TWI235158B - Human thrombopoietin produced by human established cell lines, processes foe preparing the same, and pharmaceutical composition comprising the same - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1235158 A7 B7 五、發明説明（2) 基酸序列（參照後附的序列表中之序列編號υ。 本案之發明人，在將上述之人類Τρ〇投予因致癌劑或免 疫抑制劑之施用、或因放射線照射或ΒΜΤ等而引起骨髓抑 制效果之患有血小板減少症的小鼠之後，發現其具有阻止 血小板減少、促進血小板增加之效果，並見有造血機能亢 進現象，因而得知該人類ΤΡΟ在此等血小板減少症之治療 上，擁有極佳之效果。

關於人類ΤΡΟ，至今為止僅有針對人類血漿中之τρ〇的 報告（Mats疆oto，A·等人，38thAnnualmeeting〇ftheASH (1 9 9 6 )),並且由於尚未取得經過分離及純化步驟者，因此 目㈤在其構造及機能方面，仍未盡明瞭。 此外，亦可用mRNA及ELISA標記來檢測各種細胞生產 TPO之仏況。用人類肝臟所衍生之細胞（HepG2)來進行 (Ηιηο，Μ.等人，Bi〇chem.Bi〇phys.Res.C〇mmun.，217 卷， 475-4S1頁，（1995))時，可檢出有構成性mRNA之表現； 而在用人類胎兒腎臟細胞（HEK)時，則可檢測出其具有令 mpl表現細胞（M0-7e，BaF3/mpl)增殖之活性，並檢測出 TPOmRNA。然％，該等物質亦未經分離及純化，故目前 對於其構造、機能（包括其於活體内之活性），均尚不十分 清楚。 另外，在以基因重組技術獲得之重組人類τρ〇方面，目 前已知者有：於非洲密多理猴之腎臟細胞（c〇s_〇中表現所 得者（Kato, Τ·等人，j Bi〇chem 118 卷，υ、]% 頁， (1 995))、於中國蒼鼠卵巢細胞（CH〇)中表現所得者a -5- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇><297公楚） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1235158 a7 A / B7 五、發明説明（3) H.等人，FEBSLett.395 卷，228-334 頁，（1995); Kato，T. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94 卷，4669-4697 頁，（1997))、於大腸捍菌中表現所得者（Ann，M. F.等人， Blood 86卷，54_59頁，（1995))、於幼蒼鼠腎臟細胞（ΒΗΚ) 中表現所得者（Ross，C. Η.等人，Biochemistry 35卷， 14849-14861頁，（1996))、於人類胎兒腎臟細胞（HEK293) 中表現所得者（de Sauvage 等人，Nature，369 卷，533-538 頁（1994); Bartley，T.D.等人，Cell，77 卷，1117-1124 頁，（1994))等。 然而，至今為止，尚無利用製造TPO之器官所衍生之人 類確立細胞系進行表現後所得之TPO的報告。 此外’與前述種種由非人類確立細胞系所產生之TP〇相 較，以人類確立細胞系所產生之人類TPO，或是在人血中 所發現之TPO，其彼此間構造之異同等各種性質，皆絲毫 未知。 更何況，目前的現狀是：其構造之異同與TPO之機能間 的關係究竟如何，技藝界中也完全沒有報告。 主_發明所欲解決之謀是員 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一般來說，對於如TPO之類的生理活性糖蛋白質而言， 除了主要製造之器官外，亦有可產生該蛋白質之器官存 在’且依其器官或器官衍生細胞種類之不同，有時其所產 生之蛋白質的構造也會有所差異。 同樣地’在以基因重組技術製造重組糖蛋白質時，其亦 將因所用宿主細胞之不同，而使產生之糖鏈構造亦有所差 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) M規格（210x 297公瘦） 1235158 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（4) 異。尤其是在用動物細胞時，依其種類（係指動物種類、或 是其所以衍生之器官來源種類或細胞株等）會使所附加之 糖鏈構造有各種各樣之形式，而其差異在為數不少的情況 下，又會影響蛋白質之機能—主要是抗原性及體内動 態。事實上，至今已有許多針對基因重組蛋白醫藥品之抗 體產生現象之報告（Steis等人，N. Eng. J· Med· 318卷， 1409-1413頁（1988)等），但是其僅係與充斥於體内的天然 體蛋白質有構造上及機能上之差異，並無其他之不同。 而如係在抗藥性及體内動態方面具有更佳性質之人類 TPO糖蛋白質，則其作為醫藥品之價值將更為提高。 解決課題之方法 本案之發明人由於已利用rnRNA標記確認了人類TPO之 主要製造器官為肝臟（Shimada，Y.等人，Exp. hematol.，23 卷 ’ 1388-1396 頁（1995); s.等人，Exp.hematol.，25 卷， 5 65-5 72頁（1995))，故對於衍生自人類肝臟之確立細胞系 特別加以注意。因此，發明人製備了由人類血漿經部分純 化後所得之TPO(天然的血漿TPO)、由製造人類TPO之肝 臟所衍生的確立細胞系中經純化而得之TPO(天然的 HepTPO)，以及於該製造人類Τρ〇之肝臟所衍生的確立細 胞系中表現而得之重組人類TP〇(recHepTPO)，再就其糖鏈 構造，與在CHO中表現之重組人類TP〇(recchoTPO)進行 比較。其結果為：由製造人類TP0之肝臟所衍生的確立細 胞系中純化而得之TPO(天然HepTPO)與在該製造人類 TP0之肝臟所衍生的確立細胞系中表現而得之重組人類 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x 297公廣） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1235158 7 Α7 Β7 五、發明説明（5) TPO(recHepTPO)，其N聯型糖鏈之連結型式與在ch〇中 表現之重組人類TPO並不相同，但卻與自人類血聚中純化 之TPO(天然PlasmaTPO)有共通之處。 亦即，如同後面的實例中所述者，利用抗TPO之單株抗 體及外源凝集素進行外源凝集素ELIS A分析，即可見天然

PlasmaTPO、天然 HepTPO 及 recHepTPO 對於 SSA 外源凝 集素具有反應性（此種S S A外源凝集素之中其糖鏈末端之 唾液酸之外接型式為α 2-6键結，Shibuya，N.等人，j

Biochem. 106 卷，1098-1 103 頁（1989))，而 recChoTP〇 則 無反應。另一方面，對於MAM外源凝集素（其中其唾液酸 之外接型式為α 2-3鍵結，Wei-Chun，W·等人，j. Biol Chem· 263卷，45 76-45 85頁（198 8))，此等物質則均會反 應。換言之，recChoTPO與在N聯糖鏈中具有α 2-6鍵結 型之唾液酸外接構造、由人類血漿所衍生之τρ〇間，存有 巨大差異，而另一方面，天然HepTPO及recHepTPO則是 與由人類血漿所衍生之TPO極為類似。 由上’本發明茲提供一種由人類確立細胞系所產生之新 穎TPO。其中較佳者，係一種由製造τρ〇之器官所衍生而 得的人類確立細胞系所產生之新穎人類TPO。而更佳者則 係具有前述之特定糖鏈構造的新穎人類Tp〇。 本發明 < 新穎人類ΤΡ〇，可降低抗原性、改善其體内動 悲’並可改善連續投予時血小板增多效果之低落情形。 本發明〈人類τρ〇可為··利用基因重組技術，將人類ΤΡ0 基因導入人類確立細胞系中令其表現，經分離及純化之後 -8- 本紙張尺度適用中國國^7^—㈤ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1235158 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（7) 960081 ° 本發明之人類T P 〇較佳為具有α 2 - 6键結型唾液酸之糖 鏈構造者，或是具有至少對SSA_外源凝集素[正式名稱為：

Sambucus sieboldina agglutinin 外源凝集素或 Elderberry

Bark 外源凝集素（Sibuya，N 等人，J.Bi〇l.Chem.，262: 1 596_ 1 6 1 6( 1 98乃參照有親和性之糖鏈構造者。 更佳者為於N聯糖鏈中具有α 2 - 6键結型唾液酸之糖鏈 構造者’或是具有對SSA-外源凝集素有親和性之糖鏈構造 者。 本發明之人類ΤΡ0，其蛋白質部分之一級構造（亦即其胺 基I序列）可為序列編號1所示之胺基酸序列，抑或包括在 序列編號1所示胺基酸序列中，於保持人類τρ〇活性之前 才疋下’改逢（置換、缺失、插入，及/或附加）其序列之一部 分後所得之胺基酸序列。 此處之Τ Ρ 〇活性係指能促進巨核細胞之前趨細胞的增殖 及为化’及/或於活體内專一性地刺激血小板之產生或增強 其產生等活性。 更具體言之，可為國際公開第W095/2 1919(1995年8月 17日）所揭示之τρο衍生物、第w〇96/25498(1996年8月 22曰）所揭示之τρο衍生物，及第w〇95/1 8858(1995年7 月1 3曰）所揭示之τ ρ 〇衍生物。 此外’本發明亦提供製造前述新穎人類τρ〇之方法。 由人類確立細胞系直接純化及分離之方法包括將一般純 化蛋白質所用之步騾（離子交換層析、外源凝集素親和性層 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 卜訂 1235158 A7 B7 五、發明説明（9 ) 用於轉形此等宿主細胞之載體，可為PS V2-neo(Southern and Berg，J. Mol. Appl. Genet.，1，327-341，1982)、 pCAGGS(Niwa 等人，Gene，108，193-200，1991)，或 pcDL-SR a 296(Takebe 等人，Mol. Cell Biol.，8, 466-472, 1988)等。 此等載體中，視情況所需，可包含複製起點、選擇標記、 啟動子；對真核細胞所用之載體而言，可視需要加入RNA 男接部位、聚腺菩化信號等。 複製起點可用由SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒所衍生 者。 基因表現用之啟動子可為病毒所衍生者，包括反轉錄病 毒、多瘤病毒、腺病毒、SV40所衍生之啟動子；或是由 染色體所衍生者（如EF 1 - α )等。 選擇標記可用抗新黴素（neo)基因、抗嘌呤黴素（pur)基 因、胸甞激酶（TK)基因、二氫葉酸還原酶（DHFR)基因、大 腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（Ecogpt)基因等。

較佳者係如下面實例1之⑷中所述，將人類Tp〇cDNA 配置於人類延長因子-；[_ α啟動子之下游處，再以附加了 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) SV40初期聚腺甞化信號、〇111711基因及”4〇複製起始點 等之載體，用轉染法（卜今 > 只7工夕夕厶法）（生化學工業 社製）來轉形JHH7細胞。經轉形之JHH7細胞除了產生屬 内生性人類ΤΡΟ基因表現產物之人類ΤΡΟ外，亦有可能產 生基於所導入之外來性（eX〇gen〇US)人類Τρ〇基因之 TPO。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1235158 A7

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 此外，本發明亦提供包含本發明人類則 物。本發明之醫藥組合物可視其製劑目的需要4有^ :劑;釋劑、助溶劑、防腐劑、抗氧化劑、賦形叙等: 本發明人類TP0之醫藥組合物，依其所用之 丁路仫（包括汪射等非經口、經肺、經鼻及經口 之:]型可包括例如下列者：溶液劑、懸浮劑 膠囊、顆粒劑、凍乾劑等。 d 包含本發明人類TP0之醫藥組合物，其投予之劑 為準，通常為0.05微克/公斤體重· 重’視其病況、性別及投予路徑，每日施藥—次至數次 根據本發明，可提供多數需要增加血小板數之垂者— 種以本發明人類TPO為有效成分之血小板增加劑： 更有進者，本發明可對正在施純予制癌劑或免疫抑制 叙化學療法、放射線療法’或是接受骨髓移植（B 、 PBSCT: CBSCT之患者，提供—種可治療其血小板減少症 之治療劑。 再者，本發明可针對多數患有因血小板病變（如血 生障礙或血小板壽命短縮—_血小板破壞速率之亢 血小板消耗速率之尤進)而導致血小板減少之疾患，提供立 台療劑。 例如，肇因於先天性再生不良性貧血（范可尼（7 7 ^二 一）貧血）、伴隨化學療法及放射線療法等之再生不良性 血、骨髓異常形成症候群、急性骨髓性白血病，或如骨髀 -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

-13- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1235158 五、發明説明（11) 移植時骨髓形成不全等而 之治療劑即可用於促進此等^血小板減少症等’本發明 此外，本發明之治療劑對；：：血小板的回復作用。 柘诘，丨、/十古^ .、 士於因τρ〇產生異常所致之血小 板減/猛亦有功效。而所4 A、A ,』 所，因血小板或巨核細胞之壽命短 縮而k成炙血小板減少症， 、 /、G括特發性血小板減少性紫 班病、後天性免疫不全右硅f, A 浮、 症候鮮（AIDS)、播種性血管内凝固 症候群、血小板性血小板減少症等，本發明.之治療劑亦可 用於促進此等患者之血小板的回復作用。 療々了 其夕次’在外科手術前投予τρ〇以增加自身之血小板，然 後將其血小板作為自己手術车 、、、 m 士汾 時輸血用血小板（自身血小 板輪血）’本心之TP〇s此等用途上亦極為有用 再者，本發明之TP0對於因其他化學藥品或醫藥品，或 ”台療：施造成之暫時性血小板缺損或損傷所引發的血 小板病·交；治療，亦十分有用。本發 兮笔吉4雜山、匕h 「 不愈明〈TPO可用於促進 …、者釋出新的、「未受損傷」的血小板。另外，因為 =知TP◦《王要製造器官之—為肝臟，故τρ〇之投予對於 s引發血小板減少之各種肝病(如膽道閉鎖症、肝臟移植： 乾硬化、肝炎等）的臨床應用，亦極令人期待。 此外，在㈣存之血小板的止血血小板形成功能之回_ 上，本發明之TPO亦具有極佳之功效。 夂 從而，利用本發明之醫藥組合物或治療劑，除可使抗 性=降低外，尚可令藥劑之體内動態更加改善，並；得 更優井之血小板增加效果、血小板病變治疼 獄欢果及血小板 減少症治療效果。 14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 1235158 _____B7_ 五、發明説明（12 ) 實施例 茲以下面的實例進一步具體地說明本發明；但本發明之 範圍不應因此等實例而受到限制。 實例1 (1)取自人類血漿之TPO的（部分）純化：天然piasma丁P〇 將保存於-80 °C下隻人類血漿約460毫升於流水中溶解 後’以1 3 5 Οχ克離心，除去不溶性沈澱，將其上清液45 7 毫升以等量之含有ImM EDTA 、 〇.i%Tween 20 、 0. l%NaN3的Dulbecco氏磷酸緩衝鹽水（PBS)(DPBS:日水 製藥（株）社製Cat.No.05913)稀釋之。於此之2倍稀釋人類 血漿914毫升中，為了避免蛋白酶所造成之蛋白分解作 用，加入蛋白酶抑制劑、Pefabloc(MERK社製Cat. No.124839，最終濃度O.imM)、反式·環氧基丁二醯基_L_ 亮胺醯基醯胺（4-胍基）·丁烷（SIGMA社製Cat. No.E3 132， 最終濃度 O.OlmM)。將之以 SARTOBRAN 300(Sartorius 社 製 Cat. NO.523 1307H5 —00-B)0.22m 過濾，再以 0.5 毫升 / 分鐘之流速添加至與抗TPO抗體結合之NHS-活化瓊脂糖 4FF管柱（管柱大小：p 〇.5公分χ5公分；NHS-活化瓊脂 糖 FF 管柱：Pharmacia 社製 Cat· No.17-0906-01)中。此時 為避免對該抗T P 0抗體管柱之非專一性吸附，茲以瓊脂糖 4FF管柱（管柱大小：p 〇.5公分χ〇·5公分；瓊脂糖4FF管 拄：Pharmacia社製Cat. Νο·17-0149-〇1)以及與正常兔之 IgG結合的NHS_活化瓊脂糖4FF管拄（管柱大小：ρ 0.5公 分x5公分；NHS-活化瓊脂糖4FF管柱：Pharmacia社製 -15- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ' ' K-------聲——：！-----碥 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1235158 A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明（13)

Cat. No. 17-0906-0 1)作為預先管柱，再與抗TPO抗體管柱 相接。添加完畢後，用含有lmMEDTA、0.1%Tween20、 0.1%NaN3之DPBS緩衝液沖洗管柱，於280奈米吸光度 (A28Q)降至〇.2左右時’移去預先管柱。接著，為了除去吸 附於凝膠上之非專一性吸附物，用含0.5M NaCl之10mM 鱗酸鋼p Η 7 · 3缓衝液來沖洗管柱。將管柱内部以1 5 0 m Μ NaCl 取代後，再以含有 150mM NaCl、5mM CHAPS 之 0.1Μ 甘胺酸-HClpH2.5緩衝液來沖提出TPO。沖提後，直接將 各分液以1M Na2C〇3中和，進行高感度TPO-ELISA。以 ELISA結果為基礎，收集TPO沖提分液，用超濾法濃縮， 並交換緩衝液。超過濾係用 ULTRAFREE-MC 10K cut(MILLIPORE 社製，Cat. No.UFC3LGC00)，以 4,000x 克離心、濃縮，然後進行DPBS之添加、濃縮數次。最後 將之懸浮於含有500升之ImM EDTA、0.1%Tween 20、 0· l%NaN3之DPBS緩衝液，製成經部分純化的人類血漿 TPO。 將此經部分純化之TPO中的一部分，如下述方法，於SDS 存在下進行凝膠過濾。對部分純化之TPO添加五分之一容 量之 250mMTris-HCl(pH6.8)、50%甘油、5%SDS、10mM EDTA，於95 〇C下處理5分鐘。將之置入以含有0.1%SDS、 ImM EDTA之DPBS平衡過之瓊脂糖6 HR凝膠過濾管柱 (管柱大小：φ 1公分x30公分；Pharmacia社製Cat. No. 17-0 5 3 7-0 1)，將所得分液進行 TPO-ELISA，測定 TPO 之溶出位置。結果為：人類血漿所衍生之TPO主要係於約 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1235158 A7 B7 五、發明説明（14) 與CHO表現型TPO( 1-332a·a·)相同位置處溶出，其分子量 為約80kD。此外，雖僅有極少量，但在約20kD附近也可 見有部分長型之TPO溶出。 (2) 取自JHH7細胞之TPO的（部分）純化：天然He卫 ΠΗΗ7) 將JHH7細胞置入培養面積為225平方公分之培養燒瓶 中，用含有10%FCS之l:lDalbeCC〇改質伊格爾一 /小） 培養基/哈姆〇、Λ )F12(DF)培養基（Gibco社製），於5%二氧 化碳氣體培養器中及37 °C下，培養至鋪滿狀態（confluent) 為止。然後，將其改置於無血清之DF培養基中，再培養4 日後，回收其上清液。 將前述培養所得之體積4升的上清液（TP0濃度為55pg/ 毫升）分成數份’每份約1升，再將之置入預先經5mM磷 酸鉀（ρΗ6·8)平衡過、充填有5毫升WGA-瓊脂糖（生化學社 I)之管柱中。用約2 5 〇晕升之5 m Μ鱗酸4甲（ρ Η 6.8)沖洗後， 以0.4Μ之Ν -乙醯半乳糖胺、5mM磷酸鉀（ρΗ6·8) 15毫升 沖提之，將沖提液以UFlSlOkcut(米利波爾公司製）濃縮， 製成TP0樣品（ι·〇毫升，159奈克/毫升）。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (3) 基_自ΗιιΗ7 Λ細胞之TP0的（部分）純化：HepTPO (HuH71 將HuH7細胞置入培養面積為225平方公分之培養燒瓶 中:用含有1〇%FCS之DF培養基，於5%二氧化碳氣=培 養器中及37。(：下’培養至鋪滿狀態（c〇nfluent)為止。然後， 將其改置於無血清之DF培養基中，再培養4日後，回收其 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公楚） 1235158 Α7 Β7 五、發明説明（15) 上清液。將體積1.9升的上清液（147pg/毫升）分成數份，每 份約1升，再將之置入預先經5mM磷酸鉀（pH6.8)平衡過、 充填有5毫升WGA -瓊脂糖（生化學社製）之管柱中。用約 250毫升之5mM磷酸鉀（pH6.8)沖洗後，以0.4M之N-乙醯 半乳糖胺、5mM磷酸鉀（pH6.8)各15毫升沖提之，將沖提 液以UF15-10kcut(米利波爾公司製）濃縮，製成TPO樣品 (1.5毫升，77奈克/毫升）。 (4)TP〇於 JHH7 細胞中之表現及純化 ： recHepTPO iJHH7/7/c83) 將JHH7細胞於6公分徑之培養皿（尼耳儉公司製）中，以 含有10%FCS之DMEM培養基培養增殖之，再用轉染（卜今 V只7工夕夕Λ )法（尼羅美加公司製），將其以PDEF202-h-TP0-Pl(特開平 8-22878 1)轉形。 而以質體pDEF202-h-TPO-Pl轉形之CH0細胞（CH0-DUKBII)已於1995年1月31曰寄存於曰本通商產業省工業 技術院生命工學工業技術研究所，寄存編號為FERM BP-4988 。 此外， 此細胞 株亦於 1995 年 3 月 22 日寄存 於台灣 食品工業發展研究所（FIRDI)，寄存編號為CCRC 960023。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 亦即，將pDEF202-h-TPO-Pl質體10微克及pEFneo質體 1微克添加於500微升之DMEM培養基中，得到溶液A ; 另將轉染株（卜予 > 只7工夕夕厶）（1毫克/400微升EtOH)5 微升添加於500微升之DMEM培養基中，得到溶液B ;再 將溶液A及B加以混合，並將其1毫升加入已置換為500 微升無血清D Μ E Μ培養基之6公分徑的培養皿中，再把培 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 1235158 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（16) 養皿置於37 °C之5%二氧化碳氣體溫育箱内6小時。接著 加入D Μ E Μ培養基3.5毫升，並添加血清使其最終濃度為 10%，再次將之置於37 t：之5%二氧化碳氣體溫育箱内48 小時。至於pEFneo質體之製備則係以如下方式進行：亦 即，將質體pRc/CMV(Invitrogen社製）用限制酶EcoRI-BamHI處理，以瓊脂糖電泳回收含有抗新黴素基因之小型 片段，用T4聚合酶（寶酒造社製）平滑化其末端後，令此片 段與將質體pEF185(特開平8-22878 1)用限制酶Smal處理 過後所得之載體DNA，以T4DNA·連接酶（寶酒造社製）結 合。自如此所得之2種質體中，篩選出有抗新黴素基因以 和延長因子之啟動子相同方向插入者，即為pEFneo。 接著用0.05%胰蛋白酶及53mMEDTA溶液剝離分散之， 再將之分入1 〇個24孔培養皿中，然後以含有4毫克/毫克 G4 18之DMEM+10%FCS培養液進行篩選。將其中形成菌 落者用 FDCPhMpl635/MTS 分析法（Morita H·等人，FEBS Lett.，3 95卷，228-3 34頁（1995))篩選出高表現之菌落。就 所選出之菌落進行選殖（由限界稀釋法），使成單株之純系 細胞。 經含有人類TPOcDNA之pDEF202-hTPO-Pl所轉形白勺 JHH7細胞株（JHH7/7/c83)已依布達佩斯條約，於1997年8 月11日國際寄存於日本通商產業省工業技術院生命工學 工業技術研究所，寄存編號為FERM BP-6050。此外，此 細胞株亦於1998年6月29曰寄存於台灣食品工業發展研 究所（FIRDI)，寄存編號為CCRC 960083。 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1235158 A7 _____B7___ 五、發明説明（17 ) 將此重組型JHH7細胞株（JHH7/7/C83)置入培養面積為 225平方公分之培養燒瓶中，用含有1〇%FCs之DF培養 基，於5%二氧化碳氣培養器中及37它下培養至細胞鋪滿 為止。然後，將其改置於無血清之DF培養基中，再培養4 日後，回收其上清液。 將體積8.97升之上清液（TP0濃度為〇.55微克/毫升）以 pellicon-2匣lOkcut(米利波爾公司製，產品編號Ρ2Β0 ι〇Α 05)濃縮至899毫升（TPO濃度為5.7微克/毫升）。為了抑制 蛋白齡所造成之蛋白分解作用，加入蛋白酶抑制劑、亮抑 蛋白酶肽（leupeptin，最終濃度ο.οίηιΜ)、反式-環氧基丁二 醯基亮胺醯基醯胺（4-胍基）-丁烷（最終濃度0 〇imM)。 將分成數份，每份225毫升，再將之置入預先經5mM磷 酸鉀（ρΗ6·8)平衡過、充填有5毫升WGA-瓊脂糖（生化學社 製）之4根管柱中。用約250毫升之5mM磷酸鉀（ΡΗ6.8)分 別沖洗後，以0.4Μ之Ν-乙醯半乳糖胺、5mM磷酸鉀（ρΗ6.8) 各15毫升沖提之（TPO濃度為73微克/毫升）。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將沖提液以UF15-10kcut(米利波爾公司製）濃縮，置換為 5mM磷酸鉀（pH6.8)(5.0毫升，TPO濃度為1〇84微克/毫 升）。 將之注入羥磷灰石型（BioRad社製，直徑1公分，座高1〇 公分）管柱，並以1毫升/分之流速添加之。添加完畢後， 再將5 mΜ麟酸钾（p Η6.8)注入管柱，收集未吸附之分液5 〇 毫升（ΤΡΟ濃度為54微克/毫升）。於其中加入iM之Tris-base溶液，調整pH值至8.5。 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1235158 A7 B7 五、發明説明（18) 接著將此为液以Q-瓊脂糖HP(Pharmacia Biotech社製， 產品編號，直徑5公釐，座高1〇公分）管柱展開。亦即， 利用20mM Tns_Cl(pH7.5)為展開溶劑a，以及含有lmM NaCl《20mM Tds_Cl(pH7.5)為展開溶劑b，將樣品以〇 3 耄升/分之流速，添加至預先經2〇mM Tris-C1(pH7勹平衡 過之管柱中。待添加終了後，將流速由〇.3毫升/分提高至 〇·5毫升/分，以0%B至22%6之直線濃度梯度展開之，每 1.0愛升（2分鐘）即將之收集於聚丙婦製之試管中。 以ELISA法分別測定各分液，以鑑識出τρ〇分液。由於 其結果係於編號第34-55之試管（以NaC1濃度看是在 〇·116-0·2Μ之範圍）中發現有τρ〇之分布，故將之回收， 製成ΤΡ0分液FA(22毫升）。將其以UF15-l〇kcut( $ U求了 社製）濃縮，在濃縮過程中當其液量成為41毫升時，用 ELISA法測定TP0之濃度（1143微克/毫升）。然後再繼續進 行濃縮，直到成為200微升。 最後一個步驟是：用 Superdex 200HR(Pharmacia Biotech 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 社製’直徑1公分，座高3〇公分）進行分離。亦即，以經 鱗酸醋緩衝之鹽水（PBS)置換管柱後，將fa濃縮樣品200 微升以0·3耄升/分之流速注入。注入後繼續在管柱中添加 pBS ’由開始添加樣品後經過15分鐘時起，每6〇〇微升（3 分鐘）收集成分液，將之行銀染色，以抗人類TP0之單株 抗體及ELISA法測定各分液，其結果係於編號第13、14、 15之試管（以自添加開始之總流量來看是在7.2-9.0毫升之 範圍）中發現有TP0之分布。合併此3分液，由AccQTag -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇>< 297公楚） 1235158 A7 B7 五、發明説明（19 ) 法進行組成分析，知其為1. 1 1733毫克/毫升（1.8毫升）。 表1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 VSHH 丧 §3 (so/r-/Z^HfodlCLQHOg 1 ο ο τ 1 < O) 寸 tri oo CO s f < un ON m 衮3 寸 m cn \ό r- rn 〇 4 ⑺ MD OO 等 m 1' < 〇 宕 II in ο 卜 tri O (N tn V m < s o >-1 ^ 寸 5 Γ " < T '« oo 卜· CN t < y < ο ο r—^ Ο ON σ\ o cn 〇\ CD o 〇 〇 〇 〇 o 〇〇 νο 1 S s On CO m oo 〇\ £ s CO OO v〇 o o 〇 o οο ο 〇\ ο ο oo ON (N On 〇 On VO oo O CO 〇 s > ψ i CO ON CTs oo cn § 泛 9 '""^ oo ο H CO o a o H ο C ο ο *S ό c o < 〇 < a X (D 00 ΓηεΓΙ 25VT s4iSYlc/0。ν (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -22-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1235158 五、 發明説明（2〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此時，由ELISA法測定而得之τρ〇為i」毫克/毫升，與 且成刀析之結果約略相等。換言之，此處所用之elisA即 使針對recHepTPO，亦可展現與標準τρ〇同等的反應性。 為以足貝例1所得各種τρ〇之分子量，茲進行SDS-PAGE 西式墨潰法。依常用方法，用微板凝膠（第一化·學藥品製， 4·〇%-20%濃度梯度聚丙烯醯胺凝膠），在室溫下先後以 10mA、20mA必一足電流，實施SDS凝膠電泳約2小時。 在刀子量私準參照物方面，係用普萊斯坦·布羅得蘭吉（7。 b只丁 >卜、· 7 口 ~卜、b y夕）標準參照物（新英格蘭生物 實驗室公司製）。 仏利用半乾燥（七$ F轉窝裝置（瑪里索爾公司製，韋 德福工v卜7才一）轉窝裝置模式KS_864〇)，於電泳結 束後互刻以150mA之一定電流，用！小時的時間，將之電 轉寫於PVDF膜（米利波爾公司製）。其中係以〇 3Μτ^、 20%甲醇，ρΗΙΟ.4作為陽極；以25mM Tds、2〇%甲醇， ρΗ1〇·4作為轉窝膜液；而以25mMTns、4〇mM胺基正己 酸、20%甲醇作為陰極液。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將轉寫過之膜用TTBS溶液沖洗5分鐘後，以塊狀「愛思」 (7 /夕工久）（雪印社製）進行封端包埋1小時。再度將 之以TTBS用5分鐘沖洗2次後，於9〇%TTBs、ι〇%塊狀 「愛思」、（：7、口 v夕工—只）、0.05%BSA溶液中加入抗人 類TP0之山羊抗體，並震盪！小時。接著，再度將此膜以 TTBS用5分鐘沖洗2次，於TTBS溶液中添加抗山羊、過 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1235158 A7 B7 五、發明説明（21) 氧化酶結合抗體，震盪1小時。然後將此膜以TTBS用1 〇 分鐘沖洗4次，以ECL發色系統（阿馬西姆公司製）進行發 色，再使底片（阿馬西姆公司製）感光。 於電泳中所見之分子量，不論是recChoTP〇（CHO)、天然 HepTP0(JHH7、HuH7)、recHepTPO(JHH7/7/c83)等，皆 約略相同，位於80kDa附近（圖i及圖2)。此結果與由其胺 基酸序列所預料之分子量35KDa差距極大，其原因十分容 易推知：可能是因糖鏈附加所導致之分子量增加。 實例3 夕卜源¥疋集素- ELISA進行ττ条液酸分析 外源凝集素-ELISA之實施，係如目前為止文獻所揭示方 法（Rafferty，B.等人 ’ j· Endocri·，145 卷，527-533 頁）， 固相地利用對抗目標蛋白質之專一抗體，令目標蛋白質吸 附，使生物素化心外源凝集素發生反應，接著再以標識抗 生物素蛋白（avidin)反應使其發色，再測定吸光度。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 亦即，以10微克/¾升之濃度，將抗人類小鼠單株抗體、 TN-1(Tahara，T•等人，Br」Hemat〇1，57 卷，783 788 頁 (1995))分注於96孔培養皿之各孔中，每孔1〇〇微升，於攪 拌後在4。(：下靜置約1〇小時。將各孔分別以35〇微升別 溶液沖洗4次，再將事先由外源凝集素（和後面進彳亍㈣所 用相同者）與瓊脂糖相結合所得物質（SSA-復脂㈣mam_ 瓊脂糖，二者皆由生化學工業社所製），以及經4小時 混合過之1%BSA/TTBS溶液，分注私久力^ ^ 從刀/王於各孔，每孔200微升， 並於室溫下攪拌i小時。炔德丢鲞 …、佼丟棄<，使乾燥30分鐘後， -24- 本紙張尺度適用_家蘇7^ )ϋ格（21Gx29^· A7 1235158 B7 五、發明説明（22 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將樣品以各種濃度添加於前述之P/oBSA/TTBS溶液中，再 把所得溶液分注於孔中，每種濃度3孔，各100微升，攪 摔4小時。再一次將培養狐以母孔3 5 0微升T T B S溶液沖洗 5次，然後將外源凝集素·生物素（生化學工業社製）添加於 0.5%BSA/TTBS溶液中，其中當所用者為SSA-生物素時， 使其最終濃度為0.2微克/毫升；當所用者為MAM-生物素 時，使其最終濃度為1.0微克/毫升。將所得溶液以每孔100 微升分注於各孔，攪拌2小時。再次將培養皿以每孔350 微升TTBS溶液沖洗5次，於各孔中注入0.25%BSA/TTBS 溶液（此溶液係在3 0分鐘前將抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶/ 抗生物素蛋白生物素液（DAKO社製）以各1微升/10毫升之 濃度添加後並攪拌所得者），每孔各100微升，攪拌1小時。 最後將培養皿以每孔3 5 0微升T T B S溶液沖洗6次，加入 10微升之鹼性磷酸酶發色套組（DAKO社製）基質液並攪摔 1 〇分鐘，再加入1 00微升之增感發色液，攪捽5分鐘。用 培養皿讀測劑（生化學工業社製）測定492奈米吸光度（對照 組為630奈米），以所得數值與濃度作出吸光度之濃度依存 曲線.，亦即描繪出各種TPO對外源凝集素之反應性曲線。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由圖3可知，對於SSA-外源凝集素ELISA之反應性，不 論是天然 PlasmaTPO 、天然 HepTPO(JHH7)及天然 HepTPO(HuH7)，均顯示類似之傾向；特別是天然 PlasmaTPO、天然 HepTPO(JHH7)及天然 HepTPO(HuH7) 皆展現極高之反應性。另一方面，recChoTPO則完全不發 生反應。在對MAM-外源凝集素ELISA之反應性方面，天 -25- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1235158 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（23 ) 然 PlasmaTPO、天然 HepTP0(JHH7)及天然 HepTP〇（HuH7) 亦均顯示類似之傾向，至於recChoTPO與recHepTPO (JHH7/7/C83)，其反應性則稍嫌低落。 實例4 活體内之活性 活體内的活性，原則上係以各種檢體投予小鼠之際的血 小板數為基準，加以計算而得。 換言之，將懸浮於PBS之各種濃度的各種檢體，連續4 日投予8週齡之雄性BALB/c小鼠。在連續投藥結束之日 數來第3日當天，採取血液樣品，測定其血小板數。此時， 兹將100mU定義為當血中血小板數達3xl06血小板/微升時 之濃度。 將各種TPO以前述分析方法加以比較，可知recHepTPO 為4.5x1 04U/毫克，其比起recChoTPO之9.0x1 04U/毫克顯 為較低。 實例5 活體外之活性（FDCP_hMpl635分析） 令在TPO存在下繼代培養之FDC/P2細胞強制表現全長 之人類Mpl ，回收該強制表現之FDCP-hMpll635細胞 (MoritaH.等人，FEBSLett.，395 卷，228-334 頁（1995))， 充分洗淨後，使之再度懸浮於含有10%FCS之IMDM培養 液中。將FDCP-hMpll635細胞置入組織培養用之96孔平 底培養皿中，使每孔之細胞數為2.5 X 1 03個，再加入標準 品及受檢檢體，使最終液量為20微升/孔。將培養皿置於 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） I %! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 卜訂 1235158 A7 B7 五、發明説明（24 5%二氧化碳氣體中，於37它下培養3日。於第3日培養前 4小時，/將25微升之MTS/PMS溶液（Pr〇mega社製）添加於 各孔，待培養結束後用培養皿讀測劑（生化學工業社製）測 定492奈米吸光度。 在將各種細胞所衍生之TP0重組所得之丁 p〇方面，係以 其組成分析值為基準；而在由血漿所衍生者或是由肝臟細 胞所衍生之非重組型TP0方面，則係以EUSA1(Tahara，了. 等人，Br.J.Hematol.,57 卷，783-788 頁（1995))中所得數 值為基準進行分析，由其結果可知不論何者皆顯示同等活 性（圖4)。 序列表 序列編號：1 序列長度：332 序列型式：胺基酸 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：肽 來源··人類（/fomo sap/ens) 序列：

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Lea Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15

Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Lea Ser Gla Cys Pro Glu 20 25 30

His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Lsu 3 5 4 0 d 5 -27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X 297公釐） 請 先 閲 讀 背 Φ 意 事 項 I 本 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1235158 a7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 25) Gly Gia Trp Lys Thr Gin Met Gia Giu Thr » Lys Ala Gin Asp [le Leu 50 55 60 Gly A i a Val Thr Lea Leu Leu Gla Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin S5 7G 丨 75 80 Lea Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Lea Gly Gin Leu Ser Gly Gla • 85 9 0 0 95 Val Arg Leu Leu Lea Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu^Gly Thr Gin Lea 100 105 no Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala .[le Phe 11S 120 125 Lea Ser Phe Gin His Lea Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140 Val Gly Gly Ser. Thr Lea Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Yal Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Giu Leu Pro Asn 1S5 170 175 Arg Thr Ser Gly Lea Lea Giu Thr Asn Phs Thr Ala Ser A 13 Arg Thr 180 L85 190 Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gla' Gly Phe Arg Λ l a Lys [te ^ 195 200 205 Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gla l le Pro Gly 210 2 15 220 Tyr Leu Asn Arg lie His Gin Lea Leu Asa Gly Thr Arg Gly ten Phe 225 230 • 235 2 40 Pro Gly P「〇 Ser Arg Arg Thr Leu Gly A 1 a Pro Asp [ί e Ser Ser Gl/ 245 250 255 Thr Ser Asp Thr Gly Ser Lea Pro Pro Asn Leu Gla Pro Gly Tyr Ser 260 265 270 -28 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 1235158 A7 B7 五、發明説明 26 )

Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln,Tyr Thr Leu Fhw Pro Leu 275 280 285

Pro Pro Thr Lea Pro Thr Pro Vai Val Gin Lea His Pro Leu Leu Pro 290 295 300

Asp Pro Ser Ala Pro. Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 3〇5 310 315 ， 320 Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly 325 - · 330 圖式簡要說明 圖1 圖中所示照片為以電泳法進行recChoTPO、天然 HepTPO(JHH7)及天然HepTPO(HuH7)之分子量比較結果。 其檢測係於電印跡（electroblotting)後，藉由與抗TPO山羊 IgGxRAG-HRP間之反應而進行，其中每個電泳道含抗山羊 IgGxRAG-HRP=250 微微克 TPO 〇 圖2 圖中所示照片為以電泳法進行、天然HepTPO(JHH7)及recChoTPO之分子量比較結果。其 檢測係與圖1相同方式進行，其中每個電泳道含抗山羊 IgGxRAG-HRP二250 微微克 TPO 〇 圖3 本圖所示者’為利用外源凝集素ELISA法比較圖中所示 -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝 訂

線 1235158 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（27) 之各TPO與SSA外源凝集素或MAM外源凝集素之反應 性。 圖4 本圖所示者，為以FDCP_hMpl635分析法，對圖中表示 之各TPO的活體外活性之分析結果。 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8

   1235 1条§87112978號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(94年3月） 六、申請專利範圍 公告本 1 · 一種經分離、純化所得之人類血小板生成素， 其特徵為可由人類肝臟所衍生之細胞 JHH7 (食 品工業發展研究所之寄存編號為CCRC 960082)或 者 HuH7 (食品工業發展研究所之寄存編號為 CCRC 960081)之確立細胞系所產生者，且其至少 為N -鍵結型具有α 2 - 6鍵結型唾液酸之糖鏈構 造，同時含有對於 SSA-外源凝集素管柱有親和 性之糖鏈構造，其中該血小板生成素係藉由培 養人類肝臟所衍生之細胞 JHH7 (食品工業發展 研究所之寄存編號為 CCRC 960082)或者 HuH7 (食 品工業發展研究所之寄存編號為CCRC 960081)之 確立細胞系，並分離、純化其所產生之人類血 小板生成素而得。 2 · —種經分離、純化所得之人類血小板生成素， 其特徵為可由人類肝臟所衍生之細胞 JHH7 (食 品工業發展研究所之寄存編號為CCRC 960082)或 者 HuH7 (食品工業發展研究所之寄存編號為 CCRC 960081)之確立細胞系所產生者，且其至少 為N -鍵結型具有α 2 - 6 .鍵結型唾液酸之糖鏈構 造’同時含有對於 SSA-外源凝集素管柱有親和 性之糖鏈構造，其中該血小板生成素係藉由以 包含編碼人類.血小板生成素之DNA之載體轉形 人類肝臟所衍生之細胞 JHH7 (食品工業發展研 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1235158 戠 C8 D8 六、申請專利範圍 % 所 之 寄 存 編 號 為 CCRC ( 960082)或者 HuH7 (食 品 工 業 發 展 研 究 所 之 寄 存 編 號 為 CCRC 960081)之 確 立 細 胞 系 J 並 培 養 所 獲 得 之 轉 形 體 後 y 分 離 純 化 其 所 產 生 之 人 類 血 小 板 生 成 素 而 得 o 3 ·根 據 中 請 專 利 範 圍 第 1 項 之 人 類 血 小 板 生 成 素 > 其 係 内 生 性 之 人 類 血 小 板 生 成 素 基 因 之 表 現 產 物 〇 4 ·根 據 中 請 專 利 範 圍 第 2 項 之 人 類 血 小 板 生 成 素 ’ 其 係 外 來 性 之 人 類 血 小 板 生 成 素 基 因 之 表 現 產 物 〇 5 .根 據 中 請 專: 利 範 圍 第 1 ^ -4 項 中 任 一 項 之 人 類 血 小 板 生 成 素 J 其 中 該 胺 基 酸 序 列 係 序 列 編 號 1 之 序 列 1 ^ -332 序列編號 ；1 Ser 1 Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 S 10 15 Arg t ^sp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Vai 20 25 30 His ] Pro Lea Pro Thr P ΓΟ Val Leu Leu Pro Ala Val Asp * Phe Ser Lea 35 40 45 Gly ( ：ία Trp Lys Thr Gin Met GU G1 u Thr Lys A 1 a Gin .Asp [ .r，·· 1 e Leu SO 55 1 60 Giy i Ua Vai Thr Leu Leu Leu Glu Giy Val Met Ala Ala i Arg Gly Gin - 2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) A8 B8 C8 D8 1235158 六、申請專利範圍 65 · 70 75 80 Lea Gly Pro Thr Cys Lea Ser Ser Leu Leu Gly.GLa Lea Ser Gly Gin 85 90 95 Val Arg Leu Lea Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Lea 100 10 5. HO Pro Pro GU Gly Arg Thr Thr Ala.His Lys Asp Pro Asi\ AU lie Phe 115 120 125 Lea Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg ^la Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Lea Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn 16S 170 Π5 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr 180 18’5 19〇 Thr Gly Ser Gly leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Ala Lys lie 19S 200 205 Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin 丨le Pro Gly 210 215 220 Tyr Leu Asn Arg lie His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 2 2 5 2 3 0 2 3 5 HO Pro Giy Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp lie Ser Ser Gly 245 250 255 Thr Ser Asp Thr Gly Ser Lea Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser 260 265 270 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 1235158 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Pro Ser Pro Thr Bis Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe Pro Lea 275 280 285 Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Yal Gin Leu His Pro Leu Leu Pro 290 295 300 Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 305 310 315 320 Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Cly 325 330 6 . —種人類血小板生成素之製造方法，該血小板 生成素係含有對於SSA-外源凝集素管柱有親和 性之糖鏈構造，該方法係包含培養由人類肝臟 所衍生之細胞 JHH7 (食品工業發展研究所之寄 存編號為 CCRC 960082)或者 HuH7 (食品工業發展 研究所之寄存編號為 CCRC 960081)之確立細胞 系’以及分離及純化所產生之遠人類血小板生 成素之步驟。 7 . —種人類血小板生成素之製造方法，該血小板 生成素係含有對於 SSA-外源凝集素管柱有親和 性之糖鍵構造’該方法係包含將由人類肝臟所 衍生之細胞 JHH7 (食品工業發展研究所之寄存 編號為 CCRC 960082)或者HuH7 (食品工業發展研 究所之寄存編號為CCRC 960081)之確立細胞系， 以包含編碼人類血小板生成素之DNA之載體進 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X297公翁) 1235158 - C8 D8 六、申請專利範圍 行轉形作用，培養所獲得之轉形體，並 純化其所產生之人類血小板生成素。 8 ·根據申請專利範圍第7項之方法，其中 體係 JHH7/7/C83 (食品工業發展研究所之 號為 CCRC 960083)。 9. 一種血小板增加用之醫藥組合物，其係 請專利範圍第1至5項中任一項之人類 生成素作為有效成分。 10. 根據申請專利範圍第9項之醫藥組合物， 原性經降低者。 11. 根據申請專利範圍第9項之醫藥組合物， 内動態經改善者。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 分離、 該轉形 寄存編 包含申 血小板 其係抗 其係體