JP4167061B2

JP4167061B2 - 成長因子ｆｇｆ−２の活性化の変化によって起こる疾患の治療のための長いペントラキシンｐｔｘ３の使用

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Publication number: JP4167061B2
Application number: JP2002540751A
Authority: JP
Inventors: アルベルト・マントヴァーニ; バルバラ・ボッタッツィ; マルコ・プレスタ; マルコ・ルスナティ
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2008-10-15
Anticipated expiration: 2021-11-08
Also published as: ITRM20000578A1; KR100822357B1; WO2002038169A1; SK5622003A3; CN1304047C; DK1331940T3; KR20030061396A; JP2004513151A; CA2428176A1; DE60118769T2; PL205925B1; HUP0400541A2; CA2428176C; IT1317930B1; US7858577B2; AU2002222513B8; HUP0400541A3; EP1331940A1; CZ299673B6; ES2261515T3

Description

【０００１】
本発明は、成長因子ＦＧＦ−２の生物活性を阻害する薬物の調製のための、長いペントラキシンＰＴＸ３（ＰＴＸ３）またはその機能性誘導体の１つの使用に関し、該薬物は成長因子ＦＧＦ−２の活性化の変化によって起こる疾患の予防および治療のために有用である。
【０００２】
成長因子ＦＧＦ−２の活性化の変化によって起こる疾患には、血管新生の変化によって起こる疾患や、線維芽細胞または平滑筋細胞の増殖の制御喪失によって起こる疾患が含まれる。
【０００３】
抗血管新生活性を有する化合物は、Henry Brem および Judath Folkman によって１９７５年に軟骨中から最初に発見された（J. Exp. Med. 1975 Feb. 1;141(2):427-39）。この著者らは、病的新血管新生の選択的阻害剤を用いることによって、腫瘍増殖、転移、関節の慢性および急性の炎症、および糖尿病性網膜症などの病理過程を制御するためにこの発見を利用できるのではないかと考えた。
【０００４】
成人においては血管新生は通常静止状態にあるが、例えば、創傷の治癒や女性の生殖周期における子宮内膜の再構築においては、正常な機能を果たしている。
【０００５】
血管の機能が低下し、組織への灌流が不充分な場合には、血管新生応答が生理的に刺激される。
【０００６】
概して、生理条件においては血管新生は、不充分な灌流または酸素および栄養分の供給の減少に応答して、正のフィードバック制御を構成するといわれており、それは例えば、動脈が閉塞した場合、組織集団が成長する場合（例えば筋肉組織の形成に伴う新血管新生）、および酸素および栄養分の要求の増加に伴い仕事の負荷が増大する場合などに起こる。
【０００７】
原発腫瘍の成長は腫瘍組織の良好な血管新生によって促進されることがよく知られている。酸素および栄養分の十分な供給により、腫瘍の急速な成長が促進される。
【０００８】
血管新生の程度は腫瘍の予後における非常にネガティブな因子であり得るということが示されている（van Hinsbergh VW, Collen A, Koolwijk P; Ann. Oncol., 10 Suppl., 4:603, 1999; Buolamwini JK; Curr. Opin. Chem. Biol., 3(4):5009, 1999 Aug.）。
【０００９】
腫瘍分野においては腫瘍細胞の生物学における基本的段階は、転移能力の獲得であるということも知られている。
【００１０】
転移する腫瘍細胞は周囲の構造への付着性を喪失しており、血管およびリンパ管に侵入し、離れた場所にある他の組織にコロニーを形成し、そこでさらに増殖し続けることができる。
【００１１】
転移は疾患の臨床歴においても重大な意味を持ち、癌による死の主要な原因である。転移は、腫瘍部位または隣接領域における血管組織の存在に密接に関連し、かつ、その存在によって促進される。
【００１２】
腫瘍細胞の周囲の構造を通る移動により、細胞が腫瘍内血管（既存のものであるか新血管新生によって形成されたもの）へ到達することが可能となり、血流へ到達することになる（Ray JM., StetlerStevenson WG; Eur. Respir. J., 7(11):206272, 1994; StetlerStevenson WG, Liotta LA, Kleiner DE Jr.; FASEB J., 7(15):143441, 1993 Dec.）。
【００１３】
腫瘍の脈管領域におけるリンパ管と血管との連絡の存在により、腫瘍細胞が両方の脈管系へと入ることが可能となる。
【００１４】
最近の研究により、血管新生と関節炎との間の直接的相関が示された（Koch AE; Arthritis and Rheumatism 41:951962, 1998）。具体的には、関節の軟骨での新血管新生がパンヌスの形成および関節炎の進行において重要な役割を果たしているということが示された。正常な軟骨は血管を有さないが、関節炎患者の滑液は、内皮細胞によって産生される血管新生刺激因子（ＥＡＳＦ）を含んでいる。
【００１５】
この因子の存在は血管新生および軟骨の分解に関連している。
【００１６】
その他にも異常な血管新生に関連する疾患がある。
【００１７】
糖尿病性網膜症（Histol. Histopathol. 1999 Oct; 14(4):1287-94）、乾癬（Br J.Dermatol. 1999 Dec; 141(6):1054-60）、慢性炎症および動脈硬化症（Planta Med. 1998 Dec; 64(8):686-95）において、患部組織の新血管新生は促進因子であるということが見出された。
【００１８】
成長因子ＦＧＦ−２は１８ｋＤａの陽イオン性ポリペプチドであり、インビボで新血管新生を誘導することもできるし、培養物中で細胞の増殖、走化作用および内皮細胞におけるプロテアーゼの産生を誘導することもできる（Basilico and Moscatelli, 1992, Adv. Cancer Res. 59:115-65）。
【００１９】
腫瘍血管新生におけるＦＧＦ−２の役割は既に知られている（Pathol. Biol. (Paris) 1999 Apr; 47(4):364-7）。
【００２０】
J. Pathol. 1999 Sept; 189(1):72-8 において、中皮腫を患う患者におけるＦＧＦ−２の発現の増加は、そのような腫瘍疾患を患う患者の、高い攻撃性および高い死亡率と関係があるということが報告されている。
【００２１】
Oncogene 1999 Nov 18;18(48):6719-24 において、ＦＧＦ−２がラットの膀胱癌細胞に転移性を与えるということが報告されている。
【００２２】
Int. J. Cancer 1999 May 5;81(3):451-8 においては、ＦＧＦ−２が強い分裂促進活性を有しており、ヒト腫瘍の進行およびその悪性度の上昇に関係しているということが報告されている。
【００２３】
腫瘍疾患の治療のための抗血管新生療法は、標準的な従来からの化学療法と比べて以下のような利点を有する（Cancer Research 1998, 58, 1408-16）。
【００２４】
１．特異性が高い：標的が腫瘍新血管新生プロセスである。
【００２５】
２．生物適応性が高い：標的が内皮細胞であるため、腫瘍細胞に直接作用する従来型の化学療法アプローチの有する問題を生じずに簡単に標的に到達できる。
【００２６】
３．化学耐性が生じにくい：これがこの療法の最も重要な利点であろう；実際、腫瘍細胞と比べて内皮細胞は、遺伝的に安定であり薬物耐性現象が起こり得ない。
【００２７】
４．転移が生じにくい：新血管新生の妨害により、血流を通っての体の他の部分での腫瘍細胞の増殖が制限される。
【００２８】
５．アポトーシスが促される：腫瘍における脈管網の妨害により、腫瘍細胞が利用できる酸素および栄養分が減少し、アポトーシスが増加する。
【００２９】
全身毒性が減少する：従来型の化学療法に存在する、骨髄抑制、胃腸障害および一過性脱毛症などの毒作用が、抗血管新生療法では観察されない。
【００３０】
ＦＧＦ−２は標的細胞表面に存在する２種類のクラスの受容体と反応してこのような効果を奏する：チロシンキナーゼ活性を備えた高アフィニティー受容体（ＦＧＦＲ類）およびプロテオグリカンヘパラン硫酸によって特徴付けられる低アフィニティー受容体（ＨＳＯＧ類）である（Johnson and Williams, 1993, Adv. Cancer Res. 60:1-41; Moscatelli, 1987, J. Cell. Physiol. 131:123-30）。
【００３１】
ＦＧＦ−２は内側平滑筋細胞に対する強力な分裂促進因子であり、該細胞がバルーン付カテーテルによる損傷の後に増殖するために必要である（J. Biol. Chem. 2000 Apr. 14;275(15): 11270-7）。
【００３２】
それゆえ成長因子ＦＧＦ−２の活性化の変化によって起こる疾患には、血管形成術または「肝動脈ステント」の後の再狭窄において起こる動脈の筋肉壁の過形成も含まれる（J. Vasc. Surg. 1997 Feb; 25(2):320-5）。
【００３３】
ＦＧＦ−２依存性新血管新生の制御は、血管新生の変化による疾患の制御および治療の基本的な要素の１つであり、線維芽細胞または平滑筋細胞のＦＧＦ−２依存性の制御を喪失した増殖を制御することは、過剰な線維芽細胞応答による瘢痕形成および血管形成術後の再狭窄の治療に重要である。
【００３４】
ＦＧＦ−２の生物活性を特異的に阻害する新規な治療用化合物を得ることは、この成長因子の活性化の変化によって起こる疾患の予防および治療のための非常に重要な目的である。そのような疾患には、関節炎、腫瘍、腫瘍転移、糖尿病性網膜症、乾癬、慢性炎症、動脈硬化症、過剰な線維芽細胞応答による瘢痕形成および血管形成術後の再狭窄が含まれる。
【００３５】
ＰＴＸ３は様々なタイプの細胞に発現しており（Bottazzi et al., J. Biol. Chem. 1997, 272: 32817-32823）、特に炎症性サイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ−１β）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）にさらされた後の単核食細胞および内皮細胞において発現している。
【００３６】
今日まで、ＰＴＸ３の生物機能は完全には理解されていない。
【００３７】
ＰＴＸ３は、既知のいずれの分子にも関連性のないＮ−末端ドメインと、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のような短いペントラキシンに類似しているＣ−末端ドメインとの２つの構造ドメインからなる（Breviario F., et al., J. Biol. Chem. 267:22190, 1992）。
【００３８】
ヒトＰＴＸ３（ｈＰＴＸ３）と動物のＰＴＸ３との間にはかなりの類似度が見られる。特に、マウスＰＴＸ３（ｍＰＴＸ３）は、ＤＮＡ配列と遺伝子構成および位置の点ではｈＰＴＸ３と非常に類似している。ヒトおよびマウスのＰＴＸ３遺伝子の間の同一性の程度は８２％であり、保存的置換を考慮した場合には９０％に達する（Introna M., et al.: Blood 87 (1996) 1862-1872）。マウスＰＴＸ３遺伝子はマウスの染色体３の、ヒト３ｑ領域（ｑ２４−２８）に類似する領域に位置しており、ｈＰＴＸ３が３ｑ２５領域に位置しているという報告と一致する（Introna M., et al.: Blood 87 (1996) 1862-1872）。
【００３９】
ｈＰＴＸ３とｍＰＴＸ３配列との間の高度な類似性は、進化の過程でペントラキシンが高度に保存されてきたことを示す（Pepys M. B., Baltz M. L.: Adv. Immunol. 34：141, 1983）。
【００４０】
ペントラキシンについての総説としては、H. Gewurz et al., Current Opinion in Immunology, 1995, 7:54-64を参照されたい。
【００４１】
本出願人によって出願された国際出願ＷＯ９９／３２５１６号には、感染性、炎症性、腫瘍性疾患の治療のための長いペントラキシンＰＴＸ３の使用について記載されている。ＷＯ９９／３２５１６号において記載されている、ＰＴＸ３によって示される抗腫瘍活性は、白血球の補充(leucocitary recruitment)を介する、即ち免疫学に基づくものである。ＷＯ９９／３２５１６号には、成長因子ＦＧＦ−２の活性化の変化による疾患の治療のために有用な薬剤としてのＰＴＸ３の使用については全く記載されておらず、示唆もされていない。
【００４２】
米国特許第５７６７２５２号には、ペントラキシンファミリーに属する神経細胞成長因子について記載されている（引用されている参考文献も参照されたい）。この特許は神経生物学分野に関する。
【００４３】
今回、長いペントラキシンＰＴＸ３が高いアフィニティーおよび高い特異性をもって、ＦＧＦ−２に結合することができることを見出した。ＰＴＸ３のＦＧＦ−２との結合（Ｋ_ｄ＝８−１６ｎＭ）は、ＦＧＦ−２のその高アフィニティーチロシンキナーゼ受容体への結合、および細胞表面に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンによって特徴付けられる低アフィニティー受容体部位への結合を阻害する。結合の阻害によってＦＧＦ−２生物活性の阻害が起こる。
【００４４】
ＦＧＦ−２／ＰＴＸ３間の相互作用はその基礎的性質だけでなく、成長因子の正確な高次構造にも依存している。というのは、ＰＴＸ３はシトクロームＣ（ＦＧＦ−２と分子量（１８ｋＤａ）および等電点（ｐＨ９．６）を共有するタンパク質）には結合しないからである。
【００４５】
さらに、ＰＴＸ３と相同的なＣ反応性タンパク質はＦＧＦ−２には結合しない。
【００４６】
それゆえ本発明の目的は成長因子ＦＧＦ−２の生物活性の阻害により妨げられる疾患の、予防用および治療用薬物の調製のための、長いペントラキシンＰＴＸ３またはその誘導体またはそのドメインの使用である。
【００４７】
本発明のさらなる目的は、成長因子ＦＧＦ−２の活性化の変化によって起こる疾患の、予防用および治療用薬物の調製のための、長いペントラキシンＰＴＸ３またはＰＴＸ３の誘導体またはそのドメインの使用である。
【００４８】
本発明のさらなる目的は、血管新生の変化によって起こる疾患の、予防用または治療用薬物の調製のための、長いペントラキシンＰＴＸ３またはその誘導体またはそのドメインの使用であって、血管新生の変化が成長因子ＦＧＦ−２の活性化の変化によって引き起こされるものである。このような疾患の例としては、関節炎、腫瘍転移、糖尿病性網膜症、乾癬、慢性炎症、動脈硬化症または腫瘍が含まれ、腫瘍には例えば、肉腫、癌腫、カルチノイド、骨腫瘍または神経内分泌腫瘍が含まれる。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、過剰な線維芽細胞応答による瘢痕形成および血管形成術後の再狭窄などの、線維芽細胞または平滑筋細胞の制御を失ったＦＧＦ−２依存性増殖による疾患の、治療用薬物の調製のための、長いペントラキシンＰＴＸ３またはＰＴＸ３の誘導体またはそのドメインの使用である。
【００５０】
本発明による化合物は、組換えタンパク質として投与された場合だけでなく、そのｃＤＮＡの遺伝子移入の結果として内因的に投与された場合にも、標的細胞においてＦＧＦ−２活性の阻害のために好適に用いられる。
【００５１】
それゆえ本発明のさらなる目的は、成長因子ＦＧＦ−２の活性化の変化によって起こる疾患の遺伝子治療のために、該ｃＤＮＡを含むプラスミドまたはウイルス発現ベクターを調製するためのヒトＰＴＸ３全長またはその誘導体またはそのドメインのｃＤＮＡの使用であり、ここで疾患としては例えば、腫瘍、腫瘍転移、過剰な線維芽細胞応答による瘢痕形成または血管形成術後の再狭窄が挙げられる。
【００５２】
「長いペントラキシンＰＴＸ３」とは、その起源が天然（ヒトまたは動物）であるか合成であるかにかかわらず、あらゆる長いペントラキシンＰＴＸ３を意味する。
【００５３】
誘導体とは、少なくとも１つの突然変異を有し、ＦＧＦ−２を選択的に阻害する機能的能力を維持する、上記の長いペントラキシンＰＴＸ３のあらゆる機能性アナログを意味する。
【００５４】
好適な長いペントラキシンＰＴＸ３は、その配列がＷＯ９９／３２５１６号に記載されているヒトＰＴＸ３である。
【００５５】
本明細書において記載する長いペントラキシンＰＴＸ３は、ＦＧＦ−２の発現の上昇が腫瘍疾患の攻撃性および転移能力を高めるような腫瘍疾患の治療のために、１以上の抗癌剤と組み合わせて用いてもよい。
【００５６】
実際、望ましくない副作用を回避しつつ同様の治療効果を維持するために、多くの腫瘍患者は単一の抗癌剤のみで治療されるのではなく、いくつかの抗癌剤の組み合わせ、または抗癌剤と抗血管新生化合物との組み合わせによって治療されることがよく知られている。
【００５７】
より一般的な抗癌剤の作用機構は、本発明による化合物の作用機構と全く異なり、実際、一般的な抗癌剤は腫瘍細胞に対して細胞毒性である。
【００５８】
本発明による化合物は、異なる作用機構により、それと組み合わされる抗腫瘍剤によって奏される効果とは別の治療効果（アジュバント効果）を発揮する。
【００５９】
それゆえ本明細書において記載する本発明のさらなる目的は、長いペントラキシンＰＴＸ３と１以上の既知の抗癌剤との組み合わせである。
【００６０】
本明細書において記載する本発明のさらなる目的は、長いペントラキシンＰＴＸ３と１以上の既知の抗癌剤と１以上の医薬上許容される賦形剤または媒体を組み合わせて含有する医薬組成物である。既知の抗癌剤としては、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗チューブリン剤、インターカレート化合物、抗代謝剤、ビンカアルカロイドなどの天然物、エピポドフィロトキシン、抗生物質、酵素、タキサン、および細胞分化化合物などが挙げられる。
【００６１】
本明細書において記載する本発明のさらなる目的は、１以上の既知の抗腫瘍化合物との組み合わせにおける、長いペントラキシンＰＴＸ３の腫瘍治療用薬物の調製のための使用であり、ここで該腫瘍はＦＧＦ−２の発現の上昇によって腫瘍の攻撃性が高められるものである。
【００６２】
本明細書において記載する本発明のさらなる目的は、１以上の既知の抗腫瘍化合物との組み合わせにおける、長いペントラキシンＰＴＸ３の腫瘍転移の発生の予防用薬物の調製のための使用であり、ここで該腫瘍はＦＧＦ−２の発現の上昇によって転移能力が高められるものである。
【００６３】
本明細書において記載する本発明のさらなる目的は、抗癌化合物との組み合わせにおける長いペントラキシンＰＴＸ３の、腫瘍治療用薬物の調製のための使用であり、長いペントラキシンＰＴＸ３が抗癌化合物のアジュバントとして存在することを特徴とするものである。
【００６４】
以下の実施例によって本発明を詳細に説明する。
【００６５】
実施例１
溶液中でのＰＴＸ３のＦＧＦへの結合能力
この実験は、ＦＧＦ−２へのＰＴＸ３の結合を評価するために行った。ＰＴＸ３は、Bottazzi et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:32817-32823 に記載のようにして生産した。ヒト組換えＦＧＦ−２は、Isacchi A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1991), 88:2628-32 に記載のようにして生産した。必要な場合はＦＧＦ−２を、Isacchi et al.に記載の方法により^１２５Ｉで標識した（以下を参照）。
【００６６】
実験方法：
１μｇのＦＧＦ−２（あるいはその替わりに１μｇのＰＴＸ３）を含有する１００μｌのＰＢＳを、サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィースペロース(Superose)１２カラム（Pharmacia)でのクロマトグラフィーにかけた：このカラムは分子量によってタンパク質を分離することができるものである。カラムを流速１ｍｌ／分でＰＢＳで溶出し１ｍｌ毎にフラクションを回収し、該２つのタンパク質に特異的な抗体によるドットブロットで分析した。ＦＧＦ−２へのＰＴＸ３の結合を評価するために、該２つのタンパク質（それぞれ５ｇおよび１μｇ）を１００μｌのＰＢＳに混合し、カラムにかける前に４℃で１０分間インキュベートした。フラクションを回収し、抗ＦＧＦ−２特異的抗体によるドットブロットで分析した。図１において報告する結果は、ＦＧＦ−２（１８，０００Ｄ）は約２２ｍｌの保持体積でカラムから溶出されることを示す。同じ条件下でＰＴＸ３（４５０，０００Ｄ）はカラムのボイド体積（７ｍｌ）で溶出される。４℃で１０分間ＰＴＸ３とプレインキュベートしたＦＧＦ−２をカラムにかけた場合、そのクロマトグラフィーでの振る舞いに変化が観察された：この実験条件下ではＦＧＦ−２はＰＴＸ３単独での場合と同じ保持体積でカラムから溶出された。
【００６７】
実施例２
プラスチックに固定化したＦＧＦ−２へのビオチン標識ＰＴＸ３の結合能力
５００ｎｇのＦＧＦ−２または補体成分Ｃ１ｑを含有する１００μｌのＮａＨＣＯ_３ｐＨ９．６を９６穴プラスチックプレート中で４℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次いで１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する２００μｌのＰＢＳで室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを再びＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中の様々な量のビオチン標識ＰＴＸ３の存在下で、３０ｎｇ／ｍｌの^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２とともにインキュベートした（室温で２時間）。別の実験ではウェルに様々な量のＦＧＦ−２またはＣ１ｑを吸着させ、１００μｌのＰＢＳ中の１００ｎｇ／ｍｌのビオチン標識ＰＴＸ３とともにインキュベートした。このインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌのストレプトアビジンＨＲＰ複合体（１／２０００）とともに室温で１時間インキュベートした。反応を色素原マイクロウェルペルオキシダーゼ基質システムＡＢＴＳ(the chromogen microwell peroxidase substrate system ABTS)(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加することによって可視化した。自動ＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍでプレートを読んだ。図２に報告する結果は、プラスチックウェルに固定化されたＦＧＦ−２が、生理的ＰＴＸ３のリガンドであるＣ１ｑと同様にしてビオチン標識ＰＴＸ３に結合することができることを示す（Bottazzi B. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:32817-32823）。
【００６８】
実施例３
ＰＴＸ−３−ＦＧＦ−２相互作用のキャラクタリゼーション
９６穴プレートを、ＰＴＸ３またはＣ反応性タンパク質（２００ｎＭ）あるいは２μｇ／ｍｌの以下のタンパク質（ネガティブコントロールとして使用）：ウシ血清アルブミン、フィブロネクチン、ゼラチンまたはラミニン、を含有する１００μｌのＮａＨＣＯ_３ｐＨ９．６で４℃でコーティングした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで室温で２時間ブロッキングした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次いで３０ｎｇの^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２とともに室温で２時間インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳで３回洗浄し、結合した^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２を２％ＳＤＳ水溶液２００μｌで各ウェルを２回洗浄することによって回収した。^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２のレベルをガンマカウンターで計測した。図３において報告する結果は、ＦＧＦ−２がプラスチックに固定化したＰＴＸ３に結合し、ＦＧＦ−２はＣＲＰとは弱く反応するのみであり、他の固定化タンパク質とは反応しないことから、この結合は特異的であるということを示す。
【００６９】
実施例４
過剰の非放射性ＦＧＦ−２の存在下での^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２のプラスチックに固定化されたＰＴＸ３への結合
第２の実験において^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２のプラスチックに固定化されたＰＴＸ３への結合を、過剰量のネイティブ非放射性ＦＧＦ−２（１００ｎＭ）または過剰量の熱変性非放射性ＦＧＦ−２（１００ｎＭ）の存在下、または、同様の濃度のシトクロームＣの存在下または過剰量の可溶性ＰＴＸ３（３００ｎＭ）の存在下で試験した。この実験は上述のように行った：図４において報告する結果は、非放射性ＦＧＦ−２および可溶性ＰＴＸ３が、^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２とプラスチックに固定化されたＰＴＸ３との相互作用を阻害することを示す。熱不活性化ＦＧＦ−２およびシトクロームＣ（ＦＧＦ−２と同じ分子量および等電点を有する）は、ＰＴＸ３に結合することができないということにより、この成長因子の基本的性質ではなく、正確なコンフォメーションがＰＴＸ３への結合能力に関与していることが示唆される。
【００７０】
実施例５
ＦＧＦ−２／ＰＴＸ３相互作用の解離定数（Ｋｄ）
この実験ではＦＧＦ−２／ＰＴＸ３相互作用の解離定数（Ｋｄ）を調べた。この目的のため、様々な量の^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２をプラスチックに固定化されたＰＴＸ３とともにインキュベートし、結合の結果をスキャッチャードプロットによって分析した。図５において報告する結果は、ＦＧＦ−２はＰＴＸ３に対して飽和性に結合し、高いアフィニティー（Ｋｄ＝８−１６ｎＭ）を有することを示す。このアフィニティーは、ＰＴＸ３とその生理的リガンドであるＣ１ｑとの相互作用について以前に計算されたアフィニティーと類似している。
【００７１】
実施例６
内皮細胞へのＦＧＦ−２の結合に対するＰＴＸ３の効果
形質転換胎児ウシ大動脈内皮細胞ＧＭ７３７３を、１０％ＦＣＳを含有するイーグル最小必須培地（イーグルＭＥＭ）中で２４穴シャーレに８０，０００細胞／ｃｍ^２で播種した。３７℃で２４時間後、付着細胞をＦＣＳを含有しないイーグルＭＥＭで２回洗浄し、次いで０．１５％ゼラチンと２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５を含有するイーグルＭＥＭ中で様々な濃度のＰＴＸ３の存在下または不在下で、^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに４℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、低アフィニティー受容体（ＨＳＰＧ類）および高アフィニティー受容体（ＦＧＦＲ）に結合した^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２の量を、Moscatelli, 1987 J. Cell. Physiol. 131:123-30 に記載のようにして調べた。簡単に説明すると細胞を２０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）中の２ＭＮａＣｌで２回すすいで低アフィニティー結合部位に結合している^１２５Ｉ−ＦＧＦ−２を除去し、そして２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中の２ＭＮａＣｌで２回すすいで高アフィニティー結合部位に結合している^１ ^２５Ｉ−ＦＧＦ−２を除去した。非特異的結合を１００倍モル過剰量の非標識ＦＧＦ−２の存在下で測定し、すべての値からこれを差し引いた。図６において報告する結果は、ＰＴＸ３は内皮細胞上の高アフィニティー受容体および低アフィニティー受容体に対するＦＧＦ−２の結合を用量依存的に阻害することができることを示す。
【００７２】
実施例７
内皮細胞に対しＦＧＦ−２が示す分裂促進活性に対するＰＴＸ３の効果
ＧＭ７３７３細胞を、１０％ＦＣＳを含有するイーグルＭＥＭ中で４８穴プレートに７５，０００細胞／ｃｍ^２で播種した。３７℃で２４時間後、付着細胞をＦＣＳを含有しないイーグルＭＥＭで２回洗浄し、次いで０．４％ＦＣＳを含有するイーグルＭＥＭ中でＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）および様々な濃度のＰＴＸ３の存在下または不在下で、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をトリプシン処理して計数した。別の実験においてＧＭ７３７３細胞を様々な分裂刺激の存在下（１０％ＦＣＳ、５μｇ／ｍｌジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、１０ｎｇ／ｍｌホルボールエステル（ＴＰＡ）、３０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ）または３０ｎｇ／ｍｌ血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））で上記のように処理した。図７において報告する結果は、ＦＧＦ−２による内皮細胞に対する分裂促進活性を、ＰＴＸ３が用量依存的に阻害し、ＩＤ_５０は３０ｎＭであることを示す。この値はＦＧＦ−２−ＰＴＸ３相互作用について計算されたＫｄと類似する。これらの結果はＰＴＸ３によるＦＧＦ−２生物活性の阻害は、細胞外部位におけるその封鎖によるということを示唆する。その他の分裂促進因子を用いて細胞増殖を誘導してもＰＴＸ３の阻害活性は検出されないことから、ＰＴＸ３のＦＧＦ−２に対する阻害活性は特異的である。
【００７３】
実施例８
形質転換胎児ウシ大動脈内皮細胞の増殖に対するＰＴＸ３の効果
この実験では、ＦＧＦ−２をコードする発現ベクターを安定に形質移入されたマウス大動脈内皮細胞系ＭＡＥ３Ｆ２Ｔ（Gualandris et al., 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60）の増殖に対するＰＴＸ３の効果を調べた。これら細胞は内在性ＦＧＦ−２により誘導される刺激の自己分泌ループに応答して増殖することができる（Gualandris et al., 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60）。ＭＡＥ３Ｆ２Ｔ細胞を４８穴プレート中の１０％ＦＣＳを添加したダルベッコ培地（ＤＭＥＭ）に１０，０００／ｃｍ^２で播種した。３７℃で２４時間後、付着細胞をＦＣＳを含有しないＤＭＥＭで２回洗浄し、ＰＴＸ３（７０ｎＭ）、抗ＦＧＦ−２特異的抗体またはスラミン（５０μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で０．４％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で３７℃で７２時間インキュベートした。スラミンは細胞外ＦＧＦ−２を隔離してその生物活性を阻害する能力があることが知られている（Rusnati et al., 1996, Mol. Biol. Cell. 7:369-381）。インキュベーション後に細胞をトリプシン処理してバーカー(Burker)チャンバ中で計数した。図８において報告する結果は、ＰＴＸ３がＭＡＥ３Ｆ２Ｔ細胞においてＦＧＦ−２によって誘導される刺激の自己分泌ループをブロックし、抗ＦＧＦ−２抗体およびスラミンによるのと同様に、そのＦＧＦ−２依存性増殖を阻害することができることを示す。
【００７４】
実施例９
ＦＧＦ−２によってインビボで誘導される新血管新生に対するＰＴＸ３の効果ＰＴＸ３の抗血管新生能力をニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおいてインビボで評価した。簡単に説明すると、３日齢のニワトリ受精卵の卵殻に穴を開けた。８日目にゼラチンスポンジをＣＡＭに移植し、ＰＴＸ３の存在下（５μｇ／スポンジ）または不在下でＰＢＳのみまたはＦＧＦ−２（５００ｎｇ／スポンジ）を含有するＰＢＳ１０μｌを吸収させた（１グループ当たり５−６の胚）。４日後、ＣＡＭを卵中でＺｅｉｓｓＳＲ立体顕微鏡で観察し、被験試料について知識のない２人の観察者によって血管新生応答をスコアリングした。０−４＋の任意スケールに類別し、ここで０は血管新生応答無しを表し、４＋は最も強い活性を表す。
【００７５】
図９において報告する結果はＰＴＸ３がＦＧＦ−２によってインビボで誘導される新血管新生を阻害することができることを示す。
【００７６】
実施例１０
ＰＴＸ３による遺伝子治療
ＦＧＦ２ＭＡＥ３Ｆ２Ｔと称される、ＦＧＦ−２を過剰発現するマウス内皮細胞（Gualandris et al., 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60）に、市販の発現ベクターｐＬＸＳＨ（Clontech）にサブクローニングしたヒトＰＴＸ３全長ｃＤＮＡを形質移入した。
【００７７】
ＦＧＦ２ＭＡＥ３Ｆ２Ｔ細胞のＦＧＦ−２依存性増殖およびその三次元フィブリンゲルへの侵入行動に対するＰＴＸ３過剰発現の効果を調べるために、得られた形質移入細胞系についてインビトロ研究を行った。
【００７８】
詳細に説明すると、様々なレベルのＰＴＸ３を発現するいくつかのＦＧＦ２ＭＡＥ３Ｆ２Ｔクローンおよび親ＦＧＦ２ＭＡＥ３Ｆ２Ｔ細胞（これはＰＴＸ３を産生しない）を、４８穴プレート中の１０％ＦＣＳを添加したダルベッコ培地（ＤＭＥＭ）に１０，０００／ｃｍ^２で播種した。３７℃で２４時間後、付着細胞をＦＣＳを含有しないＤＭＥＭで２回洗浄し、０．４％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中３７℃で様々な期間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をトリプシン処理してバーカーチャンバ中で計数した。図１０において報告する結果は、ＰＴＸ３の過剰発現がＦＧＦ２ＭＡＥ３Ｆ２Ｔ細胞増殖を阻害し、この阻害の程度は試験された様々なクローンによって産生されるＰＴＸ３の量と相関するということを示す。
【００７９】
ＰＴＸ３を過剰発現するＦＧＦ２ＭＡＥ３Ｆ２Ｔクローンの三次元フィブリンゲルへの侵入行動を調べるために、細胞集合体を文献（Gualandris et al., 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60）に記載されているのと全く同様にしてアガロースコーティングしたプレート上に調製した。これら集合体をフィブリンコーティングした４８穴プレートに播種した。播種の直後に２５０ｌのフィブリノーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）およびトロンビン（２５０ｍＵ／ｍｌ）を含有し、カルシウムを含有しない培地を、各ウェルに添加し３７℃で５分間ゲル化させた。次に５００ｌの培地をゲルの上面に添加した。すべての実験において線維素溶解性阻害剤トラシロール(trasylol)をゲルおよび培地に２００ＫＩＵ／ｍｌで添加して基質の溶解を防いだ。放射状に成長する細胞芽(cell sprouts)の形成を２日後にコンピュータ画像化分析によって評価した。
【００８０】
図１１において報告する結果は、ＰＴＸ３を過剰発現するＦＧＦ２ＭＡＥ３Ｆ２Ｔクローンの侵入能力は、親ＦＧＦ２ＭＡＥ３Ｆ２Ｔ細胞よりも有意に低いことを示す。
【００８１】
得られた結果は、ＰＴＸ３がそのｃＤＮＡの遺伝子移入後に内因的に産生された場合に内皮細胞のＦＧＦ−２活性を阻害することを示す。
【００８２】
したがって、本発明による化合物は既知の方法（In Vivo. 1998 Jan-Feb; 12(1):59-67; In Vivo. 1998 Jan-Feb; 12(1):35-41; In Vivo. 1994 Nov-Dec; 8(5):771-80）にしたがって、成長因子ＦＧＦ−２の活性化の変化によって起こる疾患の治療のための遺伝子治療プロトコールにおいて利用できる。

Claims

ＰＴＸ３を含む、線維芽細胞または平滑筋細胞の制御されない増殖または血管新生の変化による疾患の予防用および治療用医薬組成物であって、線維芽細胞または平滑筋細胞の制御されない増殖による疾患が過剰な線維芽細胞応答による瘢痕形成または血管形成術後の再狭窄から選択され、血管新生の変化による疾患が糖尿病性網膜症またはアテローム性動脈硬化症から選択される、医薬組成物。
ＰＴＸ３が天然に存在するＰＴＸ３である、請求項１に記載の医薬組成物。
ＰＴＸ３がヒトＰＴＸ３である、請求項２に記載の医薬組成物。
ＰＴＸ３が合成起源のＰＴＸ３である、請求項１に記載の医薬組成物。
ＰＴＸ３をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを含む、線維芽細胞または平滑筋細胞の制御されない増殖または血管新生の変化による疾患の遺伝子治療のための医薬組成物であって、線維芽細胞または平滑筋細胞の制御されない増殖による疾患が過剰な線維芽細胞応答による瘢痕形成または血管形成術後の再狭窄から選択され、血管新生の変化による疾患が糖尿病性網膜症またはアテローム性動脈硬化症から選択される、医薬組成物。
ＰＴＸ３をコードするｃＤＮＡが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターに担持される、請求項５記載の医薬組成物。