CZ299673B6

CZ299673B6 - Použití pentraxinu s dlouhým retezcem k príprave léciva pro lécbu onemocnení zpusobených pozmenenouaktivací rustového faktoru FGF-2

Info

Publication number: CZ299673B6
Application number: CZ20031179A
Authority: CZ
Inventors: Mantovani@Alberto; Bottazzi@Barbara; Presta@Marca; Rusnati@Marco
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S. P. A.
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2008-10-15
Also published as: CA2428176A1; MXPA03004005A; EP1331940B1; AU2002222513B8; ATE322906T1; BR0115190A; CZ20031179A3; HU229100B1; KR20030061396A; IT1317930B1; ITRM20000578A1; PL205925B1; AU2251302A; HUP0400541A3; ES2261515T3; JP2004513151A; EP1331940A1; CN1304047C; JP4167061B2; CN1473050A

Abstract

Je popsáno použití pentraxinu s dlouhým retezcem PTX3 (PTX3) nebo nekterého z jeho funkcních derivátu k príprave léciva, které inhibuje biologickou aktivitu rustového faktoru FGF-2, vhodného k prevenci a lécbe onemocnení zpusobených pozmenenou aktivací jmenovaného rustového faktoru FGF-2.

Description

(54) Nu/ev vvníile/n:

Použití pentraxinu s dlouhým řetězcem k přípravě léčiva pro léčbu onemocnění způsobených pozměněnou aktivací růstového faktoru FGF-2 (57) Anotace

Je popsáno použili pentraxinu s dlouhým řetězcem P ΓΧ3 (PIX3) nebo některého / jeho funkčních derivátu k přípravě léčiva, které inhibuje biologickou aktivitu růstového íákloru LGL-2. vhodného k prevenci a léčbě onemocnění způsobených pozměněnou aktivací jmenovaného růstového faktoru Kil -2.

C7. 299673 B6

Použití pentraxinu s dlouhým řetězcem k přípravě léčiva pro léčbu onemocnění způsobených pozměněnou aktivací růstového faktoru FGF-2

Oblast techniky

Předložený vynález se týká použití pentraxinu s dlouhým řetězcem PTX3 (PTX3) nebo jednoho z, jeho funkčních derivátu k přípravě léčiva, které inhibuje biologickou aktivitu růstového faktoru FGF-2: jmenované léčivo je vhodné k prevenci a léčbě takových onemocnění, která přináší pozměněná aktivace jmenovaného růstového faktoru FGF-2.

Mezi onemocnění, která sebou přináší pozměněná aktivace růstového faktoru FGF-2 náleží onemocnění vyvolaná pozměněnou angiogenezí a neregulovanou prolíferaci fibroblastů nebo buněk hladkého svalstva.

Dosavadní stav techniky

První sloučenina vybavená antiangiogenní aktivitou byla objevena v chrupavkách Henry' Bremem a Judath Folkmanem v roce 1975 (J. Exp. Med., 141, (2), 427 - 439, I. únor 1975). Autoři mysleli, že by tento objev mohl být použit k regulaci takových patologických procesů, jakými

2o jsou růst nádorů, metastázy. chronické a akutní záněty kloubů a diabetická retinopatic s použitím selektivních inhibitorů patologické neoangiogeneze.

Angiogeneze u dospělých je normálně klidná, a je normální funkcí, například při hojení poranění, nebo při obnově endometria během ženského reprodukčního cyklu.

Angiogenní odezva je při omezení vaskulárníeh funkcí a neodpovídající perfuzi tkáně stimulována fyziologicky.

Obecněji lze tvrdit, že angiogeneze vytváří za fyziologických podmínek kladnou zpětnou vazbu si) jakožto odezvu na neodpovídající perfuzi. nebo na snížený přísun kyslíku a živin, což nastává například v případě okluze arterií, v situacích růstu hmoty tkáně (například neovaskularizaee, která doprovází tvorbu svalové tkáně), a v případech zvýšené pracovní zátěže spojené sc zvýšenou spotřebou kyslíku a živin.

Je dobře známo, že růst primárního nádoru je podporován dobrou vaskularizaeí nádorové tkáně. Odpovídající přísun kyslíku a živin vyvolává rychlý růst samotného nádoru.

Bylo prokázáno, že nadbytečná angiogeneze může být v prognóze neoplasmy extrémně negativním faktorem (van Hinsbergh, V. W„ Collen, A.. Koolwijk, P.: Ann. OncoL 4. (10. dodatek),

4o 60 63, 1999: Buolamwini. J. K.;: Curr., Opin.. Chem., Biok. 3, (4). 500 - 509, srpen 1999).

V nádorové oblasti je též známo, že základním stádiem biologie nádorových buněk je zajišťování schopnosti melastázovat.

Nádorové buňky, které metastázují ztrácejí schopnost přilnout k okolním strukturám, narušují krevní a lytnťatické cesty a kolonizují další vzdálené tkáně, kde mohou pokračovat ve své reprodukci.

Melastázování je též kritickou příhodou v klinické historii onemocněn i, a je hlavní příčinou úmrtí na rakovinu, loje těsně spojeno a usnadněno přítomností vaskulární tkáně v místě nádoru nebo

5u okolních oblastech.

Migrace nádorových buněk přes obklopující tkáně umožňuje těmto buňkám dosáhnout krevního řečiště uvnitř nádoru, a to tehdy, kdy už před tím existovalo, nebo bylo vytvořeno neoangioCZ 299673 B6 genezí, a tak dosáhnout krevního oběhu (Ray. J. M., Stetler-Stevenson. W. G.; Eur. Respir. J., 7, (11). 2062 - 2072, 1994; Stetler-Stevenson, W. G., Eiotta. L, A., Kleiner Jr„ D. E.: PASEB E, 7, (15). 1434 - 1441. prosinec 1993).

Sdílení lymfatiekýeh a krevních cest ve vaskulární oblasti nádoru umožňuje neoplastickým buňkám pohybovat se v obou systémech.

Poslední studie ukázaly přímý vztah mezi angiogenezí a arthritiekými onemocněními (Koch. A. E.: Arthritis and Rheumatism, 414. 951 - 962. 1998). Bylo prokázáno, že neovaskula10 rizace kloubních chrupavek hraje klíčovou úlohu zvláště ve vytváření panusu a při progresi arthritidy. Normální chrupavka nemá krevní cesty, avšak synoviální tekutina arthritiekýeh pacientů obsahuje stimulační faktor angiogeneze vytvářený endotheliálními buňkami (EASE).

Přítomnost tohoto faktoru je spojena s vaskularizací a degradací chrupavky.

i? S abnormální angiogenezí jsou spojena i další onemocnění.

Bylo zjištěno, že u diabetické retinopatie (Histol. HistopathoL 14. (4), 1287- 1294. říjen 1999), psoriázy (Br. J. Dermatol.. 141, (6), 1054 - 1060, prosinec 1999). chronického zánětu a arteriosklerózy (Planta Med.. 64, (8). 686 - 695. 1998) je neovaskularizace napadených tkání podpůrným faktorem.

2o

Růstový faktor FGF-2 jc kationický polypeptid 18kDa schopný v endotheliálních buňkách v kultuře vyvolat jak angiogenezí in vivo, tak proliferaci buněk, ehemotaxii a tvorbu proteáz (Basilice a Moscatelli: Adv. Cancer Res.. 59, 115 - 165, 1992).

Úloha FGF-2 v nádorové angiogenezí je jíž známa (Pathol. Biol. (Paříž), 47, (4), 364 - 367, duben 1999).

V časopise J. Pathol,, 189, (1), 72 - 78, září 1999 je uváděno, že zvýšená exprese FGF-2 u pacientů trpících mezotel iomeni je spojena s vyšší agresivitou a vyšší úmrtností pacientů postiženi ných takovým nádorovým onemocněním,

V Oneogene, 18, (48), 6719 - 6724. 18. listopad 1999 je uváděno, že FGF-2 propůjčuje buňkám karcinomu schopnost metastázovat do měchýře kry sy.

Int. J. Cancer, 81. (3), 451 - 458. 5. květen 1999) uvádí, že FGF-2 má silné mitogenické účinky a je zapojen do vývoje lidských nádoru a zvyšuje jejich malignitu.

Při léčbě nádorových onemocnění představuje anti angiogenní terapie vzhledem ke standardní tradiční chemoterapii tyto výhody (Cancer Research, 58, 1408 - 1416, 1998);

4(i 1. Vyšší specifičnost; je cílem procesu neovaskularizace nádoru;

2. Vyšší biodisponibilita; oproti tradičním chemoterapeutiekým přístupům, které působí přímo na nádorové buňky jsou cílem bez problémů snadno dosažitelné endotheliální buňky;

3. Malá chemorezistence: to může být nej důležitější výhodou této terapie; endothel iální buňky jsou s ohledem na nádorové buňky geneticky stabilní, fenomén odolnosti léčiva je nepravdě45 podobný;

4. Malé metastázování: blokování neovaskularizace omezuje propagaci nádorových buněk v dalších částech těla přes krevní řečiště;

5. Je podporována apoptóza: blokování vaskulární sítě v nádoru sníží nádorovým buňkám dostupnost kyslíku a živin a touto cestou se zvýší apoptóza;

CZ 299673 Bó

6. Snížení systémové toxicity: takové toxické účinky jako je myelosuprese. gastrointestinální působení a přechodná alopecie objevující se v tradiční chemoterapii není u antiangiogenní terapie pozorována.

Ke stanovení těchto účinků reaguje FGF-2 se dvěma různými třídami receptorů přítomnými na povrchu cílových buněk: s receptory s vysokou affinitou vybavenými účinky tyrosin kinás (FGFR) a s receptory' s nízkou affinitou představované protcoglykan beparan sulfátem (HSOG) (Johnson a Williams: Adv. Cancer Res., 60. 1—41. 1993; Moscatelli: J. Cell. Physiol., 13 1, 123130, 1987).

ío FGF-2 je silným mitogenem pro buňky měkkého svalstva a je nezbytný pro jejich proliferaci po zásahu balónkovým kaletrem (J. Biol. Chem., 275, (15), 11270 - 1 1277. 14. duben 2000).

Onemocnění způsobená pozměněnou aktivací růstového faktoru FGF-2 tudíž také zahrnují hyperplasii svalové stěny arterií, což nastává během restenózy po angioplastikách a zavádění i? „koronárních stentů“ (J. Vasc. Surg.. 25. (2). 320 - 325. únor 1997).

Řízení neovaskularizacc závislé na FGF-2 představuje jeden ze základních prvků regulaci a léčení onemocnění vázaných na pozměněnou angiogenezi, rovněž tak jako řízení nekontrolované proliťerace fibroblastů či SMC závislých na FGF-2 je pro zajizvení spojené s nadměrnou fíbro2o blastovou odezvou a restenosou po angioplastice klíčové.

Dostupnost nových terapeutických sloučenin, které specificky inhibují biologickou aktivitu I GF 2 jc při prevenci a léčbě těch onemocnění, která sebou přináší pozměněná aktivace tohoto růstového Faktoru předmětem primární důležitosti. Mezi taková onemocnění náleží arthritické zs onemocnění, nádory, nádorové metastázy. diabetická retinopatie, psoriáza, chronický zánět, arleríoskleróza, hojení jizev při nadměrné fibroblastové odezvě a restenózy po angioplastice.

PTX3 je exprimován v různých typech buněk (Bottazzi, et al.: J. Biol. Chem., 272, 32817 32823. 1997), zvláště v mononuklcárních fagocytech a endotheliálníeh buňkách po vystavení .w vlivu zánětlivých cytokinů intcrlcukinu lp (IL—1 p) a nádorovému nekrotickému faktoru alfa (TNF-a).

Až posud nebyla biologická funkce PTX3 plně objasněna.

PTX3 sestává ze dvou strukturních domén: domény sN-termináleni nepříbuzné se žádnou známou látkou, a domény s C-terminálem podobné takovým pentraxinům s krátkým řetězcem jako je C-rcaktivní protein (CPR) (Breviario, F.. et al.: J. Biol., Chem., 267. 22190. 1992).

Mezi humánním PTX3 (hPTX3) a zvířecími PTX3 byla pozorována velká podobnost. Myší

PTX3 (mP l X3) je velmi podobný hPTX3 zvláště co se týká sekvence DNA, genové organizace a polohy . Humánní a myší gen PTX3 je z 82 % identický a dosahuje hodnoty až 90 %. pokud se berou v úvahu i ochranné substituce (Jntrona, M„ et al.: Blood, 87, 1862 - 1972, 1996). Myší

PTX3 gen je u myší umístěn na 3. chromosomu v obdobné oblasti jako u člověka - oblasti 3q (q24 - 28) což je v souladu s dokumentovanou polohou hPTX3 v oblasti 3q 25 (Introna, M„ et al., Blood, 87, 1862 - 1872, 1996).

Vysoký stupeň podobnosti mezi sekvencemi HPTX3 a mPTX3 je známkou vysokého stupně ochrany pentraxinů během evoluce (Pepys, Μ. B,, Balz, M. L.: Adv. Immunol., 34, 141, 1983).

Pro přehled o pentraxinech viz Gewurz, IL, et al.: Current Opiníon in Immunology. 7, 54 - 64,

1995.

Mezinárodní přihláška WO99/32 516 podaná jménem přihlašovatele popisuje použití pentraxinů s dlouhým řetězcem PTX3 k léčbě infekčních onemocnění, zánětů a nádorů. Proti nádorový účinek vykazovaný PTX3 popsaný ve W( )99/3 2 516 je zprostředkovaný leukoeitální obnovu, tj.

5o na imunologické bázi.

Ve W099/32 516 nebylo nikdy popsáno nebo doporučeno použití PTX3 jako látky vhodné k léčbě onemocnění spjatých s pozměněnou aktivací růstového faktoru FGF 2.

Patent US 5 767 252 popisuje neuronální růstový faktor náležející do skupiny pentraxinu (viz též 5 odkazy tam citované). Tento patent odkazuje na neurobiologickou oblast.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že pentraxin s dlouhým řetězcem ΡΊ Χ3 je schopen vázat FGF-2 s vysokou affinitou a specifikou. Vazba P1X3 s FGF-2 (Kj ^8-19 nM) chrání FGD2 před jeho vysokou ío affinitou k ty rosin kinázovým receptorům a před jeho navázáním na místo receptorů s nízkou affinitou představovaných heparan sulfátovými proteoglykany přítomnými na povrchu buňky.

Inhíbíce vazby způsobí inhibici biologické aktivity FGF-2.

Interakce mezi FGF-2 a PTX3 závisí na správné konformační struktuře růstového faktoru nejen 15 na jeho přirozené podstatě, protože PTX3 neváže cytochrom C (protein, který má podíl na molekulové hmotnosti (18 kDa) FGF-2 a isoelektrickém bodu (pH 9,6)).

Navíc C-reaktivní protein, homologní k PTX3 neváže FGF-2.

Předmětem předloženého vynálezu je tedy použití pentraxinu s dlouhým řetězcem PTX3 nebo jeho derivátu nebo domény k přípravě léčiva pro prevenci a léčbu onemocnění, která jsou

2o paralyzována inhibici biologické aktivity růstového faktoru FGF-2,

Dalším předmětem předloženého vy nálezu je použití pentraxinu s dlouhým řetězcem ΡΪΧ3 nebo derivátů PTX3 nebo jeho domény k přípravě léčiva pro prevenci a léčbu onemocnění, která sebou přináší pozměněná aktivace růstového faktoru FGF-2.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je použití pentraxinu s dlouhým řetězcem PTX3 nebo derivátů PTX3 nebo jeho domény k přípravě léčiva pro prevenci a léčbu onemocnění, které sebou přináší pozměněná angiogeneze. při které je pozměněná angiogeneze vyvolána pozměněnou aktivací růstového faktoru FGF-2, jejichž příklady jsou: arthritické onemocnění, nádorové meta30 stázy, diabetická retinopatie. psoriáza, chronický zánět, arterioskleróza nebo nádor, kterým je například sarkom, karcinom, karcinoid, kostní nádor nebo neuroendokrinní nádor.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je použití pentraxinu s dlouhým řetězcem PTX3 nebo derivátů PTX3 nebo jeho domény k přípravě léčiva pro prevenci a léčbu onemocnění spojených s nekontrolovanou proliferací fibroblastu nebo buněk měkkého svalstva závislou na FGF-2, jako je tomu u zajizvování s nadměrnou fibroblastovou odezvou a restenóz po angioplastice.

Sloučeniny podle vynálezu je vhodné používat k inhibici aktivity FGF-2 v cílových buňkách nejen tehdy, kdy jsou podávány jako rekombinantní protein, ale také, pokud jsou podávány endogenně v souvislosti s genovým transferem cDNA.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je použití celé cDNA humánního PTX3 nebo jeho derivátů nebo domén k přípravě plasinidiekýeh nebo virových cxprimujících vektorů obsahujících jmenovanou cDNA ke genové terapii onemocnění způsobených pozměněnou aktivací růsto45 vého faktoru FGF-2. kde jde například o onemocnění nádorem, nádorovými metastázami, hojení jizev s nadměrnou fibroblastovou odezvou a restenózu po angioplastice.

„Pentraxinem s dlouhým řetězcem PTX3“ se míní jakýkoliv pentraxin s dlouhým řetězcem nezávisle na tom, zda jde o přirozený (lidský nebo zvířecí) nebo syntetický.

Co se týká derivátů, jsou míněny jakékoliv funkční analogy výše definovaného pentraxinu s dlou5o hým řetězcem PTX3 budící alespoň mutaci, udržující si svoji funkční mohutnost selektivně inhibovat FGF-2.

- 4 CZ 299673 Bó

Přednost se dává lidskému pentraxinu s dlouhým řetězcem PTX3, jehož sekvence je popsána ve WO99/32 516.

? Zde popisovaný pentraxin s dlouhým řetězcem může být také použit v kombinaci s jedním nebo více proti nádorovým i léčivy k léčbě onemocnění, při kterých zvýšená expresi v i ta FGF-2 vyvolává vyšší agresivitu nádorového onemocnění nebo vyšší metastázující účinky.

Je dobře známo, že pro předcházení nežádoucím vedlejším účinkům (léčiv) o stejné terapeutické io účinnosti je mnoho onkologických pacientů léčeno nejen jediným protirakovinovým léčivem, ale kombinací protirakovinnýeh látek společně s antiangiogenními sloučeninami.

Mechanismus působení obvyklejších protirakov i nových léčiv je zcela odlišný od mechanismu působení sloučenin podle předloženého vynálezu, protože obvyklá protirakov i nová léčiva jsou pro nádorové buňky cytotoxická.

Sloučenina podle předloženého vynálezu má odlišný mechanismus působení, vyvolává léčebný účinek (adj uvan tni účinek), který se přidává k účinku vyvolanému proti nádorovým i léčivy, se kterými je spojen.

Dalším předmětem zde popisovaného vynálezu je tedy kombinace pentraxinu s dlouhým řetězcem ΡΊ X3 s jedním nebo více známými protirakov i novým i léčivy.

Dalším předmětem zde popisovaného vynálezu je farmaceutický přípravek obsahující pentraxin

2^ s dlouhým řetězcem ΡΓΧ3 v kombinaci s jedním nebo více známými protirakovinovými léčivy jako jsou alky lační činidla, topo i some rázové inhibitory; antitubulinová činidla, interkalační sloučeniny, antimetabolity, přírodní alkaloidy jako jc alkaloid barv ínku, epipodofíllotoxiny, antibiotika, enzymy, taxany a eytodifcrenciační sloučeniny a jedním nebo více fannakologicky přijatelnými cxcipienty nebo vehikuly.

Dalším předmětem zde popisovaného vynálezu je použití pentraxinu s dlouhým řetězcem PTX3 v kombinaci s jedním nebo více známými proti nádorový mi léčivy k přípravě léčiva k léčbě nádoru, u kterého zvýšená exprese FGF-2 vyvolává vyšší agresivitu nádoru,

5? Dalším předmětem zde popisovaného vynálezu je použití pentraxinu s dlouhým řetězcem PTX3 v kombinaci s jedním nebo více známými protinádorovými léčivy k přípravě léčiva pro prevenci nástupu meta stáž, u kterých zvýšená exprese FGF-2 vyvolává vyšší možnost metastázování.

Dalším předmětem zde popisovaného vynálezu je použití pentraxinu s dlouhým řetězcem PTX3 v kombinaci sjedním nebo více známými proti nádorovou sloučeninou k přípravě léčiva k lččbé nádoru charakterizovaného tím, že pentraxin s dlouhým řetězcem PTX3 je přítomen jako adjuvans protirakovinové sloučeniny.

Následující příklady vynález objasňují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Schopnost PTX3 vázat v roztoku FGF

Tento pokus byl proveden za účelem hodnocení vazby PTX3 na FGF-2. PTX3 byl vyroben podle popisu v Botazzi. et al.; J. Biol. Chem., 272, 32817 - 32823, 1997. Lidský rekombinant FGF-2 byl vyroben podle popisu od Isacchi, A, et al.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA.. 88, 2628 - 2632, 1991. V nutných případech byl FGF-2 značen ^!2Ί metodou popsanou lsacchim, et al. (viz níže).

. 5 .

Postup:

100 μΐ PBS obsahující 1 μg FGF-2 {nebo alternativně 1 μμ PTX3) bylo kapalinovou chromatografií chromatografováno na koloně Superose 12 (Pharmacia), která dělí proteiny podle velikosti ? molekuly: tato kolona je schopná dělit proteiny na základě jejich molekulové hmotnosti. Kolona byla cínována PBS při průtoku 1 ml.min ¹ a odebírány byly I ml frakce, které byly analyzovány metodou skvrn (dot blot) specifickými protilátkami na dva proteiny. Za účelem vyhodnocení vazby PTX3 ne FGF-2 byly před nastříknutím na kolonu smíšeny dva proteiny 5 g a 1 gg) ve 100 μΐ PBS a inkubováno při 4 °C po dobu 10 minut. Odebírané frakce byly analyzovány metodou dot in blot specifickými protilátkami proti FGF-2. Výsledky uváděné na obrázku 1 ukazují, že FGF-2 (18 000 D) je z kolony eluován při retenčním objemu přibližně 22 ml. Za stejných podmínek byl eluován PTX3 (450 000 D) s mrtvým objemem kolony (7 ml). Když byl do kolony po dobu 10 minut při 4 °C nastřikován FGF-2 předem inkubovaný s PTX3, byla pozorována změna v chování chromatografieké kolony: za těchto pokusných podmínek byl FGF-2 z kolony eluován i? při re tc ně n i m obj em u od po v í daj í c í m samot ném u PTX3.

Příklad 2

Schopnost biotinylovaného PTX3 vázat zmobilizovaný FGF-2

2o 100 μΙ NaHCCL o pH 9,6 obsahujícího 500 ng FGF-2 nebo komplementární komponentu Clq bylo inkubováno po dobu 18 hodin při 4 °C na 96 jamkové plastové destičce. Na konci inkubace byly jamky třikrál promyty PBS a následně inkubovány po dobu 2 hodin za laboratorní teploty s 200 μΐ PBS obsahujícího 1 mg.ml ¹ bovinního sérumalbuminu (BSA). Na konci inkubace byly jamky opět třikrát promyty PBS a inkubovány s 30 ng.ml ' ^L4-FGF-2 v přítomnosti vzrůstajíc í25 ho množství biotinylovaného PTX3 vc 100 μΐ PBS {2 hodiny za laboratorní teploty). Alternativně byly do jamek adsorbovány vzestupné dávky FGF-2 nebo Clq a inkubováno sc 100 ng.ml ¹biotinylovaného PTX3 ve 100 μΐ PBS. Po této inkubaci byly jamky třikrát promyty PBS a inkubováno po dobu 1 hodiny za laboratorní teploty sc 100 μΙ konjugátu streptavidinu HPR (1:2000). Reakce se podnítila přídavkem substrátového systému ABTS chromogenní microwell so peroxidázy (Kirkegaard & Perry Laboratories). Destičky byly odečítány na automatické čtečce LL1SA při 405 nm. Výsledky uvedené na obrázku 2 ukazují, že FGF-2 imobilizovaný na plastových jamkách jsou schopné vázat biotinylovaný PTX3 podobným způsobem jako fyziologický ligand PTX3 Clq (Bottazzi, B., et al.: J. Biol. Chem., 272. 32817 - 32823. 1997).

Příklad 3

Charakterizace interakcí PTX3-FGF-2 jamkové destičky byly při 4 °C pokryty 100 μΙ roztoku NaHCOi o pH 9,6 obsahujícího ΡΓΧ3 nebo C-reaktivní protein (200 nM) nebo alternativně 2 μg.ml ¹ následujících proteinů používala ných ke kontrole negativního výsledku; bovinního sérumalbuminu. ílbroneclinu. želatiny nebo lamininu. Po inkubaci byly jamky třikrát promyty PBS a 2 hodiny za laboratorní teploty blokovány 200 μΙ 1 mg.ml ¹ BSA v PBS. Na konci inkubace byly jamky třikrát promyty PBS a následně inkubovány sc 30 ng ¹ ’3-FGF-2 po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě. Následně byly jamky třikrát promyty PBS a vázaný ¹²Ί FGF-2 regenerován dvojnásobným promytím každé jamky

200 μϊ 2 % SDS ve vodě. Úroveň ^Ι2Ί FGF-2 byla měřena gama čítačem. Výsledky uvedené na obrázku 3 ukazují, že FGF-2 váže imobilizovaný PTX3, a že tato vazba je specifická, protože FGF-2 slabě reaguje s CRP a nereaguje s dalšími imobilizovanýnii proteiny.

Příklad 4

5d ' Ί-FGF-2 vazba na imobilizovaný PTX3 v přítomnosti nadbytku studeného FGF-2

Ve druhém souboru pokusu byla zkoušena v přítomnosti nadbytku jak nativního, tak teplem denaturovaného studeného FGF-2 (100 nM) vazba 'Ί-FGF-2 na ímobilizovaný PTX3. v přítomnosti podobných koncentrací cytocliromu C nebo v přítomnosti nadbytku rozpustného PTX3 (300 nM). Pokus byl proveden stejným způsobem jako to je popsáno výše; Výsledky uvedené na obrázku 4 prokazují, že studený 1-FGF-3 a rozpustný PTX3 inhibují interakci mezi ^Ι2Ί FGF-2 a imobilizovaným ΡΓΧ3. Pozorování, že teplem inaktivovaný FGF-2 a cytochrom C (o stejné molekulární hmotnosti a isoclcktrickém bodu jako FGF-2) nejsou schopné vázat PTX3 naznačuje, že na mohutnosti vazby ΡΊ Χ3 se podílí spíše správná konformace růstového faktoru, než jeho základní povaha,

Příklad 5

Dissociaění konstanta (K_d) interakce FGF-2/PTX3

V tomto pokusu byla stanovena dissociaění konstanta (K_d) interakce FGF-2/PTX3. Za tímto účelem byly inkubovány zvyšující se dávky ^L>l-FGF-2 s imobilizovaným PTX3 a výsledky uskutečněné vazby byly analyzovány vynesením podle Scatcbarda. Výsledky uvedené na obrázku 5 prokazují, že FGF-2 váže PTX3 dosyta a se vzrůstající affinilou (K_d - 8 až 16 nM). Tato affmitajc podobná affinitě dříve vypočítané pro interakci PTX3 s fyziologickým ligandem Clq.

Příklad 6

Účinek PTX3 na vazbu FGF-2 s endotheliálními buňkami

2? Transformované fetální bovinní aortické buňky GM7373 byly v ředění 80 000 buněk na cm' v Eaglově minimálním esenciálním médiu (Eaglovo MEM) obsahujícím 10% FCS naočkovány na 24 jamkové misky. Po 24 hodinách při 37 °C by ly buňky dvakrát promyty Eaglovým MEM bez FCS a následně inkubovány po dobu 2 hodin při 4 °C s ^l2T-FGF-2 (10 ng.ml ’) v Eaglově MEM obsahujícím 0,15 % želatiny a 20 mM HEPES o pH 7,5 v nepřítomnosti nebo přítomnosti

5d vzrůstajících koncentrací PTX3. Na konci inkubace byla hodnocena míra vazby ^l25I-FGF-2 na nízko (HSPG) a vysokoaffinilní (FGFR) receptory podle Moseatelliho: .1. Cell. Physiol., 131, 123 - 130, 1987. Buňky byly dvakrát krátce promyty 2M NaCl ve 20 mM ústojnétn roztoku HEPES (pil 7,5) k rozrušení vazby 'Ί FGF 2 k nízkoafllnitním vazebným polohám a dvakrát 2M NaCl ve 20 mM oclanu sodném (pH 4,0) k rozrušení vazby ^,25l-FGF-2 k vysokoaffinitnírn polohám.

Nespecifická vazba byla měřena v přítomnosti 100 násobného molárního nadbytku neznačeného FGF 2 a odečtena od ostatních hodnot. Výsledky uvedené na obrázku 6 ukazují, že PTX3 může inhibovat vazbu FGF-2 na vysoko i nízkoaffmitní receptory na endotheliální buňky podle velikosti použité dávky.

Příklad 7

Účinek PTX3 na rnilogenní aktivitu endotheliálnícb buněk vyvolaný FGF-2

Buňky GM 7373 byly v ředění 75 000 buněk na cm² v Eaglově MEM obsahujícím 10% FCS naočkovány na 48 jamkové misky. Po 24 hodinách při 37 °C byly ulpělé buňky dvakrát promyty Eaglovým MEM bez FCS a následně inkubovány po dobu 24 hodin při 37 °C v Eaglově MEM obsahuj ící m 0,4 % FCS v nepřítomnosti nebo přítomnosti FGF-2 (lOng.ml jase vzrůstající koncentrací PTX3. Na konci inkubace byly buňky trypsínizovány a odečteny. V různých souborech pokusů byly buňky GM 7373 zpracovány podle výše uvedeného popisu v přítomnosti růz5(i ných mitogenních stimulů: 10 % FCS, 5 pg.ml ¹ diacyIglycerolu (DAG), 10 ng.ml ¹ phorbolesteru (ΤΡΛ), 30 ng.ml ¹ epidermálního růstového faktoru (EGF) nebo 30 ng.ml ¹ vaskulámího endotheliálního růstového faktoru (VEGF). Výsledky uvedené na obrázku 7 ukazují, že PTX3 inhibuje mitogenní aktivitu vyvolanou na endotheliálnícb buňkách FGF-2 v závislosti na použitých

CZ. 299673 B6 dávkách s ID50 rovnajícímu sc 30 nM. Tato hodnota je blízká vypočítanému K_d pro interakci FGF-2 PTX3. Tyto výsledky naznačují, že inhibice biologické aktivity FGF-2 pomocí PTX3 probíhá v důsledku sekvestraee v polohách mimo buňky. Inhibiění aktivita PTX3 ne EGF-2 je specifická, protože není detekovatelná. pokud se k vyvolání buněčné proliferace použijí další mitogeny.

Příklad 8

Účinek PTX3 11a proliferaci transformovaných fctálních bovinnich aortiekýeh endotheliálních buněk

V tomto pokusu jsme zkoušeli účinek PTX3 na proliferaci myších aortiekýeh endotheliáln ích buněčných linií MAE3F2T stabilně transfektovaných exprimujícím vektorovým kódováním na EGE-2 (Gualandris, et al.: Cell Growth Diff., 7. 147 - 160, 1996). Tyto buňky mohou prol i Pérovat jako odezva na autokrinní smyčku stimulace vyvolanou endogenním FGF-2 (Gualandris, et al.: Cell Growth Diff.. 7, 147-16(), 1996). Buňky MAE3F2T byly v ředění 10 000 buněk na enr v médiu Dulbecco (DMEM) s přidaným 10% FCS naočkovány na 48 jamkové misky. Po 24 hodinách při 37 °C byly utpčlé buňky dvakrát promyty DMEM bez FCS a ínkubovány po dobu 72 hodin při 37 °C v DMEM obsahujícím 0.4 % FCS v přítomnosti nebo nepřítomnosti PTX3 (70 nM), anti EGE-2 specifických protilátek nebo suraminu (50 gg.ml ^!). Suramin je známý pro svoji schopnost sekvestrovat mimobunččný FGF-2 a inhibovat svojí buněčnou aktivitu (Rusnati, el al.: Mol. Biol. Cell,, 7, 369- 381, 1996). Na konci inkubaění doby byly buňky trypsinizovány a počítány v Burkerově komůrce. Výsledky uvedené na obrázku 8 ukazují, že PTX3 je schopen blokovat autokrinní smyčku stimulace vyvolané FGF-2 v buňkách MAE3E2T inhibicí jejich proliferace závisle na EGE-2 podobným způsobem, jaký je vyvolán protilátkami proti FGF-2 a ?5 suraminu.

Příklad 9

Účinek PTX3 na neovaskularizaci vyvolanou in vivo FGF 2

Antiangiogenní potenciál PTX3 byl hodnocen in vivo zkouškou na chorioalantoidní membráně kuřecího embrya (CAM). Ve skořápce oplodněného vajíčka třídenních kuřecích embryí bylo otevřeno okénko. V 8. dni byly na CAM implantovány želatinové plátky s naadsorbovanými 10 gl samotného PBS nebo obsahujícího EGE-2 (500 ng na plátek) v nepřítomnosti nebo přítomnosti PTX3 (5 μΐ na plátek) (5 až 6 embry í ve skupině). Po 4 dnech by! plátek pozorován in ovo pod Zeissovým SR stereomikroskopem a antiangiogenní odezva hodnocena dvěma pozorovateli, kteří neznalí šifrování vzorků, stupnicí 0 až 4+. kde 0 nepředstavuje žádnou angiógenní odezvu a 4 + p řed sta v uj e n ej s i I n ěj š í ú ě i n e k,

Výsledky uvedené na obrázku 9 ukazují, že PTX3 je schopen blokovat neovaskularizaci vyvolanou FGF-2 in vivo.

Příklad 10

Genová terapie pomocí PTX3

Myší endotheliální buňky přeexprimující FGF-2 nazvané FGF2MAE3F2I (Gualandris, et al.: Cell Growth Diff.. 7. 147- 160, 1996) byly transfektovány celou délkou cDNK subklonované v komerčním exprimovaném vektorem pLXSFl (Clontech) lidským PTX3.

Ve studii in vitro na získaných transfektovaných buněčných liniích byly použity ke studiu účinku přeexprimace ΡΊ Χ3 na proliferaci buněk EGE2MAE3E2T závislých na EGE-2 a jejich invazivního chování 11a trojrozměrných fibrinových gelech.

CZ 299673 Bó

Několik klonů FGF2MAE3E2T exprimuj ících různé úrovně PTX3 a parentálních buněk FGF2MAE2F2T (které nevytvářely PTX3) bylo naočkováno na 48 jamkové misky v ředění 10 000 buněk na cm² v médiu Dubelco (DMEM) s přidanými 10% FCS. Po 24 hodinách při

37 °C byly ulpélé buňky dvakrát promytv DMEM bez FCS a následně inkubovány po různou dobu při 37 °C s DMEM obsahujícím 0,4 % FCS. Na konci inkubační doby byly buňky trypsinizovány a počítány v Rurkerově komůrce. Výsledky uvedené na obrázku 10 ukazují, že přeexprimování PTX3 inhibuje proliferaeí buněk FGF2MAE3F2T, a že nadměrná inhibice souhlasí s množstvím PTX3 vytvořeným různými zkoušenými klony.

κι

K vyhodnocení invazivního chování klonů FGF2MAE3F2T přeexprimuj ících PTX3 se na trojrozměrných fibrinových gelech na agarových plotnách připravily buněčné agregáty přesně podle popisu v literatuře (Gualandris, et al.: Cell Growth Diff., 7, 147 - 160, 1996. I vto agregáty byly naočkovány na 48 jamkové destičky pokryté fibrinem. Bezprostředně po naočkování bylo do i? každé jamky přidáno 250 1 média prostého vápníku obsahujícího fibrinogen (2,5 mg.ml ’) a thrombin (250 nij.ml ') a gel ponechán 5 minut při 37 °C. Potom bylo na horní část gelu přidáno

500 I kultivačního média. U všech pokusů byl ke gelu a kultivačnímu mediu přidán ťíbrinolytický inhibitor trasylol (200 mkj.ml ') k zabránění rozpouštění substrátu. Tvorba paprskovitě rozvětvených proliferujících buněk byla hodnocena po 2 dnech počítačovou zobrazování analýzou.

Výsledky uvedené na obrázku 11 ukazují, že invazivní kapacita PTX3 přeexpriinujícího EGE2MAE3F2T klony je významné nižší než u parenterálních buněk EGF2MAE3E2T.

Získané výsledky potvrzují, že PTX3 v endotheliálníeh buňkách inhibuje aktivitu EGE-2, pokud je vytvořen endogenně po transferu genu jeho cDNA.

Sloučenina podle vynálezu tak může být použita v protokolech genové terapie podle známých postupů (In Vivo. 12, (1). 59 - 67, leden-únor 1998; lil Vivo, 12, (1 ).35 - 41, leden-únor 1998; ln Vivo, 8, (5). 771 - 780. listopad prosinec 1994) k léčbě onemocnění způsobených .κι pozměněnou aktivitou růstového faktoru FGF-2.

Claims

55 PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití pentraxinu s dlouhým řetězcem PTX3 nebo jeho derivátu či domény k přípravě léčiva pro prevenci a léčbu onemocnění způsobených nekontrolovanou proliferaeí fibroblastů nebo

40 buněk měkkého svalstva nebo pozměněné angiogeneze, přičemž onemocnění náležejí do skupiny sestávající ze: zajizvení spojeného s nadměrnou odezvou fibroblastů. restenózy po angioplastice, arthritického onemocnění, diabetické retinopatic. psoriázy a atherosklerózy.
2. Použití podle nároku I. vyznačující se tím, žc pentraxinem s dlouhým řetězcem

45 PI X3 je PTX3 přirozeného původu.
3. Použití podle nároku 2, vyznačující se tím, že pentraxinem s dlouhým řetězcem P1X3 je humánní PTX3.

50
4. Použití podle nároku l. vyznačující se tím, že pentraxinem s dlouhým řetězcem

PfX3 je PTX3 syntetického původu.
5. Použití cDNA. kódované pro pentraxin s dlouhým řetězcem PTX3 nebo jeho deriváty či domény uvedenými v nároku 1. k přípravě exprimujících vektorů obsahujících jmenovanou

55 cDNA, ke genové terapii onemocnění způsobených pozměněnou aktivací růstového faktoru

FGP-2. ve kterých toto onemocnění náleží do skupiny sestávající z nekontrolované proliferace fibroblastů nebo buněk měkkého svalstva, nebo pozměněné angiogeneze.
6. Použití podle nároku 5, kde jmenovaná eDNA obsahující genové kódování pro PTX3 nebo 5 jeho derivát je nesena plasmidickým nebo virovým vektorem.
7. Použití podle nároku 5, kde onemocnění způsobené nekontrolovanou proliferaci fibroblastů nebo buněk měkkého svalstva nebo pozměněnou angiogenezí spadá do skupiny sestávající ze zajizvení spojeného s nadměrnou odezvou fibroblastů. restenózy po angíoplasiice, arthritického m onemocnění, diabetické retinopatie, psoriázy a atherosklerózy.