CN115501342B - 类固醇激素作为孤儿粘附类受体adgrg2拮抗剂配体的应用 - Google Patents
类固醇激素作为孤儿粘附类受体adgrg2拮抗剂配体的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种类固醇激素作为孤儿粘附类受体ADGRG2拮抗剂配体的应用，属于生物工程和生物医药技术领域。本发明通过实验证明，类固醇激素脱氧皮质酮可作为孤儿受体ADGRG2的配体，特异性地结合ADGRG2，并拮抗激动剂脱氢表雄酮诱导的ADGRG2下游Gs信号通路，表明其具有作为男性避孕药物的潜力，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程和生物医药技术领域，具体涉及类固醇激素作为孤儿粘附类受体ADGRG2拮抗剂配体的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
目前男性不育正在从一个个人问题转变为一个公共健康问题，现在又将近15％的育龄夫妇是不育症，男性不育症占其中的二分之一。目前对于男性不孕症的治疗研究仍未有确定的机制和靶点。G蛋白偶联受体(GPCRs)是人类基因组编码的最大膜蛋白家族，也是最大的一类药物靶点，目前约有三分之一的临床药物直接作用于GPCR。近年来在男性生殖系统的GPCR研究也越来越多，比如血管紧张素AT2受体在附睾腔的基底细胞调节质子的分泌；LRG4受体在调控附睾上皮和间质细胞地相互作用具有重要作用，LGR4敲除小鼠的附睾小管不能正常地伸长和卷曲；GPER在精子成熟、保护和储存中具有重要作用。
粘附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)是GPCR中的第二大家族，一共有33个成员。所有的aGPCRs除了具有经典的七次跨膜结构，还有一些独特的特征，都具有很长且具有粘附类潜力的N端，N端都包括一个经诱导的可自水解的近膜结构域。粘附类受体ADGRG2因在雄性生殖系统中的输出小管和附睾头部特异性高表达，从而引起广泛关注。张道来的研究表明ADGRG2/β-arrestin 1/Gq/CFTR超复合物定位于输出小管中非纤毛细胞的顶端膜，并发挥区域信号中枢的作用，控制管腔内的液体重吸收，维持输出小管和附睾起始段的pH和氯离子稳态，对维持精子发育成熟具有重要功能。ADGRG2的下游信号转导已被广泛研究，其具有组成性的Gs和Gq活力，然而ADGRG2仍未发现其内源性配体。
基于ADGRG2在雄性生殖系统中起到重要作用，其已成为开发男性生殖疾病药物或男性避孕药的新靶点。因此找到特异性结合ADGRG2的内源性配体，并以此开发药物可能构成开发男性生殖疾病治疗药或/和诊断的基础。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供类固醇激素作为孤儿粘附类受体ADGRG2拮抗剂配体的应用。本发明通过研究发现，类固醇激素脱氧皮质酮(DOC)可作为孤儿受体ADGRG2的配体，特异性地结合ADGRG2，并拮抗激动剂脱氢表雄酮(DHEA)诱导的ADGRG2下游Gs信号通路，表明其具有作为男性避孕药物的潜力，因此具有良好的实际应用之价值。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供ADGRG2调节剂在制备男性避孕药物中的应用。
其中，所述ADGRG2调节剂是受体ADGRG2拮抗剂或受体ADGRG2抑制表达剂。
进一步的，所述ADGRG2拮抗剂包括抑制ADGRG2的配体、多肽、抗体或小分子化合物。
所述配体包括类固醇激素DOC。
本发明的第二个方面，提供脱氧皮质酮在作为受体ADGRG2拮抗剂配体中的应用。
本发明的第三个方面，提供一种药物组合物，其包含上述脱氧皮质酮或其溶剂化物或其药学上可接受的盐。
以及，一种药物制剂，其包含上述脱氧皮质酮或其溶剂化物或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的辅料和/或载体。
本发明的第四个方面，提供上述脱氧皮质酮或其溶剂化物或其药学上可接受的盐或者上述药物组合物或药物制剂在制备ADGRG2拮抗剂药物或试剂中的应用。
其中，所述ADGRG2拮抗剂药物可以为男性避孕药物。
本发明的第五个方面，提供一种避孕的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的DOC或所述药物组合物或药物制剂。
本发明所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人，所述受试者为雄(男)性。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案通过筛选大量的类固醇化合物，发现了ADGRG2的内源性小分子拮抗剂。之前研究表明ADGRG2在调控男性生殖系统输出小管内液体重吸收和维持精子成熟功能方面中的重要作用，在男生生殖领域内技术人员可通过该小分子拮抗剂实现对ADGRG2及其下游通路的调节作用，该拮抗剂具有开发成为男性避孕药的潜能。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中类固醇激素DOC诱导的粘附类受体ADGRG2的胞外端构型变化dose曲线效果图；
图2为本发明实施例1中类固醇激素DOC抑制激动剂DHEA刺激下鼠源和人源粘附类受体ADGRG2的Gs信号通路效果图；
图3为本发明实施例1中类固醇激素DOC拮抗激动剂DHEA刺激下粘附类受体ADGRG2介导的野生型和ADGRG2敲除小鼠的输出小管原代细胞CFTR电流图。
图4为本发明实施例1中类固醇激素DOC拮抗激动剂DHEA刺激下粘附类受体ADGRG2介导的野生型和ADGRG2敲除小鼠的输出小管原代细胞CFTR电流统计图。
图5为本发明实施例1中类固醇激素DOC抑制的激动剂DHEA刺激下过表达粘附类受体ADGRG2和CFTR或单独表达CFTR的HEK293细胞的CFTR电流图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
如前所述，已有研究证明粘附类受体ADGRG2在男性生殖系统功能具有重要调节作用。有鉴于此，本发明提供了一种类固醇激素DOC，该激素可作为粘附类受体ADGRG2的内源性拮抗剂，具有成为男性避孕药的潜能。
本发明的一个具体实施方式中，提供ADGRG2调节剂在制备男性避孕药物中的应用。
其中，所述ADGRG2调节剂是受体ADGRG2拮抗剂或受体ADGRG2抑制表达剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述ADGRG2拮抗剂包括抑制ADGRG2的配体、多肽、抗体或小分子化合物。
本发明的又一具体实施方式中，所述配体包括类固醇激素DOC。
本发明的又一具体实施方式中，提供脱氧皮质酮在作为受体ADGRG2拮抗剂配体中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物组合物，其包含上述脱氧皮质酮或其溶剂化物或其药学上可接受的盐。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物制剂，其包含上述脱氧皮质酮或其溶剂化物或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的辅料和/或载体。
本发明所述辅料是指药物组合物或药物制剂中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。本领域常用的辅料比如缓冲剂、稳定剂、防腐剂或赋型剂，常用的赋形剂例如粘合剂、填充剂、润湿剂、崩解剂等。
作为示例，本发明的所述制剂中可选用的赋形剂包括但不限于：所述赋形剂选自磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糊精、淀粉、凝胶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐和聚乙烯吡咯烷酮。
本发明所述药物载体可以是药学上可接受的溶剂、悬浮剂、囊泡、纳米材料等，用于将递送至动物或人体内。载体可以是液体或固体，并按照计划的给药方式进行选择，同时，蛋白和脂质体也是药物载体。
本领域技术人员可采用公知的技术将本发明的化合物配制成药物组合物或制剂。比如将本发明上述脱氧皮质酮与药用辅料混合，然后如果需要，使所得混合物形成所需的形状。以及，除本发明提到的以外，合适的药用辅料是本领域已知的，例如参见2005年版的药用辅料手册(原著第四版)，作者(英)R.C.罗(RaymondCRowe)(美)P.J.舍斯基(PaulJSheskey)。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述脱氧皮质酮或其溶剂化物或其药学上可接受的盐或者上述药物组合物或药物制剂在制备ADGRG2拮抗剂药物或试剂中的应用。
其中，所述ADGRG2拮抗剂药物可以为男性避孕药物。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种避孕的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的DOC或所述药物组合物或药物制剂。
本发明所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人，所述受试者为雄(男)性。
本发明所述治疗有效量是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药物制剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，所述响应包括减轻或部分减轻所述治疗疾病、综合征、病症或障碍的症状。
本领域的研究者、兽医、医生或其他医疗人员可根据临床试验或者本领域其他公知的手段获知可使用的治疗有效量的范围。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1类固醇激素DOC特异性结合ADGRG2并拮抗ADGRG2下游信号通路,并调控ADGRG2在输出小管中的功能
实验步骤：
1.从阿拉丁试剂官网购买商业化类固醇激素DOC。
2.采用分子生物学方法，构建基因重组的鼠源ADGRG2重组质粒，以HEK293细胞过表达鼠ADGRG2，给予DOC刺激，利用ADGRG2N端的Nluc基团和胞外环上的Flash基团的生物发光共振能量转移方法可以检测DOC诱导的ADGRG2自身构型变化程度，以生物发光功能能量转移的程度反映DHEA与ADGRG2的特异性结合。
3.以HEK293细胞过表达人源或鼠源ADGRG2，利用Glosensor方法可以检测第二信使cAMP的原理，给予固定浓度激动剂DHEA刺激细胞，使胞内cAMP浓度上升，在此基础上给予类固醇拮抗剂，以引起细胞内cAMP浓度下降的程度来表征DOC抑制ADGRG2的Gs信号通路情况。
4.已有研究证明粘附类受体ADGRG2在调控输出小管的水分重吸收方面具有重要作用，并且在输出小管的非纤毛细胞中ADGRG2介导CFTR的电流。方法：分离野生鼠和敲除鼠的输出小管单细胞，腺病毒ADGRG2-promoter-RFP-labeled病毒感染细胞。给予激动剂DHEA刺激原代细胞，再给予拮抗剂DOC刺激，电生理手段记录ADGRG2-promoter-RFP-labeled细胞的电流。
5.HEK293细胞过表达人源或鼠源ADGRG2与CFTR或单独过表达CFTR，先给予固定浓度激动剂DHEA刺激，在此基础上给予拮抗剂DOC刺激，电生理手段记录DOC诱导的两种细胞全细胞电流。
将DOC用PBS配制成工作浓度为10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M、10-4M，HEK293细胞过表达Nluc-ADGRG2-ECL1/2/3-Flash，用底物Flash-EDT2 37℃恒温孵育40分钟，PBS清洗两次，再给予不同浓度的DOC刺激，利用多功能酶标仪实时记录荧光值，对结果进行统计分析作图，结果见图1。
将DOC用PBS配制成工作浓度为10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M、10-4M，HEK293细胞中共表达人或鼠ADGRG2和Glosensor，给予不同浓度的拮抗剂DOC 37℃孵育半小时，再给予30uM激动剂DHEA刺激，阴性对照为表达空载体pcDNA和Glosensor的HEK293细胞，利用多功能酶标仪实时记录荧光值，对结果进行统计分析作图，结果见图2。
将野生鼠和ADGRG2全身敲除小鼠脱颈处死，分离输出小管，胶原酶消化半小时并打散成单细胞，用腺病毒ADGRG2-promoter-RFP-labeled病毒感染，48h后消化原代细胞至24mm×24mm的玻片上，12h原代细胞贴壁后，取细胞玻片至荧光显微镜的载物台上，给予不同浓度的DOC孵育15min，再用20uM的激动剂DHEA刺激，挑选发红色荧光的原代细胞用HEKAEPC10双探头放大器记录全细胞电流，结果见图3和图4。
体外用HEK293细胞检测DOC诱导的CFTR电流的变化，将DOC用PBS配制成工作浓度为10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M、10-4M，在共表达人或鼠ADGRG2与CFTR或单独过表达CFTR的HEK293细胞中，给予不同浓度的拮抗剂DOC刺激15min，再用20uM激动剂DHEA刺激，用HEKA EPC10双探头放大器记录全细胞电流，结果见图5。
实验结果表明，DOC能够特异性地结合黏附类受体ADGRG2，并且诱导胞外环ECL2的变化的半数有效浓度是350nM；DOC可以拮抗黏附类受体ADGRG2受DHEA诱导的Gs通路，其中人源和鼠源半数有效浓度各是8.6nM和37.6nM；DOC可以拮抗DHEA诱导的野生鼠和共表达人或鼠ADGRG2和CFTR的HEK293细胞中的全细胞电流增加，且随着剂量的增加抑制效果增强；体外过表达体系DOC拮抗DHEA诱导的人或鼠ADGRG2介导的CFTR电流增加的半数有效浓度分别是2.5nM和12.7nM。
上述实验结果表明本实施例中提供的类固醇化合物DOC能够靶向ADGRG2成为其特异性配体，并能够有效拮抗激动剂DHEA诱导的Gs信号通路。从而，本发明提供了有前景的化合物，具有发展成为男性避孕药的潜能。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.脱氧皮质酮在体外拮抗黏附类受体ADGRG2受脱氢表雄酮DHEA诱导的Gs通路中的应用；
所述应用在HEK293细胞中，且所述应用不包括疾病的诊断和治疗用途。
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| ADGRG2对输出小管液体重吸收和男性生育能力的调控机制;张道来;中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑(第12期);第E067-26页 * |
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