヒトＴＰＯ（ｒｅｃＨｅｐＴＰＯ）等を調製し、その糖鎖構造について、ＣＨＯで発現させた組換えヒトＴＰＯ（ｒｅｃＣｈｏＴＰＯ）との比較を行った。その結果、ヒトＴＰＯ産生肝臓由来株化細胞から精製したＴＰＯ（ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ）と該ヒトＴＰＯ産生肝臓由来株化細胞で発現させた組換えヒトＴＰＯ（ｒｅｃＨｅｐＴＰＯ）は、そのＮ結合型糖鎖の結合パターンがＣＨＯで発現させた組換えヒトＴＰＯと異なっており、むしろ、ヒト血漿から精製したＴＰＯ（ｎａｔｉｖｅＰｌａｓｍａＴＰＯ）と共通していることが判明した。
即ち、後述の実施例にあるように抗ＴＰＯモノクローナル抗体とレクチンを用いたレクチン− ＥＬＩＳＡ分析法によるとｎａｔｉｖｅＰｌａｓｍａＴＰＯ、ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯおよびｒｅｃＨｅｐＴＰＯは糖鎖末端のシアル酸付加様式がα２，６結合であることを特徴付けするＳＳＡレクチン（Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０６巻、１０９８−１１０３頁、（１９８９））に反応性を見せるが、ｒｅｃＣｈｏＴＰＯは反応しない、一方、シアル酸付加様式がα２，３結合であることを特徴付けするＭＡＭレクチン（Ｗｅｉ−Ｃｈｕｎ，Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３巻、４５７６−４５８５頁、（１９８８））にはこれらすべてが反応する。つまり、ｒｅｃＣｈｏＴＰＯは、Ｎ結合型糖鎖においてα２，６結合型シアル酸付加構造を有するヒト血漿由来のＴＰＯと大きく異なり、一方、ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯおよびｒｅｃＨｅｐＴＰＯはヒト血漿由来のＴＰＯと類似していると言える。
そこで、本発明によれば、ヒト株化細胞が産生する新規なＴＰＯが提供される。好ましくは、ＴＰＯ産生臓器由来ヒト株化細胞が産生する新規なヒトＴＰＯが提供される。更に好ましくは、上記特定の糖鎖構造を有する新規なヒトＴＰＯが提供される。
本発明の新規ヒトＴＰＯは、抗原性の低下、体内動態の改善、連投時の血小板増多効果の低下の改善をもたらすものである。
本発明のヒトＴＰＯとしては、遺伝子組換え技術を用いて、ヒトＴＰＯ遺伝子をヒト株化細胞に導入し、発現させ、単離・精製することによって得られる、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）のヒトＴＰＯ遺伝子のヒト株化細胞における発現産物であるヒトＴＰＯが挙げられる。あるいは、ヒトＴＰＯ遺伝子が発現されているヒト株化細胞から、単離・精製することによって得られる、内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）のヒトＴＰＯ遺伝子のヒト株化細胞における発現産物であるヒトＴＰＯであってもよい。あるいは、内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）のヒトＴＰＯ遺伝子の発現産物であるヒトＴＰＯには、ヒトＴＰＯ遺伝子をもつヒト株化細胞に、プロモーター等を外から導入し、該内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）のヒトＴＰＯ遺伝子を活性化し発現させる方法（国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号参照）によって得られるようなヒトＴＰＯも含まれる。
ヒト株化細胞としては、例として、ＨＬ６０（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２４０）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ−１５２）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ−１５２）、ＨｅＬａ（理研寄託番号ＲＣＢ００２７）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１０７４１）等が挙げられる。好ましくは、ＴＰＯ産生臓器由来ヒト株化細胞であり、例えばヒト肝臓由来細胞、ヒト骨髄ストローマ細胞などが挙げられる。更に好ましくは、ヒト由来肝臓細胞株である、ＪＨＨ７、ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２等が挙げられる。ＪＨＨ７は、１９９７年８月１１日付で、日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６０４９としてブタペスト条約下で国際寄託されている。ＨｕＨ７は、１９９７年８月１１日付で、日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６０４８として同様に寄託されている。
本発明のヒトＴＰＯとして、好ましくは、α２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつもの、もしくは、少なくともＳＳＡ−Ｌｅｃｔｉｎ［正式名称：ｓａｍｂｕｃｕｓｓｉｅｂｏｌｄｉｎａａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎｌｅｃｔｉｎ又はＥｌｄｅｒｂｅｒｒｙＢａｒｋｌｅｃｔｉｎ（Ｓｉｂｕｙａ，Ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６２：１５９６−１６１６（１９８７）参照］に親和性を有する糖鎖構造をもつものが挙げられる。更に好ましくは、Ｎ結合型糖鎖においてα２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつもの、もしくはＳＳＡ−Ｌｅｃｔｉｎに親和性を有する糖鎖構造をもつものが挙げられる。
本発明のヒトＴＰＯは、そのタンパク質部分の一次構造、即ちアミノ酸配列としては、配列番号１に示されたアミノ酸配列か、または配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、ヒトＴＰＯ活性を保持する限りにおいてその一部が改変（置換、欠失、挿入、および／または付加）されているようなアミノ酸配列であるものも含まれる。具体的には、国際公開第ＷＯ９５／２１９１９号（１９９５年８月１７日）に記載されているＴＰＯ誘導体や同第ＷＯ９６／２５４９８号（１９９６年８月２２日）に記載されたＴＰＯ誘導体、同第ＷＯ９５／１８８５８号（１９９５年７月１３日）に記載されたＴＰＯ誘導体等に見られるようなアミノ酸残基の改変を挙げることができる。
本明細書中、「ＴＰＯ活性」とは、巨核球前駆細胞の増殖および分化を促進するか、および／又は生体内で特異的に血小板の産生を刺激、または増強する活性をいう。
また、本発明によれば、上記新規なヒトＴＰＯを製造する方法も提供される。
ヒト株化細胞から直接精製および単離する方法としては、一般にタンパク質の精製に用いられる手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、色素吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、硫酸化ゲルクロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、金属キレーティングクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、分取電気泳動法、および等電点電気泳動法などの一つ以上を組み合わせた方法がある。また、ヒトＴＰＯの物理化学的な性質を利用して組み合わせることのできる方法も本発明に含まれる。さらには、ＴＰＯを認識することのできる抗体を用いた抗体カラムをも用いることができる。また、ＴＰＯはＭｐｌのリガンドであることが判明したことから（ｄｅＳａｕｖａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ３６９巻５３３−５３８頁（１９９４）；Ｂａｒｔｌｅｙら、Ｃｅｌｌ７７巻１１１７−１１２４頁（１９９４）；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ３６９巻５６５−５６８頁（１９９４））、Ｍｐｌを活性化ゲルにカップリングさせることでアフィニティーゲルカラムを調製し、これを利用することによってもＴＰＯを精製することができる。より具体的には、Ｍｐｌの細胞外領域（Ｍｐｌ−Ｘ）をＣＨＯ細胞を宿主として用いた遺伝子組換え法により生産・調製し、調製されたＭｐｌ−Ｘカラムが挙げられる（前述のＢａｒｔｌｅｙら（１９９４））。
また、本発明には、遺伝子組換え技術を用いた、本発明のヒトＴＰＯの製造方法も含まれる。例えば、ヒトＴＰＯをコードするＤＮＡをベクターの適切な部位に組み込んだ組換えベクターでヒト株化細胞を形質転換又はトランスフェクトし、産生されたヒトＴＰＯタンパク質を分離・精製することを特徴とする本発明のヒトＴＰＯの製造方法が挙げられる。本発明の実施態様において、本発明は、ＴＰＯ産生臓器由来ヒト株化細胞、好ましくはヒト肝臓由来細胞（例えばＪＨＨ７細胞）又はヒト骨髄ストローマ細胞にヒトＴＰＯ遺伝子を導入し、発現させることによるヒトＴＰＯの製造方法を提供する。これらの方法におけるヒト株化細胞としては、上述のとおりである。
これらの宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトさせるために用いられるベクターとしては、ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＳｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）．ｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａら；Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）、あるいはｐｃＤＬ−ＳＲ α２９６（Ｔａｋｅｂｅら；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，４６６−４７２，１９８８）等がある。
これらのベクターは必要に応じて複製起点、選択マーカー、プロモーターを含み、さらに真核細胞用のベクターには、必要に応じてＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等が付加される。
複製起点としては、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のもの等を用いることができる。
遺伝子発現用プロモーターとしては、ウイルス由来であるレトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０由来のもの等あるいは、染色体由来のもの（例えば、ＥＦ１−α）等を用いることができる。
選択マーカーとしては、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子、ピューロマイシン（ｐｕｒ）耐性遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子などを用いることができる。
好ましくは、後述の実施例１の（４）にあるように、ヒトエロンゲーションファクタ−１−アルファプロモーター下流にヒトＴＰＯｃＤＮＡを配置し、さらにＳＶ４０初期ポリアゲニル化シグルナル、ＤＨＦＲ遺伝子、ＳＶ４０複製開始点などを付加したベクターによって、トランスフェクタム法（プロメガ社製）を用いてＪＨＨ７細胞を形質転換することによって行われる。形質転換されたＪＨＨ７細胞は恐らく内在性のヒトＴＰＯ遺伝子の発現産物であるヒトＴＰＯに加えて導入された外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）のヒトＴＰＯ遺伝子に基づいたＴＰＯを産生することになる。
また、本発明によれば、本発明のヒトＴＰＯを含有する医薬組成物も提供される。本発明の医薬組成物は、その製剤化の目的に応じて安定化剤、希釈剤、可溶化剤、防腐剤、酸化防止剤、賦形剤及び等張化剤等を含有することができる。
本発明のヒトＴＰＯを含有する医薬組成物は注射等の非経口、経肺、経鼻、および経口を含めた種々の投与経路に応じた剤形として、溶液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、凍結乾燥製剤などが例示される。
本発明のヒトＴＰＯを含有する医薬組成物は、活性成分として通常０．０５μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重を、病状、性別及び投与経路等に応じて、一日一回〜数回程度投与することができる。
本発明によれば、本発明のヒトＴＰＯを有効成分とし、血小板の増加を必要とする多数の疾患患者に対する血小板増加剤が提供される。
更には、制ガン剤や免疫抑制剤の投与による化学療法や放射線療法、あるいは骨髄移植（ＢＭＴ）やＰＢＳＣＴ、ＣＢＳＣＴ施行患者における血小板減少症の治療剤が提供される。
更に、血小板障害、例えば、血小板産生障害や血小板の寿命短縮（血小板破壊の亢進、あるいは血小板消費の亢進）による血小板減少を特徴とする多数の疾患への治療剤が提供される。
例えば、先天性のファンコニ貧血、化学療法や放射線療法に伴う再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、または骨髄移植のような骨髄形成不全による血小板減少症などが挙げられ、このような患者の血小板の回復を促進するために用いることができる。
また、ＴＰＯ産生異常による血小板減少症にも有用である。血小板や巨核球の寿命短縮による血小板減少症としては例えば、特発性血小板減少性紫斑病、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少症などがあり、このような患者の血小板回復促進にも有用である。
更に、外科手術前にＴＰＯを投与して自分の血小板を増加させ、その血小板を自分の手術時に輸血用血小板として用いる、いわゆる自己血小板輸血への用途としても有用である。
更に本発明のヒトＴＰＯは、例えば他の化学薬品または医薬品、または治療的措置による一過性の血小板の欠損または損傷によってもたらされた血小板障害の治療にも有用である。本発明のヒトＴＰＯは、そのような患者で新しい“無傷の”血小板の放出を促進するのに用いることができる。更にＴＰＯの主たる産生臓器の一つが肝臓であることが明らかにされていることから、血小板減少をきたす各種の肝臓病、例えば、胆道閉鎖症、肝臓移植、肝硬変、肝炎などにもＴＰＯ投与の臨床応用が期待される。更に、保存血小板の止血血栓形成能を回復させる用途としても有用である。
このように、本発明の医薬組成物又は治療剤を用いることによって、抗原性がより低下すると共に、薬剤の体内動態がより改善され、より優れた血小板増加効果、血小板障害治療効果又は血小板減少症治療効果を得ることができる。
本発明はさらに、少なくともα２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒトＴＰＯを提供する。ここで、ヒトＴＰＯは外来性のヒトＴＰＯ遺伝子の株化細胞における発現産物であって単離・精製されたものであってよく、また、株化細胞はＣＨＯ細胞や、卵巣細胞同様にα２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性が低いとされる腎臓由来のＨＥＫ２９３やＢＨＫなどの細胞に、α２，６−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子を導入したものであることができる。
本発明者らは、ＣＨＯ細胞にラットα２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを導入することによって、α２，３結合型及びα２，６結合型の両シアル酸が付加された形のＴＰＯを発現させることを試みた。この場合、ヒトＴＰＯ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞に後からα２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを導入することによって形質転換を行ってもよいし、その順序は逆であっても、また同時であってもよい。また、後述の実施例において、ＣＨＯ細胞に遺伝子導入したのはラット肝臓β−ガラクトシドα２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＥｎｔｒｅｚａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ１８７６９）であるが、たとえば成熟ラット脳由来のもの（ＥｎｔｒｅｚａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ２９５５４）やマウスβ−ガラクトシドα２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＥｎｔｒｅｚａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｄ１６１０６）を用いることも可能である。
本来ＣＨＯ細胞はα２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性を有していないが（Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻，１０９３１〜１０９３４頁、（１９８９））、これにＬｅｅ，Ｅ．Ｊ．ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻，１３８４８〜１３８５５頁、（１９８９））の方法にあるように強力なプロモーター下に配したα２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを導入することによって、本来細胞の有するα２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性と競合することによってその量的優位性によってα２，６結合型シアル酸がα２，３結合型シアル酸と同一分子上に、あるいは優位に付加されたＴＰＯが産生されることになる。ここで言う「α２，６結合型のシアル酸が優位に付加された」とは、実施例３で述べられているＬｅｃｔｉｎ−ＥＬＩＳＡで測定したときにＳＳＡ−ＬｅｃｔｉｎＥＬＩＳＡに反応し、ＭＡＭ−ＬｅｃｔｉｎＥＬＩＳＡに対する反応が測定限界以下であることを指す。ＣＨＯＤ−株で産生されたＴＰＯはα２，３型の結合様式で付加されたシアル酸をもち、α２，６型の結合様式で付加されたシアル酸をもたないことが確認されているが、事実、ＮＡＭ−ＬｅｃｔｉｎＥＬＩＳＡに十分な反応性をもっていて、かつＳＳＡ−ＬｅｃｔｉｎＥＬＩＳＡに全く反応しない。２，６−シアリルトランスフェラーゼの遺伝子導入によりこの反応性が逆転し、本来有しない２，６−型の結合様式で付加されたシアル酸に特異的に結合するＳＳＡ−Ｌｅｃｔｉｎが反応するようになったということは、２，６−シアリルトランスフェラーゼが遺伝子導入によって高発現するようになった結果、その活性が２，３−シアリルトランスフェラーゼのシアル酸付加活性を圧倒的に上回り、本来α２，３型の結合様式でシアル酸が付加される位置をα２，６型の結合様式のシアル酸が占めたことを意味する。
ヒトＴＰＯ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞としては、例えば、ヒトＴＰＯをコードするＤＮＡを担持する適切な発現ベクターによって形質転換されたＣＨＯ細胞を用いることができる。例えば、１９９５年１月３１日付で日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４９８８として寄託されている、ヒト全長ＴＰＯをコードするｃＤＮＡを担持するプラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１によって形質転換されたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ＤＵＫＸＢ１１）が挙げられる。
このように、本発明はまた、ＣＨＯ細胞にα２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを導入し、該ＣＨＯ細胞においてヒトＴＰＯ遺伝子を発現させることを含む、少なくともα２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒトＴＰＯの製造方法を提供する。さらに本発明は、ＣＨＯ細胞においてヒトＴＰＯ遺伝子を発現させ、該ＣＨＯ細胞に、α２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを導入することを含む、少なくともα２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒトＴＰＯの製造方法を提供する。
実施例
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるべきでない。
＜実施例１＞
（１）ヒト血漿からのＴＰＯの（部分）精製…ｎａｔｉｖｅＰｌａｓｍＴＰＯ
−８０℃保存のヒト血漿、約４６０ｍｌを流水中にて融解後、１３５０×ｇで遠心、不溶性沈殿を除去し、その上清４５７ｍｌを等量の１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮａＮ_３を含むＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）（ＤＰＢＳ：日水製薬（株）社製Ｃａｔ．Ｎｏ．０５９１３）で希釈した。この２倍希釈ヒト血漿９１４ｍｌに対し、プロテアーゼによる蛋白分解を阻害する目的でプロテアーゼ・インヒビター、ＰｅｆａｂｌｏｃＳＣ（ＭＥＲＫ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．１２４８３９、最終濃度０．１ｍＭ）、ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｏ（４−ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）−ｂｕｔａｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ３１３２、最終濃度０．０１ｍＭ）を添加した。これをＳＡＲＴＯＢＲＡＮ３００（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．５２３１３０７Ｈ５−−００−−Ｂ）をもちいて０．２２μろ過し、抗ＴＰＯ抗体結合ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦカラム（カラムサイズ：φ０．５ｃｍ×５ｃｍ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦゲル：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０９０６−０１）へ流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。その際、抗ＴＰＯ抗体カラムへの非特異的吸着を避けるため、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（カラムサイズ：φ０．５ｃｍ×０．５ｃｍ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦゲル：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０１４９−０１）、およびｎｏｒｍａｌＲａｂｂｉｔＩｇＧ結合ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦカラム（カラムサイズ：φ０．５ｃｍ×５ｃｍ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦゲル：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０９０６−０１）をプレカラムとして、抗ＴＰＯ抗体カラムに接続した。アプリケーション終了後、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮａＮ_３を含むＤＰＢＳバッファーでカラムを洗浄し、２８０ｎｍの吸光度（Ａ_２８０）が０．２程度まで下がったところでプレカラムを取り外した。さらにゲルへの非特異的吸着物除去のため、０．５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭＳｏｄｉｕｍＰｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ７．３バッファーでカラムを洗浄した。カラム内を１５０ｍＭＮａＣｌで置換した後、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＣＨＡＰＳを含む０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌｐＨ２．５バッファーでＴＰＯの溶出を行った。溶出後、ただちに各分画を１ＭＮａ_２ＣＯ_３により中和し、高感度ＴＰＯ−ＥＬＩＳＡへ供した。ＥＬＩＳＡの結果をもとにＴＰＯ溶出画分をプールし、限外ろ過法により濃縮、バッファー交換を行った。限外ろ過濃縮にはＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−ＭＣ１０Ｋｃｕｔ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．ＵＦＣ３ＬＧＣ００）を用い、４，０００×ｇで遠心、濃縮し、その後、数回ＤＰＢＳを添加、濃縮を繰り返した。最終的に５００ｌの１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮａＮ_３を含むＤＰＢＳバッファーに懸濁、部分精製ヒト血漿ＴＰＯとした。
この部分精製ＴＰＯの一部を以下の通りＳＤＳ存在下、ゲルろ過に供した。部分精製ＴＰＯに対し、５分の１容量の２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，５％ＳＤＳ，１０ｍＭＥＤＴＡを添加し、９５℃、５分処理した。これを０．１％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡを含むＤＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲゲルろ過カラム（φ １ｃｍ×３０ｃｍ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０５３７−０１）へアプライし、得られた分画をＴＰＯ−ＥＬＩＳＡに供しＴＰＯの溶出位置の同定をおこなった。その結果、ヒト血漿由来ＴＰＯは、ＣＨＯ発現型ＴＰＯ（１−３３２ａ．ａ．）とほぼ同位置にメインに溶出され、分子量約８０ｋＤと考えられた。また僅かではあるが、約２０ｋＤ付近にも部分長型ＴＰＯの溶出を認めた。
（２）ＪＨＨ７細胞からのＴＰＯの（部分）…ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７）
ＪＨＨ７細胞を培養面積２２５ｃｍ^２の培養フラスコに入れ、１０％ＦＣＳを含む１：１ダルベッコ変法イーグル培地／ハムＦ１２（ＤＦ）培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で５％炭酸ガス培養器中にて３７℃でコンフルエントになるまで培養した。その後、これを無血清のＤＦ培地に置換して、４日間培養した後、上清を回収した。
上記培養で得られた体積４Ｌの上清（ＴＰＯ濃度５５ｐｇ／ｍｌ）を約１Ｌづつに分割してあらかじめ５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８で平衡化したＷＧＡ−ａｇａｒｏｓｅ（生化学工業社製）を５ｍｌ充填したカラムにアプライした。約２５０ｍｌの５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８で洗浄した後、０．４ＭＮ−アセチルガラクトサミン、５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８、１５ｍｌで溶出した。溶出液をＵＦ１５−１０ｋｃｕｔ（ミリポア社製）で濃縮しＴＰＯサンプルとした（１．０ｍｌ，１５９ｎｇ／ｍｌ）。
（３）ＨｕＨ７細胞からのＴＰＯの（部分）精製…ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＨｕＨ７）
ＨｕＨ７細胞を培養面積２２５ｃｍ^２の培養フラスコにいれ、１０％ＦＣＳを含むＤＦ培地で５％炭酸ガス培養器中にて３７℃でコンフルエントになるまで培養した。その後、これを無血清のＤＦ培地に置換して、４日間培養した後、上清を回収した。体積１．９Ｌの上清（１４７ｐｇ／ｍｌ）を約１Ｌづつに分割してあらかじめ５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８で平衡化したＷＧＡ−ａｇａｒｏｓｅ（生化学工業社製）を５ｍｌ充填したカラムにアプライした。約２５０ｍｌの５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８で洗浄した後、０．４ＭＮ−アセチルガラクトサミン、５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８各１５ｍｌで溶出した。溶出液をＵＦ１５−１０ｋｃｕｔ（ミリポア社製）で濃縮してＴＰＯサンプルとした（１．５ｍｌ、７７ｎｇ／ｍｌ）。
（４）ＪＨＨ７細胞におけるＴＰＯの発現、及び精製…ｒｅｃＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７／７／ｃ８３）
ＪＨＨ７細胞を６ｃｍ径のプレート（ファルコン社製）中、１０％ＦＯＳを含むＤＭＥＭ培地で培養増殖させ、これをトランスフェクタム法（プロメガ社製）を用いてｐＤＥＦ２０２−ｈ−ＴＰＯ−Ｐ１（特開平８−２２８７８１号公報）によって形質転換した。
なお、プラスミドｐＤＥＦ２０２−ｈ−ＴＰＯ−Ｐ１によって形質転換されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＤＵＫＢＩＩ）は１９９５年１月３１日付で日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ−４９８８として寄託されている。
即ち、ｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１プラスミド１０μｇ、ｐＥＦｎｅｏプラスミド１μｇを５００μｌのＤＭＥＭ培地に添加したＳｏｌｕｔｉｏｎＡ、及び５００μｌのＤＭＥＭ培地にトランスフェクタム（１ｍｇ／４００μｌＥｔＯＨ）５μｌを添加したＳｏｌｕｔｉｏｎＢを混合し、５００μｌの無血清ＤＭＥＭ培地に置換した６ｃｍ径プレートに１ｍｌ加え、６時間、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内に置いた。次に、ＤＭＥＭ培地３．５ｍｌを添加し、血清を最終濃度１０％になるように加え、再び、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内に４８時間置いた。なお、ｐＥＦｎｅｏプラスミドの作製は次のようにして行った。すなわち、プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで処理し、アガロースゲル電気泳動でｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含む小さい方の断片を回収し、Ｔ４ポリメラーゼ（宝酒造製）にて末端を平滑化した後、このフラグメントとプラスミドｐＥＦ１８Ｓ（特開平８−２２８７８１号公報）を制限酵素ＳｍａＩで処理したベクターＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）で結合する。こうしてできた２種類のプラスミドのうち、エロンゲーションファクタープロモーターと同方向でｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子が挿入されたものを選択してｐＥＦｎｅｏとした。
ついでこれを０．０５％トリプシン、５３ｍＭＥＤＴＡ溶液で剥離分散し、２４穴プレート１０枚に分割したのちに４１ｇ／ｍｇＧ４１８を含むＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地で選択を行った。このうちコロニーを形成したものをＦＤＣＰｈＭｐ１６３５／ＭＴＳアッセイ（ＭｏｒｉｔａＨ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３９５巻２２８−３３４頁、（１９９５））を行い高発現コロニーを選択した。選択されたコロニーについて限界希釈法によるクローニングを行い単一クローンとした。
ヒトＴＰＯｃＤＮＡを含むｐＤＥＦ２０２−ｈＴＰＯ−Ｐ１によって形質転換されたＪＨＨ７細胞株（ＪＨＨ７／７／ｃ８３）は、１９９７年８月１１日付で、日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６０５０としてブタペスト条約下で国際寄託されている。
この組み換え型ＪＨＨ７細胞株（ＪＨＨ７／７／ｃ８３）を培養面積２２５ｃｍ^２の培養フラスコに入れ、１０％ＦＣＳを含むＤＦ培地で５％炭酸ガス培養器中にて３７℃でコンフルエントになるまで培養した。その後、これを無血清のＤＦ培地に置換して、４日間培養した後、上清を回収した。
体積８．９７Ｌの上清（ＴＰＯ濃度０．５５μｇ／ｍｌ）をｐｅｌｌｉｃｏｎ−２ｃａｓｓｅｔｔｅ１０ｋｃｕｔ（ミリポア社製、カタログ番号Ｐ２Ｂ０１０Ａ０５）にて８９９ｍｌ（ＴＰＯ濃度５．７μｇ／ｍｌ）まで濃縮した。プロテアーゼによる蛋白分解を阻害する目的でプロテアーゼ・インヒビター、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（最終濃度０．０１ｍＭ）、ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｏ（４−ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）−ｂｕｔａｎｅ（最終濃度０．０１ｍＭ）を加えた。
２２５ｍｌづつに分解してあらかじめ５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８で平衡化したＷＧＡ−ａｇａｒｏｓｅ（生化学工業社製）を５ｍｌ充填したカラム４本にアプライした。約２５０ｍｌの５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８でそれぞれ洗浄した後、０．４ＭＮ−アセチルガラクトサミン、５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８各１５ｍｌで溶出した（ＴＰＯ濃度７３μｇ／ｍｌ）。
溶出液をＵＦ１５−１０ｋｃｕｔ（ミリポア社製）で濃縮、５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８に置換した（５．０ｍｌ、ＴＰＯ濃度１０８４μｇ／ｍｌ）。
これをＨｙｄｒｏｘｙｌＡｐａｔｉｔｅｔｙｐｅｌ（ＢｉｏＲａｄ社製直径１ｃｍ、ベッド高１０ｃｍ）カラムに注入し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで添加した。添加終了後、引き続き５ｍＭｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ６．８をカラムに注入し未吸着画分５０ｍｌ（ＴＰＯ濃度５４μｇ／ｍｌ）を集めた。これに１ＭＴｒｉｓ−ｂａｓｅ溶液を加えてｐＨを８．５に調整した。
次に、この画分をＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社、カタログ番号直径５ｍｍ、ベッド高１０ｃｍ）カラムで展開した。即ち、展開溶媒Ａに２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、展開溶媒Ｂに１ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５を用い、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５で予め平衡化したカラムに流速０．３ｍｌ／ｍｉｎでサンプルを添加した。添加終了後、流速を０．３ｍｌ／ｍｉｎから０．５ｍｌ／ｍｉｎに上げて、０％Ｂから２２％Ｂまで直線濃度勾配で展開し、１．０ｍｌ（２ｍｉｎ）ずつポリプロピレン製チューブに集めた。
それぞれの各フラクションをＥＬＩＳＡ法により測定し、ＴＰＯ画分を特定した。この結果チューブ番号３４〜５５（ＮａＣｌ濃度で０．１１６〜０．２Ｍの範囲）にＴＰＯの分布を見出したので、これを回収し、ＴＰＯ画分ＦＡ（２２ｍｌ）とした。これを、ＵＦ１５−１０ｋｃｕｔ（ミリポア社製）で濃縮し、途中液量が４．１ｍｌとなった時点でＴＰＯ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した（１１４３μｇ／ｍｌ）。さらにこれを濃縮を進め、２００μｌとした。
最終的なステップとしてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製、直径１ｃｍ、ベッド高３０ｃｍ）を用いて分離を行った。即ち、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）にてカラムを置換した後、ＦＡ濃縮サンプル２００μｌを流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで注入した。注入後引き続きＰＢＳをカラムに添加し、サンプル添加開始から１５分経過後から６００μｌ（３ｍｉｎ）ずつのフラクションとした。これを銀染色、抗ヒトＴＰＯポリクローナル抗体、ＥＬＩＳＡ法によりフラクションを測定し、この結果チューブ番号１３，１４，１５（添加開始からの総量で７．２〜９．０ｍｌ）にＴＰＯの分布を見出した。この３フラクションをプールし、ＡｃｃＱＴａｇ法により組成分析を行ったところ１．１１７３３ｍｇ／ｍｌ（１．８ｍｌ）であることが分かった（表１）。
このとき、ＥＬＩＳＡ法で測定したＴＰＯ量は１．１ｍｇ／ｍｌを与え、組成分析値とほぼ同等であった。すなわちここで用いたＥＬＩＳＡが、ｒｅｃＨｅｐＴＰＯに対しても標準ＴＰＯと同等の反応性を示すといえる。

＜実施例２＞分子量の測定
実施例１で得られた各種ＴＰＯの分子量を測定する目的でＳＤＳ−ＰＡＧＥ・ウエスタンブロッティングを行った。常法にしたがって、マイクロスラブゲル（第一化学薬品製、４．０％〜２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル）を用いて、ＳＤＳゲル電気泳動を室温下で１０ｍＡ、ついで２０ｍＡの一定電流にて約２時間かけて実施した。分子量マーカーにはプレステインド・ブロードレンジマーカー（ニューイングランドバイオラブズ社製）を用いた。
セミドライ転写装置（マリソル社製、ウエットフォー転写装置モデルＫＳ−８６４０）を用いて、泳動終了後直ちに１５０ｍＡの一定電流で１時間かけてＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に電気的に転写した。陽極に０．３ＭＴｒｉｓ、２０％メタノール、ｐＨ１０．４、転写膜液に２５ｍＭＴｒｉｓ、２０％メタノール、ｐＨ１０．４、陰極液に２５ｍＭＴｒｉｓ、４０ｍＭアミノカプロン酸、２０％メタノールを用いた。
転写された膜をＴＴＢＳ溶液にて５分間洗浄した後、ブロックエース（雪印社製）にてブロッキング１時間を行った。これを再びＴＴＢＳにて５分間洗浄した後に、９０％ＴＴＢＳ、１０％ブロックエース、０．０５％ＢＳＡ溶液に抗ヒトＴＰＯヤギ抗体を添加して１時間振とうした。ついで、この膜を再びＴＴＢＳにて５分間２回洗浄した後に、ＴＴＢＳ溶液に抗ヤギ、パーオキシダーゼ結合抗体を添加し１時間振とうした。この後この膜をＴＴＢＳ溶液にて１０分間４回洗浄し、ＥＣＬ発色システム（アマシャム社製）にて発色を行い、フィルム（アマシャム社製）に感光させた。
電気泳動における見かけの分子量はｒｅｃＣｈｏＴＰＯ（ＣＨＯ）、ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７、ＨｕＨ７）、ｒｅｃＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７／７／ｃ８３）ともにほぼ同じで８０ＫＤａ付近に存在する（図１および図２）。これはアミノ酸配列から予想される分子量３５ＫＤａとは大きく異なり、それが糖鎖付加による分子量の増加であることが容易に推定される。
＜実施例３＞Ｌｅｃｔｉｎ−ＥＬＩＳＡによるシアル酸分析
レクチン−ＥＬＩＳＡは今までに報告されている方法（Ｒａｆｆｅｒｔｙ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｎｄｏｅｒｉ．１４５巻、５２７−５３３頁）のように、固相に目的タンパクに対する特異抗体を用いることによって目的タンパクを吸着させ、ビオチン化レクチンを反応させて、続く標識アビジンの反応によって発色させ吸光度を測定することによる。
すなわち、１０μｇ／ｍｌの濃度で抗ヒトマウスモノクローナル抗体、ＴＮ−１（Ｔａｈａｒａ，Ｔ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ５７巻、７８３−７８８頁、（１９９５））を９６穴プレートに各穴１００μｌずつ分注し攪拌した後、約１０時間、４℃にて放置する。これを各穴当たり３５０μｌのＴＴＢＳ溶液にて４回洗浄したのち、予め後に検出に用いるものと同じレクチンを結合させたアガロース（ＳＳＡ−ＡｇａｒｏｓｅまたはＭＡＭ−Ａｇａｒｏｓｅ、何れも生化学工業社製）と４時間転倒混和させて、レクチン反応物を除去した１％ＢＳＡ／ＴＴＢＳ溶液を各穴２００μｌ分注し、１時間室温で攪拌した。続いてこれを捨て、３０分間乾燥させた後、サンプルを前述の１％ＢＳＡ／ＴＴＢＳ溶液に各種濃度で添加したものを各濃度３穴ずつに１００μｌずつ分注し４時間攪拌した。プレートを再び各穴当たり３５０μｌのＴＴＢＳ溶液にて５回洗浄したのち、レクチン−ビオチン（生化学工業社製）をＳＳＡ−ビオチンの場合最終濃度０．２μｇ／ｍｌ、ＭＡＭ−ビオチンの場合最終濃度１．０μｇ／ｍｌになるように０．５％ＢＳＡ／ＴＴＢＳ溶液に添加し、各穴１００μｌ分注し２時間攪拌した。再度プレートを各穴当たり３５０μｌのＴＴＢＳ溶液にて５回洗浄したのち、３０分前にアビジン−アルカリフォスファターゼ／アビジン−ビオチン液を（ＤＡＫＯ社製）を各１μｌ／１０ｍｌの濃度で加え攪拌した０．２５％ＢＳＡ／ＴＴＢＳ溶液を各穴当たり１００μｌ分注し、１時間攪拌した。最後にプレートを各穴当たり３５０μｌのＴＴＢＳ溶液にて６回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色キット（ＤＡＫＯ社製）基質液を１００μｌ加え１０分間、続いて増感発色液を１００μｌ加えて５分間攪拌し、プレートリーダー（生化学工業社製）にて吸光度４９２ｎｍ、対照として６３０ｎｍを測定し、その値と濃度で吸光度の温度依存曲線、すなわち各種ＴＰＯのレクチンに対する反応性をブロットした。
図３から、ＳＳＡ−ＬｅｃｔｉｎＥＬＩＳＡに対する反応性は、ｎａｔｉｖｅＰｌａｓｍａＴＰＯ、ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７）およびｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＨｕＨ７）は何れも似たような傾向を示す。特にｎａｔｉｖｅＰｌａｓｍａＴＰＯ、ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７）及びｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＨｕＨ７）は高い反応性を示す。一方、ｒｅｃＣｈｏＴＰＯは検出限界以下である。ＭＡＭ−ＬｅｃｔｉｎＥＬＩＳＡに対する反応性はｎａｔｉｖｅＰｌａｓｍａＴＰＯ、ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７）、及びｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＨｕＨ７）は似たような傾向を示すが、ｒｅｃＣｈｏＴＰＯ及びｒｅｃＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７／７／ｃ８３）は少し反応性が低かった。
＜実施例４＞ｉｎｖｉｖｏ活性
ｉｎｖｉｖｏ活性は原理的には各種検体をマウスに投与した際の血小板数を基に算出する。
すなわち、オス８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスにＰＢＳに懸濁した各種濃度の各種検体を４日連投する。連投終了日から数えて３日目に血液サンプルを採取し血小板数を測定する。このとき１００ｍＵを血中血小板数が３×１０^６血小板／μｌを与える濃度と定義した。
各種ＴＰＯを上記アッセイ法にて比較したところｒｅｃＨｅｐＴＰＯは４．５×１０^４Ｕ／ｍｇとなり、ｒｅｃＣｈｏＴＰＯの９．０×１０^４Ｕ／ｍｇに比べて低い値となった。
＜実施例５＞ｉｎｖｉｔｒｏ活性（ＦＤＣＰ−ｈＭｐ１６３５アッセイ）
ＴＰＯ存在下に継代培養しているＦＤＣ／Ｐ２細胞に全長ヒトＭｐｌを強制発現させたＦＤＣＰ−ｈＭｐ１６３５細胞（Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３９５巻２２８−３３４頁、（１９９５））を回収し、十分に洗浄後、１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培養液に再浮遊させた。組織培養用９６穴平底プレート１穴あたりの細胞数が２．５×１０^３個になるようにＦＤＣＰ−ｈＭｐ１６３５細胞を入れ、さらに標準品、及び被検検体を加えて、最終液量を２００μｌ／穴にした。プレートを５％炭酸ガスに入れ、３７℃で、３日間培養した。３日目の培養４時間前にＭＴＳ／ＰＭＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２５μｌを各穴に添加し、培養終了後に４９２ｎｍの吸光度をプレートリーダー（生化学工業社製）にて測定した。
各種細胞由来のＴＰＯを組換え型ＴＰＯについては組成分析値、血漿あるいは非組換え型の肝臓細胞由来ＴＰＯはＥＬＩＳＡ（Ｔａｈａｒａ，Ｔら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ５７巻、７８３−７８８頁、（１９９５））における値をもとにアッセイしたところ何れも同等の活性を示すことが分かった（図４）。
＜実施例６＞α２，６−シアリルトランスフェラーゼ発現ベクター（ｐＥＦｎｅｏ−α２，６ＳＴ）の作製
実施例１の（４）に記載のｐＥＦｎｅｏプラスミドをＸｂａＩで十分に切断した後に、引き続いて短時間、ＸｈｏＩを作用させることによってＸｂａＩ−ＸｈｏＩの部分切断断片が得られた。この場合、ＸｈｏＩ部位は３個所存在するために、ＳＶ４０の複製開始点（ｏｒｉ）を含む断片は３種類できることになる。このうち目的とする断片は２番目に長いものであるが、取り敢えずこの３種類の混合物と目的断片の連結を行い、後にｐＥＦｎｅｏのＥＦ−１αプロモーターの３’末端に近い位置をコードするプライマー５’−ＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧ−３’（配列番号２）を用いて行うシーケンスによって他の２つの可能性を排除することが可能であり、実際その通りであった。ここでいう目的断片とは、ラット肝臓由来のβ−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡ（ＧｅｎｂａｎｋＭ１８７６９／Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１７７３５〜１７７４３）の全長を含み５’末端にＸｈｏＩ部位を有し、３’末端にＸｂａＩ部位を有するＤＮＡ断片である。
このベクターはＳＶ４０の複製開始領域、ヒトエロンゲーションファクター−１−αプロモーター、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位、さらにＳＶ４０プロモーター領域、ネオマイシン耐性遺伝子、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位、β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ^ｒ）を含み、、ヒトエロンゲーションファクター−１−αプロモーター下流にβ−ガラクトシドα２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡが接続されている。
＜実施例７＞α２，６−シアリルトランスフェラーゼ発現ベクターのＣＨＯ細胞への導入
既にヒト全長ＴＰＯを発現しているＣＨＯ２９／１４株（２００ｎＭメソトレキセート耐性）を３×１０^５細胞を６ｃｍ径のプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）中１０％ウシ胎児血清を含むα最小必須培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチン添加）で培養増殖させ、これをトランスフェクタム法（プロメガ社製）によって形質転換し、α２，６−シアリルトランスフェラーゼ発現ベクターを導入した。
すなわち、実施例６で調製したｐＥＦｎｅｏ−α２，６ＳＴプラスミド１５μｇにα−ＭＥＭ（−）５００μｌを加え混合したものと、１ｍｇトランスフェクタムを４００μｌのエタノールに溶解したものを５μｌにα−ＭＥＭ（−）５００μｌを加え混合したものを混合した後に室温で１０分間放置した。この間に６ｃｍ径のプレート上で培養した上記細胞をウシ胎児血清を含まないα−ＭＥＭ（−）に置換しておく。このＤＮＡ溶液をプレートに滴下した後、ＣＯ_２インキュベーター中で約６時間培養した。プレートに２．５ｍｌのα−ＭＥＭ（−）と５００μｌのウシ胎児血清を加え、引き続き１日間培養した後、１０％透析ウシ胎児血清含有選択培地（α−ＭＥＭ（−）、チミジン、ヒポキサンチン無添加、ジエネティシン（Ｇｉｂｏｃｏ社製）添加）での選択を行った。選択は、細胞をトリプシン処理した後、６ｃｍ径のプレート１枚あたりを２４穴プレート１０枚に分割した後、２〜３日後とに選択培地交換を行いながら培養を続行することにより実施した。このとき最初の２日間は最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシンを含む選択培地で、続く３日間は最終濃度１ｍｇ／ｍｌのジェネティシンを含む選択培地で、その後は、培地交換のつど約半分の最終濃度のジェネティシンを含む選択培地に交換していき、最終的には０．２ｍｇ／ｍｌまでジェネティシン濃度を下げていった。メソトレキセートの濃度はこの間２００ｎＭのまま維持した。細胞が増殖してきた穴については、ＴＰＯ−ＥＬＩＳＡにてその培養上清中のヒトＴＰＯ量、およびＳＳＡ−レクチンＥＬＩＳＡにてα２，６−型の結合様式で付加されたシアル酸の相対的付加量を測定した。培養上清中にヒトＴＰＯ活性及びα２，６結合型シアル酸の付加が認められたものについては、新しいウエルに２００ｎＭのメソトレキセート、０．２ｍｇ／ｍｌのジェネティシンを含む選択培地で１：１５に細胞を分割し、培養を続行させることによりジェネティシンに耐性の細胞を増殖させてクローニングを行った結果、最終的に２００ｎＭのメソトレキセート、０．２ｍｇ／ｍｌのジェネティシンに耐性なクローンＣＨＯ＋２，６ＳＴ／１９／ｃ４及びＣＨＯ＋２，６ＳＴ／２１／ｃ３を得た。
＜実施例８＞発現の確認
実施例７で得られた各種ＴＰＯの分子量を測定する目的で、実施例２に記載の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ・ウエスタンブロッティングを行った。Ｔａｈａｒａ，Ｔ．らの方法（Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５７巻，７８３〜７８８頁、（１９９５））に基づいて測定された発現量をもとに得られた、クローンＣＨＯ＋２，６ＳＴ／１９／ｃ４及びＣＨＯ＋２，６ＳＴ／２１／ｃ３の産生するＴＰＯの電気泳動における見かけの分子量はｒｅｃＣｈｏＴＰＯ（ＣＨＯ２９ｃ１４）とほぼ同じで８０ＫＤａ付近に存在する（図５参照）。これはアミノ酸配列から予想される分子量３５ＫＤａとは異なり、それが糖鎖付加による分子量の増加であることが容易に推定される。
＜実施例９＞レクチン−ＥＬＩＳＡによるシアル酸分析
実施例３に記載の方法で、実施例８で得られたＴＰＯについてシアル酸分析を行った（図６）。
この結果により、２株の細胞のうちＣＨＯ＋２，６ＳＴ／１９／ｃ４は特徴としてα２，６−結合様式のシアル酸が優位に付加されたＴＰＯを産生する細胞であり、ＣＨＯ＋２，６ＳＴ／２１／ｃ３はα２，３−及びα２，６−結合様式のシアル酸の両方が同一分子上に付加されたＴＰＯを産生する細胞であることが判った。
＜実施例１０＞ｉｎｖｉｔｒｏにおける活性確認
実施例７で得られたＴＰＯについて、実施例５に記載のＦＤＣＰ−ｈＭｐ１６３５アッセイ法でｉｎｖｉｔｒｏ活性の確認を行った。
９６穴プレート中、２．５×１０^３個のＦＤＣＰｈＭｐ１６３５細胞を種々の濃度のＴＰＯと共に３７℃、３日間培養した後、各ウエルに２０μｌのＭＴＳ溶液を加えた。さらに４時間インキュベートした後、サンプルの活性を４９２ｎｍでの吸光度として検出した。結果を図７に示す。
この結果から、ＣＨＯＤ−細胞で発現させたＴＰＯもα２，６−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞で発現させたＴＰＯもＦＤＣＰｈＭｐ１６３５の増殖活性はほぼ同等であった。つまり、シアル酸の結合様式が本来ＣＨＯ細胞で見られるα２，３型からα２，６型に変化してもその割合によらず細胞の増殖活性は同じであるといえる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ｒｅｃＣｈｏＴＰＯ、ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７）およびｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＨｕＨ７）の電気泳動による分子量の比較を示す写真である。検出は、エレクトロブロッティッグ後、抗ＴＰＯヤギＩｇＧ×ＲＡＧ−ＨＲＰとの反応により行った。レーンあたり２５０ｐｇのＴＰＯが用いられた。
図２は、ｒｅｃＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７／７／ｃ８３）、ｎａｔｉｖｅＨｅｐＴＰＯ（ＪＨＨ７）およびｒｅｃＣｈｏＴＰＯの電気泳動による分子量の比較を示す写真である。検出は図１と同様に行った。
図３は、レクチン−ＥＬＩＳＡ法による図中に表示の各ＴＰＯとＳＳＡレクチン又はＭＡＭレクチンとの反応性の比較を示す。
図４は、ＦＤＣＰ−ｈＭｐ１６３５アッセイ法による図中に表示のＴＰＯのｉｎｖｉｔｒｏ活性を示す。
図５は、クローンＣＨＯ＋２，６ＳＴ／１９／ｃ４及びＣＨＯ＋２，６ＳＴ／２１／ｃ３によって産生されたＴＰＯと、クローンＣＨＯ２９ｃ１４によって産生されたｒｅｃＣｈｏＴＰＯとの分子量を、電気泳動／ウエスタンブロッティング（抗ｈＴＰＯヤギポリクローナル抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヤギＩｇＧ家兎ポリクローナル抗体使用）により比較した写真である。
図６は、レクチン−ＥＬＩＳＡ法による、クローンＣＨＯ＋２，６ＳＴ／１９／ｃ４及びＣＨＯ＋２，６ＳＴ／２１／ｃ３によって産生されたＴＰＯのシアル酸分析の結果を示す。
図７は、ＦＤＣＰ−ｈＭｐ１６３５アッセイ法による、α２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを遺伝子導入したＣＨＯ細胞（図中、１９ｃ４及び２１ｃ３と表示）及びＣＨＯＤ−細胞（図中、ＨＴＣＦと表示）で発現させて得られたＴＰＯのｉｎｖｉｔｒｏ活性の比較を示す。

Claims

ＣＨＯ細胞にα２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを導入し、該ＣＨＯ細胞においてヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）遺伝子を発現させることを含む、α２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒトＴＰＯの製造方法。
ＣＨＯ細胞においてヒトＴＰＯ遺伝子を発現させ、該ＣＨＯ細胞にα２，６−シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを導入することを含む、α２，６結合型シアル酸の糖鎖構造をもつヒトＴＰＯの製造方法。