JP4993834B2 - 細胞増殖および血管形成の調節物質、その使用方法および特定方法 - Google Patents

細胞増殖および血管形成の調節物質、その使用方法および特定方法 Download PDF

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Description

【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子／散布因子（ＨＧＦ／ＳＦ）活性、またはＨＧＦ／ＳＦ活性を抑制する特性を有するペプチドおよび小分子化合物の種々の使用に関する。前記化合物は、その活性の中でとりわけ細胞増殖の調節が所望される症状および疾患の治療に潜在的有用性を有する。前記化合物を特定する方法もまた開示される。
【０００２】
【従来技術】
散布因子（scatter factor）（ＳＦ；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）としても知られている、以下ではＨＧＦ／ＳＦと称し同様に略記する）は、細胞増殖、細胞運動性、形態発生および血管形成を刺激する多形質発現性増殖因子である。ＨＧＦ／ＳＦは、活性をもたないモノマー（〜１００ｋＤａ）として産生され、これはタンパク質分解によりその活性形に変換される。活性なＨＧＦ／ＳＦは、ヘパリン結合ヘテロダイマータンパク質で、６２ｋＤａのα鎖および３４ｋＤａのβ鎖で構成されている。ＨＧＦ／ＳＦは肝実質、上皮および内皮細胞の強力なマイトジェンである（k. Matsumoto and T. Nakamura, 1997, Hepatocyte growth factor (HGF) as a tissue organizer for organogenesis and regeneration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 239:639-44; P. Boros and C.M. Mikker, 1995, Hepatocyte growth factor: a multifunctional cytokine. Lancet 345:293-5）。
【０００３】
前記は内皮細胞の増殖を刺激し、さらにまた内皮細胞死に抗する生存因子としても機能する（R. Morishita, S. Nakamura, Y. Nakamura, M. Aoki, A. Moriguchi, I. Kida, Y. Yo, K. Matsumoto, T. Nakamura, J. Higaki, T. Ogihara, 1997, Potential role of an endothelium-specific growth factor, hepatocyte growth factor, on endothelial damage in diabetes. Diabetes 46:138-42）。血管の平滑筋細胞によって合成され分泌されたＨＧＦ／ＳＦは、内皮細胞の増殖、遊走および毛細管様の管への分化をin vitroで刺激する（D.S. Grant, H.K. Kleinman, I.D. Goldberg, M.M. Bhargava, B.J. Nickoloff, J.L. Kinsella, P. Polverini, E.M. Rosen, 1993, Scatter factor induces blood vessel formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1937-41; R. Morishita, S. Nakamura, S. Hayashi, Y. Taniyama, A. Moriguchi, T. Nagano, M. Taiji, H. Noguchi, S. Takeshita, K. Matsumoto, T. Nakamura, J. Higaki, T. Ogihara, 1999, Therapeutic angiogenesis induced by human recombinat hepatocyte growth factor in rabbit hind limb ischemia model as cytokine supplement therapy. Hypertension 33:1397-84）。
【０００４】
マウス皮下組織およびラット角膜内のＨＧＦ／ＳＦ含有移植物は、周囲組織から新生血管の成長を誘導する。ＨＧＦ／ＳＦタンパク質は、新生血管形成部位（腫瘍内の同部位を含む）で発現する（M. Jeffers, S. Rongs, G.F. Woude, 1996, Hepatocyte growth factor/scatter factor-Met signaling in tumorigenecity and invasion/metastasis. J. Mol. Med. 74:505-13; T. Moriyama, H. Kataoka, M. Koono, S. Wakisaka, 1999, Expression of hepaocyte growth factor/scatter factor and its receptor c-met in brain tumors: evidence for a role in progression of astrocytic tumors Int. J. Mol. Med.3:531-6）。これらの発見は、ＨＧＦ／ＳＦは、生理的および病的状態下で血管の形成および修復に重要な役割を果たすことを示唆している。血管形成タンパク質についての更なる考察は、米国特許第6,011,009号および同5,997,868号で見出すことができる（前記両文献は参照により本明細書に含まれる）。
【０００５】
外因的に供給される治療薬による細胞増殖の調節は、細胞増殖の制限または反対に細胞の過剰増殖が病気の原因であるか、または少なくとも病的状態からホメオスタシスへの復帰の遅れが原因である種々の症状および疾患の予防および／または治療の新規なアプローチとして供された。例えば、創傷治癒の持続、慢性心虚血もしくは心筋梗塞の結果としての心筋灌流の正常化、血管塞栓後または虚血組織もしくは器官への二次的血管発生の進行または増強、および移植組織、器官もしくは創傷治癒の血管形成は、細胞増殖、特に血管細胞の増殖を促進することによって加速することができる。
異常または過剰な細胞増殖が病気の原因である他の事例では、例えば異常増殖疾患（癌、炎症性関節および皮膚疾患（例えば慢性関節リウマチ）および糖尿病性網膜症の結果としての眼の新血管形成を含む）では、細胞増殖の抑制は前記の症状および他の症状の治療において所望される目標である。どちらの場合でも、増殖を促進または抑制する治療は局所的および一定の持続期間については有益であるが、全身的には有益ではなく、増殖調節治療は適切に適用する必要がある。
【０００６】
同時係属中の特許出願第09/606,628号（2000年6月29日出願、この文献は参照により本明細書に含まれる）では、ＨＧＦ／ＳＦ様活性および特に血管形成活性をもつペプチド類似物質が、他の薬剤、特に細胞増殖（特に血管形成）を抑制するＨＧＦ／ＳＦ拮抗ペプチドとともに記載された。そのようなペプチドは、血管の増殖を含む細胞増殖の調節が治療として有益な上記のような疾患、例えば炎症性疾患、癌、新生血管形成、心虚血、創傷治癒および他の症状の治療で有用である。さらにまた、同時係属中の仮出願第60/276,170号（2001年3月15日出願、この文献もまた参照により本明細書に含まれる）は、ＨＧＦ／ＳＦ様活性または拮抗活性をもち、上記と同じように使用される種々の小分子化合物を記載している。
本発明の目的は、ＨＧＦ／ＳＦ活性をもつペプチドおよび有機小分子、またはＨＧＦ／ＳＦ活性を抑制する物質の特定、並びにそのような活性分子の特定および製造方法である。
本明細書のいずれの引用文献も、本出願の先行技術として利用できるものと考えるべきではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
その明瞭な特徴の１つにおいて、本発明は、肝細胞増殖因子／散布因子（ＨＧＦ／ＳＦ）が治療的に有用な役割を有するか、または内因性ＨＧＦ／ＳＦの活性の抑制または停止が所望される多数の症状または疾患のいずれかの治療を目的としてＨＧＦ／ＳＦ活性を調節する方法を目的とする。前記調節は、哺乳類に本発明の化合物を所望の成果を達成するために有効な量で投与することによって達成される。ある実施態様では、本発明の化合物は、ＨＧＦ／ＳＦレセプター、ｃ−ｍｅｔの活性を調節する。さらに別の実施態様では、本発明の化合物はｃ−ｍｅｔと結合する。
【０００８】
ＨＧＦ／ＳＦ活性が所望される事例では、本発明のある種の化合物は、ＨＧＦ／ＳＦの生物学的活性を模倣するかまたは作動させることが見出され、したがってそれらは、ＨＧＦ／ＳＦの活性の中でとりわけ、例えば細胞増殖または血管増殖が所望される症状または疾患の治療で有用である。前記の症状または疾患には、肝臓疾患、腎臓疾患、骨再生、毛髪の成長、創傷もしくは組織の治癒促進、または虚血組織（例えば心筋梗塞後の心臓）への血流の増強もしくは回復が含まれる。前記化合物は、全身的または局所的に特定の組織もしくは器官に投与され、それによって所望の全身的または局所的効果を達成することができる。前記所望の活性にはまた、内皮細胞の増殖誘発、抗アポトーシス活性の誘発、散布活性の誘発、または前述の活性の任意の組合せが含まれる。好ましい実施態様では、前記活性のいずれか１つが、外因性ｃ−ｍｅｔレセプターの存在下で本発明の化合物によって低下または抑制される。
【０００９】
別の特徴では、本発明は、細胞増殖促進薬および特にペプチド薬剤を目的とし、前記薬剤は、ＨＧＦ／ＳＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と結合する能力および１つまたは２つ以上のin vitroおよび／またはin vivoアッセイで細胞増殖性活性を示す能力を特徴とする。前記薬剤は、さらにｃ−ｍｅｔ（ＨＧＦ／ＳＦレセプター）を作動させる特性を示すことができる。ある実施態様では、細胞の増殖は内皮細胞の増殖および血管形成を含む。非限定的な例を挙げれば、前記薬剤は小分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質、例えばペプチドＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹ（配列番号：１）およびＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨ（配列番号：２）、またはそれらの保存的置換変種であろう。血管形成性ペプチドはさらに、それと共役させた硫酸ヘパリン結合ペプチド、例えばＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ（配列番号：７）またはその保存的置換変種を含むことができる。前記共役物の非限定例を挙げれば、ＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ（配列番号：９）、ＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ（配列番号：１０）、およびそれらの保存的置換変種が含まれる。本発明はさらに、前述の薬剤および前記ペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を目的とする。
【００１０】
本発明のさらに別の特徴では、細胞の増殖を促進する方法が提供される。前記方法は、細胞または組織をＨＧＦ／ＳＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と結合する能力および１つまたは２つ以上のin vitroおよび／またはin vivoアッセイで増殖促進活性を示す能力を特徴とする薬剤の増殖促進有効量と接触させることを含む。前記薬剤はさらにｃ−ｍｅｔ（ＨＧＦ／ＳＦレセプター）を作動させる特性を示すことができる。前記細胞または組織はｃ−ｍｅｔレセプター発現特性を示すことができる。ある実施態様では、前記増殖促進活性は血管形成である。非限定的な例を挙げれば、前記薬剤は、小分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質、例えばペプチドＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹ（配列番号：１）およびＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨ（配列番号：２）、またはそれらの保存的置換変種であろう。増殖促進ペプチドはさらに、それと共役させた硫酸ヘパリン結合ペプチド、例えばＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ（配列番号：７）またはその保存的置換変種を含むことができる。前記共役物の非限定例を挙げれば、ＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ（配列番号：９）、ＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ（配列番号：１０）、およびそれらの保存的置換変種が含まれる。前記細胞または組織は、例えば移植された組織または器官（例えば皮膚、心臓、血管組織もしくは腎臓）、または虚血器官（例えば心筋梗塞もしくはアンギナ後の心臓）、創傷、外科的処置によって損傷を受けた組織もしくは器官、血管組織、神経組織、創傷、潰瘍などであろう。非限定的な例を挙げれば、前記細胞は、上皮細胞、内皮細胞および平滑筋細胞、並びにそのような細胞を含む組織および器官であろう。神経組織、歯およびｃ−ｍｅｔレセプターを含む他の組織の増殖および／または再生の促進もこれに包含される。治療方法には、本発明の薬剤、本発明の薬剤を含む医薬組成物の適用、本発明の薬剤を含むタンパク質を発現させるために内在性細胞にトランスフェクトする遺伝子治療、または本発明の薬剤を分泌する細胞の移植が含まれる。
【００１１】
本発明の別の特徴では、組織の血管新生を促進する方法が提供される。前記方法は、ＨＧＦ／ＳＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と結合する能力および１つまたは２つ以上のin vitroおよび／またはin vivoアッセイで血管形成活性を示す能力を特徴とする薬剤の増殖促進有効量と組織を接触させることを含む。前記薬剤はさらにｃ−ｍｅｔ（ＨＧＦ／ＳＦレセプター）を作動させる特性を示すことができる。非限定的な例を挙げれば、前記薬剤は、小分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質、例えばペプチドＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹ（配列番号：１）およびＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨ（配列番号：２）、またはそれらの保存的置換変種であろう。血管形成ペプチドはさらに、それと共役させた硫酸ヘパリン結合ペプチド、例えばＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ（配列番号：７）またはその保存的置換変種を含むことができる。前記共役物の非限定例を挙げれば、ＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ（配列番号：９）、ＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ（配列番号：１０）、およびそれらの保存的置換変種が含まれる。前記細胞または組織は、例えば移植された組織または器官（例えば皮膚、心臓、血管組織もしくは腎臓）、虚血器官（例えば心筋梗塞もしくはアンギナ後の心臓）、創傷、外科的措置によって損傷を受けた組織もしくは器官、創傷、潰瘍などであろう。薬剤デリバリーの手段は上記で述べたとおりである。
【００１２】
さらに別の実施態様では、本発明の増殖促進ペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチド（前記ポリヌクレオチドをコードするベクターを含む）が、前記ベクターを含み前記ペプチドを発現する微生物および細胞と併せて開示される。前記ポリヌクレオチド配列の治療的な使用（裸のＤＮＡ、ウイルスベクターなどによる遺伝子治療を含む）および、とりわけ上記のいずれかの目的のために本発明の薬剤を発現させるために細胞をトランスフェクトする他の手段はこれに包含される。
【００１３】
さらにまた別の実施態様では、本発明は、以下の工程を実施することによって増殖促進薬剤を特定する方法を目的とする：ａ）候補薬剤を提供し；ｂ）ＨＧＦ／ＳＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と結合する前記薬剤の能力を測定し；さらにｃ）１つまたは２つ以上のin vitroおよび／またはin vivoアッセイで細胞増殖活性を示す前記薬剤の能力を測定する。前記方法において、ＨＧＦ／ＳＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と結合する能力および増殖促進活性を示す能力を有する候補薬剤は増殖促進薬剤である。前記薬剤はさらに、ｃ−ｍｅｔレセプターを作動させる能力を示すことができる。ある実施態様では、前記薬剤は血管形成剤である。非限定的な例を挙げれば、前記薬剤は小分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質であろう。ＨＧＦ／ＳＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と結合する薬剤の能力は、前記薬剤と抗体との結合を測定することにより、または前記薬剤がＨＧＦ／ＳＦもしくはそのペプチド模倣物と抗体との結合に競合する能力を測定することにより決定することができる。別の実施態様では、増殖促進薬剤の製造方法を以下の工程によって実施することができる：ａ）上記のようにして増殖促進ペプチドを特定し；ｂ）前記ペプチドの三次元構造を決定し；さらにｃ）前記ペプチドの三次元構造にならって小分子薬剤を作製する。
【００１４】
別の明瞭な特徴では、本発明は、ｃ−ｍｅｔの細胞外ドメインと結合する能力；および細胞の成長または増殖のＨＧＦ／ＳＦ仲介増加を抑制する能力を特徴とする抗増殖性薬剤を目的とする。ある実施態様では、細胞の成長または増殖の抑制はｃ−ｍｅｔレセプターを発現している細胞に対して実施される。別の実施態様では、前記細胞には上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞および平滑筋細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。非限定的な例を挙げれば、抗増殖性薬剤は小分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質であろう。前記ペプチドの例には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：ＡＴＷＳＨＨＬＳＳＡＧＬ（配列番号：３）；ＷＰＱＬＰＰＲＰＹＳＴＬ（配列番号：４）；ＳＮＴＳＡＧＴＰＦＴＳＬ（配列番号：５）；ＤＳＴＰＫＳＴＰＷＹＹＩ（配列番号：６）；およびそれらの保存的置換変種。前述の薬剤を含む医薬組成物は本発明に包含される。
【００１５】
さらに別の特徴では、本発明は、組織または器官の細胞増殖を抑制する方法を目的とする。前記方法は、ｃ−ｍｅｔの細胞外ドメインと結合する能力；および細胞の成長または増殖のＨＧＦ／ＳＦ仲介増化を抑制する能力を特徴とする薬剤の抗増殖有効量と組織または器官を接触させることによって実施される。ある実施態様では、前記薬剤は、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞または平滑筋細胞の成長または増殖のＨＧＦ／ＳＦ仲介増強を抑制する。好ましい実施態様では、前記薬剤は内皮細胞の増殖を抑制する。非限定的な例を挙げれば、前記薬剤は小分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質である。前記ペプチドの例には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：ＡＴＷＳＨＨＬＳＳＡＧＬ（配列番号：３）；ＷＰＱＬＰＰＲＰＹＳＴＬ（配列番号：４）；ＳＮＴＳＡＧＴＰＦＴＳＬ（配列番号：５）；ＤＳＴＰＫＳＴＰＷＹＹＩ（配列番号：６）；およびそれらの保存的置換変種。前記組織または器官は、異常増殖組織（例えば腫瘍もしくは転移、または乾癬）、炎症性疾患（例えば慢性関節リウマチ）に侵襲された組織または器官、（例えば慢性糖尿病に起因する）血管新生を伴う眼、創傷治癒時のケロイド形成のような異常成長、または、例えば発育中の器官または組織の形成もしくは成熟を阻止することを目的とする意図的な細胞増殖の破壊であろう。治療の方法には、本発明の薬剤の所望の標的部位への適用、本発明の薬剤を含む医薬組成物、内在性細胞にトランスフェクトして本発明の薬剤を含むタンパク質を発現させる遺伝子治療、または本発明の薬剤を分泌する細胞の埋め込みが含まれる。
【００１６】
さらに別の特徴では、本発明は組織または器官の血管新生を抑制する方法を目的とする。前記方法は、ｃ−ｍｅｔの細胞外ドメインと結合する能力；および内皮細胞の成長または増殖のＨＧＦ／ＳＦ仲介増加を抑制する能力を特徴とする薬剤の血管形成停止有効量と組織または器官を接触させることによって実施される。非限定的な例を挙げれば、前記薬剤は小分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質である。前記ペプチドの例には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：ＡＴＷＳＨＨＬＳＳＡＧＬ（配列番号：３）；ＷＰＱＬＰＰＲＰＹＳＴＬ（配列番号：４）；ＳＮＴＳＡＧＴＰＦＴＳＬ（配列番号：５）；ＤＳＴＰＫＳＴＰＷＹＹＩ（配列番号：６）；およびそれらの保存的置換変種。小分子化合物の例は下記で述べる。前記組織または器官は、異常増殖組織（例えば腫瘍もしくは転移、または乾癬）、炎症性疾患（例えば慢性関節リウマチ）侵襲組織または器官、（例えば慢性糖尿病に起因する）血管新生を伴う眼、創傷治癒時のケロイド形成のような異常成長、または、例えば発育中の器官または組織の形成もしくは成熟を阻止することを目的とする意図的な細胞増殖の破壊であろう。薬剤の所望の部位への適用手段は上記で述べたとおりである。
【００１７】
本発明はまた、上記の抗増殖性ペプチド配列をコードする核酸を含むポリヌクレオチド（前記ポリヌクレオチドをコードするベクターを含む）並びに前記ベクターを含み前記抗増殖性ペプチドを発現する微生物および細胞を目的とする。前記のポリヌクレオチドの治療的使用（裸のＤＮＡ、ウイルスベクターなどによる遺伝子治療、および細胞にトランスフェクトして本発明の薬剤を発現させる他の手段を含む）は本発明に包含される。好ましい実施態様では、抗増殖性ペプチドおよびそれらをコードする核酸配列は抗血管形成ペプチドである。
【００１８】
さらに別の特徴では、本発明は、以下の工程を含む細胞増殖を抑制することができる薬剤を特定する方法を目的とする：ａ）候補薬剤を提供し；ｂ）Ｃ−ｍｅｔの細胞外ドメインと結合する前記薬剤の能力を測定し；さらにｃ）ＨＧＦ／ＳＦの抗増殖性活性を抑制する薬剤の能力を測定する。前記方法において、Ｃ−ｍｅｔの細胞外ドメインと結合する能力および散布因子の増殖活性を抑制する能力を有する候補薬剤は抗増殖性薬剤である。非限定的な例を挙げれば、前記薬剤は小分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質であろう。
さらに別の特徴では、以下の工程を含む抗増殖性薬剤の製造方法が提供される：ａ）上記に述べたとおり抗増殖性ペプチドを特定し；ｂ）前記ペプチドの三次元構造を決定し；さらにｃ）前記ペプチドの三次元構造にならって小分子薬剤を作製する。
【００１９】
さらに別の実施態様では、本発明は、以下の工程を含む血管形成を抑制することができる薬剤を特定する方法を目的とする：ａ）候補薬剤を提供し；ｂ）Ｃ−ｍｅｔの細胞外ドメインと結合する前記薬剤の能力を測定し；さらにｃ）散布因子の血管形成活性を抑制する前記薬剤の能力を測定する。前記方法において、Ｃ−ｍｅｔの細胞外ドメインと結合する能力および散布因子の血管形成活性を抑制する能力を有する候補薬剤は血管形成停止薬剤である。非限定的な例を挙げれば、前記薬剤は小分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質であろう。さらにまた別の特徴では、以下の工程を含む血管形成停止薬剤の製造方法が提供される：ａ）上記に述べたとおり血管形成停止ペプチドを特定し；ｂ）前記血管形成停止ペプチドの三次元構造を決定し；さらにｃ）前記血管形成停止ペプチドの三次元構造にならって小分子薬剤を作製する。
【００２０】
本発明はまた、上記に述べた作動性ペプチドおよび拮抗性ペプチドの上記で述べた全ての使用についてＨＧＦ／ＳＦ作動性物質または拮抗性物質である小分子化合物を目的とする。本発明のそのような作動性化合物は、ＨＧＦ／ＳＦ活性を模倣するかまたは作動させるために有用であり、その特徴は、非ペプチド性、非タンパク質性有機分子であり、in vitroまたはin vivoで内皮細胞の増殖を促進する１つまたは２つ以上の活性を有し、in vitroまたはin vivoで血管形成を促進し、in vivoで創傷の血管形成を高め、in vitroまたはin vivoで腫瘍細胞の増殖を促進し、散布を促進し、抗アポトーシス活性を促進し、または血管形成カスケード関連遺伝子（例えばＩＬ−８およびアンギオポイエチン−２、ただしこれらに限定されない）の遺伝子発現を誘発することである。好ましい化合物は、前述の活性が、外因的に添加されたｃ−ｍｅｔレセプターの存在下で抑制または競合されるものである。前記化合物はｃ−ｍｅｔと結合することができる。本発明は、ＨＧＦ／ＳＦ活性の増加または強化が所望される種々の症状または疾患の治療のために前記分子のいずれかを使用することを含む。ある実施態様では、本発明の化合物は、１０００ダルトン以下、好ましくは約２００ダルトンから約１０００ダルトン、より好ましくは約３００ダルトンから約７５０ダルトン、もっとも好ましくは約３００ダルトンから約５００ダルトンの分子量を有する。
【００２１】
したがって、哺乳類で肝細胞増殖因子／散布因子（ＨＧＦ／ＳＦ）活性を増化させる方法が提供され、前記方法は、約１０００ダルトンより小さい分子量をもち、以下のＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイの少なくとも１つでＨＧＦ／ＳＦ様活性を示す化合物の有効量を哺乳類に投与することによって実施される：
in vitroまたはin vivoでの内皮細胞の増殖誘発；
in vitroまたはin vivoでの血管形成誘発；
in vivoで創傷における血管形成の増加；
腫瘍増殖促進；
血管形成カスケード関連遺伝子（例えばＩＬ−８およびアンギオポイエチン−２であるが、ただしこれらに限定されない）の遺伝子発現誘発；
抗アポトーシス活性の誘発；または
散布活性の誘発。
【００２２】
好ましい実施態様では、前述の化合物のＨＧＦ／ＳＦ活性はｃ−ｍｅｔの存在下で抑制される。別の好ましい実施態様では、前記化合物はｃ−ｍｅｔと結合する。
本発明の化合物は、前述のＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイの少なくとも２つで、または前記ＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイの少なくとも３つで、または少なくとも４つの前記ＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイで、または前記ＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイの少なくとも５つで、または前記ＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイの少なくとも６つで、または前記ＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイの全てでＨＧＦ／ＳＦ様活性を示すことができる。前記化合物は、好ましくは約２００ダルトンから約７５０ダルトン、より好ましくは約３００ダルトンから約５００ダルトンの分子量を有する。
【００２３】
別の実施態様では、本発明は、肝疾患、腎疾患、骨再生、毛髪の成長、創傷もしくは組織の治癒の促進、組織の血管新生の促進、虚血組織の血管新生の促進、虚血の影響を受け易い組織の血管新生の促進、虚血組織（例えば心筋梗塞後の心臓）への血流の増強または回復に関して哺乳類で予防または治療する方法を目的とし、前記方法は、約１０００ダルトンより小さい分子量を有し、以下の少なくとも１つのＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイでＨＧＦ／ＳＦ様活性を有する化合物の有効量を全身的または、予防もしくは治療を必要としている個々の組織または器官に投与することを含む：
in vitroまたはin vivoでの内皮細胞の増殖誘発；
in vitroまたはin vivoでの血管形成の誘発；
in vivoでの創傷における血管形成の増加；
腫瘍の増殖促進；
血管形成カスケード関連遺伝子（例えばＩＬ−８およびアンギオポイエチン−２であるが、ただしこれらに限定されない）の遺伝子発現の誘発；
抗アポトーシス活性の誘発；または
散布活性の誘発。
【００２４】
好ましい実施態様では、前述の化合物のＨＧＦ／ＳＦ活性はｃ−ｍｅｔの存在下で抑制される。
本発明の化合物は、前述のＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイの少なくとも２つで、または前記ＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイの少なくとも３つで、少なくとも５つの前記ＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイで、少なくとも６つの前記ＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイで、または前記ＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイの全てでＨＧＦ／ＳＦ様活性を示すことができる。前記化合物は、好ましくは約２００ダルトンから約７５０ダルトン、より好ましくは約３００ダルトンから約５００ダルトンの分子量を有する。
【００２５】
本発明はまた、哺乳類で肝細胞増殖因子／散布因子（ＨＧＦ／ＳＦ）活性を抑制する方法を目的とし、前記方法は、約１０００ダルトンより小さい分子量をもち、以下のＨＧＦ／ＳＦ活性アッセイの少なくとも１つでＨＧＦ／ＳＦ抑制または拮抗活性を示す化合物の有効量を哺乳類に投与することを含む：
in vitroまたはin vivoでの内皮細胞の増殖抑制；
in vitroまたはin vivoでの腫瘍の増殖抑制；
正常細胞または腫瘍細胞の散布抑制；または
抗アポトーシス活性の抑制。
好ましい実施態様では、前述の化合物のＨＧＦ／ＳＦ抑制活性は、外因的に添加されたＨＧＦ／ＳＦの存在下で、またはＨＧＦ／ＳＦが発現もしくは誘発される細胞または組織で生じる。
本発明の化合物は、前述のＨＧＦ／ＳＦ活性抑制アッセイの少なくとも２つで、または前記ＨＧＦ／ＳＦ活性抑制アッセイの少なくとも３つで、または前記ＨＧＦ／ＳＦ活性抑制アッセイの全てでＨＧＦ／ＳＦ抑制活性を示すことができる。前記化合物は、好ましくは約２００ダルトンから約７５０ダルトン、より好ましくは約３００ダルトンから約５００ダルトンの分子量を有する。
【００２６】
さらに別の実施態様では、以下から成る群から選択される疾患の症状を哺乳類で予防または治療する方法が提供される：過剰な細胞増殖、血管形成、異常増殖疾患、癌、転移、炎症性疾患、糖尿病性網膜症、炎症性関節疾患、および炎症性皮膚疾患。前記方法は、約１０００ダルトンより小さい分子量を有し、以下のＨＧＦ／ＳＦ活性抑制アッセイの少なくとも１つでＨＧＦ／ＳＦ抑制または拮抗活性を示す化合物の有効量を哺乳類に投与することを含む：
in vitroまたはin vivoでの内皮細胞の増殖抑制；
in vitroまたはin vivoでの腫瘍の増殖抑制；
正常細胞または腫瘍細胞の散布抑制；および
抗アポトーシス活性の抑制。
好ましい実施態様では、前述の化合物のＨＧＦ／ＳＦ抑制活性は、外因的に添加されたＨＧＦ／ＳＦの存在下で、またはＨＧＦ／ＳＦが発現もしくは誘発される細胞または組織で生じる。
本発明の化合物は、前述のＨＧＦ／ＳＦ活性抑制アッセイの少なくとも２つで、または前記ＨＧＦ／ＳＦ活性抑制アッセイの少なくとも３つで、または前記ＨＧＦ／ＳＦ活性抑制アッセイの全てでＨＧＦ／ＳＦ抑制活性を示すことができる。前記化合物は、好ましくは約２００ダルトンから約７５０ダルトン、より好ましくは約３００ダルトンから約５００ダルトンの分子量を有する。
【００２７】
別の実施態様では、本発明は、下記一般式をもつＨＧＦ／ＳＦ活性を調節する化合物を上記のいずれかの目的のために使用する方法を目的とする：
【００２８】
【化９】
Figure 0004993834
【００２９】
式中、
Ｒ３およびＲ５は、それぞれ別個にまたは一緒になって直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル（場合によってシアノまたはハロゲンで置換されてある）、ハロゲン、トリフルオロメチルまたはジフルオロメチル基であり；
Ｒ１は、水素、メチル、ＣＯ−アリール、ＳＯ2−アリール、ＣＯ−ヘテロアリール、またはＣＯ−アルキルであり；さらに
Ｒ４はＣＨ2−アリール、ハロゲン、アリールカルボニルビニルまたはＳ−ヘテロアリールである。
式Ｉの化合物のあるものは新規であり、本発明はまた、本明細書で述べる活性をもつそのような全ての新規な化合物を目的とする。
本発明は、式Ｉの少なくとも１つの化合物および医薬的に許容できる担体を含む、本明細書で述べるいずれかの使用を目的とする医薬組成物もまた目的とする。
【００３０】
式ＩのＨＧＦ／ＳＦ活性調節物質の非限定的な例には以下の化合物が含まれるが、それらの大半は、下記実施例に示されているように、ＨＧＦ／ＳＦ作動活性を示す：
３−（５−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
［４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル］メタノン
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）メタノン
４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１−（（３，４−ジクロロフェニル）スルフォニル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール
４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール
４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール
（４−ブロモ−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド）
３−（４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパンニトリル
３，５−ジ（ｔ−ブチル）−４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２，６−ジクロロフェニル）メタノン
１−（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）２，２−ジメチルプロパン−１−オン
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（４−クロロフェニル）メタノン
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２−チエニル）メタノン
（４−クロロフェニル）（３，５−ジメチル−４−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）チオ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン。
【００３１】
別の実施態様では、本発明は、下記一般式ＩＩを有するＨＧＦ／ＳＦ活性を調節する化合物を上記の目的に使用する方法を目的とする：
【００３２】
【化１０】
Figure 0004993834
【００３３】
式中、
Ｒ５は、Ｃ１からＣ６の分枝または直鎖アルキル基であり；
Ｒ３は、置換または非置換アリール基であり；
Ｒ１は、水素またはＣ１からＣ４の直鎖、分枝もしくはシクロアルキル基であり；
Ｒ２は、ＣＯＣＨ2ＯＮＣＨ−アリール基；ヘテロアリール、ＣＯＣＨ2ＣＨ2アリール；アリール；ＣＯＳ−アリール；ＣＯ−ヘテロアリール；Ｃ１からＣ４直鎖アルキル、分枝アルキルまたはシクロアルキルであるか；またはＲ１およびＲ２は５または６個の炭素原子の環式基を形成する。
式ＩＩの化合物のあるものは新規であり、本発明は、本明細書で述べる活性を有するそのような新規な化合物の全てを目的とする。
【００３４】
本発明はまた、少なくとも１つの式ＩＩの化合物を医薬的に許容できる担体中に含む、本明細書で述べるいずれかの使用を目的とする医薬組成物もまた目的とする。
式ＩＩの化合物の大半は、下記の実施例で示されるようにＨＧＦ／ＳＦ拮抗活性または抑制活性を示す。式ＩＩの化合物の非限定的な例には以下が含まれる：
Ｎ´４，５−ジメチル−Ｎ´４−（５−ニトロ−２−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（２−（（（２，４−ジクロロベンジリデン）アミノ）オキシ）アセチル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロパノイル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
２−ニトロフェニル２−（（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）カルボニル）ヒドラジン−１−カルボチオエート
Ｎ´４−（（２−メチル−１，３−チアゾール−４−４イル）カルボニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−４カルボヒドラジド
Ｎ１−（（２−（（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）カルボニル）ヒドラジノ）（メチルチオ）メチリデン）ベンゼン−１−スルホンアミド
Ｎ´４−（２，４，６−トリクロロフェニル）−３−３（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４，３−ジ（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（３，５−ジクロロ−４−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−フェニル−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４，Ｎ´４，５−トリメチル−３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ４−アゼパン−１−イル−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボキシアミド
Ｎ´４−（６−（トリフルオロメチル）−２−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（６−（トリフルオロメチル）２−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（３，３−ジエトキシプロパノイル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド。
【００３５】
さらに別の実施態様では、本発明は、下記一般式ＩＩＩを有するＨＧＦ／ＳＦ活性を調節する化合物を前述の目的のいずれかで使用する方法を目的とする：
【００３６】
【化１１】
Figure 0004993834
【００３７】
式中、
Ｒ１は、ＳＯ2アルキル、ＳＯ2アリール、ＣＯ−ｔ−ブチル、ＣＯアリール、ＣＯＮＨアルキル、ＣＯＮＨアリールであり；さらに
Ｒ３は、ＣＨＣＨヘテロアリール、フェノキシフェニル、ヘテロアリールまたはアリール置換ヘテロアリールである。
式ＩＩＩの化合物のあるものは新規であり、本発明は、本明細書で述べる活性を有するそのような新規な化合物の全てを目的とする。
本発明はまた、少なくとも１つの式ＩＩＩの化合物を医薬的に許容できる担体中に含む、本明細書で述べるいずれかの使用を目的とする医薬組成物もまた目的とする。
【００３８】
これらの化合物は一般にＨＧＦ／ＳＦ刺激活性または作動活性を示す。式ＩＩＩの化合物の非限定的な例には以下が含まれる：
（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン；
１−（メチルスルホニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール；
２，２−ジメチル−１−（３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパン−１−オン；
Ｎ−メチル−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
（４−クロロフェニル）（３−（３−フェニルイソキサゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
（４−クロロフェニル）（３−（３−（４−クロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
（４−クロロフェニル）（３−（５−（２−チエニル）−２−チエニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
（２，４−ジクロロフェニル）（３−（５−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−フリル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
Ｎ１−フェニル−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド
（４−クロロフェニル）（３−（２−（５−（２−チエニル）−２−チエニル）−４−メチル−１，３−チアゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
（３−ベンゾヒドリル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（４−クロロフェニル）メタノン；
Ｎ１−（４−クロロフェニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
（４−クロロフェニル）（３−（２−メチルイミダゾ（１，２−ａ）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
２−クロロ−６−（４−（１−（４−クロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）フェノキシ）ベンゾニトリル；
１−（（４−クロロフェニル）スルホニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール。
【００３９】
さらに別の実施態様では、本発明は、下記一般式ＩＶを有するＨＧＦ／ＳＦ活性を調節する化合物を上記のいずれかの目的に使用する方法を目的とする：
【００４０】
【化１２】
Figure 0004993834
【００４１】
式中、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２は、１つまたは２つ以上のハロゲン、ニトロ、Ｃ１からＣ４の直鎖アルキル、分枝アルキルまたはシクロアルキル、またはＣ１からＣ４のアルキルオキシ基である。
式ＩＶの化合物のあるものは新規であり、本発明は、本明細書で述べる活性を有するそのような新規な化合物の全てを目的とする。
本発明はまた、少なくとも１つの式ＩＶの化合物を医薬的に許容できる担体中に含む、本明細書で述べるいずれかの使用を目的とする医薬組成物もまた目的とする。
前記の群の化合物は、ＨＧＦ／ＳＦ作動物質であるか、または拮抗物質であろう。式ＩＶをもつ調節物質の非限定的な例には以下が含まれる：
１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２−クロロ−６−フルオロフェニル）−１−（４−クロロ−３−メチル フェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（３，４−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（４−フルオロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−（２，４−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−１−（４−ブロモフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（３−フェノキシ−２−チエニル）−１−（２−チエニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（３−ブロモ−４−メトキシフェニル）−１−フェニルプロパ−２−エン−オン；
３−（３，４−ジクロロフェニル）−１−（２−ニトロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−（３，４−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−（３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（２−クロロフェニル）−３−（３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−クロロフェニル）−１−（２，６−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−ブロモフェニル）−３−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（２−クロロフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２，６−ジクロロフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（２−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２，６−ジクロロフェニル）−１−（２−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（３，４−ジクロロフェニル）−１−（２−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（５−ブロモ−２−ヒドロキシフェニル）−１−（３−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（５−ブロモ−２−ヒドロキシフェニル）−１−（４−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（３−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−［４−アミノ−２−（メチルチオ）−１，３−チアゾール−５−イル］−３−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］プロパ−２−エン−１−オン；
１−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−３−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１，３−ジ（５−ニトロ−３−チエニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−ブロモフェニル）−３−（３，５−ジフルオロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（３，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−ニトロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン。
【００４２】
前述の化合物はまた、ＶＥＧＦおよびＦＧＦを含む他のチロシンキナーゼレセプター増殖因子に対して拮抗活性を有し、前記増殖因子の活性により生じる症状および疾患の治療を目的として前記活性を抑制するために用いることができる。
ＨＧＦ／ＳＦ活性を有する前述の化合物の一般構造および固有構造は、前記所望の活性を有する本発明の化合物の単なる例示であって、制限的なものでは全くない。
さらに別の実施態様では、本発明は、前述の化合物のいずれか１つまたはその組合せを医薬的に許容できる担体と一緒に含む、前述のいずれかの目的のために使用される医薬組成物を目的とする。
さらに別の実施態様では、細胞増殖または血管形成を促進する活性を有する前述の化合物は、組織（特に虚血組織または虚血の影響を受け易い組織）の血管新生の促進に有用である。
【００４３】
予防または治療は、血管形成に有効な量の本発明の薬剤と組織を接触させることによって提供することができる。接触は、所望の結果を達成できる期間、有効量の薬剤をデリバーするために適した任意の手段によって提供できる。非限定的な例を挙げれば、局所適用は、所望の標的に適用するか、または輸液、薬浴または持続的デリバリー装置の埋め込みによって適用できる。全身投与の場合は、経口または非経口ルートを用いることができる。標的細胞または組織は、例えば移植組織または器官（例えば皮膚、心臓、血管組織または腎臓）、虚血器官（例えば心筋梗塞またはアンギナ後の心臓）、創傷、外科的措置によって損傷を受けた組織または器官、血管組織、神経組織、創傷、潰瘍などであろう。非限定的な例を挙げれば、前記細胞は、上皮細胞、内皮細胞および平滑筋細胞、並びに前記細胞を含む組織および器官であろう。神経組織、歯および他の組織の増殖および／または再生の促進もまた本発明に包含される。好ましい細胞、器官および組織はc−metレセプターを含む。
【００４４】
ＨＧＦ／ＳＦ活性をもつ前述の化合物はまた、種々の肝臓疾患（肝硬変および肝不全を含む）；種々の腎臓疾患（腎不全を含む）の治療に有用である。前記化合物はまた骨再生の誘発にも有用である。
本発明のまた別の明瞭な特徴では、in vivoでのＨＧＦ／ＳＦの望ましくない活性は、とりわけ細胞増殖および血管形成に一般に付随する症状および疾患の治療に有効な量の本発明のある種の化合物を哺乳類に投与することによって治療により抑制することができる。ＨＧＦ／ＳＦの抑制は、例えば異常増殖疾患（例えば癌および転移）および種々の炎症性疾患（例えば炎症性関節疾患および皮膚疾患）の治療で所望される。他の活性には、内皮細胞の増殖抑制、血管形成の抑制、血管形成停止、殺腫瘍活性および前述の任意の組合せが含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらに別の実施態様では、本発明の薬剤は、外因的に付加されたＨＧＦ／ＳＦの存在下で、または活性が存在または誘発されている細胞内で前記活性を抑制する。異常な血管増殖（例えば糖尿病で発生する）もまた本発明の方法によって治療することができる。
【００４５】
ＨＧＦ／ＳＦ活性の抑制に有用な本発明の化合物の特徴は、有機小分子またはペプチドであり、以下の活性の１つまたは２つ以上を有することである：in vitroまたはin vivoでの内皮細胞の増殖の抑制、in vitroまたはin vivoでの腫瘍細胞の増殖、散布または転移の抑制、散布の抑制、または抗アポトーシス活性の抑制。好ましいものは、外因的に添加されたＨＧＦ／ＳＦの存在下でそのような活性を示すことができる化合物である。本発明は、ＨＧＦ／ＳＦ活性を低下または抑制することが所望される種々の症状または疾患の治療に前記分子のいずれかを使用することを含む。
【００４６】
さらに、本発明のある種の化合物は、下記の実施例で示されるように、ＨＧＦ／ＳＦに対してだけでなくＶＥＧＦおよびＦＧＦに対しても作動性（活性化）または拮抗性（抑制）活性のどちらかを有することが見出された。本発明はまた、チロシンキナーゼレセプターである他の因子に対すると同様に、前記増殖因子の活性を作動させるか、またはそれらの活性と拮抗させるために前記化合物を使用することを目的とする。特に、化合物、３，３−ジブロモ−１−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−２，４−ジオンおよび４−（４−クロロフェニル）−６−（ジメチルアミノ）−２−フェニル−５−ピリミジンカルボニトリルはＶＥＧＦ様活性を有し、さらに、これら化合物および構造的に関連するＶＥＧＦ作動物質または模倣物質は、ＶＥＧＦが哺乳類、好ましくはヒトの治療に有用であろうと考えられる種々の症状および疾患、例えば創傷治癒（特に糖尿病による創傷治癒）（ただしこれらに限定されない）の治療を目的とする本発明に包含される。前記化合物は、一般に、血管内皮細胞の増殖促進および血管新生促進に、冠状動脈疾患、アンギナおよび他の虚血性疾患（卒中発作を含む）の治療での再狭窄のようなその他の使用に有用である。
本発明の前記の特徴および他の特徴は、以下の図面および以下の記載を参照することによってよりいっそう理解されるであろう。
【００４７】
【課題を解決するための手段】
本発明の薬剤および方法は、細胞の増殖を調節して、細胞増殖の制限（または反対に過剰な細胞増殖）が病気の原因であるか、または少なくとも病的状態からホメオスタシスへの復帰の遅れの原因となっている種々の症状および疾患の予防および／または治療のための効果的な薬剤および方法を提供することを目的とする。新規な特定方法を用いて、本発明は、種々のペプチドだけでなく小分子化合物の驚くべきかつ予期せぬ活性を見出した。それらのあるものは細胞増殖を促進し、他のものは細胞増殖を抑制する。前記方法を用いて、前述の活性を有するさらに別の薬剤を特定することができる。非限定的な例を挙げれば、前記薬剤のあるものはin vitroおよびin vivoで血管形成を促進し（他のものはin vitroおよびin vivoで血管形成を抑制する）、さらに２つの癌モデルで評価されたように、異常増殖組織の増殖を抑制する。さらに別の活性も認められる。さらにまた（理論に拘束されないが）、本発明で特定した増殖促進ペプチドおよび抗増殖性ペプチドは、種々の組織および器官を含む体内の種々の細胞タイプに存在するｃ−ｍｅｔレセプターを作動させ、さらに前記と拮抗することによってそれぞれその作用を発揮すると考えられる。前記細胞には上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、および平滑筋細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記の細胞タイプを含む組織および器官は本明細書に述べる種々の活性の標的である。組織または器官を構成するただ１つの細胞タイプに対する本発明の薬剤の効果が前述の治療目標をもたらすことができるので、本薬剤は、ｃ−ｍｅｔを発現する細胞がほんの小さな部分を構成する組織または器官に対して重大な効果を与えることができる。標的レセプターの発現の程度が本発明の薬剤および方法の有用性を減ずることはない。前述の活性はＨＧＦ／ＳＦの作動活性または拮抗活性を示すので、したがって、本発明に包含されるそのようなペプチド、小分子化合物および他の化合物はＨＧＦ／ＳＦ作動物質または拮抗物質であると考えることができる。さらにまた、下記で示されるように、本発明の化合物はまた、他のチロシンキナーゼレセプター（ＶＥＧＦおよびＦＧＦを含むが、ただしこれらに限定されない）の作動物質または拮抗物質としても機能し、本発明並びに小分子の作動物質および拮抗物質の特定は一般にこれらのレセプターにも及ぶ。
【００４８】
例えば、創傷治癒の期間、損傷および／または虚血器官、異個体移植片（transplant）または同一個体移植片（graft）の血管新生、慢性心虚血または心筋梗塞の結果としての心筋灌流の正常化、血管閉塞後または虚血組織もしくは器官への二次血管の発達の進行もしくは増強、および同一個体移植もしくは異個体移植組織、器官または創傷治癒の血管新生は、細胞増殖、特に血管細胞の増殖の促進によって加速することができる。さらに別の有用性は、血管の同一個体移植および異個体移植における内皮細胞の増殖促進にある。
【００４９】
異常または過剰な細胞増殖が病気の原因である他の事例、例えば癌および乾癬を含む異常増殖疾患、細胞の異常増殖を特徴とする種々の炎症性疾患（例えばアテローム性硬化症および慢性関節リウマチ、および糖尿病性網膜症の結果としての眼の新生血管形成では、細胞増殖の抑制が、前記および他の症状の治療において所望される目標である。本発明の抗増殖性薬剤は、抗血管形成活性だけでなく細胞に対して抗増殖性活性を有することが見出されたので、両活性は、例えば固形腫瘍（異常細胞増殖およびそれによって誘発される腫瘍の血管形成の強化は両方とも本発明の薬剤による抑制の標的である）の治療で有益である。いずれの事例においても、増殖を促進または抑制する治療は局所的には（さらに特定の期間については）有益であるが、全身的には有益ではなく、増殖調節治療は適切に適用する必要がある。本発明は、固有の効果を達成するために罹患組織および器官への前記薬剤の局在化デリバリーを包含する。
【００５０】
上記で特記したように、成長または新生細胞および／または新生血管形成のいずれかの促進によって、または細胞の成長を抑制することによって、および／または存在している血管系を破壊することによって細胞増殖を調節することは、多数の症状および疾患の予防または治療のために治療として所望される目標である。前記の多数の症状および疾患には重要な病的状態、例えば心筋梗塞、癌、炎症性関節および皮膚疾患、糖尿病性網膜症および創傷治癒の他に、例えば器官の異個体移植および皮膚の同一個体移植の成功率を高めるための補助療法が含まれる。
【００５１】
下記で提供される実施例は、用途の範囲または増殖促進および抗増殖薬剤についての単なる例示である。前記薬剤には血管形成薬剤および血管形成停止薬剤（これらの使用は当業者には公知である）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらにまた、本明細書で引用する種々の参考文献（これらの文献は参照により本明細書に含まれる）は、本明細書に記載したある種の使用について解説を提供する。例えば、細胞増殖の抑制は、癌を含む異常増殖の治療で望ましく、特に固形腫瘍ではさらに追加される抗血管形成活性が所望される。なぜならば、そのような腫瘍は、腫瘍を養うために血液供給の強化を必要とするだけでなく、腫瘍の血管新生を刺激する因子を産生するからである。糖尿病性網膜症の結果としての眼の硝子体液の血管新生は失明の主要な原因であり、そのような血管新生の抑制が所望される。血管の新生が所望されない他の症状には、ある種の慢性炎症性疾患（特に炎症性関節および皮膚疾患）だけでなく、増殖反応が病気の全てまたは部分をひきおこしているかもしくは原因となっている他の炎症性疾患が含まれる。例えば、乾癬は普通にみられる炎症性皮膚疾患で、突出した上皮の過形成および真皮乳頭の新生血管形成を特徴とする。（おそらく増殖因子の結果としての）平滑筋細胞の増殖は、いくつか例示すれば心筋虚血、アンギナ、心筋梗塞および卒中発作の原因となるアテローム性硬化症におけるマクロ血管系の狭窄および閉塞の要因である。末梢血管疾患および閉塞性動脈硬化症は炎症性成分を含む。多数の糖尿病合併症、例えばアテローム性硬化症および特に糖尿病性腎症（基底膜の肥厚および糸球体間質細胞の増殖を特徴とする）は、慢性の高血糖症の結果として増殖因子の過剰産生を伴う細胞増殖成分を有すると考えられている。増殖疾患のこれらの例は単なる例示として供されているのであり、増殖過程のようなそれらの病因の理論的根拠によって本発明が限定されるものではなく、出願人はそれらを開示する義務をもたず、またそのような開示に拘束されるものではない。
【００５２】
さらにまた、抗増殖薬剤または抗血管形成薬剤による組織また時には器官の局所的除去は、ある種の中枢神経系の疾患または症状の治療で有用であろう（前記薬剤を使用しない場合は危険な侵襲性の手法が必要とされることがある）。美容的に望ましくない皮膚病巣の除去は、本発明の抗増殖薬剤のさらに別の標的である。生殖生物学においては、そのような抗増殖薬剤は堕胎剤として、または非外科的去勢および卵巣切除（特に家畜およびペット動物で使用する）のために用いることができる。前記はまた本薬剤の使用の単なる例示である。
【００５３】
他方、灌流が不十分な組織および器官（例えば心筋梗塞の後遺症としての心臓）は、創傷治癒の促進、器官の異個体移植、血管の同一個体移植における内皮細胞の増殖および血管新生の加速（移植片の一体化を促進し、再閉塞による移植の不成功を防止するため）、および皮膚移植の強化と同様に、血管新生の増加および本発明の血管形成薬剤の使用の望ましい標的である。慢性的に虚血状態の器官の血管新生強化は治療として有用な目標である。
【００５４】
本明細書で用いられる“血管形成”という用語は、血管が形成されることを指す。特に血管形成は多段プロセスで、前記プロセスでは、内皮細胞が巣状に分解し、それら自身の基底膜を通って内部に侵入し、間隙の支質から血管形成刺激に向かって遊走し、遊走端近位で増殖し、血管組織を形成し、新しく形成された基底膜に再結合する（以下の文献を参照されたい：Folkman et al., Adv. Cancer Res., 43:175-203(1985)）。前記のプロセスは、可溶性因子および細胞外マトリックスによって制御される（以下の文献を参照されたい：Ingber et al., Cell, 58:803-805(1985)）。
【００５５】
したがって、本発明の特徴は、細胞増殖促進活性または抗増殖活性（血管形成活性または血管形成停止（抗血管形成）活性を含むが、ただしこれらに限定されない）をもつ薬剤を特定する方法を含む。そのような薬剤は特定の構造または化学物質クラスに限定されない。下記の実施例で示されるように、本明細書で開示する方法は、ペプチドだけでなく作動活性または拮抗活性を有する小分子化合物の特定にも用いられるが、そのような方法は、他の構造をもつクラスの活性薬剤の特定にも用いることができる。さらにまた、いったんそのような薬剤が特定されたら、下記にも記載されているように、三次元構造分析を用いて類似の活性またはより高い活性をもつ他の小分子化合物を作製することができる。そのような方法（前記方法は、例えば核磁気共鳴分光法またはＸ線結晶解析法による生体分子とそのリガンドとの間の相互作用の構造による決定をしばしば利用する）は当業者には公知で、新たな別の化合物（それらはペプチドまたは小分子有機薬剤でもよく、前記相互作用および本明細書に開示するペプチドの活性を模倣する化合物である）の開発のために、ｃ−ｍｅｔと本発明のペプチドとの間の相互作用部位の特定に利用することができる。本発明は、本発明のペプチドについて本明細書で述べる特性をベースにして、小分子および本発明の化合物の他の模倣物質を開発またはスクリーニングする方法を含む。
【００５６】
増殖促進薬剤を特定する方法は、ある薬剤（特にペプチド）の以下の能力を基準にする：１）ＨＧＦ／ＳＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と結合する；および２）１つまたは２つ以上のin vitroおよび／またはin vivoアッセイで増殖促進活性（例えば血管形成活性）を示す。これらの方法（下記で詳述する）を用いて、強力な増殖活性および血管形成活性をもついくつかのペプチドが特定された。
さらにまた、抗増殖薬剤（例えば血管形成停止薬剤であるが、ただしこれらに限定されない）も、１）ＨＧＦ／ＳＦレセプター、ｃ−ｍｅｔと結合する能力、２）１つまたは２つ以上のin vitroおよび／またはin vivoアッセイで抗増殖活性（例えば血管形成停止活性であるが、ただしこれに限定されない）を示す能力によって特定できる。これらの方法（下記で詳述する）を用いて、強力な抗増殖活性をもついくつかのペプチドが特定された。
【００５７】
より詳細に本発明の個々の特徴を述べる前に、以下の考察は、本明細書に開示する本発明の種々の特徴をもついずれのものにも、特に作動活性または拮抗活性をもつペプチドおよび小分子化合物にも当てはまる。
本発明の薬剤は、身体または標的組織もしくは器官内の所望の部位に、所望の治療効果を達成する任意の手段によって投与することができる。非限定的な例を挙げれば、血管形成薬剤を含む増殖促進薬剤は、局所的に、例えば注射もしくは標的組織内のデポジットによって、または制御放出デリバリー装置もしくは薬剤含有マトリックスの埋め込みによって投与して局所効果を達成することができる。前記のような部位には外科的にアクセスするか、または経皮的カテーテル設置により主要な血管系から組織もしくは器官にアクセスすることができる。例えば、虚血心臓の灌流強化は、本発明の血管形成薬剤の冠状動脈系への放出を可能にする位置で経皮的カテーテルを使用することにより達成できる。
【００５８】
抗血管形成（血管形成停止）薬剤を含む抗増殖性薬剤の場合は、活性が所望される部位（例えば腫瘍または硝子体液）での薬剤の局所投与を実施することができ、また、本発明の薬剤を含む制御放出デリバリー装置を腫瘍内または眼内に埋め込むことは局所効果達成のために所望されるであろう。外科的または経皮的方法もまた使用することができる。本発明の薬剤を所望される標的細胞、組織または器官と接触させる前記の手段および他の手段は当業者には明白であろう。
【００５９】
本発明のさらに別の特徴では、上記薬剤の医薬組成物が提供される。上記で特記したように、本発明の化合物の適用および適用期間については、局所での個々の配置またはデリバリー、例えば固形腫瘍へのまたは硝子体液内での抗増殖性化合物の曝露が要求され、例えば全身的曝露の回避が必要である。増殖促進薬剤（例えば血管形成化合物）を身体の他の部位に曝露することなく、前記薬剤を移植組織または虚血組織に曝露することが望ましい。前記のような配慮は、治療が増殖促進であるか増殖抑制であるかにかかわらず、さらに曝露の期間にかかわらず、標的細胞、組織または器官に応じて当業者は容易に決定できよう。本発明の化合物の適切な賦形剤もしくは担体またはドラッグデリバリー系による製剤化もまた当業者は容易に決定することができる。さらに前記のデリバリーの方法は全て本発明に包含される。本明細書にはその例が例示として提供されるが、たとえ何であれそれらに限定しようとするものではない。
【００６０】
前記の医薬組成物は、個々の部位に注射、カテーテル設置または埋め込みによって投与することができるが、ある種の使用については他のルート（経口、経肺、経鼻または他の投与形態を含む）によってもデリバーできる。一般に、本発明に包含されるものは、本発明の１つもしくは複数の薬剤または誘導生成物の有効量を医薬的に許容できる希釈剤、保存料、安定化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体とともに含む医薬組成物である。前記の組成物は、種々の緩衝内容（例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度をもつ希釈剤；添加物、例えば洗剤および可溶化剤（例えばトゥイーン８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）および増容剤（例えばラクトース、マンニトール）を含むことができる。前述の例は単なる例示で非限定的であり、当業者は、適切な賦形剤および本発明の１つまたは２つ以上の薬剤を含む医薬組成物の他の成分を容易に知ることができる。
【００６１】
制御デリバリーの場合は、ポリマー化合物（例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸など）の粒子調製物またはリポソーム中への材料の取り込みを利用することができる。また制御放出装置（例えば埋め込み可能な浸透圧ポンプまたは他のタイプのポンプ）を用いることができる。本治療薬剤の制御放出のまた別の形態はオロス（Oros）治療系（Alza Corp.）をベースにした方法によるものである。すなわち、薬剤は半透膜に包まれ、前記半透膜は、水を取り入れ、さらに浸透作用により薬剤をただ１つの小さな開口部から押し出す。同様にして当業者は、本発明の薬剤に適用して本発明の治療目標を達成することができる適切なデリバリー方法を容易に知ることができる。前記のような局所的放出は、例えば腫瘍または眼の異常な血管新生の治療用抗増殖薬剤について、さらに移植部位における増殖性薬剤について望ましいであろう。
【００６２】
本発明の別の実施態様では、本発明の種々のペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本発明のペプチド薬剤を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを体細胞にトランスフェクトすることができる。前記ポリヌクレオチドには、前記と同じペプチドまたは前記のペプチドを含むタンパク質をコードする縮退ポリヌクレオチドが含まれる。さらにまた、前記のような縮退ポリヌクレオチドは、標的の哺乳類細胞での発現のために最適化することができる。トランスフェクションは任意の手段、例えばウイルスベクターを用いて実施できる。この場合、前記トランスフェクトされた細胞は付随の局所作用をもつペプチドを発現しこれを分泌する。ＤＮＡ、ウイルスまたは前記ポリヌクレオチドのための他の輸送体もしくはベクターは、カテーテルまたは他の手段によって標的部位に投与できる。そのようなベクターには、弱毒または不完全ＤＮＡウイルス、例えば単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。不完全ウイルス（これらは完全にまたはほぼ完全にウイルス性遺伝子を欠く）が好ましい。不完全ウイルスは、細胞に導入された後感染性をもたない。不完全ウイルスを用いることによって、ベクターが他の細胞に感染するという懸念はなく、特定の限局された領域の細胞に投与することが可能になる。したがって、特定の組織を特異的に標的とすることができる。具体的なベクターの例には、不完全ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）ベクター［Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330(1991)］、弱毒アデノウイルスベクター、例えば文献に記載されたベクター［Stratford-Perricaude et al., J. Clin. Invest. 90:626-630(1992)］、および不完全アデノ付随ウイルスベクター［Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101(1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828(1989)］が含まれるが、ただしこれらに限定されない。また別には、前記ベクターは、リポフェクションによってin vivoで導入することができる。過去１０年間の間、核酸の被包化およびin vitroでのトランスフェクションを目的とするリポソームの使用が増加した。リポソーム仲介トランスフェクションで生じる問題および危険性を制限できるようにデザインされた合成の陽イオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のin vivoトランスフェクション用リポソームを調製することができる［Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:7413-7417(1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:8027-8031(1988)］。陽イオン脂質の使用によって、負に荷電した核酸の被包化が促進され、さらに負に荷電した細胞膜との融合もまた促進することができる。リポフェクションを使用して外因性遺伝子を特定の器官にin vivoで導入することには実際的なある種の利点が存在する。リポソームの特定の細胞に対する分子ターゲッティングは利点の主たるものの１つである。トランスフェクションを特定の細胞タイプに誘導することは細胞が不均一である組織、例えばすい臓、肝臓、腎臓および脳では特に有利であることは明らかである。標的への誘導のために脂質を化学的に他の分子と結合させることができる（例えば上掲書（Mackey et al.）を参照されたい）。標的となるペプチド（例えばホルモンまたは神経伝達物質）およびタンパク質（例えば抗体）または非ペプチド分子をリポソームに化学的に結合させることができる。
【００６３】
さらにまた、ベクターを裸のＤＮＡプラスミドとしてin vivoで導入することも可能である。遺伝子治療のために裸のＤＮＡベクターを所望のホスト細胞に当分野で公知の方法（例えばトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用）によって導入することができる（例えば以下を参照されたい：Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967(1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624(1988); Hartmut et al., カナダ特許出願第2,012,311号（1990年3月15日出願））。
本発明の好ましい実施態様では、上記の遺伝子治療ベクターは、ベクターに挿入された血管形成または血管形成停止ペプチドの配列に機能的に結合させた転写制御配列を利用している。すなわち、本発明の固有の発現ベクターを遺伝子治療に用いることができる。
【００６４】
さらに、細胞または組織にトランスフェクトして、本発明のタンパク質または本発明のペプチドを含むタンパク質を発現させ、続いて所望の部位に移植することができる。そのような細胞は、細胞が受け入れられるように例えば患者自身の体から得ることができる。また別に外因性細胞を用いてもよい。前記の患者由来細胞または外因性細胞は、例えば特定の薬剤に対する感受性または特定の薬剤によって活性化される発現によって選択的に活性化または破壊できるように調製することができる。それによって、所望の薬剤の分泌を開始し、継続し、または適切な治療期間に従って終了させることができる。適切なプロモーターおよび感受性マーカーを用いてそのような細胞を遺伝子工学によって作製する技術は当分野で公知である。
【００６５】
上記で特記したように、本発明のペプチドは保存的に置換することができる。保存的置換では、機能的に同等なアミノ酸残基が配列内の残基と置換されて保存的アミノ酸置換が得られる。前記のような変更は、本明細書で用いられるように“保存的置換変種”という用語で示される。例えば、配列内の１つまたは２つ以上のアミノ酸残基を類似の極性を有する別のアミノ酸（これは機能的同等物として作用する）で置換することができる。配列内のアミノ酸のための置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含むアミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽性荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。前記の変更によっては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点によって決定されるとおり、見かけの分子量に影響は与えられないであろう。
特に好ましい保存的置換は以下のとおりである：
−陽性荷電が維持できるようにＬｙｓでＡｒｇを置換するかまたはその逆；
−陰性荷電が維持できるようにＧｌｕでＡｓｐを置換するかまたはその逆；
−遊離−ＯＨを維持することができるようにＳｅｒでＴｈｒを置換する；
−遊離ＮＨ２を維持することができるようにＧｌｎでＡｓｎを置換する。
全てのアミノ酸配列は、アミノ末端残基から始まりカルボキシ末端残基で終わるように記載されていることを特記する。さらにまた、配列は１文字または３文字略語を用いて提供される。
【００６６】
本発明の適切な有効用量は、ペプチド、小分子化合物、ＤＮＡベクターまたは他の活性薬剤のいずれであろうと、以下の標準的な方法によって容易に決定できる。臨床環境で遭遇する症状および疾患のモデルとなるいくつかの動物モデルは本明細書に記載されている。さらに薬剤開発の部分として、動物実験、特にドースレスポンス実験での有効用量が、当業者に周知の以下のガイドラインにしたがってヒトでの試験のために適切な用量に変換される。したがって、ヒトでの有効用量は、そのような工業的標準ガイドラインイしたがって決定できる。
【００６７】
別の実施態様では、本発明の増殖促進または抗増殖薬剤（特にペプチド薬剤）と別の成分との結合は、薬剤の特定の性状（例えば標的到達、デリバリー、体内もしくは投与部位での持続性など）を強化するために実施することができる。下記の実施例で示されるように、硫酸ヘパリン結合ポリペプチドが血管形成ペプチドのカルボキシ末端に付加され（固相ペプチド合成によって実施される）、得られたポリペプチドは優れた血管形成活性を示した。したがって、本発明は、融合ペプチドまたは他の本発明のペプチドと別のペプチド配列との結合物を包含し、これらは、上記で記載したように投与でき、または、体内で薬剤の発現をもたらす融合ペプチドを含むポリヌクレオチド配列を体内の細胞にトランスフェクトすることができる。したがって、本発明の薬剤は、本明細書に含まれる本発明の活性薬剤をその一部分として含みさえすればよい。
【００６８】
増殖促進薬剤の特定
本発明にしたがえば、増殖促進薬剤および特にペプチド薬剤は、１）ＨＧＦ／ＳＦに対する抗体と結合する、および２）増殖活性（例えば血管形成活性であるが、ただしこれに限定されない）を１つまたは２つ以上のin vitroまたはin vivoアッセイで有するという特性をもつことによって特定することができる。ＨＧＳ／ＳＦに対する抗体との結合は、ＨＧＳ／ＳＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体によって認識されるエピトープを含む薬剤（ペプチドおよびタンパク質が含まれるがただしこれらに限定されない）と関係がある。モノクローナル抗体が好ましい。前記の抗体の非限定的な例には、ポリクローナルウサギ抗ＨＧＦ／ＳＦ抗体（８１３と称する）およびモノクローナル抗ＨＧＦ／ＳＦ抗体（例えばクローン２３Ｃ２）が含まれる。結合検定の手段には、当業者に公知の種々の免疫化学的方法が含まれる。結合は抗体と薬剤との結合によって測定され（この場合、薬剤は別の物質と結合されてある）、例えば下記実施例で述べるファージディスプレー法によって測定される。また別には、抗ＨＧＦ／ＳＦ抗体との結合は、ＨＧＦ／ＳＦに対する抗体と任意のＨＧＦ／ＳＦペプチド模倣物質または増殖促進薬剤として本明細書の方法によって特定された任意の薬剤との結合で薬剤の競合を測定することによって検定できる。したがって、ハプテンサイズの小分子薬剤は、抗体とその結合パートナーとの結合の干渉として特定できる。
【００６９】
さらにまた、本発明の増殖促進薬剤剤によって表示することができる活性は、ｃ−ｍｅｔ（ＨＧＦ／ＳＦレセプター）の作動（必ずしも作動である必要はないが）である。したがって、そのような作動についてのアッセイは、前記の活性薬剤を特定する方法に含むことができる。
血管形成薬剤を含む増殖促進についてのIn vivoおよびin vitroアッセイは当業者には公知であるが、いくつかの非限定的な例を下記の実施例で述べる。そのようなアッセイに適した細胞はｃ−ｍｅｔを発現する。
【００７０】
本発明を実施する非限定的な例の１つでは、ファージディスプレー系で発現した任意に生成された１２−量体ペプチドを、ＨＧＦ／ＳＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体との結合についてスクリーニングし、前記抗体と結合するペプチドを発現するファージを増幅して再度スクリーニングし、前記工程を３回繰り返した後、２０の陽性クローンを選別した。ペプチド（小分子薬剤も同様に）を生成するまた別の他の方法も同様に有用である。ＨＧＦ／ＳＦに対する抗体と結合するアッセイは上記のように実施するか、または抗体と候補薬剤の直接結合を検定するスクリーニングで実施することができる。さらに小分子またはハプテンの場合には、抗ＨＧＦ／ＳＦ抗体との結合のアッセイは、完全なＨＧＦ／ＳＦもしくは抗体により認識されるエピトープを含む分子フラグメントと抗体との結合の候補薬剤による抑制、または前記抗体とペプチドの１つもしくは本明細書で述べた方法によって以前に増殖促進化合物もしくは血管形成化合物と特定された他の小分子との結合の抑制を測定することによって実施できる。当業者には公知の標準的な免疫アッセイ方法（ＥＬＩＳＡを含む）は、例えば、結合させた抗体および前記抗体に対する標識結合パートナーとともに用いることができる。
【００７１】
抗ＨＧＦ／ＳＦ抗体と結合することができる、または血管形成分子と抗体との結合を干渉することができる化合物を特定するために化合物をスクリーニングした後、前記候補化合物を１つまたは２つ以上の機能的な増殖および／または血管形成アッセイで評価することができる。そのようなアッセイには、内皮細胞増殖アッセイ（これは内皮細胞の増殖に対する化合物の作用をin vitroで測定する）が含まれるがただしこれに限定されない。他のアッセイには、ｃ−ｍｅｔを発現する細胞（例えば内皮細胞、上皮細胞、ニューロン細胞、および平滑筋細胞であるが、ただしこれらに限定されない）の増殖が含まれる。前記の方法は当分野で公知であり、その例は下記の実施例に記載されている。別のアッセイは血管出芽または大動脈リングアッセイで、この場合は、コラーゲンゲルに包埋した大動脈リングからの内皮細胞の成長が評価される。In vivoアッセイでは、基底膜およびテストサンプルを含む固形ゲルをマウスの皮下に埋め込み、一定期間後に、血管のマトリックスへの成長を組織学的に決定する。下記の実施例で示すように、２つのペプチドＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹ（配列番号：１）およびＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨ（配列番号：２）を血管形成アッセイで活性を有するものとして特定した。
さらにまた、いったん薬剤が発見されたら、三次元構造分析を用いて、本明細書に記載したように小分子薬剤を含む他の化合物を作製することができる。
【００７２】
別の実施態様では、増殖促進ペプチドを改変して活性を強化することができる。非限定的手段の１つは、活性ペプチドを硫酸ヘパリン結合ペプチドと結合させることによる。そのような改変には、化学的結合、同じペプチド鎖の同時発現（すなわちペプチド結合による連結）などが含まれる。非限定的な例を挙げれば、リジンに富む配列、ＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ（配列番号：７）を配列番号：２のカルボキシ末端に添加した（配列番号：１０が形成される）。実施例に示すように、結合物の血管形成活性はコントロール結合物よりも約３倍高く、ＳＦおよびｂＦＧＦのマイトジェン活性に匹敵もしくはより高い活性を有していた（前記コントロール結合物では、同じ血管形成ペプチドが非特異的配列（同じアミノ酸組成をもつが硫酸ヘパリン結合活性をもたない）（ＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＱＫＡＫＴＲＡＫＡＡＫＰＤＫＫ（配列番号：８）に結合されてある）。これらのデータは、配列番号：２の増殖促進活性およびおそらく血管形成活性は、そのヘパリンに対する親和性の増加によって強化させることができることを示している。
【００７３】
増殖促進薬剤の使用
上記で述べたように、本発明の血管形成薬剤を含む増殖促進薬剤は、身体の組織および器官の血管新生並びに灌流の増加という目標のために、内皮細胞および微細血管の成長の促進に用いることができる。前記はまた、他の細胞タイプ、例えばｃ−ｍｅｔ発現細胞の増殖促進にも用いることができる。さらにまた上記で特記したように、前記薬剤は局所的に適用または所望の１つの部位もしくは複数の部位にデリバーすることができる。本発明は、血管形成薬剤および一般的に増殖を促進する薬剤のヒトおよび他の哺乳類に対するいずれかの使用および全ての使用を包含するが、例を挙げれば、いくつかの例には以下が含まれる：例えば損傷後の虚血性組織および器官の治療（心臓発作後の心筋の損傷を含む）；他の個体に移して再び結合させた、または移動させた組織または器官の血管新生の促進（例えば器官の異個体移植後、外傷性損傷後）；創傷治癒、皮膚および他の器官の同一個体移植の促進。前記は特に血管の同一個体移植片（graft）および異個体移植片（transplant）の内皮細胞の増殖促進に有用である。
【００７４】
本発明の薬剤は投与に適した医薬組成物に製剤化できる。上記で特記したように、そのような組成物および投与方法には、身体の標的組織および器官の細胞にベクター（例えばウイルスベクターまたは裸のＤＮＡ）をトランスフェクトして本発明の薬剤のin situでの発現を誘発することが含まれる。前記はまた、本発明の１つの薬剤または複数の薬剤を発現している細胞を所望の標的上で局所的に作用させるために埋め込み、薬剤を持続的に生成させることを含む。前記のような細胞は、例えば薬剤に対する感受性をもつように操作し、それによって所望の治療が終結したときに薬剤を発現している細胞を容易に破壊することができる。
【００７５】
抗増殖薬剤の特定
抗増殖活性（血管形成停止活性を含む）を有する薬剤は、ＨＧＦ／ＳＦレセプターｃ−ｍｅｔと結合するそれらの能力によって特定できる。下記実施例で示すように、本明細書で述べるファージディスプレーペプチドライブラリー（これはｐＩＩＩコートタンパク質と融合させた１２−量体の組合せライブラリーを発現する）を、ＨＧＦ／ＳＦレセプターＣ−ｍｅｔの細胞外ドメインとの結合についてスクリーニングした。この方法にしたがって、以下の４つのペプチドを特定し、固相合成によって合成した：ＡＴＷＳＨＨＬＳＳＡＧＬ（配列番号：３）；ＷＰＱＬＰＰＲＰＹＳＴＬ（配列番号：４）；ＳＮＴＳＡＧＴＰＦＴＳＬ（配列番号：５）；およびＤＳＴＰＫＳＴＰＷＹＹＩ（配列番号：６）。
【００７６】
これらのペプチドの内皮増殖を刺激する能力または内皮増殖におけるＨＧＦ／ＳＦ仲介増加を抑制する能力を続いて決定した。これらのペプチドは内皮細胞増殖に顕著な影響は与えなかったが、内皮細胞増殖におけるＳＦ仲介増加を完全に抑制した。これらのデータは、ｍｅｔペプチドはＨＧＦ／ＳＦレセプターＣ−Ｍｅｔと結合し、それによってＨＧＦ／ＳＦの結合を抑制することができることを示している。したがって、これらのペプチドは潜在的な血管形成停止活性を有する可能性がある。さらにまた、腫瘍の血管系の非存在下でin vitroでいくつかの腫瘍細胞の増殖が抑制されることは、本発明の抗増殖薬剤が普遍的な抗増殖活性を有し、必ずしも抗血管形成活性だけではないことを示している。両活性は、ある種の症状、例えば腫瘍細胞標的および腫瘍血管標的の両方を有する固形腫瘍の治療に有用である。
【００７７】
前記のペプチドおよびその保存的置換変種は、上記で述べたように、細胞、組織および器官の成長および増殖の抑制だけでなく組織および器官の血管新生の抑制のために様々に使用される医薬組成物として提供できる。上記でも特記したように、前述の方法を用いて、血管形成停止活性を含む抗増殖活性をもつペプチド以外の薬剤を、ｃ−ｍｅｔと結合する特性をもつ化合物を特定することにより、さらに抗増殖活性（例えば血管形成停止活性であるが、ただしこれに限定されない）を示すことによって特定することができる。さらにまた、いったん薬剤を見つけたら、三次元構造分析を用いて、他の化合物（小分子薬剤を含む）を作製できる。
本発明の抗増殖ペプチドは、ヒト神経膠腫細胞株および神経膠芽腫細胞株の２つの腫瘍モデルで評価した。これらのデータは、Ｃ−ｍｅｔはおのおの単独または一緒になって内因性ＨＧＦ／ＳＦ活性および付随の腫瘍増殖を阻止することができることを示している。
【００７８】
抗増殖薬剤の使用
散布因子（ＨＧＦ／ＳＦ）およびそのレセプターｃ−ｍｅｔの発現は、しばしばヒトの腫瘍（神経膠腫）の悪性進行に付随する。実験的神経膠腫におけるＨＧＦ／ＳＦの過剰発現は、腫瘍形成および腫瘍付随血管形成（すなわち、新生血管の成長）を強化する。より最近の研究は、ヒトの神経膠腫はＨＧＦ／ＳＦ−ｃ−ｍｅｔ依存であり、内因性ＨＧＦ／ＳＦまたはｃ−ｍｅｔの発現の低下は腫瘍の成長および腫瘍形成の抑制をもたらすことができることを示した。したがって、ＨＧＦ／ＳＦ−ｃ−ｍｅｔシグナリング経路を標的とすることは、腫瘍進行の制御で重要なアプローチであろう。
【００７９】
本発明にしたがって治療できる癌、腫瘍、悪性疾患、新形成および他の異常増殖疾患には、白血病（例えば骨髄性およびリンパ性白血病）、リンパ腫、骨髄系増殖疾患、および固形腫瘍（例えば以下であるがただしこれらに限定されない：肉腫および癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、直腸癌、すい臓癌、乳癌、卵巣癌、落屑性細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌腫、腎細胞癌、肝腫瘍、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴覚神経腫、稀突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、および網膜芽細胞腫）が含まれる。
【００８０】
本発明はまた、本発明の薬剤の治療的有効量の投与による非悪性腫瘍および不適切な細胞または組織の増殖を伴う他の疾患の治療を目的とする。例えば、本発明は、動静脈（ＡＶ）の特に頭蓋内の奇形の治療に有用であると考える。本発明はまた、乾癬（炎症および血管の増殖を特徴とする皮膚症状）、良性前立腺肥大（炎症およびおそらくは血管増殖を伴う症状）および皮膚の真菌乾癬の治療に用いることができる。他の過剰増殖疾患の治療もまた意図される。本薬剤はまた、いぼ、先天的あざ、ほくろ、母斑、皮膚ポリープ、脂肪腫、血管腫（先天的血管腫を含む）、および他の皮膚病巣を美容目的または他の目的で除去するために局所的に用いることができる。
上記で特記したように、本明細書の薬剤の他の使用には、例えば動物の飼育および生殖生物学の分野におけるヒトもしくは動物の組織または器官の意図的な除去または破壊が含まれ、堕胎剤として、および特に家畜および家庭用動物（例えばペット）のための生化学的去勢を達成する手段として生育する胚の数を減少させる。
【００８１】
本発明の薬剤は投与のために適切な医薬組成物に製剤化することができる。上記で特記したように、そのような組成物および投与方法は、ベクター並びに本発明のペプチド薬剤および前記ペプチドを含むより大きなポリペプチドを発現する微生物（細胞を含む）を含み、さらに身体の標的組織または器官内の細胞にベクター（例えばウイルスベクターまたは裸のＤＮＡ）をトランスフェクトして本発明の薬剤のin situでの発現を誘発することに及ぶ。前記はまた、本発明の１つの薬剤または複数の薬剤を発現している細胞を所望の標的上で局所的に機能させるために埋め込み、薬剤を持続的に生成させることを含む。前記のような細胞は、例えば薬剤に対する感受性をもつように遺伝子工学的に操作し、それによって所望の治療が終結したときに薬剤を発現している細胞を容易に破壊することができる。
【００８２】
上記で述べた本発明のペプチド薬剤の他に、本発明は、分子量が約１０００ダルトンより小さく、さらにチロシンキナーゼレセプター（例えば肝細胞増殖因子／散布因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ））と結合する種々の増殖因子の生物学的活性を模倣または拮抗する能力を有する種々の有機小分子を特定した。本発明は、前記増殖因子、例えば肝細胞増殖因子／散布因子（ＨＧＦ／ＳＦ）によって表出される種々の活性を非タンパク質性または非ペプチド性小分子を用いて調節する方法を目的とする。本発明は、ＨＧＦ／ＳＦ、ＶＥＧＦまたはＥＧＦ活性を模倣するか、もしくは前記活性を有する有機小分子を、ＨＧＦ／ＳＦ、ＶＥＧＦおよびＥＧＦ活性を抑制もしくは拮抗することができる有機小分子と同様に初めて特定した。したがって、ＨＧＦ／ＳＦ様活性またはＨＧＦ／ＳＦ抑制活性を有する小分子化合物が開示され、さらに種々の症状および疾患の治療を目的とするそれらの使用が本明細書に含まれる。短期および特に長期間にわたる治療目標を達成するために、効果を有する期間にわたって所望のレベルでタンパク質性治療薬剤を投与する場合に付随する困難のために、所望の増殖因子調節活性を有する小分子の本発明による発見は、製造コストにもかかわらず、これまで利用可能な治療ではほとんど治療することができなかった多数の症状および疾患に対して医薬として望ましい手段を提供する。
【００８３】
ＨＧＦ／ＳＦ様活性を有する非タンパク質性または非ペプチド性の小分子化合物は、以下の活性の１つまたは２つ以上を特徴とする：in vitroまたはin vivoでの内皮細胞の増殖促進、in vitroまたはin vivoでの血管形成の促進、in vivoでの創傷における血管形成の促進、in vitroまたはin vivoでの腫瘍細胞の増殖促進、散布の促進、抗アポトーシス活性の促進、または血管形成カスケード関連遺伝子（例えばＩＬ−８およびアンギオポイエチン−２）の遺伝子発現の誘発。本発明の調節化合物は、ＨＧＦ／ＳＦ様活性（本明細書ではＨＧＦ／ＳＦ作動活性と互換的に称する）を示そうと、またはＨＧＦ／ＳＦ抑制活性（本明細書ではＨＧＦ／ＳＦ拮抗活性と互換的に称する）を示そうと、ＨＧＦ／ＳＦレセプターｃ−ｍｅｔを介して作用すると推測される。出願人らは、本発明の化合物の作用原理を開示する義務を負わず、さらにその理論にも拘束されないが、本発明の小分子化合物はｃ−ｍｅｔ活性を調節し、さらにｃ−ｍｅｔと結合する。前述の活性が、外因的に添加されたｃ−ｍｅｔレセプターの存在下で抑制または競合される化合物が好ましい。当業者は、下記実施例で述べる前述のアッセイを実施することによって前記化合物を容易に特定することができる。さらに本発明は、本明細書に記載する目的のためにそのような化合物のいずれかおよび全てを使用することを含む。
【００８４】
本明細書ではＨＧＦ／ＳＦ作動物質および拮抗物質の活性について考察されるが、当業者には、本明細書に記載した研究をベースに他の増殖因子を用いて、前記他の増殖因子に対する作動性化合物および拮抗性化合物が前記と類似の使用によって得られることは理解されよう。
ＨＧＦ／ＳＦ拮抗活性を有する非タンパク質性または非ペプチド性小分子化合物は、以下の１つまたは２つ以上の活性を特徴とする：in vitroまたはin vivoでの内皮細胞の増殖抑制；in vitroまたはin vivoでの腫瘍細胞の増殖、散布または転移の抑制、散布の抑制、抗アポトーシス活性の抑制。前記の活性が外因的に添加されたｃ−ｍｅｔレセプターの存在下で表出される化合物が好ましい。当業者は、下記実施例で述べる前述のアッセイを実施することによって前記のような化合物を容易に特定することができ、本発明は、本明細書に記載する目的にそのような化合物のいずれかおよび全てを使用することを含む。
【００８５】
本発明の有機小分子は、好ましくは１０００ダルトン以下、より好ましくは約２００ダルトンから約１０００ダルトン、もっとも好ましくは約３００ダルトンから約７５０ダルトン、さらにもっとも好ましくは約３００ダルトンから約５００ダルトンの分子量を有する。さらにまた、本化合物は、好ましくはタンパク質でもペプチドでもないが、有機分子の他のいずれかのクラスに入るであろう。
【００８６】
ＨＧＦ／ＳＦ活性を有する化合物は、その多くの事例で（全ての事例というわけではないが）、細胞の増殖または血管の増殖（血管形成）の強化と関係がある多数の症状および疾患の処置で治療的に有用である。これらは上記で詳細に述べた。本発明の特徴の１つは、本明細書に記載した小分子化合物を前記症状および疾患の治療に使用することを含む。前記の症状および疾患は、器官の機能不全および再生、創傷治癒の期間の短縮、慢性心虚血または心筋梗塞の結果としての心筋灌流正常化、虚血組織または器官の血管閉塞後の二次血管発生の進行または増強、および移植組織、器官または創傷治癒の血管新生に関係がある。例えば、細胞増殖の促進、特に血管細胞の増殖促進は、虚血器官、損傷器官または移植器官の治療に適用できる。予防または治療は、血管形成有効量の本発明の化合物と組織を接触させることによって提供できる。接触は、所望の結果を達成するための期間にわたって有効量の薬剤をデリバーできる任意の適切な手段によって提供できる。非限定的な例を挙げれば、所望の標的に適用するか、または輸液、薬浴または持続デリバリー装置の埋め込みによって局所適用を実施できる。全身投与の場合は、経口または非経口ルートを用いることができる。標的細胞または組織は、例えば、肝臓もしくは腎臓、異個体（transplanted）または同一個体（grafted）移植組織または器官（例えば皮膚、心臓、血管組織もしくは腎臓）、虚血器官（例えば心筋梗塞もしくはアンギナ後の心臓）、損傷、外科的措置により損傷した組織または器官、血管組織、神経組織、創傷、潰瘍などであろう。非限定的な例を挙げれば、細胞は、上皮細胞、内皮細胞および平滑筋細胞、並びの前記細胞を含む組織および器官であろう。神経組織、歯および他の組織の増殖および／または再生の促進も本発明に含まれる。好ましい細胞、器官および組織はｃ−ｍｅｔレセプターを含む。ＨＧＦ／ＳＦ活性を有する前述の化合物はまた、種々の肝疾患（肝硬変および肝不全を含む）、種々の腎疾患（腎不全を含む）の治療に当を得て有用である。本化合物はまた骨再生の誘発に有用である。
【００８７】
ある好ましい実施態様では、真性糖尿病の特徴である内皮細胞機能障害、血管症および治癒不全では本発明の方法および化合物がとりわけ有用である。
したがって、本発明の特徴の１つは、ＨＧＦ／ＳＦ活性が所望されるかまたは活性の増加が所望される、哺乳類の症状または疾患の予防または治療の方法を目的とし、前記方法は、哺乳類にＨＧＦ／ＳＦ活性を有する小分子化合物の有効量を投与することを含む。本発明の小分子化合物のＨＧＦ／ＳＦ活性は、ｃ−ｍｅｔの存在下で、またはｃ−ｍｅｔとの予備インキュベーションによって抑制または阻止される。
【００８８】
本発明のまた別の明瞭な特徴では、ＨＧＦ／ＳＦ活性と拮抗する化合物は、ＨＧＦ／ＳＦ活性が望ましくない症状および疾患の治療のために治療的に望ましい特性を有する。前記の小分子化合物のいずれかまたは全ての使用は本発明に含まれる。例えば、異常な細胞増殖（例えば異常増殖疾患（例えば種々の癌および乾癬）で生じる）は、そのようなふさわしい症状である。他の症状にはとりわけ、増殖性構成要素を示す（例えばアテローム性硬化症の内膜肥厚および平滑筋細胞の増殖）炎症性疾患が含まれる。
したがって、本発明の別の実施態様は、ＨＧＦ／ＳＦ活性が所望されないかまたは活性の低下が所望される、哺乳類の症状または疾患の予防または治療の方法を目的とし、前記方法は、哺乳類にＨＧＦ／ＳＦ拮抗活性を有する小分子化合物の有効量を投与することを含む。本発明の小分子ＨＧＦ／ＳＦ拮抗化合物のＨＧＦ／ＳＦ拮抗活性は単独で出現することもあり、または外因的に添加されたＨＧＦ／ＳＦの存在下でのみ出現することもあり、またはＨＧＦ／ＳＦが発現している細胞もしくは組織で出現することもある。
【００８９】
散布因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、およびそのレセプター（ｃ−ｍｅｔ）の発現は、しばしばヒトの腫瘍（神経膠腫を含む）の悪性進行（転移）に付随する。実験的神経膠腫におけるＨＧＦ／ＳＦの過剰発現は、腫瘍原性および腫瘍付随血管形成（すなわち新生血管の成長）を強化する。より最近の研究では、ヒトの神経膠芽腫はＨＧＦ／ＳＦ−ｃ−ｍｅｔ依存性であり、内因性ＨＧＦ／ＳＦまたはｃ−ｍｅｔの減少は腫瘍成長を抑制および腫瘍形成を抑制することができることが示された。したがって、上記の特徴を有する化合物を用いてＨＧＦ／ＳＦ−ｃ−ｍｅｔシグナリング経路を標的とすることは腫瘍の進行制御における重要なアプローチである。
【００９０】
本発明はまた、非悪性腫瘍および不適切な細胞または組織の成長を伴う他の疾患を、本発明の薬剤の治療的に有効な量を投与することによって治療することを目的とする。例えば、本発明は、動静脈（ＡＶ）奇形（特に頭蓋内におけるＡＶ奇形）の治療に有用であると考える。本発明はまた、乾癬（炎症および血管の増殖を特徴とする皮膚症状）、良性前立腺肥大（炎症およびおそらくは血管の増殖を伴う症状）、および皮膚の真菌感染を治療するために用いることができる。他の過剰増殖疾患の治療も意図されている。本発明の薬剤はまた、いぼ、先天的あざ、ほくろ、母斑、皮膚ポリープ、脂肪腫、血管腫（先天的血管腫を含む）、および他の皮膚病巣を美容目的または他の目的で除去するために局所的に用いることができる。
【００９１】
本発明のＨＧＦ／ＳＦ活性調節小分子化合物は、以下に示すように一般的に４つの群に分類される。本明細書で用いられるように、“アルキル”という用語は、直鎖、分枝鎖、または環式飽和脂肪族炭化水素基（好ましくは１から約６個の炭素原子を含む）を指す。前記の直鎖基の代表は、メチル、エチル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどである。分枝鎖基の例には、イソプロピル、イソブチルおよびｔ−ブチルが含まれる。シクロアルキルには、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが含まれるが、ただしこれらに限定されない。“アリール”という用語は、例えば、フェニル、ビフェニルおよびナフチル基を指し、前記は場合によって、１つまたは２つ以上のハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）、Ｃ１からＣ４アルキルまたはＣ１からＣ４アルキルオキシで置換されてあり、ここでアルキルオキシは、上記で定義したアルキル基が分子の残りの部分と酸素によって結合させられてあるものを指す。アルキルオキシの例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシなどが含まれる。“ヘテロアリール”という用語は、４から１０個の環員並びに酸素、窒素および硫黄から成る群から選択される１から３個のヘテロ原子を含む複素環式基を指す。前記の例にはイソキサゾリル、フェニルイソキサゾリル、フリル、ピリミジニル、キノリル、テトラヒドロキノリル、ピリジル、イミダゾリル、ピロリジニル、１，２，４−トリアゾイリル、チアゾリル、チエニルなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。アリールまたはヘテロアリール基は、場合によって１つまたは２つ以上のハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）、Ｃ１からＣ４アルキル、Ｃ１からＣ４アルキルオキシ（上記で述べたとおりである）、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、ニトロ、ヒドロキシ、アミン（場合によってアルキル置換されてある）、または別のアリールもしくは別のヘテロアリール基（上記で述べたとおりである）よって置換されてあってもよい。
【００９２】
ＨＧＦ／ＳＦ様作動活性または拮抗活性を有する本明細書に記載した有機化合物は、ＨＧＦ／ＳＦの活性の１つまたは２つ以上を調節し、さらにそれらの使用が本明細書に包含される化合物の単なる例示である。
下記に記載する化合物および製剤の中であるものは公知であり、他のものはこれまで報告されていない。本発明は、本明細書に記載する活性の１つまたは２つ以上を有するそのような新規な化合物の全てを、前記化合物を含む医薬組成物と同様に包含する。
【００９３】
ある実施態様では、本発明は、下記一般式Ｉを有しＨＧＦ／ＳＦ活性を調節する化合物を、前述のいずれか１つまたは２つ以上の目的に使用することを目的とする：
【００９４】
【化１３】
Figure 0004993834
【００９５】
式中、
Ｒ３およびＲ５は、それぞれ別個にまたは一緒になって直鎖もしくは分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル（場合によってシアノまたはハロゲンで置換されてある）、ハロゲン、トリフルオロメチルまたはジフルオロメチル基であり；
Ｒ１は、水素、メチル、ＣＯ−アリール、ＳＯ2−アリール、ＣＯ−ヘテロアリールまたはＣＯ−アルキルであり；さらに
Ｒ４はＣＨ2−アリール、ハロゲン、アリールカルボニルビニルまたはＳ−ヘテロアリールである。
置換基の定義は上記で述べたとおりである。Ｒ３およびＲ５は、好ましくはメチル、ｔ−ブチルまたはクロロ基であろう。置換基Ｒ１のアリール基は、好ましくは芳香族基、例えばフェニル、ナフチル、またはビフェニルであって、１つまたは２つ以上のハロゲン、Ｃ１からＣ４アルキルまたはＣ１からＣ４アルキルオキシ基で置換されてある。置換基Ｒ１のヘテロアリール基は、好ましくは３−アリール−置換イソキサゾールまたは３−アリール−置換チエニル基である。置換基Ｒ１のアルキル基は好ましくは、ｔ−ブチルまたはＣ１−Ｃ６直鎖、分枝もしくはシクロアルキル基である。もっとも好ましい実施態様では、Ｒ３はメチルであり、Ｒ５はクロロであり、Ｒ１はメチルであり、さらにＲ４は４−クロロフェニルカルボニルビニル基である。
【００９６】
式Ｉの化合物のあるものは新規であり、本発明はそのような新規化合物の全てを目的とする。本発明はまた、少なくとも１つの式Ｉの化合物を医薬的に許容できる担体中に含む、本明細書で述べるいずれかの使用のための医薬組成物を目的とする。
本発明はまた、ＨＧＦ／ＳＦの作用が有益である哺乳類の症状または疾患の予防または治療方法を目的とし、前記方法は、上記の式Ｉを有するＨＧＦ／ＳＦ作動物質を含む医薬組成物の有効量を前記哺乳類に投与することを含む。上記で述べたように、前記の活性には、細胞（とりわけ内皮細胞、血管細胞、肝細胞、腎細胞が含まれる）の増殖促進；血管形成促進；血管新生促進；創傷治癒および創傷治癒の血管形成促進；虚血組織の血流改善；および内在的に存在するかまたは外因的に投与されたＨＧＦ／ＳＦの所望の生物活性に付随する他の所望される活性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ＨＧＦ／ＳＦ拮抗活性を示す式Ｉの化合物（当業者には容易に決定できる）は、ＨＧＦ／ＳＦの作用が望ましくない哺乳類の症状または疾患の予防または治療に有用であろう。前記は、上記の式Ｉを有する活性なＨＧＦ／ＳＦ拮抗物質を含む医薬組成物の有効量を哺乳類に投与することによって実施される。前記の用途には、血管形成または新生血管形成の抑制、腫瘍の成長または転移の防止、散布の抑制、および抗アポトーシス活性の抑制が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
さらに別の実施態様では、本発明は、そのＨＧＦ／ＳＦ様活性がＨＧＦ／ＳＦレセプター、ｃ−ｍｅｔの存在下、またはｃ−ｍｅｔとの予備インキュベーションによって抑制される式Ｉの化合物の治療的に有効な量を用いて、前述の症状および疾患を予防または治療する方法を目的とする。
【００９７】
式Ｉを有するＨＧＦ／ＳＦ活性調節物質の非限定的な例には以下の化合物が含まれるが、それらの大半は、下記実施例で示されるようにＨＧＦ／ＳＦ作動活性を示す：
３−（５−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
［４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル］メタノン
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）メタノン
４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１−（（３，４−ジクロロフェニル）スルフォニル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール
４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール
４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール
（４−ブロモ−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド）
３−（４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパンニトリル
３，５−ジ（ｔ−ブチル）−４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２，６−ジクロロフェニル）メタノン
１−（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）２，２−ジメチルプロパン−１−オン
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（４−クロロフェニル）メタノン
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２−チエニル）メタノン
（４−クロロフェニル）（３，５−ジメチル−４−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）チオ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン。
【００９８】
別の実施態様では、本発明は、下記一般式ＩＩを有する、ＨＧＦ／ＳＦ活性を調節する化合物を上記の目的のいずれか１つまたは２つ以上のために使用することを目的とする：
【００９９】
【化１４】
Figure 0004993834
【０１００】
式中、
Ｒ５は、Ｃ１からＣ６の分枝または直鎖アルキル基であり；
Ｒ３は、置換または非置換アリール基であり；
Ｒ１は、水素またはＣ１からＣ４の直鎖、分枝もしくはシクロアルキル基であり；
Ｒ２は、ＣＯＣＨ2ＯＮＣＨ−アリール；ヘテロアリール、ＣＯＣＨ2ＣＨ2アリール；アリール；ＣＯＳ−アリール；ＣＯ−ヘテロアリール；Ｃ１からＣ４の直鎖アルキル、分枝アルキルまたはシクロアルキルであるか；またはＲ１およびＲ２は５または６個の炭素原子の環式基を形成する。
置換基は上記で定義したとおりである。好ましくは、Ｒ５はメチルであり、Ｒ３は、好ましくはアルキル−、ハロゲン−またはアルキルオキシ−置換フェニル基、例えば２，６−ジクロロフェニルである。Ｒ１は、好ましくは水素またはメチルである。Ｒ２は、好ましくは置換ピリジル基（例えば２−（６−トルフルオロメチル）ピリジル）、置換アリールチオカルボニル基（例えば２−（ニトロフェニル）チオカルボニル）、または４−アリール−置換−５−メチルイソキサゾンカルボニル基である。
【０１０１】
式ＩＩの化合物のあるものは新規であり、本発明はそのような新規な化合物の全てを目的とする。本発明はまた、少なくとも１つの式ＩＩの化合物を医薬的に許容できる担体中に含む、本明細書で述べるいずれかの使用を目的とする医薬組成物もまた目的とする。
したがってこの特徴では、本発明は、ＨＧＦ／ＳＦの作用が望ましくない哺乳類の症状または疾患の予防または治療方法を目的とし、前記方法は、上記の式ＩＩを有する活性なＨＧＦ／ＳＦ拮抗物質を含む医薬組成物の有効量を前記哺乳類に投与することによって実施される。前記の用途には、血管形成もしくは新生血管形成の抑制、腫瘍の成長もしくは転移の抑制、散布の抑制、および抗アポトーシス活性の抑制が含まれるが、ただしこれらに限定されない。上記で特記したように、式ＩＩのいくつかの化合物はＨＧＦ／ＳＦ様活性を示し、同様に、上記の式ＩＩの活性なＨＧＦ／ＳＦ作動物質を含む医薬組成物の有効量を前記哺乳類に投与することによって、ＨＧＦ／ＳＦの作用が有益である哺乳類の症状または疾患の予防または治療に有用である。上記で述べたように、前記の活性には、細胞（とりわけ内皮細胞、血管細胞、肝細胞、腎細胞が含まれる）の増殖促進；血管形成促進；血管新生促進；創傷治癒および内皮細胞の機能不全の治療；虚血組織への血流改善；および内在的に存在するかまたは外因的に投与されたＨＧＦ／ＳＦの所望の生物学的活性に付随する他の所望される活性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。式ＩＩの化合物の活性は当業者には容易に決定できよう。
【０１０２】
さらに別の実施態様では、本発明は、そのＨＧＦ／ＳＦ拮抗活性が外因的に添加されるかまたは内因的に産生されたＨＧＦ／ＳＦの存在下で出現する、式ＩＩの化合物の治療的に有効な量を用いて、前述の症状または疾患を予防または治療する方法を目的とする。
【０１０３】
式ＩＩの化合物の非限定的な例には以下が含まれる：
Ｎ´４，５−ジメチル−Ｎ´４−（５−ニトロ−２−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（２−（（（２，４−ジクロロベンジリデン）アミノ）オキシ）アセチル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロパノイル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
２−ニトロフェニル２−（（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）カルボニル）ヒドラジン−１−カルボチオエート
Ｎ´４−（（２−メチル−１，３−チアゾール−４−４イル）カルボニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−４カルボヒドラジド
Ｎ１−（（２−（（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）カルボニル）ヒドラジノ）（メチルチオ）メチリデン）ベンゼン−１−スルホンアミド
Ｎ´４−（２，４，６−トリクロロフェニル）−３−３（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４，３−ジ（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（３，５−ジクロロ−４−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−フェニル−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４，Ｎ´４，５−トリメチル−３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ４−アゼパン−１−イル−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボキシアミド
Ｎ´４−（６−（トリフルオロメチル）−２−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（６−（トリフルオロメチル）２−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（３，３−ジエトキシプロパノイル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド。
【０１０４】
さらに別の実施態様では、本発明は、下記一般式ＩＩＩを有する、ＨＧＦ／ＳＦ活性を調節する化合物を前述の目的に使用することを目的とする：
【０１０５】
【化１５】
Figure 0004993834
【０１０６】
式中、
Ｒ１は、ＳＯ2アルキル、ＳＯ2アリール、ＣＯ−ｔ−ブチル、ＣＯアリール、ＣＯＮＨアルキル、ＣＯＮＨアリールであり；さらに
Ｒ３は、ＣＨＣＨヘテロアリール、フェノキシフェニル、ヘテロアリールまたはアリール置換ヘテロアリールである。
好ましくは、Ｒ１は、ＳＯ2アルキル（ここでアルキルはＣ１からＣ４の直鎖、分枝鎖またはシクロである）、もっとも好ましくはＳＯ2ＣＨ3；ＳＯ2−アリール（ここでアリールは、ハロ、Ｃ１−Ｃ４アルキルもしくはアルキルオキシ置換フェニルである）；ＣＯアルキル（ここでアルキルはＣ１からＣ６直鎖アルキル、分枝アルキルまたはシクロアルキルである）、もっとも好ましくはＣＯ−ｔ−ブチル；ＣＯアリール（ここでアリールはハロ、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアルキルオキシで置換されたフェニルである）；ＣＯＮＨアルキル（ここでアルキルはＣ１からＣ６の直鎖アルキル、分枝アルキルまたはシクロアルキルである）、もっとも好ましくはＣＯＮＨＣＨ3；またはＣＯＮＨアリール（ここでアリールはハロ、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルキルオキシで置換されたフェニルである）であろう。Ｒ３は、ＣＨＣＨ−ヘテロアリール（ここでヘテロアリールはシスおよびトランスＣＨＣＨ−３−チエニル、ＣＨＣＨ−２−フリル並びにＣＨＣＨ−３−フリル並びに置換ＣＨＣＨ−チエニルおよびＣＨＣＨ−フリルを含むが、ただしこれらに限定されない）、もっとも好ましくはＣＨＣＨ−２−チエニル；フェノキシフェニル；ヘテロアリール；またはアリール置換ヘテロアリールであろう。
式ＩＩＩの化合物のあるものは新規であり、本発明はそのような新規な化合物の全てを目的とする。本発明はまた、少なくとも１つの式ＩＩＩの化合物を医薬的に許容できる担体中に含む、本明細書で述べるいずれかの使用を目的とする医薬組成物もまた目的とする。
【０１０７】
本発明はまた、ＨＧＦ／ＳＦの作用が有益である哺乳類の症状または疾患の予防または治療方法を目的とし、前記方法は、上記の式ＩＩＩを有する活性なＨＧＦ／ＳＦ作動物質を含む医薬組成物の有効量を前記哺乳類に投与することによる。上記で述べたように、前記の活性には、細胞（とりわけ内皮細胞、血管細胞、肝細胞、腎細胞が含まれる）の増殖促進；血管形成促進；血管新生促進；創傷治癒の改善または強化；内皮細胞の機能不全の治療；虚血組織への血流改善；および内在的に存在するかまたは外因的に投与されたＨＧＦ／ＳＦの所望の生物学的活性に付随する他の所望される活性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ＨＧＦ／ＳＦ拮抗活性を示す式ＩＩＩの化合物（当業者には容易に決定できる）は、ＨＧＦ／ＳＦの作用が望ましくない哺乳類の症状または疾患の予防または治療に有用であろう。前記は、上記の式ＩＩＩを有する活性なＨＧＦ／ＳＦ拮抗物質を含む医薬組成物の有効量を哺乳類に投与することによって実施される。前記の用途には、血管形成または新生血管形成の抑制、腫瘍の成長または転移の防止、散布の抑制、および抗アポトーシス活性の抑制が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
さらに別の実施態様では、本発明は、そのＨＧＦ／ＳＦ様活性がＨＧＦ／ＳＦレセプター、ｃ−ｍｅｔの存在下、またはｃ−ｍｅｔとの予備インキュベーションによって抑制される式ＩＩＩの化合物の治療的に有効な量を用いて、前述の症状および疾患を予防または治療する方法を目的とする。
【０１０８】
前記の化合物は一般にＨＧＦ／ＳＦ刺激活性または作動活性を示す。非限定的な式ＩＩＩの化合物例には以下が含まれる：
（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン；
１−（メチルスルホニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール；
２，２−ジメチル−１−（３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパン−１−オン；
Ｎ−メチル−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
（４−クロロフェニル）（３−（３−フェニルイソキサゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
（４−クロロフェニル）（３−（３−（４−クロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
（４−クロロフェニル）（３−（５−（２−チエニル）−２チエニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
（２，４−ジクロロフェニル）（３−（５−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−フリル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
Ｎ１−フェニル−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド
（４−クロロフェニル）（３−（２−（５−（２−チエニル）−２−チエニル）−４−メチル−１，３−チアゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
（３−ベンゾヒドリル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（４−クロロフェニル）メタノン；
Ｎ１−（４−クロロフェニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
（４−クロロフェニル）（３−（２−メチルイミダゾ（１，２−ａ）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
２−クロロ−６−（４−（１−（４−クロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）フェノキシ）ベンゾニトリル；
１−（（４−クロロフェニル）スルフォニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール。
【０１０９】
さらに別の実施態様では、本発明は、下記一般式ＩＶを有するＨＧＦ／ＳＦ活性を調節する化合物を前述のいずれか１つまたは２つ以上の目的に使用することを目的とする：
【０１１０】
【化１６】
Figure 0004993834
【０１１１】
式中、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり；さらに
Ｒ２は、１つまたは２つ以上のハロゲン、ニトロ、Ｃ１からＣ４の直鎖アルキル、分枝アルキルもしくはシクロアルキル、またはＣ１からＣ４アルキルオキシ基である。
前記の置換基の定義は上記に記載されている。好ましくは、Ｒ１は、１つまたは２つ以上のハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルもしくはＣ１−Ｃ４アルキルオキシ基で置換されたフェニル基、またはヘテロアリール（もっとも好ましくは４−ブロモ−２−チエニル、４−ピリジル、２−フリル、３−チエニル）で、ハロゲンおよび／またはＣ１−Ｃ４アルキルで置換されてある。Ｒ２は、好ましくはハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ）、ニトロ、またはＣ１−Ｃ４直鎖アルキル、分枝アルキルもしくはシクロアルキル基、またはＣ１−Ｃ４アルキルオキシ基であり、もっとも好ましくは、Ｒ２はメチル基およびクロロ基である。
式ＩＶの化合物のあるものは新規であり、本発明はそのような新規化合物の全てを目的とする。さらに、本発明はまた、少なくとも１つの式ＩＶの化合物を医薬的に許容できる担体中に含む、本明細書で述べるいずれかの使用を目的とする医薬組成物を目的とする。
【０１１２】
式ＩＶの化合物のあるものはＨＧＦ／ＳＦ作動活性を示し、他のものはＨＧＦ／ＳＦ拮抗活性を示す。当業者は、前記化合物の活性、および前記化合物がそのような活性を示す用量を容易に決定することができる。したがって、本発明はまた、ＨＧＦ／ＳＦの作用が有益である哺乳類の症状または疾患の予防または治療方法を目的とし、前記方法は、上記の式ＩＶを有する活性なＨＧＦ／ＳＦ作動物質を含む医薬組成物の有効量を前記哺乳類に投与することによって実施される。上記で述べたように、前記の活性には、細胞（とりわけ内皮細胞、血管細胞、肝細胞、腎細胞が含まれる）の増殖促進；血管形成促進；血管新生促進；創傷治癒の改善；創傷治癒の血管新生の改善；内皮細胞の機能不全の改善；虚血組織への血流改善；および内在的に存在するかまたは外因的に投与されたＨＧＦ／ＳＦの所望の生物学的活性に付随する他の所望される活性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ＨＧＦ／ＳＦ拮抗活性を示す式ＩＶの化合物（当業者には容易に決定できる）は、ＨＧＦ／ＳＦの作用が望ましくない哺乳類の症状または疾患の予防または治療に有用であろう。前記は、上記の式ＩＶを有する活性なＨＧＦ／ＳＦ拮抗物質を含む医薬組成物の有効量を哺乳類に投与することによって実施される。前記の用途には、血管形成または新生血管形成の抑制、腫瘍の成長または転移の防止、散布の抑制、および抗アポトーシス活性の抑制が含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらにまた。式ＩＶの化合物は増殖因子ＶＥＧＦおよびＦＧＦに対して拮抗活性を示し、ＶＥＧＦまたはＦＧＦ活性の抑制が所望されるいずれかの症状または疾患の治療に用いることができる。
さらに別の実施態様では、本発明は、そのＨＧＦ／ＳＦ様活性がＨＧＦ／ＳＦレセプター、ｃ−ｍｅｔの存在下、またはｃ−ｍｅｔとの予備インキュベーションによって抑制される式ＩＶの化合物の治療的に有効な量を用いて、前述の症状および疾患を予防または治療する方法を目的とする。
【０１１３】
この群の化合物は、ＨＧＦ／ＳＦ作動物質であるか、または拮抗物質であろう。式ＩＶを有する調節物質の非限定的な例には以下が含まれる：
１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２−クロロ−６−フルオロフェニル）−１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（３，４−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（４−フルオロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−（２，４−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−１−（４−ブロモフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（３−フェノキシ−２−チエニル）−１−（２−チエニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（３−ブロモ−４−メトキシフェニル）−１−フェニルプロパ−２−エン−オン；
３−（３，４−ジクロロフェニル）−１−（２−ニトロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−（３，４−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−（３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（２−クロロフェニル）−３−（３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−クロロフェニル）−１−（２，６−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−ブロモフェニル）−３−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（２−クロロフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２，６−ジクロロフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（２−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２，６−ジクロロフェニル）−１−（２−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（３，４−ジクロロフェニル）−１−（２−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（５−ブロモ−２−ヒドロキシフェニル）−１−（３−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（５−ブロモ−２−ヒドロキシフェニル）−１−（４−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（３−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−［４−アミノ−２−（メチルチオ）−１，３−チアゾール−５−イル］−３−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］プロパ−２−エン−１−オン；
１−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−３−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１，３−ジ（５−ニトロ−３−チエニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１−（４−ブロモフェニル）−３−（３，５−ジフルオロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
３−（３，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−ニトロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン。
【０１１４】
上記で述べた式ＩＶの化合物は、有機合成化学の分野の業者には容易に利用できる下記の標準的な方法にしたがって合成および単離することができる。さらにまた、前記化合物は、上記で述べたようにＨＧＦ／ＳＦの望ましい活性または望ましくない活性と関連する症状または疾患のいずれかを予防または治療するために有効な用量で哺乳類（好ましくはヒト）に投与するために許容できる純度で容易に製造することができる。
種々の使用、医薬組成物を含む製剤、および用量についての考察は上記で述べたとおりである。
【０１１５】
前述の考察は、ＨＧＦ／ＳＦ活性、（およびそのレセプター、ｃ−ｍｅｔ）の促進または抑制に有用な化合物を基本的に目的としているが、そのような考察は、一般的に増殖因子、特にその活性がチロシンキナーゼレセプターとの結合を必要とする増殖因子の作動物質および拮抗物質に適用することができる。下記の実施例で示されるように、本発明の化合物は、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ活性の抑制を示し、さらに他の化合物はＶＲＧＦ様活性を示した。本発明は、一般的に前記の増殖因子を指向する種々の作動活性および拮抗活性のための薬剤として、前記化合物だけでなく他のチロシンキナーゼレセプター増殖因子および小分子化合物（本明細書に記載されたものを含むがただしこれらに限定されない）も同様に包含する。
本発明は、以下の非限定的実施例（これらは本発明の例示として提供される）を参照することによって理解が容易になるであろう。下記の例は本発明の好ましい実施態様をより十分に説明するために供されるが、それらを本発明の明瞭な範囲を制限するものと解してはならない。
【０１１６】
【実施例】
実施例１
方法
ペプチドライブラリー：Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレーペプチドライブラリー（New England BioLabs）を用いた。最初のライブラリーは１．５×１０9ｐｆｕ／μＬを含んでいた。このペプチドライブラリーは、Ｍ１３ファージの小コートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合させた１２−量体のランダムペプチドの組合せライブラリーをベースにしている。表示した１２−量体ペプチドはｐＩＩＩのＮ−末端に発現される。
ファージディスプレー：ＨＧＦ／ＳＦのペプチド模倣物質を特定するために、ポリクローナルＨＧＦ／ＳＦ抗体（８１３、ウサギ）およびモノクローナルＨＧＦ／ＳＦ抗体（クローン−２３Ｃ２）を用いて、ペプチドライブラリーを各々２回スクリーニングした。抗体は、ＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ８）で希釈し（最終濃度〜１００μｇ／μＬ）、９６穴（ウェル）プレートを１００μＬの抗体で１６時間４℃で被覆した。ウェルをＴＢＳ（０．１％トゥイーン２０を含むトリス緩衝食塩水）で洗浄した。出発のファージの１０μＬ（４×１０10）を１０ｍＬに希釈し、前記溶液の１００μＬを抗体被覆プレートと穏やかに揺らしながら６０分室温でインキュベートした。非結合ファージを除去し、ウェルをＴＢＳＴで１０回洗浄した。結合ファージを１００μＬの溶出緩衝液（０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ；ｐＨ２．２、１ｍｇ／ｍＬのアルブミン）で溶出させ、１５ｍＬのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和して増幅させた。第１巡目の溶出液の力価は２×１０10ｐｆｕ／μＬであった。生物学的選別の第２巡目は、上記の第１回目の増幅ファージ２×１０11ｐｆｕを用いて実施した。前記手順をさらにもう１回繰り返した。
【０１１７】
結合クローンの性状決定およびペプチド合成：３巡目で２０クローンを釣り上げてコンセンサス結合配列を検出した。１０個のクローンはモノクローナル抗体プレートから、１０個のクローンはポリクローナル抗体プレートから得た。以下の増幅ＤＮＡを抽出し、配列を決定した。配列決定した２０クローンから９個の固有配列を特定した：ＳＧＷＨＭＲＳＰＦＮＨＭ（配列番号：１２）；ＨＬＫＰＨＦＷＰＳＳＰＹ（配列番号：１３）；ＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹ（配列番号：１）；ＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨ（配列番号：２）；ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号：１４）；ＮＨＰＨＰＴＰＡＲＧＩＩ（配列番号：１５）；ＶＳＲＨＱＳＷＨＰＨＤＬ（配列番号：１６）；ＡＬＮＷＳＲＫＬＰＶＰＰ（配列番号：１８）；ＱＴＧＨＷＮＡＥＷＨＴＲ（配列番号：１９）。固相ペプチド合成装置（North Shore University Research Building）を用いて前記のＤＮＡ配列をベースにしてペプチドを合成した。
【０１１８】
内皮細胞増殖：ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）およびヒト微細血管内皮細胞（ＭＭＥＣ）を増殖アッセイに用いた（１９）。ＢＡＥＣは、１０％ＦＢＳを含む最少必須培養液で増殖させた。ＨＭＥＣは、１０％ＦＢＳおよび１０％NuSerumを含むＲＰＭＩ培養液で増殖させた。内皮細胞増殖は以前の報告にしたがって測定した。細胞が互いに融合するまでに達していない（サブコンフルエント）（５０−６０％）の内皮細胞を、種々の濃度のペプチドまたは増殖因子を含む血清非含有培養液中で１６時間から２４時間インキュベートした。続いて3Ｈ−チミジンを培養液に添加し、さらに４から５時間培養条件下でインキュベーションを継続した。細胞を洗浄し、3Ｈ−チミジンの取り込み（ＤＮＡ合成の増加）を測定した。
【０１１９】
血管出芽（大動脈リング）アッセイ：ラット動脈リングの血管形成アッセイは、以前の報告（２０）に従って実施した。簡単に記せば、１ｍｍの長さの大動脈リングをラットの動脈から分割し、コラーゲンゲルに埋め込んだ。ゲル化の後、配列番号：２（１００μｇ／ｍＬ）またはＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）の非存在下（コントロール）または存在下で、４％血清を含む培養液中で前記切断片をインキュベートした。
ネズミ血管形成アッセイ：血管形成は、皮下組織からテストサンプルを含む基底膜の固形ゲル中への血管の成長としてアッセイした。以前に報告されたように（２１）、液状形のマトリゲル（Matrigel）（０．５ｍＬ）を配列番号：２または塩基性線維芽細胞増殖因子と混合し、ネズミの腹腔皮下組織に注射した。１０日後に、ネズミを殺し、マトリゲル塊を取り出し、固定して切片を作製し、染色して血管の内方向成長について調べた。
【０１２０】
実施例２
ＨＧＦ／ＳＦ抗体−結合ペプチド
前記９つのペプチドのうちの２つ、ＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹおよびＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨ（それぞれ配列番号：１および配列番号：２と称する）は、内皮細胞増殖を刺激することが示され、更なる性状決定に付した。
内皮細胞と配列番号：１および配列番号：２（１００μｇ／ｍＬ）とのインキュベーションによって、3Ｈ−チミジンのＤＮＡへの取り込みは顕著に増加した（ｐ＜０．０１）。前記の増加は、ＨＧＦ／ＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）によって示された増加に匹敵する。図１に示されているように、サブコンフルエントの内皮細胞を配列番号：２（１００μｇ／ｍＬ）または散布因子（ＨＧＦ／ＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬ）と血清非含有培養液中で培養条件下で２４時間インキュベートした。続いて3Ｈ−チミジンを添加し、５時間後にＤＮＡ合成を調べた。値は６回の測定の平均±ＳＤを示す。*ｐ＜０．０１
【０１２１】
配列番号：２で表されるペプチドは、in vitro血管形成アッセイで微小血管の成長を刺激した。図２は、ラット大動脈リングアッセイでの血管形成に対するペプチド４（配列番号：２）およびＨＧＦの作用を示している。１ｍｍの長さの大動脈リングをラットの大動脈から分割し、コラーゲンゲルに埋め込んだ。ゲル化後に、配列番号：２（１００μｇ／ｍＬ）またはＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）の非存在下（コントロール）または存在下で４％血清を含む培養液中で切断片をインキュベートした。値は平均±ＳＤを示す（ｎ＝７０−１２０）。
前記ペプチドの血管の成長をin vivoで誘発する能力を調べた。前記実験は、パラゴンバイオサービス（Paragon Bioservices, Baltimore,MD）で実施された。前記アッセイでは、配列番号：１もしくは配列番号：２または等量の水（コントロール）をマトリゲル（再構成した基底膜のマトリックス）と混合した。サンプルをマウスに皮下注射した。１０日後に、組織学的分析および形態測定分析のためにマウスを殺した。配列番号：２を含むゲル塊では内皮細胞の数は極めて増加した（図３、ｐ＜０．０００１、ｎ＝５６）。
【０１２２】
実施例３
ヘパリン結合配列の付加は増殖促進活性を強化する
ＨＧＦ／ＳＦはヘパリン結合タンパク質であり、最近の研究では、細胞表面結合ＨＧＦ／ＳＦ、ＨＳＰＧは、ｃ−ｍｅｔによるＨＧＦ／ＳＦ誘発シグナルトランスダクションを極めて強化することが示された（１１，２２）。配列番号：２の増殖促進活性が、そのヘパリン親和性の増加によって強化されるか否かを決定するために、リジンに富むヘパリン結合配列（２３）を配列番号：２のカルボキシ末端に付加した（“ＨＳ−Ｐ４”；ＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ［配列番号：７］）。同じアミノ酸組成をもつ非特異的配列を付加し、非特異的コントロールとして処理した（“ＮＳ−Ｐ４”；ＫＶＷＹＨＴＴＳＩＰＳＨＣＱＫＡＫＴＲＡＫＡＡＫＰＤＫＫ［配列番号：８］）。ＨＳ−Ｐ４およびＮＳ−Ｐ４の内皮細胞増殖刺激能は、配列番号：２（図４Ａ）および増殖因子（図４Ｂ）に匹敵した。内皮細胞をペプチドと２４時間インキュベートし、さらに3Ｈ−チミジンの取り込みを測定した。ＨＳ−Ｐ４は内皮細胞増殖を約３倍増加させたがＮＳ−Ｐ４では増加させず（図４Ａ）、前者はＨＧＦ／ＳＦおよびｂＦＧＦのマイトジェン活性と匹敵するかまたはそれよりも高かった（図４Ｂ）。前記のデータは、配列番号：２の増殖促進活性およびおそらくは血管形成活性は、ヘパリンに対する親和性の増加によって強化できることを示唆している。
【０１２３】
実施例４
散布因子レセプターｃ−ｍｅｔと結合するペプチドの特定
Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレーペプチドライブラリーを上記のように用いた。ＨＧＦ／ＳＦレセプターＣ−ｍｅｔの細胞外ドメインをＲ＆Ｄシステムズから入手した。ペプチドライブラリーは、ＨＧＦ／ＳＦ抗体のスクリーニングについて上記で述べたようにＣ−ｍｅｔで被覆したプレートを用いて２回スクリーニングした。１８個の結合クローンの配列を決定した。前記のうちで、１５クローンが固有の配列を含んでいることが判明した。４つのペプチド（配列番号：３、４、５および６）を合成した：ＡＴＷＳＨＨＬＳＳＡＧＬ（配列番号：３）；ＷＰＱＬＰＰＲＰＹＳＴＬ（配列番号：４）；ＳＮＴＳＡＧＴＰＦＴＳＬ（配列番号：５）；およびＤＳＴＰＫＳＴＰＷＹＹＩ（配列番号：６）。前記ペプチドの内皮細胞の増殖を刺激する能力または内皮細胞増殖におけるＨＧＦ／ＳＦ仲介増加を抑制する能力を決定した（3Ｈ−チミジンの取り込みで評価）。配列番号：３から６は内皮細胞増殖に顕著には影響を与えなかった（図５）。図５に示したように、サブコンフルエントの内皮細胞を各ペプチド単独（１００μｇ／ｍＬ）、散布因子単独（ＨＧＦ／ＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬ）またはＨＧＦ／ＳＦ＋各ペプチドとともに培養条件下で血清非含有培養液中で２４時間インキュベートした。続いて3Ｈ−チミジンを添加し、５時間後にＤＮＡ合成を調べた。値は４回の測定の平均±ＳＤを示す。ＨＧＦ／ＳＦは内皮細胞増殖を約２倍誘発した。しかしながら、配列番号：３から６は、内皮細胞増殖におけるＨＧＦ／ＳＦ仲介増加を完全に抑制した。これらのデータは、前記のペプチドはＨＧＦ／ＳＦレセプターＣ−ｍｅｔと結合し、それによってＨＧＦ／ＳＦの結合を抑制することができることを示唆している。したがって前記のペプチドは潜在的な血管形成停止活性を有するであろう。
【０１２４】
実施例５
in vivo での抗増殖活性
ヒトの神経膠芽細胞腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ；ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−１４）および神経膠細胞腫細胞株（Ｈｓ６８３；ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−１３８）を米国菌細胞収集所（ＡＴＣＣ）（Ｖａ）から入手した。Ｕ８７ＭＧ細胞は、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭのピルベートおよび０．１ｍＭの非必須アミノ酸を含む最少必須培養液（ＭＥＭ）で維持した。細胞を４８穴プレートで平板培養した（１００００細胞／ウェル）。細胞を播種後２４時間して、培養液を血清非含有培養液と置き換えた。８時間後に、ペプチドを含む（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）培養液または含まない培養液とともに細胞を２０時間インキュベートした。3Ｈ−チミジンを続いて添加し、ＤＮＡ合成を４時間測定した。配列番号：３から６のペプチドおよびＡＫＴＹＡＧＳＳＹＱＦＧ（配列番号：１１）を調べた。
配列番号：５のペプチドは、Ｈｓ６８３細胞の増殖抑制でもっとも有効であった（ｐ＜０．００１）（図６Ａ）。しかしながら、配列番号：４、５および６のペプチドはＵ８７ＭＧ細胞の増殖に対して顕著な抑制を示した（図６Ｂ）。これらのデータは、Ｃ−ｍｅｔペプチドは、各々単独または組み合わさって内因性ＨＧＦ／ＳＧ活性および付随する腫瘍増殖を阻止することができることを示している。
【０１２５】
実施例６
小分子化合物のアッセイ方法
以下のアッセイを用いて、本明細書で考察する種々の化合物の活性を評価した。ある種の化合物およびその化合物群はＨＧＦ／ＳＦ様活性を発現させる。すなわち、それらは、とりわけ散布、細胞増殖、アポトーシス抑制活性を誘発し、ｃ−ｍｅｔレセプターを介して作用する場合は、ｃ−ｍｅｔレセプター活性を作動または刺激する。ｃ−ｍｅｔレセプターを介して機能するそのような化合物の特異性は、遊離ｃ−ｍｅｔレセプターの存在下で刺激アッセイを実施することによって特定できる。ｃ−ｍｅｔの存在下での増殖反応の減少は前記の活性を指し示している。
活性の抑制物質を評価するために、直接、化合物を抗増殖活性について、例えば細胞増殖の抑制、腫瘍の成長抑制、散布の抑制および遺伝子発現の抑制について評価することができる。さらにまた、ＨＧＦ／ＳＦと一緒に化合物を細胞に曝露したときに、活性を抑制するそれらの能力について調べてもよい。そのような事例では、添加されることによって誘発された散布および／または増殖活性は、本発明の抑制化合物が一緒に存在することにより抑制されるであろう。したがって、ある種の抑制物質は、外因的に添加されるＨＧＦ／ＳＦの非存在下で抑制性であろう。これらの化合物および／または他の化合物は、ＨＧＦ／ＳＦが存在する場合にのみ抑制活性を示すことができる。
出願人らは、本発明の化合物が機能する理論またはメカニズムを開示する義務を負わず、さらにまたそのような開示に一切拘束されないことを特記する。
【０１２６】
細胞増殖アッセイの内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、２％ウシ胎児血清、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、アスコルビン酸、ＥＧＦ、ＧＡ、ヘパリンおよびヒドロコーチゾンを含む通常の増殖培養液（ＥＧＭ−２，Clonetics）中で１００００から２００００細胞／ウェルの濃度で４８穴プレートに播種した。細胞を通常は前記増殖培養液で２４時間、３７℃および５％ＣＯ2で増殖させた。続いて、細胞をＲＰＭＩ−１％ＢＳＡで洗浄し、１から２時間飢餓状態にした。全ての化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中で１０ｍｇ／ｍＬの濃度で作製し、ＲＰＭＩ−１％ＢＳＡで最終濃度１から１２μｇ／ｍＬに希釈した。続いて細胞を洗浄し化合物で処理し、さらに２４時間３７℃でインキュベートした。その後、3Ｈ−チミジン（ＲＰＭＩ−ＢＳＡ中で０．５μｇ／ｍＬ）を細胞に添加し、４から５時間３７℃でインキュベートした。取り込まれなかったチミジンを１×ＰＢＳで４回細胞を洗浄することにより除去した。続いて、細胞を０．５ＭのＮａＯＨで３０分溶解し、放射能をβカウンターで計測した。
【０１２７】
他の実験では、ヒトの腸骨動脈内皮細胞を上記で述べた条件と同様な条件下で用いた。
腫瘍細胞の増殖に対する作用：腫瘍細胞の増殖を促進または抑制する本明細書の化合物の活性はヒトの子宮内膜癌細胞を用いて調べた。
散布アッセイ：ＭＤＣＫ細胞の散布についての標準的アッセイを実施した。結果は顕微鏡試験で評価した。
抗アポトーシス活性：本発明の化合物のアポトーシスから細胞を保護する能力は、アドリアマイシン（１５μモル）に曝露してアポトーシスを誘発させたＭＤＣＫ細胞によるＭＴＴ生存活性アッセイを用いて実施した。
遺伝子発現パターンに対する化合物の作用：本発明の化合物の細胞性作用に対する更に別のデータは、ジーンチップ（GeneChip）実験から得られた。特に、血管形成カスケード関連遺伝子（インターロイキン−８およびアンギオポイエチン−２を含む）の誘発に対する作用を調べた。
【０１２８】
実施例７
化合物
本明細書では以下の化合物を調べた。
（４−クロロフェニル）［５−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン（Ｃ１６Ｈ１１ＣＩＮ２ＯＳ／３１５）
１−（メチルスルホニル）−５−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール
２，２−ジメチル−１−（３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパン−１−オン
（４−クロロフェニル）（３、５−ジ（ｔ−ブチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン
Ｎ−メチル−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド
１−（４−クロロベンゾイル）−５−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
（４−クロロフェニル）（３−（３−フェニルイソキサゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン
５−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール
エチル１−（４−クロロベンゾイル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキシレート
（４−クロロフェニル）（３，５−ジメチル−４−（ピリミジン−２−イルチオ）−１Ｈ−ピラゾール−１イル）メタノン
（４−クロロフェニル）（３−（３−（４−クロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１イル）メタノン
（４−クロロフェニル）（３−（５−２−チエニル）−２−チエニル）−１Ｈ−ピラゾール−１イル）メタノン
（２，４−ジクロロフェニル）（３−（５−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−フリル）−１Ｈ−ピラゾール−１イル）メタノン
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１イル）（４−クロロフェニル）メタノン
メチル４−（１−（４−クロロベンゾイル）−１Ｈ−ピラゾール−５イル）−５−メチルイソキサゾール−３−カルボキシレート
（４−クロロフェニル）（５−メチルチオ）−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−１イル）メタノン
（４−クロロフェニル）（３，５−ジメチル−４−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）チオ）−１Ｈ−ピラゾール−１イル）メタノン
Ｎ１−フェニル−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド
（４−クロロフェニル）（３−（２−（５−（２−チエニル）−２−チエニル）−４−メチル−１，３−チアゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１イル）メタノン
（４−クロロフェニル）（３，５−ジメチル−４−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール−１イル）メタノン
（３−ベンゾヒドリル−１Ｈ−ピラゾール−１イル）（４−クロロフェニル）メタノン
（４−クロロフェニル）（３，５−ジメチル−４−（（５−トリフルオロメチル）−２−ピリジル）チオ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン
Ｎ１−（４−クロロフェニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド
メチル１−（４−クロロベンゾイル）−５−（ジメトキシメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート
（４−クロロフェニル）（３−（２−メチルイミダゾ（１，２−ａ）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン
（４−クロロフェニル）（３，５−ジメチル−４−）（（１−フェニル−１Ｈ−１，２，３，４−テトラゾール−５−イル）チオ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン
メチル１−（４−クロロベンゾイル）−５−イソキサゾール−５−イル−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート
（３−（ｔ−ブチル）５−（メチルチオ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（４−クロロフェニル）メタノン
２−クロロ−６−（４−（１−（４−クロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フェノキシ）ベンゾニトリル
（４−クロロフェニル）（５−（５−メチル−３−フェニルイソキサゾール−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン
１−（（４−クロロフェニル）スルホニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール
（４−クロロフェニル）（３，５−ジメチル−４−（（４−メチル−５−（トリフルオロメチル）−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）チオ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン
メチル１−（４−クロロベンゾイル）−３−メチル−５−（４−メチル−１，２，３、−チアジアゾル−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシレート
［４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１H-ピラゾール−１−イル］［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル］メタノン（Ｃ２３Ｈ１７Ｃ１４Ｎ３O２／５０９）
４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１−（フェニルスルフォニル）−１Ｈ−ピラゾール
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）メタノン
４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１−（（３，４−ジクロロフェニル）スルフォニル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール
４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール
４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール
（４−ブロモ−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド）
Ｎ´４，５−ジメチル−Ｎ´４−（５−ニトロ−２−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（２−（（（２，４−ジクロロベンジリデン）アミノ）オキシ）アセチル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−（３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロパノイル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
２−ニトロフェニル２−（（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）カルボニル）ヒドラジン−１−カルボチオエート
４−（２，６−ジクロロベンジル）−１−（（３，５−ジ（トリフルオロメチル）フェニル）スルフォニル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール
１（（４−クロロフェニル）スルフォニル）−４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール
（４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２，６−ジクロロフェニル）メタノン
３−（４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−イル）プロパンニトリル
Ｎ´４−（（２−メチル−１，３−チアゾール−４−４イル）カルボニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−４カルボヒドラジド
Ｎ１−（（２−（（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）カルボニル）ヒドラジノ）（メチルチオ）メチリデン）ベンゼン−１−スルホンアミド
Ｎ´４−（２，４，６−トリクロロフェニル）−３−３（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４，３−ジ（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
３,５−ジ（ｔ−ブチル）−４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール
Ｎ´４−（３，６−ジクロロ−４−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ´４−フェニル−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２，６−ジクロロフェニル）メタノン
１−（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）２，２−ジメチルプロパン−１−オン
Ｎ´４，Ｎ´４，５−トリメチル−３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド
Ｎ４−アゼパン−１−イル−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボキシアミド
Ｎ´４−（６−（トリフルオロメチル）−２−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（４−クロロフェニル）メタノン
Ｎ４ピペリジノ−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボキシアミド
Ｎ´４−（３，３−ジメトキシプロパノイル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２−チエニル）メタノン
Ｎ´４（２，５−ジクロロフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド
１（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン
１（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２−クロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン
３（２−クロロ−６−フルオロフェニル）−１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン
３（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（３，４−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン
３（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン
３（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（４−フルオロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン
３（４−ブロモ−２−チエニル）−１−（４−クロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン
１−（４−クロロフェニル）−３−（２，４−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン
３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−１−（４−ブロモフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（３−フェノキシ−２−チエンル）−１−（２−チエニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（３−ブロモ−４−メトキシフェニル）−１−フェニルプロパ−２−エン−オン
３−（３，４−ジクロロフェニル）−１−（２−ニトロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
１−（４−クロロフェニル）−３−（３，４−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
１−（４−クロロフェニル）−３−（３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
１−（２−クロロフェニル）−３−（３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（４−クロロフェニル）−１−（２，６−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
１−（４−ブロモフェニル）−３−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
１−（２−クロロフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
１−（４−クロロフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（２，６−ジクロロフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］プロパ−２−エン−１−オン
３−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（２−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（２，６−ジクロロフェニル）−１−（２−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（３，４−ジクロロフェニル）−１−（２−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（２，６−ジクロロフェニル）−１−（３−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（５−ブロモ−２−ヒドロキシフェニル）−１−（３−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（５−ブロモ−２−ヒドロキシフェニル）−１−（４−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（３−メチルフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
１−［４−アミノ−２−（メチルチオ）−１，３−チアゾール−５−イル］−３−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
１−（４−クロロフェニル）−３−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］プロパ−２−エン−１−オン
１−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル−３−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
１，３−ジ（５−ニトロ−３−チエニル）プロパ−２−エン−１−オン
１−［（４−メチル−２−（３−チエニル）−１，３−チアゾール−５−イル）−３−（２−チエニル）プロパ−２−エン−１−オン
１−（４−ブロモフェニル）−３−（３，５−ジフルオロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
３−（３，５−ジフルオロフェニル）−１−（３−ニトロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン
【０１２９】
実施例８
本発明の化合物のＨＧＳ／ＳＦ様細胞増殖活性
上記で述べた内皮細胞増殖アッセイを用いたとき、化合物、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンは、２から５倍のＨＵＶＥＣ増殖増加を示した。3Ｈ−チミジンの取り込みによって測定される前記化合物による内皮細胞増殖刺激の特異性は、ＨＧＦ／ＳＦレセプターｃ−ｍｅｔと細胞との予備インキュベーションによってテストした。図７では、最初の棒線はコントロール細胞を、第二の棒線は、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン（６μｇ／ｍＬ）を、第三の棒線は（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン（６μｇ／ｍＬ）＋ｃ−ｍｅｔレセプター（１００μｇ／ｍＬ）を示している。（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンは、それだけで3Ｈ−チミジンの取り込みを８４％刺激した。したがって、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンは、ＨＵＶＥＣ増殖の刺激でＨＧＦ／ＳＦと同じように有効である。ｃ−ｍｅｔの存在下では、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンの3Ｈ−チミジン取り込み刺激は７５％抑制された。出願人らは理論に拘束されないが、この実験もまた、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンはｃ−ｍｅｔレセプターを介してＨＵＶＥＣの増殖を促進することを示している。また別の関連実験では、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン（１２μｇ／ｍＬ）を最初の標的分子Ｃ−ｍｅｔレセプター（５μｇ／ｍＬ）と３０分インキュベートし、続いて細胞に添加した。化合物誘発ＥＣ増殖は、Ｃ−ｍｅｔレセプターの存在下で４０％阻止された。
【０１３０】
実施例９
ＭＤＣＫ細胞の散布
ＨＧＦ／ＳＦに対して特異的である標準的散布アッセイで、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンをＨＧＦ／ＳＦ活性についてさらにテストした。散布能力は、非ペプチド候補化合物を用いて初めて示された。（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンによるＭＤＣＫ細胞の散布は、さらに、その作用がｃ−ｍｅｔレセプターの刺激により仲介されることを示した。図８に示すように、前記化合物は、ＨＧＦ／ＳＦで認められた散布と同様なＭＤＣＫ細胞の散布を惹起した。図８Ａ：コントロール細胞；図８Ｂ：（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン（６μｇ／ｍＬ）。
【０１３１】
実施例１０
（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−
１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンの抗アポトーシス活性
ＨＧＦ／ＳＦは、多数の培養細胞株で顕著な抗アポトーシス活性を示す。ＭＴＴ細胞生存活性アッセイを用いて、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンがアドリアマイシン誘発アポトーシスから細胞を保護する能力を調べた。ＨＧＦ／ＳＦと同様に、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンは、アドリアマイシン誘発アポトーシスをＭＤＣＫ細胞で顕著に阻止することができた（図９）。細胞の生存活性は、ＨＧＦ／ＳＦ単独（カラム５）でもＨＧＦ／ＳＦと（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンとの組合せ（カラム７）でも変化はなかった。アドリアマイシン（１５ｍＭ）は、細胞の生存活性をコントロールの５６％に低下させた（カラム３）。ＨＧＦ／ＳＦ（カラム４）または（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン（カラム６）のどちらかによる処理は、アドリアマイシン誘発アポトーシスに対してほぼ完全な防御（９４％）を達成した。
別の細胞株では、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンによって９０％の防御が得られた。
【０１３２】
実施例１１
（４−クロロフェニル）（３−２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ
−ピラゾール−１−イル−メタノンのＨＵＶＥＣ増殖に対する作用
図１０は、（４−クロロフェニル）（３−２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル−メタノンとＨＵＶＥＣ増殖レベルとの間のドースレスポンス関係を示している。
【０１３３】
実施例１２
遺伝子発現
本発明の化合物を用いたジーンチップ予備実験は、同様な遺伝子刺激プロフィールを示した。前記遺伝子刺激プロフィールは、インターロイキン−８およびアンギオポイエチン−２の刺激を含み、両者は血管形成カスケードにおいて重要な役割を果たす。
【０１３４】
実施例１３
ＨＧＦ／ＳＦ仲介ＨＵＶＥＣ増殖に対する［４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル］メタノンの作用
図１１は、ＨＧＦ／ＳＦおよび［４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル］メタノンの存在下におけるＨＵＶＥＣ増殖実験の結果を示している。ＨＧＦ／ＳＦの添加はＨＵＶＥＣ（二番目の棒線）の増殖を増加させるが、本化合物単独では基準増殖に対して何ら影響を与えず、ＨＧＦ／ＳＦと本化合物の組合せ（四番目の棒線）は、ＨＧＦ／ＳＦ仲介刺激の顕著な抑制をもたらした。
【０１３５】
実施例１４
血管内方向成長 in vivo アッセイ
血管形成を皮下組織からテスト化合物を含む基底膜固形ゲル中への血管の成長としてアッセイした。液状形のマトリゲル（０．５ｍＬ）を本発明の化合物または塩基性線維芽細胞増殖因子（コントロールとして）と混合し、以前に報告されたようにマウスの腹腔皮下組織に注射した（M.C. Kibbey, D.S. Grant, R. Auerbach, & H.K. Kleinman, (1992) Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J. Natl. Can. Inst. 84, 1633-38）。１０日後、マウスを殺し、マトリゲル塊を取り出し、固定して切片を作製し、染色して血管の内方向成長について調べた。図１２Ａでは、１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オンの作用は、血管の内方向成長をコントロールより低いがほぼ完全な抑制として観察された。対照的に、図１２Ｂでは、（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）メタノンは、血管の内方向成長の顕著な刺激を示した。
【０１３６】
実施例１５
クローン原性アッセイ
（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）メタノン（図１３）および１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オン（図１４）の作用を７日間にわたってクローン原性アッセイで調べた。図１３および１４は両方とも、前記実験中のＤＵ１４５細胞増殖における用量応答性抑制を示している。
【０１３７】
実施例１６
in vivo 血流改善アッセイ
図１５は、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンを大腿動脈摘出に続いて７日間マウスに投与したin vivo実験の結果を示している。結果は、前記化合物による血流の顕著な改善を示している。
【０１３８】
実施例１７
活性を有する他の化合物
上記と同様な態様で、以下の関連化合物を内皮細胞増殖の刺激について調べた。３回の別個のテストを実施した。
Figure 0004993834
Figure 0004993834
【０１３９】
以下の化合物を再評価した。
Figure 0004993834
化合物は以下のとおりである：
１：４（５−クロロベンゾ（ｂ）チオフェン−３−イル）−１−（２クロロフェニル）スルフォニル）−３，５ジメチル−１−Ｈ−ピラゾール；
２：４−（２，６−ジクロロベンジル）−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピタゾール−５−オール；
３：３−メチル−４−（２−メチルアリル）−１−（フェニルスルフォニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
４：［３−（２，６−ジフルオロフェニル）−４−エチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］（２−チエニル）メタノン；
５：４−［（５−クロロ−１−ベンゾチオフェン−３−イル）メチル］−Ｎ，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
６：３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
７：３−（２，６−フルオロフェニル）−４−エチル−１Ｈ−ピラゾール；
８：Ｎ１−（３−クロロフェニル）−４−［（５−クロロベンゾ（ｂ）チオフェン−３−イル）メチル］−３，５−ジュメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
９：｛４−［（５−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）メチル］−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝（４−ニトロフェニル）メタノン；
１０：Ｎ１−フェニル−４−［（５−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）メチル］−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
１１：４−［（５−クロロ−１−ベンゾチオフェン−３−イル）メチル］−Ｎ−（２，４−ジクロロフェニル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
１２：１−［３−（２，６−ジフルオロフェニル）−４−エチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］−２，２−ジメチルプロパン−１−オン；
１３：４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１−｛［３，５−ジ（トリフルオロメチル）フェニル］スルフォニル｝−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール。
【０１４０】
実施例１８
細胞増殖の抑制
［４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル］メタノンを、ＨＧＦ／ＳＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖を阻止する能力について上記で述べたように調べた。前記は１２μｇ／ｍＬで４０から６０％の阻止を示した。
【０１４１】
実施例１９
腫瘍成長の抑制
［４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル］メタノンを、ヒト内皮細胞癌の腫瘍成長の抑制について調べた。成長は４０μｇ／ｍＬで４０から５０％抑制された。
【０１４２】
実施例２０
本発明の化合物の抗増殖活性
上記のアッセイを用いたとき、以下の化合物が、外因的に添加したＨＧＦ／ＳＦの存在下でまたは非存在下でＨＵＶＥＣの増殖を阻止することが見出された。
Figure 0004993834
＊化合物は以下のとおりである：
１：（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）メタノン；
２：（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１−（（３，４−ジクロロフェニル）スルフォニル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール；
３：４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール；
４：４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール；
５：（４−ブロモ−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド）；
６：Ｎ´４，５−ジメチル−Ｎ´４−（５−ニトロ−２−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
７：Ｎ´４−（２−（（（２，４−ジクロロベンジリデン）アミノ）オキシ）アセチル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
８：３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
９：Ｎ´４−（３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロパノイル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
１０：２−ニトロフェニル２−（（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）カルボニル）ヒドラジン−１−カルボチオエート；
１１：１−（（４−クロロフェニル）スルフォニル）−４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール；
１２：３−（４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパンニトリル；
１３：Ｎ´４−（（２−メチル−１，３−チアゾール−４−４イル）カルボニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−４カルボヒドラジド；
１４：Ｎ１−（（２−（（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）カルボニル）ヒドラジノ）メチルチオ）メチリデン）ベンゼン−１−スルホンアミド；
１５：Ｎ´４−（２，４，６−トリクロロフェニル）−３−３（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
１６：Ｎ´４，３−ジ（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
１７：３，５−ジ（ｔ−ブチル）−４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール；
１８：Ｎ´４−（３，５−ジクロロ−４−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
１９：Ｎ´４−フェニル−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
２０：（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２，６−ジクロロフェニル）メタノン；
２１：１−（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）２，２−ジメチルプロパン−１−オン；
２２：Ｎ´４，Ｎ´４，５−トリメチル−３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
２３：Ｎ４−アゼパン−１−イル−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボキシアミド；
２４：Ｎ´４−（６−（トリフルオロメチル）−２−ピリジル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
２５：（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（４−クロロフェニル）メタノン；
２６：Ｎ´４−（３，３−ジエトキシプロパノイル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボヒドラジド；
２７：（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２−チエニル）メタノン。
【０１４３】
実施例２１
他の化合物の活性
前述の実施例に記載した化合物と構造的に関係のない以下の化合物もまた、外因的に添加したＨＧＦ／ＳＦの存在下または非存在下で内皮細胞の増殖に対する作用について調べた。潜在的に抗増殖活性をもついくつかの化合物が活性を示した（外因性のＨＧＦ／ＳＦの存在下でのみ活性を示したものを含む）。さらにまた、いくつかの化合物は刺激活性を示し、上記で述べたように有用な潜在的増殖促進活性を有する。
Figure 0004993834
【０１４４】
Figure 0004993834
化合物＊は以下のとおりである：
１：テトラフェニルチオフェン；
２：ペンタフェニルベンゼン；
３：１，３，５−トリフェニルベンゼン；
４：（３−ビフェニル）トリメチルシラン；
５：１６メチル−１６デヒドロプレグネノロン；
６：９−ビフェニル−４−イルメチレン−９Ｈ−トリ−ベンゾ（Ａ，Ｃ，Ｅ）−シクロヘプテン；
７：１，１，３−トリフェニリンデン；
８：９，９−ビフェナントレン；
９：Ｎ−（フルフリリデン）−２，４−キシリジン；
１０：１−（４−クロロ−３メチルフェニル）３−２（２，６−ジクロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
１１：３−（４−ブロモフェニル）−１−フェニルプロパ−２−エン−１−オン；
１２：８−ベンジリデン−２，４−ジフェニル−５，６，７，８テトラヒドロホスフィノリン；
１３：６−（３，５−ジメチルフェニル）チオ）−３−フェニル（１，２，４−トリアゾール（４，３−ｂ）ピリダジン。
【０１４５】
実施例２２
ＨＧＦ／ＳＦ、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ活性の抑制
上記で述べた内皮細胞増殖アッセイで、内皮細胞の増殖因子誘発刺激に拮抗するその能力について、化合物１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オンをＨＧＦ／ＳＦ、ＶＥＧＦまたはＦＧＦの存在下で調べた。図１６Ａに示すように、１．５μモルで前記化合物は、内皮細胞増殖のＨＧＦ／ＳＦ−、ＶＥＧＦ−およびＦＧＦ−仲介増加を抑制した。同様な結果が、３μモルの１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オンで観察された（図１６Ｂ）。
【０１４６】
実施例２３
ＶＥＧＦ様活性を有する化合物
２μｇ／ｍLの化合物を用いて標準的アッセイでＶＥＧＦ様活性について化合物をスクリーニングした。図１７で示すように、３，３−ジブロモ−１−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−２，４−ジオン（ＶＣ８）および４−（４−クロロフェニル）−６−（ジメチルアミノ）−２−フェニル−５−ピリミジンカルボニトリル（ＶＣ１４）は陽性活性を示し、前記は両方ともＶＥＧＦ（１２５９±１０４ｃｐｍ）より活性は高かった。本発明はまた、ＶＥＧＦが哺乳類（好ましくはヒト）の治療に有用である種々の症状および疾患の治療（例えば創傷治癒（特に糖尿病性創傷治癒）の加速であるが、ただしこれに限定されない）に、前記および構造的に関連を有するＶＥＧＦ作動物質または模倣物質を使用する方法を目的とする。前記化合物は、一般に血管内皮細胞の増殖促進および血管新生の促進のために、さらに、冠状動脈疾患、アンギナおよび他の虚血性疾患（卒中発作を含む）の治療に対する再狭窄のような他の疾患のために有用である。
【０１４７】
実施例２４
（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−
ピラゾール−１−イル］メタノンの更なるＨＧＦ／ＳＦ様活性
ＨＧＦ／ＳＦ様活性により特定された化合物の１つ、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンは、in vivoで内皮細胞増殖を刺激することができる（図１８：最初の棒線：コントロール細胞；二番目の棒線：（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン、３８ｍＭ；三番目の棒線：ＨＧＦ／ＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬ；四番目の棒線：（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン＋ＨＧＦ／ＳＦ）。ＨＧＦ／ＳＦレセプターｃ−ｍｅｔと細胞の予備インキュベーションによって、３Ｈ−チミジン取り込みによるＨＵＶＥＣ増殖刺激について前記化合物の特異性をテストした。（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンは、単独で３Ｈ−チミジンの取り込みを５倍以上刺激した（図１８、棒線２）。（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンは、ＨＵＶＥＣ増殖刺激でＨＧＦ／ＳＦと同じ効果を有する。ｃ−ｍｅｔの存在下で、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンの３Ｈ−チミジン取り込み刺激は７５％抑制された。培養されているＭＤＣＫ細胞を散布することは散布因子の公知の特異的作用であり、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンもまたこの能力を示し、これは非ペプチド化合物でこの活性が示された最初のものである。（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンは、ＨＧＦ／ＳＦと同様に線維芽細胞株の増殖は刺激せず、さらに両者はＨｅｐＧ２へパトーマ細胞株で同様な抑制作用を示した。
【０１４８】
実施例２５
（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンはｃ−ｍｅｔおよびＥｒｋのリン酸化をもたらす
免疫沈澱およびウェスタンブロッティングを用いて、ＨＧＦ／ＳＦと同様に、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンはシグナリングタンパク質Ｅｒｋのリン酸化をもたらすことを示すことができた（図１９）。ＨＧＦ／ＳＦ（レーン４）および（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン（レーン２）は両方とも、非刺激コントロール細胞（レーン１）と比較して顕著な量のリン酸化Ｅｒｋを示した。小分子拮抗薬、（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）メタノンはＥｒｋのリン酸化（レーン３）に対して作用を示さなかった。全Ｅｒｋは下段に示されている。
【０１４９】
実施例２６
創傷治癒実験
（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンの血管形成特性をブタの創傷治癒モデルでさらにテストした。完全な厚さの８ｍｍの皮膚創傷をブタで形成し、５日後に創傷を切り出し、Ｈ＆Ｅで染色して、高倍率で各切片の５つの領域で血管を数えた。（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン（５００μｇ）で処理した創傷は、賦形剤（ＤＭＳ）処理コントロールと較べて血管密度は３３％高かった（図２０）。
【０１５０】
実施例２７
（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）
−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンによる毛細血管の数の増加
マウスの片側後肢を虚血に付し、ＨＧＦ／ＳＦ作動薬（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン（２５μｇ／日）または賦形剤で殺処分の前に２週間または３週間処置した。後肢の筋肉を液体窒素で凍結し、アルカリホスファターゼ術により毛細血管を染色し、盲検観察者が前記筋肉の６から１２の任意の領域内で筋肉繊維当たりの毛細血管数を数えた。虚血筋肉内の毛細血管数の増加によって後肢の虚血をもつマウスの回復が観察された（図２１）。（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン処理マウスの筋肉繊維当たりの毛細血管数は、賦形剤処理コントロールと比較して２週間で４２％増加した。この毛細血管数の増加は、サンプルを分析した最終時点である３週間の間持続した。
【０１５１】
実施例２８
（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−
ピラゾール−１−イル］メタノンはｃ−ｍｅｔの用量依存リン酸化をもたらす
ｃ−ｍｅｔのリン酸化実験を更に進めて、リン酸化が用量と関係があること、およびＭＤＣＫ細胞と同様にＨＵＶＥＣでも生じることを示した（図２２）。ＨＵＶＥＣ（左の１式）またはＭＤＣＫ細胞（右の１式）をＨＧＦ／ＳＦまたは（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンのどちらかで処理し、可溶化溶解物を細胞から調製し、特異的抗体を用いてリン酸化ｃ−ｍｅｔおよび全ｃ−ｍｅｔの免疫沈澱を標準的方法で実施した。
免疫沈澱物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、リン酸化ｃ−ｍｅｔ（上段）および全ｃ−ｍｅｔ（下段）の検出をＥＣＬケミルミネッセンスシステム（Amersham）を用いて実施した。ＨＧＦ／ＳＦおよび（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンの両方が、非刺激コントロール細胞と比較して顕著な量のリン酸化ｃ−ｍｅｔを示した。全ｃ−ｍｅｔは下段に示されている。
この結果は、ＨＧＦ／ＳＦと同様に、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノンはｃ−ｍｅｔレセプターの活性化を介してその作用を生じるという発見をさらに立証した。
【０１５２】
実施例２９
ｃ−ｍｅｔ拮抗物質による腫瘍および血管形成の抑制
ＨＧＦ／ＳＦ拮抗物質が腫瘍の成長を抑制し、in vivo実験で生存を改善する能力を決定するために実験を実施した。ＤＵ１４５腫瘍細胞（５×１０6）を雄のヌードマウスの右側下方の側腹部皮下に注射した。１４日目に、腫瘍を形成した（腫瘍サイズ、２５から３０ｍｍ2）マウスに１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オンの腫瘍内注射を１回実施し、腫瘍成長の顕著な抑制がもたらされた（図２３Ａ）。さらに生存は顕著に延びた（図２３Ｂ）。マウスの生存は、与えられた日の生存マウスの百分率として記録した。全動物実験について、腫瘍サイズは二週間毎にノギスを用いて測定し、最大の垂直差し渡しを有する生成物（ｍｍ2）として表した。腫瘍の差し渡しが１５０ｍｍを越えたとき（実験の最終点である）、動物を殺処分した。
本発明は、本明細書に記載した個々の実施態様によって範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書に記載した態様のほかに本発明の多様な改変が、前述の記載および添付の図面から当業者には明白であろう。そのような改変は、添付の請求の範囲内に包含されるであろう。
【０１５３】
様々な文献が本明細書に引用されており、これらの内容は全てここに組み入れるものとする。
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＨＧＦ／ＳＦと比較した、本発明の血管形成ペプチドの内皮細胞増殖を刺激する能力を示す。測定は放射能標識チミジンの取り込みによる。
【図２】 図２は、ラット動脈リングの血管出芽アッセイでの血管形成に対する血管形成ペプチドおよびＨＧＦ／ＳＦの作用を示す。
【図３】 図３は、マウスの皮下に埋め込んだ基底膜マトリックスを用いるin vivoアッセイでの血管形成に対する本発明の血管形成ペプチドの作用を示す。
【図４】 図４Ａ−４Ｂは、リジン高含有配列、硫酸ヘパリン結合配列またはコントロール配列と共役させた場合の、本発明のペプチドの血管形成活性の促進を示す。図４Ａは、放射能標識チミジンの取り込みによる測定で共役ペプチドのそれと比較した内皮細胞増殖に対する作用を示す。図４Ｂは、増殖因子ＨＧＦ／ＳＦおよびｂＦＧＦに対する活性の比較を示す。
【図５】 図５は、内皮細胞増殖におけるＨＧＦ／ＳＦ仲介増加を抑制する本発明の血流停止ペプチドの能力を示す。測定は放射能標識チミジンの取り込みによる。
【図６】 図６Ａ−６Ｂは、ヒト神経膠芽細胞腫細胞株（Ｕ８７；図６Ａ）およびヒト神経膠腫細胞株（Ｈｓ６８３；図６Ｂ）における本発明のペプチドの血流停止活性を示す。腫瘍の増殖の程度は放射能標識チミジンの取り込みにより測定した。
【図７】 図７は、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル−１H−ピラゾール−１−イル）メタノン（ＨＧＦ／ＳＦ様活性を有する本発明の化合物）による内皮細胞増殖の刺激、および前記観察された刺激のｃ−ｍｅｔを加えることによる抑制を示す。
【図８】 図８Ａ−Ｂは、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル−１H−ピラゾール−１−イル）メタノンによるＭＤＣＫ細胞散布の誘発を示す。
【図９】 図９は、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル−１H−ピラゾール−１−イル）メタノンによる、アドリアマイシン誘発アポトーシスに対するＭＤＣＫ細胞の保護を示す。
【図１０】 図１０は、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１H−ピラゾール−１−イル］メタノンによる内皮細胞増殖刺激の用量依存曲線を示す。
【図１１】 図１１は、化合物（４−２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１H−ピラゾール−１−イル）−３−（２，６−ジクロロフェニル−５−メタノンのＨＧＦ／ＳＦ仲介内皮細胞増殖の能力を示す。
【図１２】 図１２Ａ−Ｂは、１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オンおよび（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）メタノンを用いたマトリゲルのin vivoアッセイのそれぞれの結果を示す。
【図１３】 図１３は、ＤＵ１４５細胞および（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）メタノンを用いたクローン原性アッセイの結果を示す。
【図１４】 図１４は、ＤＵ１４５細胞および１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オンを用いたクローン原性アッセイの結果を示す。
【図１５】 図１５は、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１H−ピラゾール−１−イル］メタノンによる治療の後で大腿動脈摘出後のマウスの血流が改善されたのを示す。
【図１６】 図１６Ａ−Ｂは、増殖因子ＨＧＦ／ＳＦ、ＶＥＧＦおよびＦＧＦによって誘発した内皮細胞増殖に対する化合物１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オンの作用（Ａ；１．５μモル、Ｂ；３．０μモル）を示す。
【図１７】 図１７は、本発明の２つの化合物のＶＥＧＦ様活性を示す。
【図１８】 図１８は、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１H−ピラゾール−１−イル］メタノンによるＨＵＶＥＣへの３Ｈ−チミジン取り込みの刺激を示す。
【図１９】 図１９は、ＨＧＦ／ＳＦおよび、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１H−ピラゾール−１−イル］メタノンによるＥｒｋのリン酸化を示す。
【図２０】 図２０は、ブタの創傷治癒モデルにおける（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１H−ピラゾール−１−イル］メタノンによる効能を示す。
【図２１】 図２１は、マウスの虚血後肢で毛細血管の数を増加させる、（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１H−ピラゾール−１−イル］メタノンの能力を示す。
【図２２】 図２２は、ＨＵＶＥＣおよびＭＤＣＫ細胞の（４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１H−ピラゾール−１−イル］メタノンによる用量依存性リン酸化を示す。
【図２３】 図２３Ａ−Ｂは、１−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニル）−プロパ−２−エン−１−オンの腫瘍内注射によるマウスの生存時間の延長を示す。

Claims (8)

  1. 下記一般式Ｉを有する化合物：
    Figure 0004993834
    式中、
    Ｒ３およびＲ５は、それぞれ別個にまたは一緒になってメチル、ｔ−ブチルまたはクロロ基であり；
    Ｒ１は、ＣＯ−アリール、ＳＯ2−アリール、ＣＯ−ヘテロアリールまたはＣＯ−アルキルであり、ここで前記アリールはフェニル、ナフチルもしくはジフェニルで、前記アリールは、１つまたは２つ以上のハロゲン、Ｃ１からＣ４アルキルもしくはＣ１からＣ４アルコキシ基で置換されており、または前記ヘテロアリールは、３−アリール−置換イソキサゾールもしくは３−アリール置換チエニル基であり、または前記アルキル基はｔ−ブチルであり；さらに
    Ｒ４はＣＨ2−アリール、ハロゲン、アリールカルボニルビニルまたはＳ−ヘテロアリールである。
  2. 以下から成る群から選択される化合物：
    ３−（５−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１−（４−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン；
    ［４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル］メタノン；
    （４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）メタノン；
    ４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１−（（３，４−ジクロロフェニル）スルフォニル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール；
    ４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール；
    ４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール；
    （４−ブロモ−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（３−（２，６−ジクロロフェニル）イソキサゾール−４−カルボヒドラジド）；
    ３−（４−（２，６−ジクロロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパンニトリル；
    ３，５−ジ（ｔ−ブチル）−４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール；
    （４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２，６−ジクロロフェニル）メタノン；
    １−（４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）２，２−ジメチルプロパン−１−オン；
    （４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（４−クロロフェニル）メタノン；
    （４−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２−チエニル）メタノン；および
    （４−クロロフェニル）（３，５−ジメチル−４−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）チオ）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン。
  3. 下記一般式ＩＩＩを有する化合物：
    Figure 0004993834
    式中、
    Ｒ１は、ＳＯ2アルキル（ここでアルキルはＣ１からＣ４の直鎖、分枝またはシクロアルキル基である）、ＳＯ2アリール（ここでアリールはハロ、Ｃ１からＣ４のアルキル−またはアルキルオキシ−置換フェニルである）、ＣＯアルキル（ここでアルキルはＣ１からＣ６の直鎖アルキル、分枝アルキルまたはシクロアルキルである）、ＣＯアリール（ここでアリールは、ハロ、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはアルキルオキシで置換されたフェニルである）、ＣＯＮＨアルキル（ここでアルキルはＣ１からＣ６の直鎖アルキル、分枝アルキルまたはシクロアルキルである）、またはＣＯＮＨアリール（ここでアリールは、ハロ、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルキルオキシで置換されたフェニルである）であり；さらに
    Ｒ３は、ＣＨＣＨ−ヘテロアリール（ここでヘテロアリールはシスまたはトランスＣＨＣＨ−３−チエニル、ＣＨＣＨ−２−フリル、ＣＨＣＨ−３−フリル、置換ＣＨＣＨ−チエニルまたはＣＨＣＨ−フリルである）、フェノキシフェニル、ヘテロアリールまたはアリール置換ヘテロアリールである。
  4. R1がSO2CH3、CO-t-ブチルまたはCONHCH3であり、R3がCHCH-2-チエニルである、請求項３記載の化合物。
  5. 下記から成る群から選択される化合物：
    （４−クロロフェニル）［３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］メタノン；
    １−（メチルスルホニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール；
    ２，２−ジメチル−１−（３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパン−１−オン；
    Ｎ−メチル−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
    （４−クロロフェニル）（３−（３−フェニルイソキサゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
    （４−クロロフェニル）（３−（３−（４−クロロフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
    （４−クロロフェニル）（３−（５−（２−チエニル）−２−チエニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
    （２，４−ジクロロフェニル）（３−（５−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−フリル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
    Ｎ１−フェニル−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド
    （４−クロロフェニル）（３−（２−（５−（２−チエニル）−２−チエニル）−４−メチル−１，３−チアゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
    （３−ベンゾヒドリル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（４−クロロフェニル）メタノン；
    Ｎ１−（４−クロロフェニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミド；
    （４−クロロフェニル）（３−（２−メチルイミダゾ（１，２−ａ）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタノン；
    ２−クロロ−６−（４−（１−（４−クロロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）フェノキシ）ベンゾニトリル；および
    １−（（４−クロロフェニル）スルフォニル）−３−（２−（２−チエニル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール。
  6. 請求項２、４及び５のいずれか一項に記載の化合物を含む、哺乳類におけるHGF／SF及び／またはVEGF活性調節物質。
  7. HGF／SF作動物質またはHGF／SF拮抗物質である、請求項６記載の調節物質。
  8. 請求項６または７記載の活性調節物質および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
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