CN110590929A - Tdgf-1截短体小分子多肽在抗肝纤维化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种TDGF‑1截短体小分子多肽在抗肝纤维化中的应用。本发明实验证明TDGF‑1截短体小分子多肽在肝星状细胞中具有阻断TGF‑β信号通路以及降低α‑SMA表达的能力，是抗纤维化治疗的理想的多肽类药物，又因为本发明的TDGF‑1截短体小分子多肽缺少了促肿瘤结构域导致其在抗纤维化应用中更具有安全性，具有良好的市场应用前景。

Description

TDGF-1截短体小分子多肽在抗肝纤维化中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及TDGF-1截短体小分子多肽在抗肝纤维化中的应用。

背景技术

肝纤维化几乎是所有慢性肝脏疾病向终末期进展共有的病理性改变，其实质就是肝脏炎症坏死后的纤维组织瘢痕。导致肝纤维化形成的慢性肝脏疾病包括酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，以及由病毒感染引发的慢性肝炎等。若病情持续进展，肝纤维化会发展成为肝硬化、肝癌。因而，对肝纤维化患者进行适时、积极的干预，对于降低终末期肝病的发生几率非常重要。

肝纤维化的本质是一种疤痕反应，各种肝损伤都可以造成疤痕反应，包括中毒，代谢以及病毒侵袭。构成该反应的基础则是肝中实质细胞的活化，实质细胞(主要是HSC)转化为有弹性的MF，进而产生疤痕包围受损区域。Disse腔是肝血窦内皮与肝细胞之间的部分，居于此间的HSC是一种实质细胞。静态的HSC(qHSC)富含维生素A，一旦出现肝受损，HSC就会活化，失去维生素A，进而扩大增殖，富有弹性，释放促炎症，促纤维化以及促分裂细胞因子。活化后的HSC能够转移，造成ECM组分的沉积。

对于肝纤维化的发生机制，目前研究最为清楚的就是肝星状细胞(HSC)在相关炎症因子的作用下发生活化、细胞外基质(ECM)的过度沉积。因此，活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝脏纤维化发生时ECM的主要来源，是肝纤维化药物干预的最重要的靶标。在细胞因子中，与肝星状细胞激活关系最为密切的是转化生长因子β(TGF-β)。TGF-β在正常人肝脏中主要由肝窦状内皮细胞、肝脏巨噬细胞、淋巴细胞表达，而HSC本身表达量较低，其信号通路能够抑制肝实质细胞的再生效率，并促进HSC的活化。TGF-β与细胞膜表面的TGF-βⅡ型受体结合并引起受体变构，进一步招募I型受体，形成TGF-β/receptorII/receptorI三体复合物，并进一步磷酸化其下游的细胞质转导因子，包括经典通路的Smads，被激活的Smads复合物向细胞核内进行转移并调控基因表达。胶原蛋白CollagenI是Smads调控的靶标基因，TGF-β在促进ECM合成和分泌的同时又抑制了ECM的降解。随着胶原的增多，使得TGF-β形成了一个自分泌的反馈通路，使得胶原蛋白及PDGF进一步积累。另外，TGF-β促进HSC激活和增殖的同时，又抑制了肝实质细胞的再生，导致肝脏发生纤维化。

畸胎瘤演化生长因子TDGF-1，是1987年从人畸胎瘤cDNA文库中钓取的基因，是EGF-CFC家族成员之一，为人类胚胎早期发育所必须的分子。TDGF-1蛋白分子结构相对简单，除了N端信号肽序列和C端的COOH疏水氨基酸序列之外，仅包含两个大的功能结构域，EGF结构域和CFC结构域。近年来，TDGF-1的CFC结构域逐渐被认为是TDGF-1行使其促肿瘤发生和干细胞逆向分化功能的主要分子区域。TDGF-1结合肿瘤细胞表面的Glypican-1受体，进一步活化MAPK和AKT通路，而这二者是引起肿瘤细胞快速增殖和转移的经典通路；另外，TDGF-1依赖CFC结构域结合肿瘤细胞表面的Wnt受体，辅助性激活Wnt/β-catenin通路，并起到稳定β-catenin结构的作用。Bianco等人认为，Wnt/β-catenin通路的持续性激活对于维持肿瘤干细胞特性非常重要。因而，作为一种癌胚抗原，CFC结构域的功能发挥了主要作用，而EGF结构域的氨基酸序列由于相对于EGF分子有较明确的突变序列，引发其功能限制。

现有技术还未见TDGF-1蛋白及其蛋白结构域与肝纤维化存在相关性的报道。

发明内容

本发明构建了一种人类在胚胎时期特异性表达的蛋白质TDGF-1的截短体多肽，并去除了其具有促肿瘤发生的功能结构域部分。实验证明该截短体多肽在肝星状细胞中具有阻断TGF-β信号通路以及降低α-SMA表达的能力，对于靶向肝星状细胞发挥抗纤维化作用非常重要：一方面抑制了TGF-β诱导的肝星状细胞激活，另一方面α-SMA表达水平的降低可抑制细胞外胶原的过度沉积。

基于以上研究成果，本发明提供了以下技术方案：

根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种TDGF-1蛋白的截短体多肽，所述多肽序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了编码前面所述的多肽的核酸分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的多肽的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的多肽的序列中。

根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括前面所述的核酸分子。

构建本发明的重组载体的载体包括(但不限于)由Celltrion Inc.(韩国)生产的MarEx表达载体；市场上可广泛买到的pCDNA载体；F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘粒；噬菌体，诸如λ噬菌体、λ形噬菌体、M13噬菌体、Mu噬菌体、P1噬菌体、P22噬菌体、Qμ噬菌体、T-偶数噬菌体、T2噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体等；植物病毒。本发明中可使用本领域技术人员已知的各种载体的任意一种，且载体的选择依赖于所选择的宿主细胞的性质。宿主细胞中载体的导入可通过(但并不限于)磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔实现，且本领域的任何技术人员可选择和使用适用于所用的载体和宿主细胞的导入方法。优选地，上述载体包含一种或多种选择标记，但并不限于此，且还可使用不包含选择标记的载体。选择标记的选择可依赖于选择的宿主细胞(如本领域的技术人员公知的)，但这对于本发明并不是关键性的。

为了促进本发明的DNA分子的纯化，可将标签(tag)序列插入载体中。标签的实例包括(但不限于)六个组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或FLAG标签。可在本发明中使用本领域的技术人员已知的促进纯化的任何标签。

根据本发明的第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前面所述的核酸分子或前面所述的重组载体。

在本发明中可使用本领域技术人员已知的可用作宿主细胞的任何细胞。可用于本发明的宿主细胞包括但不限于微生物，例如噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；重组酵母表达载体转化的酵母菌例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)；烟草花叶病毒(TMV)感染的或重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。

根据本发明的第五个方面，本发明提供了一种前面所述的多肽的制备方法。

进一步，所述制备方法包括利用前面所述的宿主细胞表达所述多肽。

本发明的多肽可以通过多种技术中的任一种制备。通常，多肽可以通过细胞培养技术产生，包括通过常规技术产生多肽，或通过将多肽的核酸分子转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中，以允许多肽的产生，其中所述多肽可以是重组的。术语“转染”的各种形式意在包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的各种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的多肽，但是优选在真核细胞中表达多肽，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)更可能比原核细胞组装和分泌正确折叠的多肽。当将编码多肽的核酸分子的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许多肽在宿主细胞中表达的一段时间，或更优选地，将多肽分泌至培养宿主细胞的培养基。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收多肽。

根据本发明的第六个方面，本发明提供了一种抗肝纤维化的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的前面所述的多肽。

进一步，所述药物还包括药学上可接受的载体。其中，药学上可接受的载体是指不会对生物体引起显著刺激且不会消除所施用多肽的生物活性和性质的载体或稀释剂，如，生理盐水，无菌水，林格氏溶液，缓冲盐溶液，葡萄糖溶液，麦芽糊精溶液，甘油，乙醇，和其中两种或更多种的混合物。如果需要，本发明的药物组合物还可以包括其它常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，并配置成可注射制剂，如水性溶液，悬浮液和乳剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂和片剂。

本发明的药物组合物在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，真空干燥和冷冻干燥从活性成分和其它期望成分的预先无菌过滤过的溶液产生活性成分和其它期望成分的粉末。可选择地，本发明的组合物可在溶液中，且在递送之前或递送时可加入和/或混合适当的药学上可接受的赋形剂以提供可注射的单位剂型。优选地，本发明中使用的药学上可接受的赋形剂适用于高药物浓度，可保持适当的流动性，且如果需要可延迟吸收。

本发明的药物组合物的最佳给药途径的选择会受到几个因素的影响，包含组合物中活性分子的物理化学性质、临床表现的紧迫性和活性分子的血浆浓度与期望的治疗效果之间的关系。例如，可与载剂一起制备本发明的多肽，其中载剂将保护它们以防止快速释放(诸如控释制剂)，该载剂包含植入物、透皮贴剂和微胶囊化的递送系统。可在本发明中使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。进一步地，多肽可包被有防止多肽失活的材料或化合物、或与这样的材料或化合物同时给药。例如，多肽可与适当的载剂(例如脂质体或稀释剂)一起给药。

本发明的药物组合物的给药途径可分成口服给药和胃肠外给药。优选的给药途径是静脉注射，但并不限于此。

口服剂型可被配制成片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、分散的粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊、软胶胶囊、糖浆或酏剂、丸剂、糖衣丸、液体、凝胶或膏剂。这些制剂可包含药学赋形剂，其中药学赋形剂包括但并不限于：成粒剂和崩解剂，结合剂，润滑剂，防腐剂，着色剂、调味剂或甜味剂，植物油或矿物油，湿润剂，和增稠剂。

由于胃肠外给药的制剂可为水性或非水性的等渗无菌无毒的注射或灌注溶液或悬浮液的形式。所述溶液或悬浮液可包括所采用的剂量和浓度对接受者无毒的试剂，诸如1，3-丁二醇、林格氏溶液(Ringer’s solution)、汉克溶液(Hank’s solution)、等渗的氯化钠溶液、油、脂肪酸、局部的麻醉剂、防腐剂、缓冲液、粘度或溶解性增高的试剂、水溶性的抗氧化剂、油溶性的抗氧化剂和金属螯合剂。

本发明的药物组合物可以与其他治疗肝纤维化的药物联合应用，这样的治疗肝纤维化的药物包括但不限于：抑制HSC活化增殖的药物、抑制炎症的药物、抑制氧化应激的药物、抑制ECM生成的药物。

抑制HSC活化增殖的药物包括但不限于：吡非尼酮、氟非尼酮、马洛替酯、索拉非尼、伊马替尼、BMS-986036、羟尼酮、辛伐他汀、VBY-376。

抑制炎症的药物包括但不限于：奥贝胆酸杂质、GS-0976、利拉鲁肽、cenicriviroc、恩利卡生、己酮可可碱、selonsertib、elafibranor、GR-MD-02、GM-CT-01。

抑制氧化应激的药物包括但不限于：GKT137831、氯沙坦。

抑制ECM生成的药物包括但不限于：常山酮、吉利德单抗。

根据本发明的第七个方面，本发明提供了一种靶向肝脏抗肝纤维化的药物递送系统，所述药物递送系统包括前面所述的多肽，以及靶向肝脏的运载物质。

所述运载物质可以将本发明的多肽递送到肝脏部位，降低多肽用药量。

这样的药物递送系统包括纳米颗粒。

根据本发明的第八个方面，本发明提供了一种抗肝纤维化的方法，所述方法包括施用TDGF-1全长蛋白或前面所述的多肽。

根据本发明的第九个方面，本发明提供了一种抑制肝星状细胞激活的方法，所述方法包括施用TDGF-1全长蛋白或前面所述的多肽。

根据本发明的第十个方面，本发明提供了一种降低细胞外胶原沉积的方法，所述方法包括施用TDGF-1全长蛋白或前面所述的多肽。

根据本发明的第十一个方面，本发明提供了TDGF-1蛋白在制备抗纤维化的药物中的应用。

根据本发明的第十二个方面，本发明提供了前面所述的多肽在制备抗纤维化的药物中的应用。

根据本发明的第十三个方面，本发明提供了TDGF-1蛋白在制备抑制肝星状细胞激活的药物中的应用。

根据本发明的第十四个方面，本发明提供了前面所述的多肽在制备抑制肝星状细胞激活的药物中的应用。

根据本发明的第十五个方面，本发明提供了TDGF-1蛋白在制备降低肝星状细胞中α-SMA表达水平的药物中的应用。

根据本发明的第十六个方面，本发明提供了前面所述的多肽在制备降低肝星状细胞中α-SMA表达水平的药物中的应用。

根据本发明的第十七个方面，本发明提供了TDGF-1蛋白在制备降低细胞外胶原沉积的药物中的应用。

根据本发明的第十八个方面，本发明提供了前面所述的多肽在制备降低细胞外胶原沉积的药物中的应用。

如本文中所用，“肝纤维化”被限定为肝内的结蹄或瘢痕组织的过度累积。肝纤维化中的结蹄/瘢痕组织的累积相比于正常健康肝脏中的结蹄组织水平是过度的。该纤维化经常伴随肝组织的坏死和/或炎症。特别地，在正常肝中的储存维生素A的肝星状细胞(HSCs)通过急性和慢性肝损伤被转化成肌纤维母细胞，通过细胞外基质诸如胶原、蛋白聚糖或透明质酸的合成和迁移的增加快速地增殖和合成过量的结蹄组织，这导致刺激肝纤维化的进展[Friedman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82:8681(1985)Gressner等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,151:222(1988)Gressner等人,J.Hepatol.,22:28(1995)]。

如本文所用“抗肝纤维化”是指预防肝纤维化或治疗肝纤维化，“治疗”是指尝试改变被治疗的个体或细胞的疾病过程的临床干预，并且可以在临床病理学过程中进行。治疗的治疗性作用包括但不限于限制、预防疾病复发、缓和症状，消除疾病的任何直接或间接的病理学后果，降低疾病进展的速率，缓和或减轻疾病状态，以及豁免或改善的预后。

如本文中所用，术语"治疗有效量"和“有效量”可互换地使用以指本发明的多肽的量：其足以导致肝纤维化或其一种或多种症状的发展或发病的预防，增强或改善另一种治疗的效果，和/或缓和肝纤维化的一种或多种症状。对于遭受肝纤维化的对象，优选的治疗有效量是有效减少纤维化和/或改善肝功能的量。

可以在一个或多个剂量中将治疗有效量施用给患者，所述剂量足以减轻、缓和、稳定、逆转或减缓疾病的进展，或者以其它方式减轻疾病的病理学后果，或者减轻疾病的症状。所述缓和或减轻不需要是持久的，但却可以是在一定时间范围(至少一个小时，至少一天，或者至少一周或更长)内。有效量通常由医生按照个案情况确定，并且属于本领域的技术人员的技能范围内。当确定实现有效量的适当剂量时，通常会考虑若干因素。这些因素包括患者的年龄、性别和体重、被治疗的病况、所述病况的严重程度、以及施用途径、剂型和方案以及所期望的结果。

治疗肝纤维化或抗肝纤维化是指施用本文所述的多肽或组合以治疗患有肝纤维化的对象。肝纤维化的治疗的一种结果是减少结缔组织的形成。肝纤维化的治疗的另一种结果是减少炎症和免疫细胞的浸润。肝纤维化的治疗的另一种结果是减少肝组织坏死。肝纤维化的治疗的另一种结果是改善肝功能。

如本文中所用，术语“对象”和“患者”可互换地使用并且是指动物，优选哺乳动物诸如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类动物(例如猴和人)，并且最优选是人。

如本文中所用，“TDGF-1全长蛋白”、“TDGF-1蛋白”和“TDGF-1”可互换使用，其序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的有益效果和优势：

(1)本发明首次证明TDGF-1及其EGF-like结构域具有抗肝纤维化的作用。

(2)TDGF-1及其EGF-like结构域序列来自于胚胎时期表达的人源蛋白，作用靶标明确，不会被免疫系统清除，是抗纤维化治疗的理想的多肽类药物，具有良好的应用前景。

(3)本发明的TDGF-1的截短体多肽：EGF-like结构域短肽由于缺少了促肿瘤的CFC结构域导致单独应用更具有安全性。

附图说明

图1显示本发明的TDGF-1及其截短体多肽的蛋白电泳图；

图2显示利用免疫荧光实验检测Smad4定位的荧光图；

图3显示荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶水平的统计图；

图4显示TDGF-1蛋白截短体多肽对α-SMA表达影响的统计图；

图5显示利用细胞平板克隆增殖实验检测TDGF-1蛋白及其截短体多肽对肝细胞增殖的影响的实物图；

图6显示利用小鼠模型检测TDGF-1蛋白及其截短体多肽对小鼠肝脏纤维化程度影响的病理图。

具体实施方式

实施例1 TDGF-1蛋白及其截短体多肽合成

通过大肠杆菌原核表达的方式获得了人TDGF-1的全长蛋白(序列如SEQ ID NO.3所示)，与吉凯基因(上海)进行合作合成了TDGF-1截短体多肽：EGF-like结构域短肽(序列如SEQ ID NO.1所示)及CFC结构域短肽(序列如SEQ ID NO.2所示)。

SEQ ID NO.1：PPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCML；

SEQ ID NO.2：PSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCK。

SEQ ID NO.3：

MDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDSIWPQEEPAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYY

蛋白及多肽电泳图如图1所示。

实施例2体外细胞实验研究TDGF-1蛋白及其截短体多肽的功能

1、免疫荧光实验

方法：将1×10⁵个LX2(人肝星状细胞系)细胞种植于6孔板中，37℃，5％CO₂无菌环境中培养24小时至完全贴壁，移除培养上清，换成含有3％胎牛血清的DMEM培养液继续培养，在不同的细胞上清中分别加入PBS，50ng Cripto-1全蛋白(R&D公司)，50ng EGF-like结构域短肽，50ng CFC结构域短肽，孵育48小时。移除上清，PBS清洗细胞三次，每孔加入预冷的4％多聚甲醛固定5分钟，PBS洗涤3次，加入含有0.5％TritonX-100的PBS，每孔1ml，室温下孵育10分钟；吸出0.5％TritonX-100的PBS，每孔加入1ml 5％BSA(PBS稀释)，室温封闭1小时；移除BSA，每孔加入100μl一抗(Smad4小鼠抗人抗体，Santa Cruz),至于室温4小时；用PBS清洗孔内抗体，5分钟/次，共3次；移除PBS，每孔加入100μl山羊抗小鼠的CY3标记荧光二抗(Proteintech公司)，室温孵育1小时；PBS洗涤3次，5分钟/次；加入DAPI(Roch公司)试剂对细胞核进行复染，室温作用5分钟，PBS洗涤3次，5分钟/次，荧光倒置显微镜下观察。

结果：如图2所示，EGF-like结构域短肽作用下，与Cripto-1全蛋白功能相似，能够部分抑制Smad4的细胞核滞留，从而阻断TGF-β通路。

2、荧光素酶报告基因实验

前期已经设计并构建了含有TGF-β应答基因的荧光素酶报告载体-PGL3-caga(参见文献：Ying Shi et al.Alantolactone inhibits cell proliferation byinterrupting the interaction between Cripto-1and activin receptor type II Ain activin signaling pathway.J Biomol Screen.2011Jun；16(5):525-35.doi:10.1177/1087057111398486.Epub 2011Mar4)，其中包含5个拷贝的TGF-β应答基因启动子关键序列，能够特异性反应TGF-β通路的激活情况。

方法：将293T细胞种植于6孔板中，37℃，5％CO₂无菌环境中培养24小时，完全贴壁后汇合度达到70-80％，将1μg构建好的pGL-3-CAGA载体与0.1μgβ-半乳糖苷酶载体与3μlPEI阳离子转染试剂在无血清DMEM(BI)中混合，静置20分钟后，将混合物加至细胞上清中，轻轻混匀后，孵育24小时。

转染24小时后，分组加入TGF-b(100ng/孔)、TGF-b(100ng/孔)+TDGF-1蛋白(200ng/孔)、TGF-b(100ng/孔)+EGF-like结构域短肽(100ng/孔)、TGF-b(100ng/孔)+CFC结构域短肽(100ng/孔)继续孵育24小时。转染48小时后细胞用PBS洗涤3次，用荧光素酶检测试剂盒中专用裂解液对细胞进行冰上裂解30分钟，12000g离心10分钟，取20μl上清与荧光素酶检测试剂混合，化学发光法检测荧光素酶表达强度；再取20μl细胞裂解上清，加入50μlβ-半乳糖苷酶检测试剂，酶标仪490mm吸收波长检测荧光强度。以荧光素酶检测值与β-半乳糖苷酶检测值做比值进行组间比较。

结果：如图3所示，TDGF-1全长蛋白和EGF-like结构域短肽可显著降低荧光素酶水平，表明EGF-like结构域短肽可以抑制TGF-β通路活性。

3、EGF-like结构域短肽对肝纤维化相关蛋白表达的影响

方法：肝星状细胞LX-2细胞接种6孔板，每孔5*10⁵个细胞，24小时待细胞完全贴壁后，分别在四个孔中加入TDGF-1蛋白(200ng/孔)，EGF-like结构域短肽(100ng/孔)，CFC结构域短肽(100ng/孔)，作用48小时后细胞裂解提取全蛋白，用免疫印迹的方法对细胞中α-SMA的表达量进行比较分析。

结果如图4所示：TDGF-1与EGF-like下调α-SMA的表达量。

4、细胞平板克隆增殖实验

方法：对数生长期HepG2细胞以0.25％胰蛋白酶消化并垂悬至单个细胞，种植于6孔板中，种植密度1000个/孔，每孔中细胞培养液为3ml含有10％胎牛血清的DMEM细胞完全培养基，轻轻摇动平板让细胞平均分布在平板的各个角落。将平板至于37℃，5％CO2的无菌培养箱中培养10-14天。细胞铺板24小时后，每孔依次分别加入PBS，20ng Cripto-1，20ngEGF-like结构域短肽，20ng CFC结构域短肽。当观察到有明显的克隆形成时，终止培养，移除培养液，PBS洗涤2次，每孔加1ml 4％多聚甲醛固定10分钟，移除固定液，加入结晶紫试剂染色10分钟，蒸馏水洗涤，空气干燥。

结果：如图5所示，EGF-like结构域短肽抑制HepG2细胞增殖，表明EGF-like结构域短肽不具有促肿瘤的作用，证明EGF-like结构域短肽在抗肝纤维化中具有安全性。

实施例3体内实验研究TDGF-1蛋白及其截短体多肽的功能

1、肝纤维化小鼠模型构建

健康C57雄性小鼠，体重18-22g之间，适应性饲养3-5天。以四氯化碳皮下注射或腹腔注射法(15μl四氯化碳/85μl橄榄油)构建肝纤维化小鼠模型，每周注射2次，每次注射液总体积100μl，连续注射8周后处死小鼠，取肝脏及外周血用于肝纤维化评价指标分析(模型建立方案来源：J Hepatol.2017Oct；67(4):770-779)。

2、检测

肝纤维化小鼠建模第4周开始取不同时间点(4-10周)用TDGF-1截短体多肽小分子对肝纤维化小鼠进行干预，腹腔注射(10ng/g体重)，每周一次。小鼠共分为四组，每组6-8只，包括正常对照组，疾病模型组，疾病模型TDGF-1全蛋白干预组，疾病模型TDGF-1截短体多肽干预组。建模8周对肝脏切片组织标本进行Masson染色。

Masson染色流程：

(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。

(2)苏木素染细胞核：masson染色试剂盒内Weigert氏铁苏木素染5min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，流水冲洗数分钟返蓝。

(3)丽春红染色：masson染色试剂盒内丽春红酸性品红液染5-10min，蒸馏水快速漂洗。

(4)磷钼酸处理：masson染色试剂盒内磷钼酸水溶液处理约3-5min。

(5)苯胺蓝染色：不用水洗，直接用masson染色试剂盒内苯胺蓝液复染5min。

(6)分化：1％冰醋酸处理1min。

(7)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

(8)显微镜镜检，图像采集分析。染色结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色；细胞核呈蓝黑色。

3、结果：

如图6所示，从染色结果可以看出，TDGF-1全长蛋白和EGF-like结构域短肽干预的小鼠肝脏的成纤维面积小于未干预小鼠。A：正常对照；B：疾病模型；C：疾病模型TDGF-1全长蛋白干预；D：疾病模型TDGF-1截短体多肽干预。

在此说明书中，本发明已经参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110> 吉林大学第一医院

<120> TDGF-1截短体小分子多肽在抗肝纤维化中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg Thr Cys Cys

1 5 10 15

Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu

20

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys Glu Asn

1 5 10 15

Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys Ser Leu

20 25 30

Cys Lys

<210> 3

<211> 188

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 3

Met Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile

1 5 10 15

Met Ala Ile Ser Lys Val Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly

20 25 30

His Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Tyr Leu Ala Phe Arg Asp

35 40 45

Asp Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Arg Val Pro Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg

65 70 75 80

Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala

85 90 95

Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys

100 105 110

Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys

115 120 125

Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Gln Ala

130 135 140

Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala

145 150 155 160

Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met

165 170 175

Leu Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr

180 185

Claims (10)

1.一种抗肝纤维化的TDGF-1蛋白的截短体多肽，其特征在于，所述多肽序列如SEQ IDNO.1所示。

2.编码权利要求1所述的多肽的核酸分子。

3.包含权利要求2所述的核酸分子的重组载体。

4.包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的重组载体的宿主细胞。

5.权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，利用权利要求4所述的宿主细胞表达所述多肽。

6.一种抗肝纤维化的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括治疗有效量的权利要求1所述的多肽。

7.一种靶向肝脏抗肝纤维化的药物递送系统，其特征在于，所述药物递送系统包括权利要求1所述的多肽，以及靶向肝脏的运载物质。

8.一种方法，所述方法包括施用TDGF-1蛋白或权利要求1所述的多肽；所述方法包括以下方法中的任一种：

(1)抗肝纤维化的方法；

(2)抑制肝星状细胞激活的方法；

(3)降低肝星状细胞中α-SMA表达水平的方法；

(4)降低细胞外胶原沉积的方法。

9.TDGF-1蛋白的应用，所述应用包括以下应用中的任一种：

(1)在制备抑制肝星状细胞激活的药物中的应用；

(2)在制备降低肝星状细胞中α-SMA表达水平的药物中的应用；

(3)在制备降低细胞外胶原沉积的药物中的应用；

(4)在制备抗纤维化的药物中的应用。

10.权利要求1所述的多肽的应用，所述应用包括以下应用中的任一种：

(1)在制备抑制肝星状细胞激活的药物中的应用；

(2)在制备降低肝星状细胞中α-SMA表达水平的药物中的应用；

(3)在制备降低细胞外胶原沉积的药物中的应用；

(4)在制备抗纤维化的药物中的应用。