JP4236265B2 - ファルネソール生産性酵母 - Google Patents
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Description
この発明は、酵母サッカロミセス・セレビシエの変異菌株であるファルネソール生産性酵母およびアルコール飲料並びにファルネソール含有食品に関する。
一般に、テルペノイド合成の第一段階はイソプレン単位の生成であり、アセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡとなって活性化され、他の２分子のアセチルＣｏＡと反応し、還元されてメバロン酸が生成する。さらにこれが脱炭酸してイソペンテニル二リン酸（C５）およびジメチルアリル二リン酸（C５）となる。ジメチルアリル二リン酸にイソペンテニル二リン酸が順次結合することにより炭素数が５つずつ増えていき、ゲラニル二リン酸（C１０）やファルネシル二リン酸（C１５）などが合成される。
このうち、ファルネシル二リン酸は重要な生合成中間体であり、エルゴステロール等のステロイド類、キノンの側鎖、セスキテルペン類、スクアレン、ファルネシル化タンパク質のアンカー分子、ドリコール、バクトプレノール、天然ゴムなどの合成前駆体であり、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な上記ビタミン類をはじめとする化合物の合成出発物質としてもまた重要な物質である。
ファルネシル二リン酸が脱リン酸化されて生成するファルネソール（FOH）は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲｓ）の標的遺伝子の転写活性化に機能していることが報告されている（非特許文献１参照）。
このようなFOHはＰＰＡＲｓのリガンドとなり、ＰＰＡＲｓ活性を上昇させることから、抗肥満および抗高脂血症効果が期待されるものである。
しかしながら、現在、FOHは、精油等の天然物から少量調整される以外には、化学合成法により合成されている。
化学合成法で合成されるFOHは、一般的には炭素骨格が同じであるが、二重結合が(E)-型（trans型）と(Z)-型（cis型）の混合物として得られる。(All-E)-型である(E,E)-FOHは生物の代謝経路で生合成される幾何異性を持つ化合物であり、工業的価値を有する。
(E,E)-FOHを純粋な形で得るためには、カラムクロマトグラフィーや精密蒸留などの操作が必要であり、工業実施に適さないことから、(E,E)-FOHの活性型(FOH)の純品を大量に生産できる系の確立が望まれている。
ファルネソールを生産する酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の変異菌株としては、スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子（スクアレンシンセターゼ遺伝子とも別称される。）の変異株が知られており（非特許文献２参照）、このerg９変異株を培養すると、培養液１リットルあたり１.３mgのFOHを生産することが知られている。
また、生合成による合成法としては、スクアレン合成酵素遺伝子転写産物量を減少させる方法（特許文献１参照）、スクアレン合成酵素阻害剤を利用した方法などが知られている（特許文献２参照）。
N.Takahashi, T,Kawada, T.Goto, T.Yamamoto, A.Taimatsu, N.Matsui, K.Kimura, M.Saito, M.Hosokawa, K.Miyashita. T.Fushiki, (2002) Dual action of isoprenols from herbal medicines on both PPARγ and PPARα in 3T3-L1 adipocytes and HepG2 hepatocytes. FEBS Lett（フェブズレターズ）. 514:315-22.
Chambon, C., Ladeveze, V., Oulmouden, A., Servouse, M., and Karst, F., (1990) Isolation and properties of yeast mutants affected in farnesyl diphosphate synthetase. Curr. Genet.（カレント ジェネティックス） 18, 41-46
しかし、前記した非特許文献２に記載された方法でerg9変異株を培養するには、エルゴステロールを添加する必要があった。
また、特許文献１、２に記載された方法では、遺伝子組換えやスクアレン合成酵素阻害剤等を使用する方法であることから食品などへの応用は不可能であった。
そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決して、新規なerg9-2変異遺伝子を有するFOH生産性酵母を創製し、これを用いて通常の培養しやすい条件でFOHを効率よく大量生産でき、これによってFOHを含有する清酒や食品を工業的に製造できるようにすることである。
上記の課題を解決するため、本願の発明者らは、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のスクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のgがaに置換された新規なerg9-2変異を有する変異菌株を創製し分離したのである。
すなわち、本願の請求項１に係る発明は、スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子が、その塩基配列の７１４位のgがaに置換された配列番号１で表わされるerg9-2遺伝子に変異したサッカロミセス・セレビシエであるFOH生産性酵母としたのである。
このようなFOH生産性酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＨＬ２９６株［ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３２菌株］として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託（受領日：平成１６年７月２３日）されたFOH生産性酵母を使用できる。
また、本願の請求項１に係る発明は、前記同様の課題を解決するために、上記したFOH
生産性酵母と酵母一倍体との戻し交雑により得られたFOH生産性酵母を使用する。すなわち、FOH生産性酵母と酵母（協会７号系清酒酵母）の一倍体株と交雑させ、胞子形成させた後、子嚢解剖を行い得られた一倍体株で、高濃度のFOHを生産する酵母とする。
生産性酵母と酵母一倍体との戻し交雑により得られたFOH生産性酵母を使用する。すなわち、FOH生産性酵母と酵母（協会７号系清酒酵母）の一倍体株と交雑させ、胞子形成させた後、子嚢解剖を行い得られた一倍体株で、高濃度のFOHを生産する酵母とする。
そして、FOHを含有する清酒や食品を工業的に効率よく製造できるようにするためには、上記のFOH生産性酵母で発酵させて製造されたアルコール飲料、または上記のFOH生産性酵母を用いて発酵させて製造されたFOH含有食品としたのである。
この発明は、ＥＲＧ９遺伝子が、配列番号１で表わされるerg9-2遺伝子に変異したサッカロミセス・セレビシエからなるFOH生産性酵母（HL２８５株）としたので、このerg9-2変異株は、特別な培地を必要とせずエルゴステロールの添加を必要としないでＹＰＤ培地で培養することができ、高FOH生産性を示すという利点がある。
また、清酒酵母との戻し交雑により得られたFOH生産性酵母（HL２９６株）は、清酒醪においてアルコール生産性を示し、FOH生産性酵母（HL２８５株）よりも高いFOH生産性を示すものになる。これにより従来の清酒中およびパン等発酵食品中に存在していなかったFOHを含有する清酒や食品を製造することができる。
また、このFOH生産性酵母は、組換え等の操作をしておらず、変異処理および交雑により得られたものであることから、安全に清酒、焼酎、ワイン、みりん、パン等の製造に使用することが可能である。
この発明でいうerg9-2変異遺伝子は、配列番号１で表わされる塩基配列からなる遺伝子であり、通常のＥＲＧ９遺伝子のＤＮＡ塩基配列の７１４位のｇがａに置換されたもので、これによってスクアレン合成酵素のアミノ酸配列２３８位のトリプトファンが終止コドンに置換され、その結果としてFOH生産性を酵母に付与し得るものである。
また、発明に用いる酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、例えば、実験室酵母、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母などのいずれの酵母であってもよく、これらに対して上記のerg9-2変異を導入することで、FOH生産性を付与して有効に利用することができる。
またこの発明では、FOHを生産させるために特別な培地を必要とせず、エルゴステロールを添加する必要がない。すなわち、ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース５％）で２日間好気的に培養するだけでよい。
erg9-2変異株の簡便な識別方法として、次の方法を採用した。
すなわち、各菌株をＹＰＤ培地で、３０℃で２日間振盪培養後、培養液中のFOHをジエチルエーテルで抽出し、極性キャピラリーカラムと水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を装着したガスクロマトグラフを用いて分析した。なお、2-ドデカノールを内部標準物質として使用した。
すなわち、各菌株をＹＰＤ培地で、３０℃で２日間振盪培養後、培養液中のFOHをジエチルエーテルで抽出し、極性キャピラリーカラムと水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を装着したガスクロマトグラフを用いて分析した。なお、2-ドデカノールを内部標準物質として使用した。
図１および図２に、順にerg9-2変異株および野生型株の培養液抽出物のガスクロマトグラムを示した。図１中の数字は、各ピークのリテンションタイム（カラム内の保持時間）を示し、リテンションタイム３８.０１分，４７.６８分の各ピークが、2-ドデカノール（内部標準物質），FOHにそれぞれ相当する。また、図２中のリテンションタイム３８.０１分のピークは、２-ドデカノール（内部標準物質）である。
図１および図２の結果からも明らかなように、erg9-2変異株ではリテンションタイム４７.６８分でFOHのピークが認められるのに対して、野生型株ではこのピークが不検出であるので、両者は簡単に識別することができる。
以上の方法を用いて創成した酵母変異株として、ＨＬ２８５株（MATa erg9-2）を挙げることができる。この菌株は、野生型実験室酵母Ｘ２１８０−１Ａ株（ATCC 204504, MATa）を紫外線照射して変異を誘導した後に、FOH生産性を指標にして選抜し、シーケンスによってerg9-2変異を確認した。
さらに、HL２８５株と協会７号系清酒酵母一倍体を交雑させ、子嚢解剖により得られたFOH生産性酵母をHL２９６株とした。
HL２９６株の菌学的性質を以下に示す
HL２９６株の菌学的性質を以下に示す
（１）形態
１．栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ、幅：４〜６μｍ
２．栄養細胞の形状：卵型
３．増殖の形態：出芽
（２）生理学的性質
a．糖の資化性
グルコース： ＋
ガラクトース： ＋
スクロース： ＋
マルトース： ＋
ラクトース： −
b．糖の発酵性
グルコース： ＋
ガラクトース： ＋
スクロース： ＋
マルトース： ＋
ラクトース： −
メリビオース： −
ラフィノース： ＋
（３）接合性
接合型：a型
接合能：協会７号酵母の型の一倍体と接合する。また、実験室酵母サッカロマイセス・セレビシエＸ２１８０−１Bと接合する。
（４）胞子形成
HL２９６株を、胞子形成用培地にて３０℃で４日間培養し、胞子の有無を顕微鏡により観察した。HL２９６株は一倍体のため胞子形成しないが、Ｘ２１８０−１Bとの交雑株は良好に胞子形成した。
１．栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ、幅：４〜６μｍ
２．栄養細胞の形状：卵型
３．増殖の形態：出芽
（２）生理学的性質
a．糖の資化性
グルコース： ＋
ガラクトース： ＋
スクロース： ＋
マルトース： ＋
ラクトース： −
b．糖の発酵性
グルコース： ＋
ガラクトース： ＋
スクロース： ＋
マルトース： ＋
ラクトース： −
メリビオース： −
ラフィノース： ＋
（３）接合性
接合型：a型
接合能：協会７号酵母の型の一倍体と接合する。また、実験室酵母サッカロマイセス・セレビシエＸ２１８０−１Bと接合する。
（４）胞子形成
HL２９６株を、胞子形成用培地にて３０℃で４日間培養し、胞子の有無を顕微鏡により観察した。HL２９６株は一倍体のため胞子形成しないが、Ｘ２１８０−１Bとの交雑株は良好に胞子形成した。
上記の菌学的性質は、新規酵母HL２９６株がサッカロマイセス・セレビシエに属する酵母菌であることを示している。
なお、本願の各請求項に係る発明に用いるHL２９６株は、出願人により独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにて寄託されている。そして、HL２９６株は、平成１６(２００４)年７月２３日に受領され、受領番号（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３２）が付与されている。
本願の発明に係るerg9-2遺伝子に変異したサッカロミセス・セレビシエは、このような寄託微生物ばかりでなく、前述した能力を有するerg9-2遺伝子を有する変異体を独自に創製した場合や創製された変異体の子孫にも受け継がれ、発明として広い利用形態があるものと認められる。
図３にＨＬ２９６の培養液抽出物のガスクロマトグラムを示した。図１のＨＬ２８５のＦＯＨのピークと比較してＨＬ２９６のピークは増大していることがわかる。
この発明の新規酵母を用いて、酒類、食品を製造することができ、その種類は、製造に酵母を用いるものであれば特に限定はない。この例として、清酒、焼酎、ワイン、薬味酒、果実酒、ビール、その他のアルコール飲料、及びパン、食酢、醤油、味噌、納豆、漬物、発酵調味料等の食品を挙げることができ、これらの製造は常法により行うことができる。例えば、焼酎では通常の仕込過程において、焼酎酵母の代わりに当該酵母を使用することでFOHを含む焼酎を製造することが可能である。その他の酒類、食品に関しても同様に通常の酵母の代わりに当該酵母を使用することができる。
ＨＬ２９６株と清酒酵母、さらにＨＬ２８５株のFOH生産性を比較するために、各株をＹＰＤ培地に植菌し、30℃で2日間振盪培養を行った。各培養液のジエチルエーテル抽出物を、ガスクロマトグラフを用いて分析した結果を表１に示す。
表１の結果から明らかなように、erg9-2変異を有するHL２８５株はFOH生産性を有しており、０.２４mg/l生産していたが、清酒酵母は生産性を示さなかった。さらに、これらの交雑により得られたHL２９６株はFOH生産性が増大しており、２０.２０ mg/lの生産性が見られた。
以上の結果から、erg9-2変異株を清酒酵母と交雑し、子嚢解剖することで、FOH生産性が増大すると認められた。これは、実験室酵母に比べて、清酒酵母はエルゴステロール合成系が活性化されていることが原因であると考えられる。
次に、ＨＬ２９６株と清酒酵母を用いて清酒小仕込試験を行った結果を示す。
清酒小仕込試験は、下記の表２に示す仕込配合で三段仕込で行った。HL２９６株をＹＰＤ培地１０mlで３０℃で一晩培養し、これを集菌し蒸留水で洗浄後、蒸留水５ mlに懸濁し全量を小仕込試験に使用した。小仕込試験の醪は１５℃一定で発酵させた。生成酒の一般分析値およびFOH生産量を表３に示した。
HL２９６株は、清酒酵母と比べてアルコール濃度が低くなっていたが、それでも十分量のアルコール生産性を示した。また、清酒酵母ではFOHの生成は見られなかったのに対し、HL２９６株では０.２１ mg/l生産することができた。
ＨＬ２９６株を用いたパンの製造試験およびその結果を以下に示す。
HL２９６株をＹＰＤ培地１０００ ｍｌで３０℃で一晩培養し、水で２回洗浄した。その後、強力粉２８０ｇ、酵母８.６ｇ（wet）、上白糖２１ｇ、スキムミルク７.２ｇ、食塩４.６ｇ、無塩バター２０ｇ、水１８０ｍｌを用い、ホームベーカリーにてパンを作製した。作製したパン１ｇをジエチルエーテル抽出後、ガスクロマトグラフによりFOH生産性の測定を行った。対照は市販のドライイースト３ｇを用いた。
HL２９６株をＹＰＤ培地１０００ ｍｌで３０℃で一晩培養し、水で２回洗浄した。その後、強力粉２８０ｇ、酵母８.６ｇ（wet）、上白糖２１ｇ、スキムミルク７.２ｇ、食塩４.６ｇ、無塩バター２０ｇ、水１８０ｍｌを用い、ホームベーカリーにてパンを作製した。作製したパン１ｇをジエチルエーテル抽出後、ガスクロマトグラフによりFOH生産性の測定を行った。対照は市販のドライイースト３ｇを用いた。
表４の結果からも明らかなように、ドライイーストで生地を発酵させたパンからはFOHが検出されなかった。一方、HL２９６株を用いて製造したパンは表４に示すように、パン１ｇあたり０.９４ｍｇのFOHを生産していた。
Claims (4)
- スクアレン合成酵素をコードするERG9遺伝子が、その塩基配列の７１４位のgをaに置換された配列番号１で表わされるerg9-2遺伝子に変異したサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）と、清酒酵母一倍体との戻し交雑により得られたファルネソール生産性酵母。
- ファルネソール生産性酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＨＬ２９６株［ＦＥＲＭ Ｐ−２０１３２菌株］である請求項１に記載のファルネソール生産性酵母。
- 請求項１または２に記載のファルネソール生産性酵母で発酵させて製造されたアルコール飲料。
- 請求項１または２に記載のファルネソール生産性酵母を用いて発酵させて製造されたファルネソール含有食品。
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