SK287791B6

SK287791B6 - Použitie dlhého pentraxin PTX3 alebo jeho funkčných derivátov alebo domén na prípravu liečiva

Info

Publication number: SK287791B6
Application number: SK562-2003A
Authority: SK
Inventors: Alberto Mantovani; Barbara Botazzi; Marco Presta; Marco Rusnati
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A.
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2011-10-04
Also published as: WO2002038169A1; US20040023879A1; ITRM20000578A1; JP4167061B2; CN1304047C; PL205925B1; ATE322906T1; SK5622003A3; EP1331940B1; CN1473050A; KR20030061396A; BR0115190A; ES2261515T3; AU2002222513B2; CA2428176A1; JP2004513151A; HUP0400541A2; KR100822357B1; CY1106092T1; MXPA03004005A

Abstract

Opísané je použitie dlhého pentraxin PTX3 (PTX3) alebo jeho funkčných derivátov alebo domén na prípravu liečiva, ktoré inhibuje biologickú aktivitu rastového faktora FGF-2, pričom uvedené liečivo je použiteľné pri prevencii a liečbe chorôb vyvolaných zmenenou aktiváciou uvedeného rastového faktora FGF-2.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka použitia dlhého pentraxin PTX3 (PTX3) alebo použitia jedného z jeho funkčných derivátov na prípravu liečiva, ktoré inhibuje biologickú aktivitu rastového faktora FGF-2, pričom uvedené liečivo je upotrebiteľné pri prevencii a liečbe chorôb vyvolaných zmenenou aktiváciou uvedeného rastového faktora FGF-2.

Doterajší stav techniky

Do ochorení vyvolaných zmenenou aktiváciou rastového faktora FGF-2 sa zahŕňajú ochorenia vyvolané zmenenou angiogenézou a neregulovanou proliferáciou fibroblastov alebo buniek hladkého svalstva.

Henry Brem a Judath Folkman objavili ako prví v roku 1975 v chrupke zložku, ktorá mala antiangiogénnu aktivitu ((1975) J. Exp. Med. Feb.l, 141 (2), 427-39). Uvedení autori sa domnievajú, že tento objav by sa mohol použiť na reguláciu patologického procesu, ako napríklad tumorového rastu, metastázy, chronického a akútneho zápalu kĺbu a diabetickej retinopatie, a to použitím selektívnych inhibítorov patologickej neoangiogenézy.

Angiogenéza je u dospelých bežne inaktívna, zatiaľ čo napríklad pri liečbe rán alebo rekonštrukcii endometria počas ženského reprodukčného cyklu sa vyskytuje prirodzene.

Angiogénna reakcia je stimulovaná fyziologicky pri znížení vaskulámych funkcií a neadekvátnej tkanivovej perfúzii.

Okrem toho sa môže obvykle potvrdiť, že vo fyziologických podmienkach angiogenéza vytvára pozitívnu spätnú väzbu ako reakciu na neadekvátnu perfuziu alebo na redukovaný prívod kyslíka a živín, čo sa vyskytuje napríklad v prípade oklúzie artérie, pri raste tkanivovej hmoty (napríklad pri neovaskularizácii, ktorá sprevádza tvorbu svalového tkaniva); a v prípade zvýšenej záťaže pri práci v súvislosti so zvýšenou potrebou kyslíka a živín.

Dobre známou skutočnosťou je, že rast primárneho tumoru je podporovaný dobrou vaskularizáciou tumorového tkaniva. Adekvátny prívod kyslíka a živín podporuje rýchly rast samotného tumoru.

Ukázalo sa, že rozsah angiogenézy môže byť extrémne negatívnym faktorom pri prognóze novotvarov (van Hinsbergh, V. W., Collen, A., Koolwijk, P., (1999) Ann. Oncol., Suppl. 10, 4, 60-3; Buolamwini, J.K., Aug., (1999) Curr., Opin., Chem., Biol., 3(4), 500-9).

Tak isto je v odbore týkajúcom sa tumorov známe, že základné štádium v biológii tumorovej bunky je nadobudnutie schopnosti vytvárať metastázy.

Metastázujúce tumorové bunky sú schopné stratiť priľnavosť k obklopujúcim štruktúram, vnikajú do krvných a lymfatických ciev a kolonizujú ďalšie tkanivá, a to až na vzdialenosť, v ktorej môže pokračovať ich reprodukovanie.

Metastázovanie je tiež kritické v prípade klinickej anamnézy ochorenia, pretože to je hlavná príčina smrti zapríčinenej rakovinou. Veľmi úzko súvisí s, a je uľahčené, prítomnosťou vaskulámeho tkaniva v mieste tumoru alebo na priľahlých plochách.

Migrácia tumorových buniek cez priľahlé štruktúry umožňuje bunkám dosiahnuť intratumorové krvné cievy, či už existujúce alebo vytvorené neoangiogenézou, a tak preniknúť do krvného riečiska (Ray, J.M., Stetler-Stevenson, W. G.,(1994) Eur. Respir. J., 7(11), 2062-72; Stetler-Stevenson, W. G., Liotta, L. A., Kleiner, D.E, Jr., Dec. (1993) FASEB J., 7(15), 1434-41).

Existencia spojenia medzi lymfatickými a krvnými cievami vo vaskulámej oblasti tumoru umožňuje neoplastickým bunkám pohybovať sa v obidvoch vaskulámych systémoch.

Nedávne výskumy ukázali priame spojenie medzi angiogenézou a artritickým ochorením (Koch, A.E., (1998) Arthritis and Rheumatism, 41, 951-962). Predovšetkým sa ukázalo, že neovaskularizácia kĺbových chrupiek má rozhodujúcu úlohu pri tvorbe ložiska a postupe artritídy. Normálna chrupka nemá krvné cievy, zatiaľ čo synoviálna tekutina artritických pacientov obsahuje angiogenézu stimulujúci faktor produkovaný endotelovými bunkami (EASF).

Prítomnosť tohto faktora je spojená s vaskularizáciou a degradáciou chrupky.

S abnormálnou angiogenézou súvisia aj ďalšie ochorenia.

Zistilo sa, že pri diabetickej retinopatii [Oct. (1999) Histol. Histopathol., 14(4), 1287-94], psoriáze [Dec. (1999) Br. J. Dermatol., 141. (6), 1054-60], chronickom zápale a artérioskleróze [Dec. (1998) Planta Med., 64(8), 686-95] je neovaskularizácia zasiahnutých tkanív podporným faktorom.

Rastový faktor FGF-2 je 18 kDa katiónový polypeptid, ktorý je schopný indukovať aj neoangiogenézu in vivo aj proliferáciu buniek, chemotaxu a produkciu proteáz v endotelových bunkách v kultúre (Basilico and Moscatelli., (1992) Adv. Cancer Res.. 59. 115-65).

Funkcia FGF-2 v tumorovej angiogenéze je už známa (Apr. (1999) Pathol. Biol. (Paris)., 47(4), 364-7).

V J. Pathol., Sept. (1999) 189(1). 72-8 sa publikovalo, že zvýšená expresia FGF-2 u pacientov trpiacich na mezotelióm súvisí s vyššou agresivitou a vyššou mortalitou pacientov postihnutých takýmto tumorovým ochorením.

V Oncogene, Nov (1999) 18; 18(48), 6719-24 sa publikovalo, že FGF-2 umožňuje proces metastázovania v zhubných bunkách potkaneho mechúra.

V Int. J. Cancer, May (1999) 5, 81(3), 451-8 sa publikovalo, že FGF-2 má silnú mitogénnu aktivitu a je zahrnutý do vývoja tumorov u ľudí a do zvyšovania ich malignity.

Pri liečení tumorových ochorení predstavuje antiangiogénna terapia v porovnaní so štandardnou tradičnou chemoterapiou nasledovné výhody ((1998) Cancer Research) 58, 1408-16):

1. Vyššiu špecifícitu: zacielenú na tumorový neovaskularizačný proces.

2. Vyššiu disponibilitu: zacielenú na endotelové, ľahko dosiahnuteľné, bunky bez problémov spojených s tradičným chemoterapeutickým prístupom, ktorý účinkuje priamo na tumorové bunky.

3. Nepatrná chemorezistencia: toto môže byť najdôležitejšou výhodou tejto terapie; v skutočnosti ak sú endotelové bunky v porovnaní s tumorovými bunkami geneticky stabilné, je fenomén rezistencie na liečivo nepravdepodobný.

4. Nepatrné metastázovanie: blokovanie hraníc neovaskularizačného šírenia tumorových buniek do ďalších častí tela cez krvné riečisko.

5. Zvýšenú apoptózu: blokovanie vaskulámej siete v tumore znižuje dostupnosť kyslíka a živín tumorovými bunkami a týmto spôsobom je apoptóza zvýšená.

6. Redukovanú systémovú toxicitu: pri antiangiogénnej terapii nie je pozorovaný toxický vplyv, ako napríklad mielosupresia, gastrointestinálne vplyvy a prechodná alopécia, ktoré nastávajú pri tradičnej chemoterapii.

Na stanovenie týchto účinkov sa nechá FGF-2 reagovať s receptormi, patriacimi do dvoch rozdielnych receptorových tried, ktoré sú prítomné na povrchoch cieľových buniek, a to s receptormi, ktoré majú vysokú afinitu s tyrozínkinázovými aktivitami (FGFR) a receptory, ktoré majú nízku afinitu vyjadrenú pomocou proteoglykaneparansulfátu (HSOG) (Johnson and Williams, (1993) Adv. Cancer Res., 60, 1-41; Moscatelli, (1987)7. CellPhysiol. 131, 123-30).

Pre bežné bunky hladkého svalu je FGF-2 silným mitogénom a je potrebný na ich proliferáciu pri poškodení s balónikovým katétrom (Apr. (2000) J. Biol. Chem., 14, 275(15), 11270-7).

Preto ochorenia spôsobené zmenenou aktiváciou rastového faktora FGF-2 zahŕňajú tiež hyperpláziu muskulámej steny artérií, ktorá sa vyskytuje počas restenózy po angioplastike alebo „koronárnom stentovaní“ [Feb. (1977)7. Vasc. Surg., 25(2) 320-5)].

Regulácia neovaskularizácie závislej od FGF-2 predstavuje jeden zo základných prvkov regulácie a liečby ochorení spojených so zmenenou angiogenézou, rovnako ako regulácia nekontrolovanej od FGF-2 závislej proliferácie fibroblastov alebo SMC je rozhodujúca pri ošetrení cikatrizácie spojenej s nadmernou fibroblastickou reakciou a restenózou po angioplastike.

Dostupnosť novej terapeutickej zložky, ktorá špecificky inhibuje biologickú aktivitu FGF-2 predstavuje cieľ prvoradej dôležitosti pri prevencii a liečbe ochorení vyvolaných zmenenou aktiváciou tohto rastového faktora. Takéto ochorenia zahrnujú artritické ochorenie, tumor, tumorovú metastázu, diabetickú retinopatiu, psoriázu, chronický zápal, artériosklerózu, cikatrizáciu spojenú s nadmernou fibroblastickou reakciou a restenózou po angioplastike.

Pentraxín PTX3 sa exprimuje v rôznych typoch buniek (Bottazzi a kol., (1997) 7. Biol. Chem. 272, 32817-32823), predovšetkým v jednojadrových fagocytoch a endotelových bunkách, a to po expozícii so zápalovými cytokínmi interleukínom 1 β (IL-1 β) a alfa faktorom nekrózy tumoru (TNF- a).

Doteraz nie je úplne objasnená biologická funkcia PTX3.

Pentraxín PTX3 pozostáva z dvoch štruktúrnych domén, a to N-koncovej domény, ktorá nemá súvis so žiadnou známou molekulou a C-koncovej domény, ktorá sa podobá krátkym pentraxínom, ako napríklad C-reaktívnemu proteínu (CRP) (Breviario, F. a kol., (1992) 7. Biol. Chem. 267, 22190).

Vysoká miera podobnosti sa zistila medzi ľudským PTX3 (hPTX3) a živočíšnymi PTX3. Predovšetkým myšací PTX3 (mPTX3) má veľmi podobnú sekvenciu DNA, génovú organizáciu a umiestnenie shPTX3. Miera identity medzi ľudským a myšacím PTX3 génom je 82 % a dosahuje 90 %, ak sa uvážia konzervatívne substitúcie (Introna, M. a kol., (1996) Blood 87, 1862-1872). Myšací PTX3 gén je u myší umiestnený na chromozóme 3 v oblasti podobnej ľudskej 3q oblasti (q24-28), čo je v zhode s publikovaným umiestnením hPTX3 v 3q 25 oblasti (Introna, M. a kol., (1996) Blood, 87, 1862-1872).

Vysoká miera podobnosti medzi sekvenciami hPTX3 a mPTX3 je znakom vysokej miery konzervácie pentraxínov počas evolúcie (Pepys, M. B., Baltz, M. L., (1983) Adv. Immunol. 34, 141).

Prehľadné informácie o pentraxínoch sa nachádzajú v Gewurz, H. a kol., (1995) Current Opinion in Immunology, 7, 54-64.

Medzinárodná prihláška WO99/32516 podaná v mene žiadateľa opisuje použitie dlhého pentraxínu PTX3 na liečbu infekčných, zápalových a tumorových ochorení. Antitumorová aktivita, ktorú vykazuje PTX3 a opisuje ju WO99/32516, je sprostredkovaná leukocytámou požiadavkou, t. j. na imonulogických základoch. Vo WO99/32516 sa vôbec neopisuje alebo neodporúča použiť PTX3 ako prostriedok na liečbu ochorení spojených so zmenenou aktiváciou rastového faktora FGF-2.

US 5767252 opisuje neurónový rastový faktor prislúchajúci do rodiny pentraxínov (pozri tiež tam citované odkazy). Tento patent sa týka neurobiologického sektora.

Podstata vynálezu

Zistilo sa, že dlhý pentraxín PTX3 je schopný viazať FGF-2 s vysokou afinitou a špecificitou. Viazanie PTX3 s FGF-2 (K_d = 8-16 nM) zabraňuje FGF-2 viazať sa s jeho vysokoafuiitnými tyrozínkinázovými receptormi a viazať sa na mieste nízkoafmitných receptorov reprezentovaných eparánsulfátovými proteoglykánmi nachádzajúcimi sa na bunkovom povrchu. Inhibícia viazania zapríčiňuje inhibíciu biologickej aktivity FGF-2.

Interakcia medzi FGF-2/PTX3 závisí od správneho priestorového usporiadania štruktúry rastového faktora, nielen na jeho bázickom charaktere, pretože PTX3 neviaže cytochróm c (proteín, ktorý sa podieľa na molekulovej hmotnosti FGF-2 (18 kDa) a izoelektrickom bode (pH 9,6)).

Okrem toho C-reaktívny proteín, homológny s PTX3, neviaže FGF-2.

Predmetom predloženého vynálezu je preto použitie dlhého pentraxín PTX3 alebo jeho derivátov, alebo jeho domén na prípravu liečiva na prevenciu a liečbu ochorení, ktoré sú paralyzované pomocou inhibície biologickej aktivity rastového faktora FGF-2.

Predložený vynález sa ďalej týka použitia dlhého pentraxinu PTX3 alebo jeho derivátov, alebo jeho domén na prípravu liečiva na prevenciu a liečbu ochorení vyvolaných zmenenou aktiváciou rastového faktora FGF-2. Predložený vynález sa ďalej týka použitia dlhého pentraxinu PTX3 alebo jeho derivátov, alebo jeho domén na prípravu liečiva na prevenciu a liečbu ochorení vyvolaných zmenenou angiogenézou, pri ktorých je zmenená angiogenéza vyvolaná zmenenou aktiváciou rastového faktora FGF-2, pričom uvedenými ochoreniami sú napríklad: artritické ochorenie, tumorová metastáza, diabetická retinopatia, psoriáza, chronický zápal, artérioskleróza alebo tumor, ako napríklad sarkóm, karcinóm, karcinoid, kostný tumor alebo neuroendokrinný tumor.

Predložený vynález sa ďalej týka použitia dlhého pentraxinu PTX3 alebo jeho derivátov, alebo jeho domén na prípravu liečiva na prevenciu a liečbu ochorení spojených s nekontrolovanou, od FGF-2 závislou, proliferáciou fibroblastov alebo buniek hladkého svalstva, napríklad ako cikatrizáciou spojenou s nadmernou fibroblastickou reakciou a restenózou po angioplastike.

Zložka podľa tohto vynálezu sa dá použiť na inhibíciu FGF-2 aktivity v cieľových bunkách nielen vtedy, keď je aplikovaná ako rekombinantný proteín, ale tiež vtedy, keď je aplikovaná endogénne génovým transferom j ej cDNA.

Predložený vynález sa ďalej preto týka použitia úplnej dĺžky cDNA ľudského PTX3 alebo jeho derivátov, alebo jeho domén na konštrukciu plazmidových alebo vírusových expresných vektorov, zahrnujúcich uvedenú cDNA, na génovú terapiu ochorení zapríčinených zmenenou aktiváciou rastového faktora FGF-2, pričom uvedenými ochoreniami sú napríklad: tumor, tumorová metastáza, cikatrizácia spojená s nadmernou fibroblastickou reakciou alebo restenózou po angioplastike.

Za „dlhý pentraxín PTX3“ sa považuje ktorýkoľvek dlhý pentraxín PTX3, a to nezávisle od toho, či je prirodzeného pôvodu (ľudský alebo živočíšny) alebo syntetický.

Derivátmi sú akékoľvek funkčné analógy dlhého pentraxín PTX3, ako sa uviedlo, ktoré poskytujú prinajmenšom mutáciu, a to pri udržiavaní svojej funkčnej kapacity selektívne inhibovať FGF-2.

Výhodný dlhý pentraxín PTX3 je ľudský PTX3, ktorého sekvencia je opísaná vo WO99/32516.

Dlhý pentraxín PTX3 opísaný v tomto dokumente sa môže tiež použiť pri liečbe tumorových ochorení, v kombinácii s jedným alebo viacerými protirakovinovými liečivami, pri ktorých zvýšená expresia FGF-2 vyvoláva vyššiu agresivitu tumorového ochorenia alebo vyššiu schopnosť metastázovania.

V skutočnosti je dobre známe, že na to, aby sa obišli nežiaduce vedľajšie účinky pri udržaní rovnakej terapeutickej účinnosti sa väčšina onkologických pacientov lieči nielen s jedným protirakovinovým liečivom, ale používa sa aj kombinácia niekoľkých protirakovinových prostriedkov alebo kombinácia protirakovinových prostriedkov v spojení s antiangiogénnymi zložkami.

Navyše mechanizmus účinku protirakovinových liečiv je úplne odlišný od mechanizmu účinku zložky podľa tohto vynálezu, pretože bežné protirakovinové liečivá pôsobia cytotoxicky na tumorové bunky.

Zložka podľa predloženého vynálezu, ktorá má odlišný mechanizmus účinku, napomáha liečebnému účinku (ako adjuvans) spolu s protirakovinovým liečivom, s ktorým je spojená.

Ďalším predmetom vynálezu, ktorý je opísaný v tomto dokumente, je preto kombinácia dlhého pentraxín PTX3 s jedným alebo viacerými známymi protirakovinovými liečivami.

Vynález opísaný v tomto dokumente sa ďalej týka farmaceutickej kompozície obsahujúcej dlhý pentraxin PTX3, v kombinácii s jedným alebo viacerými liečivami, ako napríklad alkylačnými činidlami, inhibítormi topoizomerázy, antitubulínovými činidlami, interkalačnými zložkami, antimetabolitmi, prírodnými produktmi ako napríklad „vinea“ alkaloidmi, epipodofylotoxínmi, antibiotikami, enzýmami, taxónmi a cytodiferenčnými zložkami a jednou alebo viacerými farmakologicky dostupnými pomocnými látkami alebo vehikulami.

Vynález opísaný v tomto dokumente sa ďalej týka použitia dlhého pentraxinu PTX3, v kombinácii s jednou alebo viacerými známymi protirakovinovými zložkami, na preparáciu liečiva určeného na liečbu tumoru, v ktorom zvýšená expresia FGF-2 vyvoláva vyššiu agresivitu tumoru.

Vynález opísaný v tomto dokumente sa ďalej týka použitia dlhého pentraxinu PTX3, v kombinácii s jednou alebo viacerými známymi protirakovinovými zložkami, na prípravu liečiva určeného na prevenciu nástupu tumorovej metastázy, pri ktorej zvýšená expresia FGF-2 vyvoláva vyššiu schopnosť metastázovania.

Predmetom vynálezu opísaného v tomto dokumente je ďalej použitie dlhého pentraxinu PTX3, v kombinácii s protirakovinovými zložkami, na prípravu liečiva určeného na liečbu tumoru, pričom dlhý pentraxin PTX3 je prítomný ako adjuvans protirakovinovej zložky.

Tento vynález je v ďalšom ilustrovaný pomocou nasledovných príkladov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Schopnosť PTX3 viazať FGF v roztoku

Tento pokus sa uskutočnil s cieľom vyhodnotiť viazanie PTX3 s FGF-2. Pentraxin PTX3 sa produkoval podľa opisu v publikácii Bottazzi a kol., (1977) J. Biol. Chem. 272, 32817-32823. Ľudský rekombinantný FGF-2 sa produkoval podľa opisu v publikácii Isacchi, A. a kol., Proc Natl. Acad. Sci. USA 88, 2628-32. V prípade potreby sa FGF-2 označil pomocou ^l25I metódou, ktorú opísal Isacchi a kol. (pozri ďalší text). Experimentálny postup

Na chromatografovanie 100 μΐ PBS obsahujúcich lgg FGF-2 (alebo alternatívne 1 gg PTX3) sa použila kvapalinová vylučovacia chromatografia na kolóne Superose 12 (Pharmacia) s naviazaným proteínom; táto kolóna je schopná separovať proteíny na základe ich molekulovej hmotnosti. Kolóna sa eluovala s PBS pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min., odoberali sa 1 ml frakcie a analyzovali sa pomocou bodovej hybridizácie (dot blot) so špecifickými protilátkami pre dva proteíny. Na vyhodnotenie viazania PTX3 s FGF-2 sa dva proteíny (5 gg a 1 gg) zmiešali v 100 gl PBS a inkubovali sa pred nanesením na kolónu pri 4 °C 10 minút. Frakcie sa zbierali a analyzovali pomocou bodovej hybridizácie s anti FGF-2 špecifickými protilátkami. Z výsledkov, ktoré sú uvedené na obrázku 1 vyplýva, že FGF-2 (18000 D) sa eluuje z kolóny s retenčným objemom asi 22 ml. V rovnakých podmienkach sa PTX3 (450000 D) eluuje s vyprázdňovacím objemom kolóny (7 ml). Keď sa FGF-2 vopred inkuboval 10 minút pri 4 °C pred nanesením na kolónu, pozoroval sa zmenený chromatografický priebeh: v takýchto experimentálnych podmienkach sa FGF-2 eluoval z kolóny s retenčným objemom, ktorý bol ekvivalentný samotnému PTX3.

Príklad 2

Schopnosť biotinylovaného PTX3 viazať na plast imobilizovaný FGF-2

Na 96 jamkových plastových platniach sa pri 4 °C inkubovalo počas 18 hodín 100 gl NaHCO₃, pH 9,6 obsahujúcich 500 ng FGF-2 alebo komplement komponentu Clq. Po skončení inkubácie sa jamky trikrát premyli PBS a potom sa inkubovali 2 hodiny pri teplote miestnosti s 200 gl PBS obsahujúcimi 1 mg/ml hovädzieho sérumalbumínu (BSA). Po skončení inkubácie sa jamky opäť trikrát premyli PBS a inkubovali s 30 ng/ml ¹²⁵I-FGF-2 v prítomnosti narastajúcich množstiev biotinylovaného PTX3 v 100 gl PBS (2 hodiny pri teplote miestnosti). Alternatívne sa v jamkách adsorbovali narastajúce dávky FGF-2 alebo Clq a inkubovali sa so 100 ng/ml biotinylovaného PTX3 v 100 gl PBS. Po tejto inkubácii sa jamky trikrát premyli PBS a inkubovali 1 hodinu pri teplote miestnosti so 100 gl streptavidínového HRP konjugátu (1/2000). Reakcia sa vyvolala prídavkom chromogénového peroxidázového substrátového systému pre mikrojamky ABTS (Kirkegaard & Perry Laboratories). Platne sa snímkovali v automatickom ELISA snímači pri 405 nm. Výsledky sú uvedené na obrázku 2 a poukazujú na to, že FGF-2 imobilizovaný na plastových jamkách je schopný viazať biotinylovaný PTX3 spôsobom podobným fyziologickému PTX3 ligandu Clq (Bottazzi, B. a kol., (1977) J. Biol. Chem. 272, 32817-32823).

Príklad 3

Charakterizácia interakcií PTX3 - FGF-2

Na 96 jamkovú platňu sa pri 4 °C nanieslo 100 μΐ NaHCO₃ (pH 9,6) obsahujúcich PTX3 alebo C-reaktívny proteín (200 nM) alebo alternatívne 2 pg/ml nasledovných proteínov použitých ako negatívna kontrola: hovädzí sérumalbumín, fibronektín, želatína alebo laminín. Po inkubácii sa jamky premyli trikrát PBS a blokovali 2 hodiny pri teplote miestnosti pomocou 200 μΐ 1 mg/ml BSA v PBS. Po skončení inkubácie sa jamky trikrát premyli PBS a potom sa inkubovali s 30 ng ¹²⁵I-FGF-2 pri teplote miestnosti 2 hodiny. Jamky sa potom trikrát premyli PBS a viazaný ^l25I-FGF-2 sa získal tak, že každá jamka sa dvakrát premyla 200 μΐ 2 % SDS vo vode. Množstvá ¹²⁵I-FGF-2 sa merali v gama počítači. Výsledky, ktoré sú uvedené na obrázku 3 poukazujú na to, že FGF-2 viaže PTX3 imobilizovaný na plast, a že toto viazanie je špecifické, pretože FGF-2 reaguje slabo s CRP a nereaguje s inými imobilizovanými proteínmi.

Príklad 4

Viazanie ^l25I-FGF-2 s PTX3 imobilizovaným na plast v prítomnosti nadbytku neaktívneho FGF-2

Ďalšia séria pokusov na testovanie viazania ¹²⁵I-FGF-2 s PTX3 imobilizovaným na plast sa uskutočnila v prítomnosti nadbytku oboch, natívneho alebo tepelne denaturovaného neaktívneho FGF-2 (100 nM), a to v prítomnosti rovnakých koncentrácií cytochrómu c alebo v prítomnosti nadbytku rozpusteného PTX3 (300nM). Pokus sa vykonal podľa uvedeného opisu. Výsledky sú uvedené na obrázku 4 a poukazujú na to, že neaktívny FGF-2 a rozpustený PTX3 inhibujú interakciu medzi ¹²⁵I-FGF-2 a PTX3 imobilizovaným na plast. Zistenie, že tepelne inaktivovaný FGF-2 acytochrómc (majúci rovnakú molekulovú hmotnosť a izoelektrický bod ako FGF-2) nie sú schopné viazať PTX3 naznačujú, že správna konformácia rastového faktora ovplyvňuje schopnosť viazať PTX3 viac ako jeho bázický charakter.

Príklad 5

Disociačná konštanta (Kd) pre interakciu FGF-2 / PTX3

Týmto pokusom sa stanovila disociačná konštanta (Kd) pre interakciu FGF-2 / PTX3. Uskutočnilo sa to tak, že narastajúce dávky ¹²⁵I-FGF-2 sa inkubovali s PTX3 imobilizovaným na plast a väzbové výsledky sa analyzovali pomocou Scatchardovho diagramu. Výsledky sú uvedené na obrázku 5 a poukazujú na to, že FGF-2 viaže PTX3 nasýtiteľným spôsobom a so zvýšenou afinitou (Kd = 8-16 nM). Táto afinita je rovnaká ako afinita predbežne vypočítaná pre interakciu PTX3 s jeho fyziologickým ligandom C lq.

Príklad 6

Vplyv PTX3 na viazanie FGF-2 s endotelovými bunkami

Transformované fetálne hovädzie aortálne endotelové bunky GM7373 sa naočkovali v množstve 80000 buniek/cm² do 24-jamkových misiek s Eagle minimálnym esenciálnym médiom (Eagle MEM) obsahujúcim 10 % FCS. Po 24 hodinách pri 37 °C sa adherentné bunky dvakrát premyli Eagle MEM bez FCS a potom inkubovali 2 hodiny pri 4 °C s ¹²⁵I-FGF-2 (10 ng/ml) v Eagle MEM obsahujúcom 0,15 % želatíny a 20 nM HEPES (pH 7,5) bez alebo v prítomnosti narastajúcich koncentrácií PTX3. Po skončení inkubácie sa množstvo ^l25I-FGF-2 naviazané na nízkoafinitné (HSPG) a vysokoafmitné receptory (FGFR) vyhodnotilo podľa Moscatelliho (J. Celí Physiol. (1987) 131, 123-30). Stručne, bunky sa premyli dvakrát s 2 M NaCl v 20 nM tlmivom roztoku HEPES (pH7,5), aby sa odstránil ¹²⁵I-FGF-2 naviazaný na nízkoafinitné väzbové miesta a dvakrát s 2 M NaCl v 20 mM acetáte sodnom (pH 4,0), aby sa odstránil ¹²⁵I-FGF-2 naviazaný na vysokoafinitné väzbové miesta. Nešpecifické viazanie sa meralo v prítomnosti 100-násobného molámeho nadbytku neoznačeného FGF-2 a odpočítalo od celkových hodnôt. Výsledky, ktoré sú uvedené na obrázku 6 poukazujú na to, že PTX3 je schopný inhibovať viazanie FGF-2 s jeho vysokoaŕmitnými a nízkoafinitnými receptormi na endotelových bunkách, a to dávkovo závislým spôsobom.

Príklad 7

Vplyv PTX3 na mitogénnu aktivitu použitím vplyvu FGF-2 na endotelové bunky

Bunky GM7373 sa naočkovali v množstve 75000 buniek/cm² do 48-jamkových platní s Eagle MEM obsahujúcim 10 % FCS. Po 24 hodinách pri 37 °C sa adherentné bunky dvakrát premyli Eagle MEM bez FCS a potom inkubovali 24 hodín pri 37 “C s Eagle MEM obsahujúcom 0,4 % FCS bez alebo v prítomnosti narastajúcich koncentrácií FGF-2 (10 ng/ml) a narastajúcich koncentrácií PTX3. Po skončení inkubácie sa na bunky pôsobilo trypsínom a bunky sa spočítali. V inom usporiadaní pokusov sa bunky GM7373 spracovali podľa uvedeného opisu v prítomností rôznych mitogénnych stimulátorov: 10% FCS; 5 pg/ml diacylglycerolu (DAG); 10 ng/ml forbolesteru (TPA); 30 ng/ml epidermálneho rastového faktora (EGF) alebo 30 ng/ml vaskulámeho endotelového rastového faktora (VEGF). Výsledky, ktoré sú uvedené na obrázku 7 poukazujú na to, že PTX3 inhibuje mitogénnu aktivitu vyvolanú na endotelových bunkách pomocou FGF-2 dávkovo závislým spôsobom s ID₅₀ rovnajúcim sa 30 nM. Táto hodnota je rovnaká ako Kd vypočítaná pre interakciu FGF-2- PTX3. Tieto výsledky naznačujú, že inhibícia biologickej aktivity FGF-2 pomocou PTX3 je zapríčinená jeho sekvestráciou na extracelulámych miestach. Inhibičná aktivita PTX3 na FGF-2 je špecifická, pretože sa nedá detegovať vtedy, ak sú použité ďalšie mitogény na indukovanie celulámej proliferácie.

Príklad 8

Vplyv PTX3 na proliferáciu transformovaných fetálnych hovädzích aortálnych endotelových buniek

V tomto pokuse sme skúmali vplyv PTX3 na proliferáciu myšacej aortálnej endotelovej bunkovej línie MAE3F2T stabilne transfekovanej s expresným vektorom kódujúcim FGF-2 (Gualandris a kol., (1996) Celí Growth Diff. 7, 147-60). Tieto bunky môžu proliferovať ako reakcia na autokrinný cyklus stimulácie indukovanej endogénnym FGF-2 (Gualandris a kol. (1966) Celí Growth Diff. 7, 147-60). Bunky MAE3F2T sa naočkovali v množstve 10000 buniek/cm² do 48 jamkových platní s Dulbecco médiom (DMEM) pridanom s 10 % FCS. Po 24 hodinách pri 37 °C sa adherentné bunky dvakrát premyli DMEM s FCS alebo bez FCS a potom inkubovali 72 hodín pri 37 “C v DMEM obsahujúcom 0,4 % FCS v prítomnosti alebo neprítomnosti PTX3 (70 nM), anti FGF-2 špecifických protilátok alebo suramínu (50 pg/ml). O suramíne je známe, že má schopnosť sekvestrovať extracelulámy FGF-2 a inhibovať jeho biologické aktivity (Rusnati a kol., (1966) J. Mol. Celí. 7, 369-381). Po skončení inkubácie sa na bunky pôsobilo trypsínom a bunky sa spočítali v Burkerovej komôrke. Výsledky, ktoré sú uvedené na obrázku 8 poukazujú na to, že PTX3 je schopný blokovať autokrinný cyklus stimulácie indukovanej endogénnym FGF-2 v MAE3F2T bunkách, a to inhibovaním ich proliferácie, závislej od FGF-2, rovnakým spôsobom, ako ktorý vyvolávajú anti FGF-2 protilátky a suramín.

Príklad 9

Vplyv PTX3 na neovaskularizáciu indukovanú in vivo pomocou FGF-2

Antiangiogénny potenciál PTX3 sa vyhodnotil in vivo pomocou skúšky na kuracej embryonálnej chorioalantoickej membráne (CAM). Stručne sa to dá opísať tak, že na vajcovej škrupine 3-dňových oplodnených vajíčok sa vytvoril otvor. Na ôsmy deň sa na CAM membrány implantovali želatínové tampóny a na ne sa adsorbovalo 10 μΐ PBS samotného alebo obsahujúceho FGF-2 (500 ng/tampón) v neprítomnosti alebo v prítomnosti PTX3 (5 pg/tampón) (5-6 embryí na skupinu). Po 4 dňoch sa CAM membrány skúmali in ovo pod Zeiss SR stereomikroskopom a pozorovanie vyhodnotili dvaja výskumníci bez vedomosti o testovanej vzorke a klasifikovali sa subjektívnou stupnicou od 0 do 4, pričom 0 predstavuje stav bez angiogénnej reakcie a 4+ predstavuje najsilnejšiu aktivitu. Výsledky, ktoré sú uvedené na obrázku 9, poukazujú na to, že PTX3 je schopný blokovať neovaskularizáciu indukovanú in vivo pomocou FGF-2.

Príklad 10

Génová terapia pomocou PTX3

Myšacie endotelové bunky nadmerne exprimujúce FGF-2, označené ako FGF2MAE3F2T (Gualandris a kol. (1966) Celí Growth Diff. 7, 147-60), sa transfekovali ľudským PTX3, a to úplnou dĺžkou cDNA subklonovanej do komerčného expresného vektora pLXSH (Clontech).

Na získaných transfekovaných bunkových líniách sa uskutočnili výskumy in vitro, aby sa zistil vplyv nadmernej expresie PTX3 na proliferáciu FGF2MAE3F2T buniek, závislej od FGF-2 a ich invazívne správanie na trojrozmerných fibrínových géloch.

Podrobne, príslušné FGF2MAE3F2T klony exprimujúce rôzne množstvá PTX3 a rodičovské FGF2MAE3F2T bunky (ktoré neprodukujú PTX3) sa naočkovali v množstve 10000 buniek/cm² do 48-jamkových platní s Dulbecco médiom (DMEM) pridaným s 10 % FCS. Po 24 hodinách pri 37 °C sa adherentné bunky dvakrát premyli DMEM bez FCS a potom inkubovali počas rôznych časových intervalov pri 37 °C v DMEM obsahujúcom 0,4 % FCS. Po skončení inkubácií sa na bunky pôsobilo trypsínom a bunky sa spočítali v Burkerovej komôrke. Výsledky, ktoré sú uvedené na obrázku 10 poukazujú na to, že nadmerná expresia PTX3 inhibuje proliferáciu buniek FGF2MAE3F2T, pričom rozsah tejto inhibície koreluje s množstvom PTX3 produkovaným rôznymi testovanými klonmi.

Na vyhodnotenie invazívneho správania FGF2MAE3F2T klonov, nadmerne exprimujúcich PTX3 na trojrozmerných fibrínových géloch, sa pripravili bunkové agregáty na platniach s nanesenou agarózou presne podľa opisu uvedenom v Gualandris a kol., (1966) Celí Growth Diff. 7, 147-60. Tieto agregáty sa naočkovali na 48 jamkové platne s naneseným fibrínom. Ihneď po naočkovaní sa 250 μΐ média, ktoré neobsahuje vápnik, ale obsahuje fibrinogén (2,5 mg/ml) a trombín (250 mU/ml), pridalo do každej jamky a nechalo 5 minút pri 37 °C stuhnúť. Vo všetkých pokusoch sa do gélu a do kultivačného média pridal fibrinolytický inhibítor trasylol na 200 KlU/ml, aby sa zabránilo disolúcii substrátu. Vytvorenie radiálne narastajúcich bunkových výhonkov sa vyhodnotilo po 2 dňoch počítačovou analýzou obrazu.

Výsledky, ktoré sú uvedené na obrázku 11 poukazujú na to, že invazívna schopnosť klonov FGF2MAE3F2T nadmerne exprimujúcich PTX3 je signifikantne nižšia v porovnaní s pôvodnými FGF2MAE3F2T bunkami.

Získané výsledky poukazujú na to, že PTX3 inhibuje aktivitu FGF-2 v endotelových bunkách, ak je endogénne produkovaný po génovom transfere jeho cDNA.

Zložka podľa tohto vynálezu sa teda môže použiť v protokoloch génovej terapie v súlade so známymi metódami (Jan - Feb (1998) In Vivo, 12(1), 59-67; Jan - Feb (1998) In Vivo, 12(1), 35-41; Nov - Dec (1994) In Vivo, 8(5), 771-80) na liečbu ochorení zapríčinených zmenenou aktiváciou rastového faktora FGF-2.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie dlhého petraxinu PTX3 alebo jeho funkčného derivátu, alebo jeho domény na prípravu liečiva na prevenciu a liečbu ochorení spôsobených neregulovanou proliferáciou fibroblastov alebo buniek hladkého svalstva, pričom spomínané ochorenie je vybrané zo skupiny zahrnujúcej cikatrizáciu spojenú s nadmernou fibroblastickou reakciou a restenózu po angioplastike; ďalej na prevenciu a liečbu ochorení spôsobených zmenenou angiogenézou, pričom spomínané ochorenie je vybrané zo skupiny zahrnujúcej diabetickú retinopatiu a aterosklerózu.
2. Použitie podľa nároku 1,vyznačujúce sa tým, že dlhý petraxin PTX3 je PTX3 prírodného pôvodu.
3. Použitie podľa nároku 2, vyznačujúce sa tým, že dlhý pentraxin PTX3 je ľudský PTX3.
4. Použitie podľa nároku 1,vyznačujúce sa tým, že dlhý pentraxin PTX3 je PTX3 syntetického pôvodu.
5. Použitie cDNA, ktorá kóduje dlhý pentraxin PTX3 alebo jeho funkčný derivát, alebo jeho doménu, na konštruovanie expresných vektorov obsahujúcich uvedenú cDNA, na génovú terapiu ochorení spôsobených nekontrolovanou proliferáciou fibroblastov alebo buniek hladkého svalstva, pričom ochorenie je vybrané zo skupiny zahrnujúcej cikatrizáciu spojenú s nadmernou fibroblastickou reakciou a restenózu po angioplastike; na génovú terapiu ochorení spôsobených zmenenou angiogenézou, pričom ochorenie je vybrané zo skupiny zahrnujúcej diabetickú retinopatiu a aterosklerózu.
6. Použitie podľa nároku 5, vyznačujúce sa tým, že uvedená cDNA obsahujúca gén kódujúci PTX3 alebo jeho derivát je prenášaná pomocou plazmidového alebo vírusového vektora.