JP3190684B2 - 過形成および関連疾患の治療におけるブレフェルジンａおよびその誘導体の使用 - Google Patents
過形成および関連疾患の治療におけるブレフェルジンａおよびその誘導体の使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 血管壁中の平滑筋細胞（SMC）の増殖は、アテローム
硬化症によるか、血管再建後かまたは他の血管損傷に関
連した血管病変の形成にかかわる重要な現象である。例
えば、アテローム硬化症の治療はしばしば、アテローム
硬化斑をカテーテル挿入によって圧迫もしくは除去し
（血管形成術）、切開によって動脈壁から取り除き（動
脈内膜切除術）、または自然もしくは人工移植片を使っ
てバイパス形成するという外科的手法である、血管形成
術、動脈内膜切除術、整腹アテローム切除術またはバイ
パス移植術による、閉塞血管の清浄化を含む。これらの
手法は、血管内皮を除去し、その下にある内膜層を破壊
し、そして内側のSMCを致死せしめる。この損傷の後
に、内側のSMCの増殖と内膜への移動が起こり、それに
細胞外マトリックスの過剰な沈着が付随する。この病変
発生は、特徴的には外傷後最初の数週間以内で且つ６カ
月まで起こり、そして上に内皮層が再形成されると止ま
る。ヒトの場合、それらの病変は細胞約20％と細胞外基
質約80％から成る。
硬化症によるか、血管再建後かまたは他の血管損傷に関
連した血管病変の形成にかかわる重要な現象である。例
えば、アテローム硬化症の治療はしばしば、アテローム
硬化斑をカテーテル挿入によって圧迫もしくは除去し
（血管形成術）、切開によって動脈壁から取り除き（動
脈内膜切除術）、または自然もしくは人工移植片を使っ
てバイパス形成するという外科的手法である、血管形成
術、動脈内膜切除術、整腹アテローム切除術またはバイ
パス移植術による、閉塞血管の清浄化を含む。これらの
手法は、血管内皮を除去し、その下にある内膜層を破壊
し、そして内側のSMCを致死せしめる。この損傷の後
に、内側のSMCの増殖と内膜への移動が起こり、それに
細胞外マトリックスの過剰な沈着が付随する。この病変
発生は、特徴的には外傷後最初の数週間以内で且つ６カ
月まで起こり、そして上に内皮層が再形成されると止ま
る。ヒトの場合、それらの病変は細胞約20％と細胞外基
質約80％から成る。
血管形成術、動脈内膜切除術またはバイパス移植術に
より処置した患者の約30％またはそれ以上において、血
栓症および／または内膜中のSMC増殖が血管の再閉塞を
引き起こし、その結果として再形成術が失敗に終わる。
この手術後の血管の閉塞は再狭窄として知られている。
より処置した患者の約30％またはそれ以上において、血
栓症および／または内膜中のSMC増殖が血管の再閉塞を
引き起こし、その結果として再形成術が失敗に終わる。
この手術後の血管の閉塞は再狭窄として知られている。
同様なSMC増殖過程が臓器移植片においても観察され
ており、これは移植片アテローム硬化症および臓器機能
不全の一因となり得る。この過程の内膜肥厚は、移植し
た臓器のみが関係する。
ており、これは移植片アテローム硬化症および臓器機能
不全の一因となり得る。この過程の内膜肥厚は、移植し
た臓器のみが関係する。
血小板分裂促進因子（マイトジェン）、例えば血小板
由来増殖因子（PDGF）はアテローム硬化斑の発生に何ら
かの役割を果たすと推測されている（Ross他,Cell 46:
155−169,1986;Harker,Am.J.Cardiol.60:20B−28B,198
7）。硬化斑形成の１つの提唱された機序は、内皮露出
部位における、SMC増殖を刺激する増殖因子の血小板に
よる放出である（RossおよびGlomset,N.Eng.J.Med.295:
369−377,420−425,1976;Ross,Arteriosclerosis １:29
3−311,1981）。Moore他（Thrombos.Haemostas.（Stutt
g.）35:70,1976）とFriedman他（J.Clin.Invest.60:119
1−1201,1977）は、内在カテーテル損傷モデルを使っ
て、抗血小板血清の投与により誘導された長期血小板減
少による、ウサギ動脈における実験的に導入した内膜損
傷発生の抑制を報告した。SMCがオートクリン機構を通
して損傷形成を刺激するPDGFを自己生産し得るとも仮定
されている（Ross他，前掲;Walker他,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 83:7311−7315,1986）。Fingerle他（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86:8412−8416,1989）は血小板減少症
ラットにおいて内膜損傷形成を研究し、そして血小板が
バルーン損傷後の内膜SMC増殖に役割を果たすのではな
くて内膜中へのSMCの移動を調節することができると結
論づけた。血小板は現在、PDGF、表皮増殖因子（EG
F）、形質転換増殖因子αおよびβ（TGFαおよびTGF
β）、インスリン様増殖因子Ｉ（IGF−Ｉ）および血小
板由来内皮細胞増殖因子をはじめとする多数の増殖因
子、並びに幾つかの化学誘引分子を放出することが知ら
れている。ある実験はPDGFを損傷発生に伴う過程に関係
づけたけれども、霊長類の内膜過形成の病因は不明のま
まである。
由来増殖因子（PDGF）はアテローム硬化斑の発生に何ら
かの役割を果たすと推測されている（Ross他,Cell 46:
155−169,1986;Harker,Am.J.Cardiol.60:20B−28B,198
7）。硬化斑形成の１つの提唱された機序は、内皮露出
部位における、SMC増殖を刺激する増殖因子の血小板に
よる放出である（RossおよびGlomset,N.Eng.J.Med.295:
369−377,420−425,1976;Ross,Arteriosclerosis １:29
3−311,1981）。Moore他（Thrombos.Haemostas.（Stutt
g.）35:70,1976）とFriedman他（J.Clin.Invest.60:119
1−1201,1977）は、内在カテーテル損傷モデルを使っ
て、抗血小板血清の投与により誘導された長期血小板減
少による、ウサギ動脈における実験的に導入した内膜損
傷発生の抑制を報告した。SMCがオートクリン機構を通
して損傷形成を刺激するPDGFを自己生産し得るとも仮定
されている（Ross他，前掲;Walker他,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 83:7311−7315,1986）。Fingerle他（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86:8412−8416,1989）は血小板減少症
ラットにおいて内膜損傷形成を研究し、そして血小板が
バルーン損傷後の内膜SMC増殖に役割を果たすのではな
くて内膜中へのSMCの移動を調節することができると結
論づけた。血小板は現在、PDGF、表皮増殖因子（EG
F）、形質転換増殖因子αおよびβ（TGFαおよびTGF
β）、インスリン様増殖因子Ｉ（IGF−Ｉ）および血小
板由来内皮細胞増殖因子をはじめとする多数の増殖因
子、並びに幾つかの化学誘引分子を放出することが知ら
れている。ある実験はPDGFを損傷発生に伴う過程に関係
づけたけれども、霊長類の内膜過形成の病因は不明のま
まである。
血管形成術または動脈内膜切除術によるアテローム硬
化斑の除去は限定された効果を有し、処置した血管の再
狭窄またはバイパス移植片の狭窄の効果的な治療法はま
だ開発されていない。従って、血管壁における高SMC損
傷（バルーンカテーテル挿入、動脈内膜切除、血管内ス
テント据付、整腹アテローム切除術、並びに血管移植、
臓器移植およびカテーテル挿入による損傷のような血管
損傷後の血管の狭窄を含む）の発生を削減または防止す
る方法が当業界で要望されている。本発明はそういった
方法を提供し、且つ別の関連した要望を満たす。
化斑の除去は限定された効果を有し、処置した血管の再
狭窄またはバイパス移植片の狭窄の効果的な治療法はま
だ開発されていない。従って、血管壁における高SMC損
傷（バルーンカテーテル挿入、動脈内膜切除、血管内ス
テント据付、整腹アテローム切除術、並びに血管移植、
臓器移植およびカテーテル挿入による損傷のような血管
損傷後の血管の狭窄を含む）の発生を削減または防止す
る方法が当業界で要望されている。本発明はそういった
方法を提供し、且つ別の関連した要望を満たす。
発明の要約 本発明は、非ペプチド性PDGFアンタゴニストとしてブ
レフェルジンＡ（1,6,7,8,9,11a,12,13,14,14a−デカヒ
ドロ−1,13−ジヒドロキシ−６−メチル−4H−シクロペ
ンタ〔ｆ〕オキサシクロトリデシン−４−オン）および
その誘導体を使用する方法を提供する。
レフェルジンＡ（1,6,7,8,9,11a,12,13,14,14a−デカヒ
ドロ−1,13−ジヒドロキシ−６−メチル−4H−シクロペ
ンタ〔ｆ〕オキサシクロトリデシン−４−オン）および
その誘導体を使用する方法を提供する。
本発明は、式I,IIまたはIIIの化合物の抗過形成性有
効量を投与することを含んで成る、哺乳類の血管系にお
ける内膜過形成を抑制する方法を提供する： 構造I,IIおよびIIIにおいて、点線は単結合または二重
結合を表し;R1およびR2は同一であり、そして単一基＝
Ｏであるか、あるいはＨとOH、ＨとOR、またはＨとOCOR
であり;R3は単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとOH、Ｈ
とOR、またはＨとOCORであり;R4はCOOH、COOHの医薬上
許容される塩、またはCH2ORであり;R5とR6は両方とも酸
素であるか、またはR5とR6の一方がＯでありそして他方
が二重結合を含み；そしてＲはC1-5アルキル、フェニル
またはベンジルである。
効量を投与することを含んで成る、哺乳類の血管系にお
ける内膜過形成を抑制する方法を提供する： 構造I,IIおよびIIIにおいて、点線は単結合または二重
結合を表し;R1およびR2は同一であり、そして単一基＝
Ｏであるか、あるいはＨとOH、ＨとOR、またはＨとOCOR
であり;R3は単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとOH、Ｈ
とOR、またはＨとOCORであり;R4はCOOH、COOHの医薬上
許容される塩、またはCH2ORであり;R5とR6は両方とも酸
素であるか、またはR5とR6の一方がＯでありそして他方
が二重結合を含み；そしてＲはC1-5アルキル、フェニル
またはベンジルである。
本発明の範囲内での使用に好ましい化合物は、点線が
単結合または二重結合を表し、R1およびR2が単一基＝Ｏ
であるか、またはＨとOHであるもの；点線が単結合また
は二重結合を表し、そしてR1およびR2がＨとOR、または
ＨとOCORであり、ＲがC1-5アルキル、フェニルまたはベ
ンジルであるもの;R1およびR2が単一基＝Ｏであるか、
またはＨとOHであり、R5がＯでありそしてR6が単結合ま
たは二重結合であるもの;R1およびR2が単一基＝Ｏであ
るか、またはＨとOHであり、R5が単結合または二重結合
であり、そしてR6がＯであるもの；点線が単結合または
二重結合を表し、R1,R2およびR3が単一基＝Ｏである
か、またはＨとOHであり、そしてR4がCOOHまたはCOOHの
医薬上許容される塩であるもの；点線が単結合または二
重結合を表し、R1,R2およびR3がＨとOR、またはＨとOCO
Rであり、R4がCH2ORであり、そしてＲがC1-5アルキル、
フェニルまたはベンジルであるものである。
単結合または二重結合を表し、R1およびR2が単一基＝Ｏ
であるか、またはＨとOHであるもの；点線が単結合また
は二重結合を表し、そしてR1およびR2がＨとOR、または
ＨとOCORであり、ＲがC1-5アルキル、フェニルまたはベ
ンジルであるもの;R1およびR2が単一基＝Ｏであるか、
またはＨとOHであり、R5がＯでありそしてR6が単結合ま
たは二重結合であるもの;R1およびR2が単一基＝Ｏであ
るか、またはＨとOHであり、R5が単結合または二重結合
であり、そしてR6がＯであるもの；点線が単結合または
二重結合を表し、R1,R2およびR3が単一基＝Ｏである
か、またはＨとOHであり、そしてR4がCOOHまたはCOOHの
医薬上許容される塩であるもの；点線が単結合または二
重結合を表し、R1,R2およびR3がＨとOR、またはＨとOCO
Rであり、R4がCH2ORであり、そしてＲがC1-5アルキル、
フェニルまたはベンジルであるものである。
好ましい態様では、本発明は、ブレフェルジンＡの抗
過形成性有効量を投与することにより哺乳類の内膜過形
成を抑制する方法を提供する。
過形成性有効量を投与することにより哺乳類の内膜過形
成を抑制する方法を提供する。
本発明は更に、哺乳類の内膜過形成を抑制する方法で
あって、前記内膜過形成が急性血管損傷、血管移植片ま
たは移植臓器の据付に起因する方法を提供する。
あって、前記内膜過形成が急性血管損傷、血管移植片ま
たは移植臓器の据付に起因する方法を提供する。
本発明はまた、哺乳類の血管損傷部位における内膜過
形成を抑制する方法を提供する。本発明の特定の態様で
は、前記血管損傷が、血管形成術、動脈内膜切除術、整
腹アテローム切除術、血管内レーザー剥離または血管移
植片の吻合のような血管再建によるものである。
形成を抑制する方法を提供する。本発明の特定の態様で
は、前記血管損傷が、血管形成術、動脈内膜切除術、整
腹アテローム切除術、血管内レーザー剥離または血管移
植片の吻合のような血管再建によるものである。
本発明は、哺乳類の急性血管損傷の前、同時または後
の抗過形成性有効期間内での式I,IIまたはIIIの化合物
の投与方法も提供する。関連した態様では、哺乳類の急
性血管損傷と同時またはその前の抗過形成性有効期間内
で前記化合物が投与される。
の抗過形成性有効期間内での式I,IIまたはIIIの化合物
の投与方法も提供する。関連した態様では、哺乳類の急
性血管損傷と同時またはその前の抗過形成性有効期間内
で前記化合物が投与される。
本発明は更に、ヘパリンと式I,IIまたはIIIの化合物
の協同投与（coordinate administration）により哺乳
類の内膜過形成を抑制する方法を提供する。
の協同投与（coordinate administration）により哺乳
類の内膜過形成を抑制する方法を提供する。
本発明はまた、例えば哺乳類においてPDGF活性を抑制
するために、PDGFアンタゴニストとして式I,IIまたはII
Iの化合物を使用する方法も提供する。
するために、PDGFアンタゴニストとして式I,IIまたはII
Iの化合物を使用する方法も提供する。
発明の詳細な説明 上述したように、血管の再狭窄は血管形成術、動脈内
膜切除術またはバイパス移植術を受けた患者に共通の問
題である。再狭窄は、細胞外マトリックスの生成（付
着）はもちろん、外科手術によっても、損傷を受けた部
位への血管平滑筋細胞の増殖（有糸分裂）と移動の両方
を含む過程により進行すると思われる、内膜過形成の一
例である。一般的には、Harker,Am.J.Cardiol.60:20B−
28B,1987;およびDeFeudis,Drug News and Perspectives
５:49−51,1992を参照のこと。この増殖過程は、血管
移植片（自系または同種異系を含む天然移植片、および
合成移植片の両方）および移植された臓器の閉塞の形で
も現れる。この増殖過程は平滑筋細胞に富む病変の発生
を引き起こすので、本明細書中では内膜過形成と呼ぶこ
とにする。
膜切除術またはバイパス移植術を受けた患者に共通の問
題である。再狭窄は、細胞外マトリックスの生成（付
着）はもちろん、外科手術によっても、損傷を受けた部
位への血管平滑筋細胞の増殖（有糸分裂）と移動の両方
を含む過程により進行すると思われる、内膜過形成の一
例である。一般的には、Harker,Am.J.Cardiol.60:20B−
28B,1987;およびDeFeudis,Drug News and Perspectives
５:49−51,1992を参照のこと。この増殖過程は、血管
移植片（自系または同種異系を含む天然移植片、および
合成移植片の両方）および移植された臓器の閉塞の形で
も現れる。この増殖過程は平滑筋細胞に富む病変の発生
を引き起こすので、本明細書中では内膜過形成と呼ぶこ
とにする。
本発明は、式I,IIまたはIIIの化合物の抗過形成性有
効量の使用を通して高SMC病変〔内膜の肥厚（過形成）
による血管の一部または完全遮断〕の発生を抑制する方
法を提供する。それらの化合物は非ペプチド性PDGFアン
タゴニストであることが判明した。この化合物は単独に
または抗過形成性有効量のヘパリンと組み合わせて使用
することができる。本発明はまた、非ペプチド性PDGFア
ンタゴニストとしてブレフェルジンＡおよびその誘導体
を使用する方法も提供する。非ペプチド性PDGFアンタゴ
ニストは、強皮症、肺過形成、腎線維症、慢性関節リウ
マチの治療法において、または骨肉腫、線維肉腫、神経
膠腫もしくは他の増殖性細胞疾患を含むがそれに限定さ
れない固形癌の治療において治療薬として有用である。
効量の使用を通して高SMC病変〔内膜の肥厚（過形成）
による血管の一部または完全遮断〕の発生を抑制する方
法を提供する。それらの化合物は非ペプチド性PDGFアン
タゴニストであることが判明した。この化合物は単独に
または抗過形成性有効量のヘパリンと組み合わせて使用
することができる。本発明はまた、非ペプチド性PDGFア
ンタゴニストとしてブレフェルジンＡおよびその誘導体
を使用する方法も提供する。非ペプチド性PDGFアンタゴ
ニストは、強皮症、肺過形成、腎線維症、慢性関節リウ
マチの治療法において、または骨肉腫、線維肉腫、神経
膠腫もしくは他の増殖性細胞疾患を含むがそれに限定さ
れない固形癌の治療において治療薬として有用である。
本発明の化合物を製造するのに使われる誘導体化方法
は当業界で周知である。R.C.Larock,Comprehensive Org
anic Transformations,VCH Publishers,Inc.,New York,
1989;H.O.House,Modern Synthetic Reactions,W.A.Benj
amin,Inc.,Menlo Park,CA.1972;L.F.FieserおよびM.Fie
ser,Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and
Sons,Inc.,New York,Vol.1,1967;J.March,Advanced Org
anic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,
McGraw−Hill Book Company,New Ycrk,1968;I.T.Harris
onおよびS.Harrison,Compendium of Organic Synthetic
Methods,Wiley−Interscience,New York,Vol.1,1971;
P.N.Rylander,Hydrogenation Methods,Academic Press,
New York,1985;D.J.PastoおよびC.R.Johnson,Organic S
tructure Determination,Prentice−Hall,Inc.Englewoo
d Cliffs,N.J.,1969。
は当業界で周知である。R.C.Larock,Comprehensive Org
anic Transformations,VCH Publishers,Inc.,New York,
1989;H.O.House,Modern Synthetic Reactions,W.A.Benj
amin,Inc.,Menlo Park,CA.1972;L.F.FieserおよびM.Fie
ser,Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and
Sons,Inc.,New York,Vol.1,1967;J.March,Advanced Org
anic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,
McGraw−Hill Book Company,New Ycrk,1968;I.T.Harris
onおよびS.Harrison,Compendium of Organic Synthetic
Methods,Wiley−Interscience,New York,Vol.1,1971;
P.N.Rylander,Hydrogenation Methods,Academic Press,
New York,1985;D.J.PastoおよびC.R.Johnson,Organic S
tructure Determination,Prentice−Hall,Inc.Englewoo
d Cliffs,N.J.,1969。
式IVのブレフェルジンＡ誘導体は、α，β−不飽和ケ
トンの一部であるオレフィンを、低温のもしくはピリジ
ン中の水素化ホウ素ナトリウムで、アンモニア−エーテ
ル中のリチウムで、または酢酸中の亜鉛で選択的に還元
することにより調製することができる。水素と触媒（好
ましくは炭素上のパラジウム）を使った水素化は、２つ
の二重結合を還元する。カルボニルへのヒドロキシル官
能基の酸化は、クロム試薬、例えば三酸化クロムと硫酸
（ジョーンズ試薬）もしくはクロロクロム酸ピリジニウ
ムを使って、またはジメチルスルホキシドと無水酢酸を
使って達成することができる。還元と酸化は選択的に行
うことができる。
トンの一部であるオレフィンを、低温のもしくはピリジ
ン中の水素化ホウ素ナトリウムで、アンモニア−エーテ
ル中のリチウムで、または酢酸中の亜鉛で選択的に還元
することにより調製することができる。水素と触媒（好
ましくは炭素上のパラジウム）を使った水素化は、２つ
の二重結合を還元する。カルボニルへのヒドロキシル官
能基の酸化は、クロム試薬、例えば三酸化クロムと硫酸
（ジョーンズ試薬）もしくはクロロクロム酸ピリジニウ
ムを使って、またはジメチルスルホキシドと無水酢酸を
使って達成することができる。還元と酸化は選択的に行
うことができる。
式ＶのブレフェルジンＡ誘導体は、適当な酸クロリド
または酸無水物と塩基（好ましくはピリジン）を使っ
て、ヒドロキシルをアシル化することにより調製され
る。ヒドロキシルからエーテルへの変換は、塩基または
酸化銀と、適当なハロゲン化アルキルまたはハロゲン化
ベンジルとを使って行うことができる。二重結合の還元
は上述した通りである。
または酸無水物と塩基（好ましくはピリジン）を使っ
て、ヒドロキシルをアシル化することにより調製され
る。ヒドロキシルからエーテルへの変換は、塩基または
酸化銀と、適当なハロゲン化アルキルまたはハロゲン化
ベンジルとを使って行うことができる。二重結合の還元
は上述した通りである。
式VIのブレフェルジンＡ誘導体は、ハロゲン化溶媒
（例えばジクロロメタン）中の４−クロロペルオキシ安
息香酸を使って、孤立した二重結合をエポキシド化する
ことにより調製される。ヒドロキシルの酸化および共役
二重結合の還元は上述した通りである。
（例えばジクロロメタン）中の４−クロロペルオキシ安
息香酸を使って、孤立した二重結合をエポキシド化する
ことにより調製される。ヒドロキシルの酸化および共役
二重結合の還元は上述した通りである。
式VIIのブレフェルジンＡ誘導体は、エステルのカル
ボニルと共役したオレフィンを、塩基性条件下で過酸化
水素を使ってエポキシド化することにより調製される。
ヒドロキシルの酸化および二重結合の還元は上述した通
りである。
ボニルと共役したオレフィンを、塩基性条件下で過酸化
水素を使ってエポキシド化することにより調製される。
ヒドロキシルの酸化および二重結合の還元は上述した通
りである。
式VIIIのブレフェルジンＡ誘導体は、上記と同様な二
重結合の還元とヒドロキシルの酸化により調製される。
ラクトン基の加水分解はアルコール（例えばメタノー
ル）中の水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを使っ
て行われる。
重結合の還元とヒドロキシルの酸化により調製される。
ラクトン基の加水分解はアルコール（例えばメタノー
ル）中の水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを使っ
て行われる。
式IXのブレフェルジンＡ誘導体は、二重結合の（選択
的）還元および上述したようなヒドロキシル官能基のア
シルまたはアルキル誘導体の形成により調製される。テ
トラヒドロキシ誘導体の形成は、金属水素化物還元剤、
好ましくは水素化リチウムアルミニウムを使って行われ
る。
的）還元および上述したようなヒドロキシル官能基のア
シルまたはアルキル誘導体の形成により調製される。テ
トラヒドロキシ誘導体の形成は、金属水素化物還元剤、
好ましくは水素化リチウムアルミニウムを使って行われ
る。
本明細書で用いる「非ペプチド性PDGFアンタゴニス
ト」なる語は、PDGFで誘導される応答経路の刺激を抑制
する、ペプチド性化合物以外の化合物を言う。「応答経
路」は、必ずしも常にではないが一般的に、膜結合型レ
セプターに直接関連づけられる外部刺激に応じて活性化
される生化学経路である。応答経路は一般に、応答性細
胞系からの細胞外マトリックス分泌、ホルモン分泌、化
学走性、分化、または応答性細胞の細胞分裂の刺激、と
いった細胞性応答を誘導する。
ト」なる語は、PDGFで誘導される応答経路の刺激を抑制
する、ペプチド性化合物以外の化合物を言う。「応答経
路」は、必ずしも常にではないが一般的に、膜結合型レ
セプターに直接関連づけられる外部刺激に応じて活性化
される生化学経路である。応答経路は一般に、応答性細
胞系からの細胞外マトリックス分泌、ホルモン分泌、化
学走性、分化、または応答性細胞の細胞分裂の刺激、と
いった細胞性応答を誘導する。
PDGFレセプターは、通常その発現が中胚葉由来の細胞
に限定される膜貫通型の一体型糖タンパク質である。２
つのPDGFレセプターポリペプチドが記載されている。そ
れらは「αレセプター」（Kelly他,WO90/14425;Kelly
他，米国特許第5,371,205号;Claesson−Welsh他,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 86:4917−4921,1989）および「βレ
セプター」（Claesson−Welsh他,Mol.Cell.Biol.８:347
6−3486,1988;Cronwald他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
5:3435−3439,1988）と呼ばれる。PDGFリガンドの存在
下で、レセプターポリペプチドは二量化する。よって３
種のレセプターサブタイプが考えられる：αα、αβお
よびββ。βレセプターはPDGFのＢ鎖に特異的であり、
一方αレセプターはＡ鎖とＢ鎖に結合する。従って、PD
GFへの細胞の増殖調節応答性は、PPDFのAA、ABおよびBB
リガンドイソ型タンパク質の利用可能性にだけでなく、
異なるPDGFレセプターサブタイプの発現および利用可能
性にも依存する（Heldin他,Cell Regul.１:555−566,19
90）。ヒト平滑筋細胞はαレセプターとβレセプターの
両サブタイプを発現する（Heldin他,Cell Regul.１:555
−566,1990）が、単一のレセプターサブタイプのみを発
現する他の細胞型が知られている（Gronwald他,J.Biol.
Chem.264:8120−8125,1989）。
に限定される膜貫通型の一体型糖タンパク質である。２
つのPDGFレセプターポリペプチドが記載されている。そ
れらは「αレセプター」（Kelly他,WO90/14425;Kelly
他，米国特許第5,371,205号;Claesson−Welsh他,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 86:4917−4921,1989）および「βレ
セプター」（Claesson−Welsh他,Mol.Cell.Biol.８:347
6−3486,1988;Cronwald他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
5:3435−3439,1988）と呼ばれる。PDGFリガンドの存在
下で、レセプターポリペプチドは二量化する。よって３
種のレセプターサブタイプが考えられる：αα、αβお
よびββ。βレセプターはPDGFのＢ鎖に特異的であり、
一方αレセプターはＡ鎖とＢ鎖に結合する。従って、PD
GFへの細胞の増殖調節応答性は、PPDFのAA、ABおよびBB
リガンドイソ型タンパク質の利用可能性にだけでなく、
異なるPDGFレセプターサブタイプの発現および利用可能
性にも依存する（Heldin他,Cell Regul.１:555−566,19
90）。ヒト平滑筋細胞はαレセプターとβレセプターの
両サブタイプを発現する（Heldin他,Cell Regul.１:555
−566,1990）が、単一のレセプターサブタイプのみを発
現する他の細胞型が知られている（Gronwald他,J.Biol.
Chem.264:8120−8125,1989）。
本発明は、抗過形成性有効量の非ペプチド性PDGFアン
タゴニストと抗過形成性有効量のヘパリンを協同して投
与することにより、内膜過形成を抑制する方法も提供す
る。本明細書で用いる「ヘパリン」という語は、グルコ
サミンおよびグルクロン酸糖残基の反復構造により一般
に特徴付けられる、構造的に複雑な硫酸化グリコサミノ
グリカンの化合物群のいずれかの構成員を指す（Casu,A
dv.Carbo−hyd.Chem.and Biochem.47:578−583,198
5）。最も広く知られているヘパリンは、ウシ肺または
ブタ腸から調製された「未分画の」または「市販の」ヘ
パリンであって、それらは約8,000〜20,000ダルトンの
分子量に及ぶヘパリン分子の不均一混合物を包含する
（Wolinsky他,J.Am.Coll.Cardiol.15:475−481,199
0）。しかしながら、ヘパリンという語は広範囲のより
均一なヘパリン調製物、並びに硫酸ヘパランのようなヘ
パリン様分子も包含する。それらの特定のヘパリン例の
中で、より具体的なヘパリンサブタイプも知られてい
る。例えば、報告によれば、平滑筋細胞の増殖を阻害す
ることに関して未分画ヘパリンよりも40倍まで活性であ
る、内皮細胞（Castellot他,J.Cell.Biol.90:372−379,
1981）および平滑筋細胞（Fritze他,J.Cell.Biol.100:1
041−1049,1985）により生産される硫酸ヘパリン成分が
単離されている。その上、天然に存在するヘパリンサイ
ズ変異体の中で、抗凝固活性または抗増殖活性のいずれ
かを主として示す分画ヘパリン種が単離されている（Wo
linsky他,J.Am.Coll.Cardiol.15:475−481,1990）。後
者の活性は低分子量ヘパリン種、例えば五（ペンタ）〜
十（デカ）糖類の範囲内のヘパリンに存在する傾向があ
り、それらの種はより大きな生体適合性とより長い半減
期も与えることが報告されており（Id,Bacher他,Thromb
osis Res.70:295−306,1993）、従って本発明の特定態
様において特に有用かもしれない。本発明を説明する目
的でのヘパリンの定義の中には合成ヘパリンおよびヘパ
リン誘導体も含まれ、多種多様なヘパリンが常用の化学
合成、修飾および分解技術を使って製造されている（例
えばRoden,L.The Biochemistry of Glycoproteins and
Proteoglycans（Lennarz,W.J.編）267−371頁,PlenumPu
blishing Corp.,New York,1980を参照のこと。その内容
は参考として本明細書中に組み込まれる〕。
タゴニストと抗過形成性有効量のヘパリンを協同して投
与することにより、内膜過形成を抑制する方法も提供す
る。本明細書で用いる「ヘパリン」という語は、グルコ
サミンおよびグルクロン酸糖残基の反復構造により一般
に特徴付けられる、構造的に複雑な硫酸化グリコサミノ
グリカンの化合物群のいずれかの構成員を指す（Casu,A
dv.Carbo−hyd.Chem.and Biochem.47:578−583,198
5）。最も広く知られているヘパリンは、ウシ肺または
ブタ腸から調製された「未分画の」または「市販の」ヘ
パリンであって、それらは約8,000〜20,000ダルトンの
分子量に及ぶヘパリン分子の不均一混合物を包含する
（Wolinsky他,J.Am.Coll.Cardiol.15:475−481,199
0）。しかしながら、ヘパリンという語は広範囲のより
均一なヘパリン調製物、並びに硫酸ヘパランのようなヘ
パリン様分子も包含する。それらの特定のヘパリン例の
中で、より具体的なヘパリンサブタイプも知られてい
る。例えば、報告によれば、平滑筋細胞の増殖を阻害す
ることに関して未分画ヘパリンよりも40倍まで活性であ
る、内皮細胞（Castellot他,J.Cell.Biol.90:372−379,
1981）および平滑筋細胞（Fritze他,J.Cell.Biol.100:1
041−1049,1985）により生産される硫酸ヘパリン成分が
単離されている。その上、天然に存在するヘパリンサイ
ズ変異体の中で、抗凝固活性または抗増殖活性のいずれ
かを主として示す分画ヘパリン種が単離されている（Wo
linsky他,J.Am.Coll.Cardiol.15:475−481,1990）。後
者の活性は低分子量ヘパリン種、例えば五（ペンタ）〜
十（デカ）糖類の範囲内のヘパリンに存在する傾向があ
り、それらの種はより大きな生体適合性とより長い半減
期も与えることが報告されており（Id,Bacher他,Thromb
osis Res.70:295−306,1993）、従って本発明の特定態
様において特に有用かもしれない。本発明を説明する目
的でのヘパリンの定義の中には合成ヘパリンおよびヘパ
リン誘導体も含まれ、多種多様なヘパリンが常用の化学
合成、修飾および分解技術を使って製造されている（例
えばRoden,L.The Biochemistry of Glycoproteins and
Proteoglycans（Lennarz,W.J.編）267−371頁,PlenumPu
blishing Corp.,New York,1980を参照のこと。その内容
は参考として本明細書中に組み込まれる〕。
化合物の「抗過形成性有効量」は、血管、血管移植片
または移植臓器の血管成分において内膜過形成を測定可
能なほどに減少または防止するのに十分な化合物の量と
して定義される。より詳しくは、「内膜過形成の抑制」
は、技術の現状において説明されている内膜過形成過
程、例えば血管平滑筋細胞（VSMC）移動、VSMC増殖、お
よび細胞外マトリックスの新生内膜沈着、のうちの１つ
または複数の測定可能な抑制を含むものとして本明細書
中では定義される。この状況下では、内膜過形成のまた
は内膜過形成に含まれる過形成過程の減少または防止
は、当業界で周知の試験管内、生体内および生体外アッ
セイ方法を使って、特に霊長類のアッセイ方法（例え
ば、非ヒトもしくはヒト霊長類のVSMC培養物もしくは血
管組織外植片、または非ヒト霊長類の生体内試験）を使
って、容易に評価することができる。PDGFがそれの刺激
作用を及ぼさないようにすることにより、SMC増殖およ
びその後のマトリックス沈着を減らすことができる。内
膜過形成の減少は、急性血管損傷後の管腔容積の低下の
有意な減少として臨床的に表れる。そのような減少は一
般的に、初期損傷部位における再血管形成手術（例えば
繰り返し血管形成術）の必要性の減少をもたらすだろ
う。
または移植臓器の血管成分において内膜過形成を測定可
能なほどに減少または防止するのに十分な化合物の量と
して定義される。より詳しくは、「内膜過形成の抑制」
は、技術の現状において説明されている内膜過形成過
程、例えば血管平滑筋細胞（VSMC）移動、VSMC増殖、お
よび細胞外マトリックスの新生内膜沈着、のうちの１つ
または複数の測定可能な抑制を含むものとして本明細書
中では定義される。この状況下では、内膜過形成のまた
は内膜過形成に含まれる過形成過程の減少または防止
は、当業界で周知の試験管内、生体内および生体外アッ
セイ方法を使って、特に霊長類のアッセイ方法（例え
ば、非ヒトもしくはヒト霊長類のVSMC培養物もしくは血
管組織外植片、または非ヒト霊長類の生体内試験）を使
って、容易に評価することができる。PDGFがそれの刺激
作用を及ぼさないようにすることにより、SMC増殖およ
びその後のマトリックス沈着を減らすことができる。内
膜過形成の減少は、急性血管損傷後の管腔容積の低下の
有意な減少として臨床的に表れる。そのような減少は一
般的に、初期損傷部位における再血管形成手術（例えば
繰り返し血管形成術）の必要性の減少をもたらすだろ
う。
本発明の方法は、急性血管損傷による内膜過形成の治
療に特に有用である。急性血管損傷は、生涯に渡って発
達する慢性血管損傷（例えばアテローム硬化症）とは対
照的に、迅速に（即ち数日から数カ月の間に）起こる損
傷である。急性血管損傷はしばしば、血管形成術、動脈
内膜切除術、整腹アテローム切除術、血管内レーザー剥
離、血管内ステント据付、血管移植片の吻合などの技術
を使用する、血管再建のような外科的処置から生じる。
過形成は、例えば血管移植片の据付または臓器移植に応
答して、遅延反応として起こることもある。
療に特に有用である。急性血管損傷は、生涯に渡って発
達する慢性血管損傷（例えばアテローム硬化症）とは対
照的に、迅速に（即ち数日から数カ月の間に）起こる損
傷である。急性血管損傷はしばしば、血管形成術、動脈
内膜切除術、整腹アテローム切除術、血管内レーザー剥
離、血管内ステント据付、血管移植片の吻合などの技術
を使用する、血管再建のような外科的処置から生じる。
過形成は、例えば血管移植片の据付または臓器移植に応
答して、遅延反応として起こることもある。
式I,IIおよびIIIの化合物は、PDGFの過形成過程また
は他の生物学的作用を抑制するのに有効な量で、内膜過
形成の危険性があるかまたは他の形でPDGFアンタゴニス
ト療法を必要とする哺乳類に投与される。一般に、該化
合物は、特定化合物の比活性、患者の年齢、体重および
一般状態、並びに治療しようとする症状の重さといった
要因に応じて、１日あたり受容者の体重1kgあたり化合
物１μｇ〜10mgの量で、より普通には1mg/kg/日未満の
量で投与されるだろう。致命的症状は、一般に他の場合
では許容されないような多量で治療されるだろう。特定
化合物の用量は、実験動物を使った研究と組み合わせた
試験管内または生体外研究から決定することができる。
試験管内または生体外で有効であると認められた化合物
の濃度は動物実験のための指針を与え、その実験におい
て作用部位に同様な濃度を与えるように用量が算定され
る。動物実験において有効であると決定された用量は通
常、１オーダーの範囲内でヒトの用量の予測値となる。
用量決定は当業者の技術水準の範囲内であり、特定の状
況において使用する最終用量は臨床医により決定される
だろう。
は他の生物学的作用を抑制するのに有効な量で、内膜過
形成の危険性があるかまたは他の形でPDGFアンタゴニス
ト療法を必要とする哺乳類に投与される。一般に、該化
合物は、特定化合物の比活性、患者の年齢、体重および
一般状態、並びに治療しようとする症状の重さといった
要因に応じて、１日あたり受容者の体重1kgあたり化合
物１μｇ〜10mgの量で、より普通には1mg/kg/日未満の
量で投与されるだろう。致命的症状は、一般に他の場合
では許容されないような多量で治療されるだろう。特定
化合物の用量は、実験動物を使った研究と組み合わせた
試験管内または生体外研究から決定することができる。
試験管内または生体外で有効であると認められた化合物
の濃度は動物実験のための指針を与え、その実験におい
て作用部位に同様な濃度を与えるように用量が算定され
る。動物実験において有効であると決定された用量は通
常、１オーダーの範囲内でヒトの用量の予測値となる。
用量決定は当業者の技術水準の範囲内であり、特定の状
況において使用する最終用量は臨床医により決定される
だろう。
単独でまたはヘパリンと併用して、非ペプチド性PDGF
アンタゴニスト療法で治療されるヒトの場合、該アンタ
ゴニストは広範囲の条件のもとで投与され得る。アンタ
ゴニストは血管再生術の前とそのような手術後の複数
回、ボーラス注射によって投与することができる。アン
タゴニストは、手術前に（一般に手術前の24時間以内
に）ボーラス注射（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮
下）としておよび手術後の連続した輸液（埋込式ポンプ
を通した輸液を含む）として与えることができる。多く
の場合、入院中は一日量を投与し（輸液による投与を含
む）、その後で１〜２週間またはそれ以上の外来患者治
療の期間の間、より少頻度のボーラス注射を与えること
が好ましいだろう。処置は最初の損傷後６カ月まで続け
ることができる。アンタゴニストは静脈内、筋肉内また
は皮下注射を含む複数のルートで投与することができ
る。加えて、灌流バルーンカテーテル、ステント上への
コーティング、またはゲルコーティングされたバルーン
への設置を使って、アンタゴニストを血管損傷部位に局
所的に投与することもできる。後者の場合、アンタゴニ
ストの用量は全身投与される時に必要であるものよりも
実質的に少ないだろうと期待される。アンタゴニストは
徐放性デリバリーシステム、例えば血管移植片もしくは
ステント中に組み込んだそのようなシステムにより、ま
たは灌流もしくは二重バルーンカテーテルによって送達
せしめることもできる。ポンプおよび他の既知のデリバ
リーシステムを使ってもよい。
アンタゴニスト療法で治療されるヒトの場合、該アンタ
ゴニストは広範囲の条件のもとで投与され得る。アンタ
ゴニストは血管再生術の前とそのような手術後の複数
回、ボーラス注射によって投与することができる。アン
タゴニストは、手術前に（一般に手術前の24時間以内
に）ボーラス注射（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮
下）としておよび手術後の連続した輸液（埋込式ポンプ
を通した輸液を含む）として与えることができる。多く
の場合、入院中は一日量を投与し（輸液による投与を含
む）、その後で１〜２週間またはそれ以上の外来患者治
療の期間の間、より少頻度のボーラス注射を与えること
が好ましいだろう。処置は最初の損傷後６カ月まで続け
ることができる。アンタゴニストは静脈内、筋肉内また
は皮下注射を含む複数のルートで投与することができ
る。加えて、灌流バルーンカテーテル、ステント上への
コーティング、またはゲルコーティングされたバルーン
への設置を使って、アンタゴニストを血管損傷部位に局
所的に投与することもできる。後者の場合、アンタゴニ
ストの用量は全身投与される時に必要であるものよりも
実質的に少ないだろうと期待される。アンタゴニストは
徐放性デリバリーシステム、例えば血管移植片もしくは
ステント中に組み込んだそのようなシステムにより、ま
たは灌流もしくは二重バルーンカテーテルによって送達
せしめることもできる。ポンプおよび他の既知のデリバ
リーシステムを使ってもよい。
本発明の別の態様では、非ペプチド性PDGFアンタゴニ
ストは、哺乳類の血管系での内膜過形成を協同して抑制
するのに十分なアンタゴニストとヘパリンの各々の単位
用量で、哺乳類にヘパリンと協同投与される。本明細書
の「協同投与（coordinate administration）」は、ア
ンタゴニストとヘパリンの同時の、別々のまたは連続し
た投与を含むつもりである。この場合、アンタゴニスト
とヘパリンの両者は互いに関して限定された併用有効期
間の中で投与される。「併用有効期間」とは、２つの剤
が併用すると過形成を抑制するのに有効であるようなア
ンタゴニストの投与とヘパリンの投与の間に入る最大期
間として定義される。「併用すると有効である」という
語は、他の点では同等の条件および用量の下で単独で投
与した抗体またはヘパリンのいずれかにより独立に与え
られる最大抑制レベルを上回る、内膜の肥厚もしくは損
傷形成のまたは過形成過程の測定可能な抑制をもたらす
ものとして定義される。
ストは、哺乳類の血管系での内膜過形成を協同して抑制
するのに十分なアンタゴニストとヘパリンの各々の単位
用量で、哺乳類にヘパリンと協同投与される。本明細書
の「協同投与（coordinate administration）」は、ア
ンタゴニストとヘパリンの同時の、別々のまたは連続し
た投与を含むつもりである。この場合、アンタゴニスト
とヘパリンの両者は互いに関して限定された併用有効期
間の中で投与される。「併用有効期間」とは、２つの剤
が併用すると過形成を抑制するのに有効であるようなア
ンタゴニストの投与とヘパリンの投与の間に入る最大期
間として定義される。「併用すると有効である」という
語は、他の点では同等の条件および用量の下で単独で投
与した抗体またはヘパリンのいずれかにより独立に与え
られる最大抑制レベルを上回る、内膜の肥厚もしくは損
傷形成のまたは過形成過程の測定可能な抑制をもたらす
ものとして定義される。
通常、ヘパリンの用量は約１μｇ〜100mg/kg/日であ
ろう。好ましくは、ヘパリンの用量は20μｇ〜10mg/kg/
日であり、より好ましくは約1mg/kg/日未満であろう。
当業者が知るように、実際の用量は患者のパラメーター
や投与される抗体の特性（例えば、特異性、比活性、循
環半減期）およびヘパリンの特性（例えば血栓崩壊活
性）をはじめとする、特定の状況を考慮しながら決定さ
れるだろう。
ろう。好ましくは、ヘパリンの用量は20μｇ〜10mg/kg/
日であり、より好ましくは約1mg/kg/日未満であろう。
当業者が知るように、実際の用量は患者のパラメーター
や投与される抗体の特性（例えば、特異性、比活性、循
環半減期）およびヘパリンの特性（例えば血栓崩壊活
性）をはじめとする、特定の状況を考慮しながら決定さ
れるだろう。
過形成の抑制は患者の臨床的事象の減少をもたらすと
期待されるだろう。それらとしては、心筋梗塞、狭心
症、血管再生術の必要性および死亡のうちの１つまたは
複数の減少が挙げられる。
期待されるだろう。それらとしては、心筋梗塞、狭心
症、血管再生術の必要性および死亡のうちの１つまたは
複数の減少が挙げられる。
次の実施例は例示目的で与えられるのであって限定目
的ではない。
的ではない。
実施例１ アンタゴニストアッセイ SWISS3T3細胞中で発現される血清応答要素（SRE）−
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を阻止すること
ができる物質を同定するSRE−ルシフェラーゼ高処理量
アッセイ系を通して、非ペプチド性PDGFアンタゴニスト
としてのブレフェルジンＡの初期特徴づけが可能になっ
た。SRE−ルシフェラーゼ構成物であるpKZ67は、−360
から＋30までのヒトｃ−fos配列を含む合成セグメント
（van Straaten他,Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:3183−
3187,1983）（TATA、SREおよびSIEプロモーター要素を
含む）、ルシフェラーゼ配列（Delegeane他,Mol.Cell B
iol.７:3994−4002,1987;deWet他,Mol.Cell Biol.７:72
5−737,1987）およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネ
ーターを含有するルシフェラーゼ発現単位を含んで成る
pUC18由来の哺乳類細胞発現ベクターである。この発現
単位は、SV40プロモーター配列とターミネーター配列に
よって隣接されたネオマイシン耐性マーカーを含む第二
の発現単位に対して反対の転写方向にある。SWISS3T3細
胞は、PDGF−AA,−ABおよび−BB;bFGF並びにEGFの内因
性増殖因子レセプターを発現する。それらの増殖因子の
いずれかによる該レセプターの刺激は、ルシフェラーゼ
の誘導に至るシグナルカスケードを開始させる。PMA
（ホルボール12−ミリステート13−アセテート）は、プ
ロテインキナーゼＣを刺激することにより該レセプター
を迂回しそして内部シグナルカスケードを開始させてル
シフェラーゼの誘導をもたらす。アンタゴニスト特異性
の程度は、３つの増殖因子（PDGF,bFGFおよびEGF）につ
いての生成シグナルを比較することにより決定すること
ができる。対照に比べて50倍のシグナル低下をもたらす
化合物を更なる分析に使った。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を阻止すること
ができる物質を同定するSRE−ルシフェラーゼ高処理量
アッセイ系を通して、非ペプチド性PDGFアンタゴニスト
としてのブレフェルジンＡの初期特徴づけが可能になっ
た。SRE−ルシフェラーゼ構成物であるpKZ67は、−360
から＋30までのヒトｃ−fos配列を含む合成セグメント
（van Straaten他,Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:3183−
3187,1983）（TATA、SREおよびSIEプロモーター要素を
含む）、ルシフェラーゼ配列（Delegeane他,Mol.Cell B
iol.７:3994−4002,1987;deWet他,Mol.Cell Biol.７:72
5−737,1987）およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネ
ーターを含有するルシフェラーゼ発現単位を含んで成る
pUC18由来の哺乳類細胞発現ベクターである。この発現
単位は、SV40プロモーター配列とターミネーター配列に
よって隣接されたネオマイシン耐性マーカーを含む第二
の発現単位に対して反対の転写方向にある。SWISS3T3細
胞は、PDGF−AA,−ABおよび−BB;bFGF並びにEGFの内因
性増殖因子レセプターを発現する。それらの増殖因子の
いずれかによる該レセプターの刺激は、ルシフェラーゼ
の誘導に至るシグナルカスケードを開始させる。PMA
（ホルボール12−ミリステート13−アセテート）は、プ
ロテインキナーゼＣを刺激することにより該レセプター
を迂回しそして内部シグナルカスケードを開始させてル
シフェラーゼの誘導をもたらす。アンタゴニスト特異性
の程度は、３つの増殖因子（PDGF,bFGFおよびEGF）につ
いての生成シグナルを比較することにより決定すること
ができる。対照に比べて50倍のシグナル低下をもたらす
化合物を更なる分析に使った。
SWISS3T3/KZ67−G1−６細胞（SRE−ルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子でトランスフェクトされたもの）を、維
持培地〔10％ウシ胎児血清（FBS）、２mMＬ−グルタミ
ン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mg/mlのG418が補足さ
れたDMEM（GIBCO BRL,Gaithersburg,MD）〕中での連続
継代により維持した。アッセイの２日前に、細胞をトリ
プシン処理し、増殖培地（１％FBS、２mMＬ−グルタミ
ン、1mMピルビン酸ナトリウムが補足されたDMEM）中で
５×104細胞／ウエルに調整し、透明な白い96ウエルマ
イクロタイタープレートに200μ／ウエル（１×104細
胞／ウエル）を接種し、そして37℃,5％CO2で48時間増
殖させた。
ポーター遺伝子でトランスフェクトされたもの）を、維
持培地〔10％ウシ胎児血清（FBS）、２mMＬ−グルタミ
ン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mg/mlのG418が補足さ
れたDMEM（GIBCO BRL,Gaithersburg,MD）〕中での連続
継代により維持した。アッセイの２日前に、細胞をトリ
プシン処理し、増殖培地（１％FBS、２mMＬ−グルタミ
ン、1mMピルビン酸ナトリウムが補足されたDMEM）中で
５×104細胞／ウエルに調整し、透明な白い96ウエルマ
イクロタイタープレートに200μ／ウエル（１×104細
胞／ウエル）を接種し、そして37℃,5％CO2で48時間増
殖させた。
試験物質は４％DMSO中に調製した。ウエルから弱った
培地を除去し、50μ／ウエルのアッセイ培地〔0.5％
第Ｖ画分 BSA（Sigma,St.Louis,Mo.）、２mMＬ−グル
タミン、1mMピルビン酸ナトリウム、20mM Hepesが補足
されたハムF12培地（GIBCO BRL）〕を添加することによ
り、誘導を開始した。アッセイ培地中の試験試料25μ
を添加した。アッセイ培地中に調製した次の対照を各プ
レートに含めた：未処理のウエル（基底）、12.5ng/m
l、より好ましくは6.25ng/mlのPDGF−BB〔血小板由来増
殖因子、原液10μg/ml、10mM酢酸,0.25％ RSA/PBS〕、
2.0ng/mlのbFGF〔塩基性繊維芽細胞増殖因子（Genzyme
Diagnostics,Cambri−dge,MA）〕、4.5ng/mlのEGF〔表
皮増殖因子（Sigma）〕または50ng/mlのPMA（Sigma）。
DMSOの最終アッセイ濃度は１％以下であった。プレート
を37℃,5％CO2で５時間インキュベートした。
培地を除去し、50μ／ウエルのアッセイ培地〔0.5％
第Ｖ画分 BSA（Sigma,St.Louis,Mo.）、２mMＬ−グル
タミン、1mMピルビン酸ナトリウム、20mM Hepesが補足
されたハムF12培地（GIBCO BRL）〕を添加することによ
り、誘導を開始した。アッセイ培地中の試験試料25μ
を添加した。アッセイ培地中に調製した次の対照を各プ
レートに含めた：未処理のウエル（基底）、12.5ng/m
l、より好ましくは6.25ng/mlのPDGF−BB〔血小板由来増
殖因子、原液10μg/ml、10mM酢酸,0.25％ RSA/PBS〕、
2.0ng/mlのbFGF〔塩基性繊維芽細胞増殖因子（Genzyme
Diagnostics,Cambri−dge,MA）〕、4.5ng/mlのEGF〔表
皮増殖因子（Sigma）〕または50ng/mlのPMA（Sigma）。
DMSOの最終アッセイ濃度は１％以下であった。プレート
を37℃,5％CO2で５時間インキュベートした。
誘導後、プロメガ社製ルシフェラーゼアッセイキット
（E1500;Promega Corp.,Madison,WI）を使ってアッセイ
キットプロトコールに従ってルシフェラーゼ活性を測定
した。簡単に言えば、プレートからアッセイ培地を除去
し、そして無菌水で1:5希釈した25μ／ウエルの細胞
溶解緩衝液をプレートに添加した。プレートを15分間イ
ンキュベートした。プレートをLumiskan（商標）マイク
ロタイタールミノメーター（ICN Biomedical,Clevelan
d,OH）に移し、そこに40μ／ウエルのルシフェラーゼ
アッセイ基質（Promega Corp.）を添加した。１秒間の
混合と１〜３のシグナル積分の後、発光の量（相対光単
位、RLU）を測定した。全ての測定値から基底の（未誘
導の）ルシフェラーゼシグナルを差し引き、そして試験
試料により誘導されたルシフェラーゼシグナルを、対照
からのシグナルに対する百分率（％）として表した。基
底レベルを超えるシグナルを誘導する試料を、更なる特
徴づけのために選択した。表１に与えるデータは、対照
活性の50％を阻害するのに必要なブレフェルジンＡのお
よその有効量（IC50）を示す。
（E1500;Promega Corp.,Madison,WI）を使ってアッセイ
キットプロトコールに従ってルシフェラーゼ活性を測定
した。簡単に言えば、プレートからアッセイ培地を除去
し、そして無菌水で1:5希釈した25μ／ウエルの細胞
溶解緩衝液をプレートに添加した。プレートを15分間イ
ンキュベートした。プレートをLumiskan（商標）マイク
ロタイタールミノメーター（ICN Biomedical,Clevelan
d,OH）に移し、そこに40μ／ウエルのルシフェラーゼ
アッセイ基質（Promega Corp.）を添加した。１秒間の
混合と１〜３のシグナル積分の後、発光の量（相対光単
位、RLU）を測定した。全ての測定値から基底の（未誘
導の）ルシフェラーゼシグナルを差し引き、そして試験
試料により誘導されたルシフェラーゼシグナルを、対照
からのシグナルに対する百分率（％）として表した。基
底レベルを超えるシグナルを誘導する試料を、更なる特
徴づけのために選択した。表１に与えるデータは、対照
活性の50％を阻害するのに必要なブレフェルジンＡのお
よその有効量（IC50）を示す。
実施例２ ラット平滑筋細胞（SMC）への125I−PDGF−BB結合の阻
害 ラットSMCの単層培養物への125I−PDGF−BB結合を阻
害する能力についてブレフェルジンＡを分析した。SMC
を約20,000細胞／ウエルの密度で24ウエル培養皿に接種
した。接種後２〜７日目に細胞をアッセイに使った。試
験化合物を結合培地〔500mlのハムＦ−12（Gibco BR
L）,12mlの1M Hepes,pH7.4,5mlの100×PSN、1gmのウサ
ギ血清アルブミン（Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O）〕中で表２に示す濃度に希釈し、次いで三重反復試
験においてSMC（1ml/ウエル）に添加した。次いでそれ
らのウエルに50μの125I−PDGF−BB結合原液を添加し
た。結合培地のみを陰性対照として使用し、125I−PDGF
−BBに対する非特異的結合を測定するのに200ng/mlのPD
GF−BBの添加を使った。４℃で約1.5時間細胞をインキ
ュベートし、次いで結合培地で洗浄して未結合のリガン
ドを除去した。次いで細胞を抽出緩衝液（20mM Tris−H
Cl pH8.0,100mM NaCl,1mM EDTA,0.5％デオキシコール酸
ナトリウム,10mM Nal,1％ウシ血清アルブミン）と共に
インキュベートし、抽出液を収集し、γカウンター中で
カウントした。
害 ラットSMCの単層培養物への125I−PDGF−BB結合を阻
害する能力についてブレフェルジンＡを分析した。SMC
を約20,000細胞／ウエルの密度で24ウエル培養皿に接種
した。接種後２〜７日目に細胞をアッセイに使った。試
験化合物を結合培地〔500mlのハムＦ−12（Gibco BR
L）,12mlの1M Hepes,pH7.4,5mlの100×PSN、1gmのウサ
ギ血清アルブミン（Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O）〕中で表２に示す濃度に希釈し、次いで三重反復試
験においてSMC（1ml/ウエル）に添加した。次いでそれ
らのウエルに50μの125I−PDGF−BB結合原液を添加し
た。結合培地のみを陰性対照として使用し、125I−PDGF
−BBに対する非特異的結合を測定するのに200ng/mlのPD
GF−BBの添加を使った。４℃で約1.5時間細胞をインキ
ュベートし、次いで結合培地で洗浄して未結合のリガン
ドを除去した。次いで細胞を抽出緩衝液（20mM Tris−H
Cl pH8.0,100mM NaCl,1mM EDTA,0.5％デオキシコール酸
ナトリウム,10mM Nal,1％ウシ血清アルブミン）と共に
インキュベートし、抽出液を収集し、γカウンター中で
カウントした。
結合研究の結果を表２に示す。データは125I−PDGF−
BBについての結合した比放射能（cpm）として与えられ
る。200ng/mlの未標識のPDGF−BBの添加により測定され
た非特異的結合は853cpmであり、与えられるデータから
この値が差し引かれている。
BBについての結合した比放射能（cpm）として与えられ
る。200ng/mlの未標識のPDGF−BBの添加により測定され
た非特異的結合は853cpmであり、与えられるデータから
この値が差し引かれている。
実施例３ ヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF−BB有糸分裂促進活性の阻
害 ヒヒ平滑筋細胞に対するPDGFの有糸分裂促進活性を阻
害する能力についてブレフェルジンＡを分析した。ヒヒ
血管平滑筋細胞（BVSMC）に対して行った全ての有糸分
裂アッセイは、13〜20継代培養した細胞の初代培養物に
関して実施した。出発培養物は大動脈性組織外植片の派
生物から確立された。ヒヒ平滑筋細胞を、10％ウシ胎児
血清が補足されたDMEM中、ウエルあたり約20,000細胞の
密度で24ウエルの培養皿に接種した。使用する１日前に
培地を除去し、1mlのMito Media（表３）を各ウエルに
添加して、細胞を静止状態にした。実験開始時点で、細
胞をPDGF−BBで刺激した。1,0.5,0.25,0.062および0ng/
mlの濃度を使ってPDGF−BBについて標準曲線を作成し
た。0.25％アルブミンを含む10mM酢酸中への希釈により
各PDGF濃度について20×原液を作り、そして50μのPD
GFまたは希釈賦形剤のみを培養ウエルに添加した。
害 ヒヒ平滑筋細胞に対するPDGFの有糸分裂促進活性を阻
害する能力についてブレフェルジンＡを分析した。ヒヒ
血管平滑筋細胞（BVSMC）に対して行った全ての有糸分
裂アッセイは、13〜20継代培養した細胞の初代培養物に
関して実施した。出発培養物は大動脈性組織外植片の派
生物から確立された。ヒヒ平滑筋細胞を、10％ウシ胎児
血清が補足されたDMEM中、ウエルあたり約20,000細胞の
密度で24ウエルの培養皿に接種した。使用する１日前に
培地を除去し、1mlのMito Media（表３）を各ウエルに
添加して、細胞を静止状態にした。実験開始時点で、細
胞をPDGF−BBで刺激した。1,0.5,0.25,0.062および0ng/
mlの濃度を使ってPDGF−BBについて標準曲線を作成し
た。0.25％アルブミンを含む10mM酢酸中への希釈により
各PDGF濃度について20×原液を作り、そして50μのPD
GFまたは希釈賦形剤のみを培養ウエルに添加した。
PDGF−BB有糸分裂促進活性を中和するブレフェルジン
Ａの活性を分析するために、1ng/mlのPDGFをブレフェル
ジンＡの様々な希釈液と一緒にウエルに添加した。細胞
を試験試料と共に37℃で約20時間インキュベートした。
次いで各ウエルに50μの20×原液を添加して１μCi/m
lの最終濃度を与えた。細胞を37℃で４時間インキュベ
ートし、PBSで洗浄し、次いでトリプシンを使って収穫
し、Wallac（Turku,Finland）Betaplate（商標）液体シ
ンチレーションカウンター中で〔3H〕チミジンの取込み
についてカウントした。表３に与える結果は、PDGF−BB
有糸分裂促進活性が用量依存形式でブレフェルジンＡに
より阻害されることを証明する。この阻害のED50はブレ
フェルジンＡの場合約25nMであった。
Ａの活性を分析するために、1ng/mlのPDGFをブレフェル
ジンＡの様々な希釈液と一緒にウエルに添加した。細胞
を試験試料と共に37℃で約20時間インキュベートした。
次いで各ウエルに50μの20×原液を添加して１μCi/m
lの最終濃度を与えた。細胞を37℃で４時間インキュベ
ートし、PBSで洗浄し、次いでトリプシンを使って収穫
し、Wallac（Turku,Finland）Betaplate（商標）液体シ
ンチレーションカウンター中で〔3H〕チミジンの取込み
についてカウントした。表３に与える結果は、PDGF−BB
有糸分裂促進活性が用量依存形式でブレフェルジンＡに
より阻害されることを証明する。この阻害のED50はブレ
フェルジンＡの場合約25nMであった。
これらのデータは、ラットSMCへのPDGF結合を阻害す
るのに必要とされる用量の1/1000であるブレフェルジン
Ａの用量がヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF−BB有糸分裂促
進活性を有意に阻害できることを証明する。
るのに必要とされる用量の1/1000であるブレフェルジン
Ａの用量がヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF−BB有糸分裂促
進活性を有意に阻害できることを証明する。
これと同じ実験の一部として、ヘパリンの存在下でブ
レフェルジンＡの阻害活性を分析し、ヘパリンがブレフ
ェルジンＡと協同形式でPDGF−BB有糸分裂促進活性を阻
害する作用をすることができるかどうかを調べた。ヒヒ
平滑筋細胞を0.5U/mlの未分画ヘパリンの存在下でブレ
フェルジンＡを1ng/mlのPDGF−BBと共にインキュベート
した。細胞を上記と同様に〔3H〕チミジンでパルス標識
し、〔3H〕チミジン取込みのレベルを測定した。表３に
与える結果は、ブレフェルジンＡへのヘパリンの添加が
ブレフェルジンＡのみにより達成されるものを超える大
きな〔3H〕チミジン取込みの阻害をもたらしたことを証
明する。
レフェルジンＡの阻害活性を分析し、ヘパリンがブレフ
ェルジンＡと協同形式でPDGF−BB有糸分裂促進活性を阻
害する作用をすることができるかどうかを調べた。ヒヒ
平滑筋細胞を0.5U/mlの未分画ヘパリンの存在下でブレ
フェルジンＡを1ng/mlのPDGF−BBと共にインキュベート
した。細胞を上記と同様に〔3H〕チミジンでパルス標識
し、〔3H〕チミジン取込みのレベルを測定した。表３に
与える結果は、ブレフェルジンＡへのヘパリンの添加が
ブレフェルジンＡのみにより達成されるものを超える大
きな〔3H〕チミジン取込みの阻害をもたらしたことを証
明する。
フロントページの続き (72)発明者 エムシー コネル，オリバー，ジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98199, シアトル，フォーティース アベニュ ウエスト 2642 (72)発明者 マルティネツ，テレサ アメリカ合衆国，ワシントン 98277, オーク ハーバー，ノース ベントン プレイス 2722 (72)発明者 ウエスト，ロバート，アール. アメリカ合衆国，ワシントン 98117, シアトル，シックスティース アベニュ ノース ウエスト 7737 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 31/075,31/122 A61K 31/19,31/365 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (21)
- 【請求項１】哺乳類の血管系におけるPDGF活性を抑制す
るための剤であって、式I,IIまたはIII: （上式中、点線は単結合または二重結合を表し； R1およびR2は同一であり、そして単一基＝Ｏであるか、
あるいはＨとOH、ＨとOR、またはＨとOCORであり； R3は単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとOH、ＨとOR、ま
たはＨとOCORであり； R4はCOOH、COOHの医薬上許容される塩、またはCH2ORで
あり； R5とR6は両方とも酸素であるか、またはR5とR6の一方が
Ｏでありそして他方が二重結合を含み；そして ＲはC1-5アルキル、フェニルまたはベンジルである） により表される化合物を含んで成る剤。 - 【請求項２】哺乳類において平滑筋細胞へのPDGF−BBの
結合を抑制するための剤であって、式I,IIまたはIII: （上式中、点線は単結合または二重結合を表し； R1およびR2は同一であり、そして単一基＝Ｏであるか、
あるいはＨとOH、ＨとOR、またはＨとOCORであり； R3は単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとOH、ＨとOR、ま
たはＨとOCORであり； R4はCOOH、COOHの医薬上許容される塩、またはCH2ORで
あり； R5とR6は両方とも酸素であるか、またはR5とR6の一方が
Ｏでありそして他方が二重結合を含み；そして ＲはC1-5アルキル、フェニルまたはベンジルである） により表される化合物を含んで成る剤。 - 【請求項３】哺乳類においてPDGF−BB有糸分裂促進活性
を抑制するための剤であって、式I,IIまたはIII: （上式中、点線は単結合または二重結合を表し； R1およびR2は同一であり、そして単一基＝Ｏであるか、
あるいはＨとOH、ＨとOR、またはＨとOCORであり； R3は単一基＝Ｏであるか、あるいはＨとOH、ＨとOR、ま
たはＨとOCORであり； R4はCOOH、COOHの医薬上許容される塩、またはCH2ORで
あり； R5とR6は両方とも酸素であるか、またはR5とR6の一方が
Ｏでありそして他方が二重結合を含み；そして ＲはC1-5アルキル、フェニルまたはベンジルである） により表される化合物を含んで成る剤。 - 【請求項４】前記化合物が、式IV （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；そして R1およびR2は単一基＝Ｏであるか、またはＨとOHであ
る） により表される化合物である、請求項１〜３のいずれか
１項に記載の剤。 - 【請求項５】前記化合物が、式Ｖ （上式中、点線は単結合または二重結合を表し；そして R1およびR2はＨとOR、またはＨとOCORであり、ＲはC1-5
アルキル、フェニルまたはベンジルである） により表される化合物である、請求項１〜３のいずれか
１項に記載の剤。 - 【請求項６】前記化合物が、式VI （上式中、点線は単結合または二重結合を表し； R1およびR2は単一基＝Ｏであるか、またはＨとOHであ
り；そして R5はＯである） により表される化合物である、請求項１〜３のいずれか
１項に記載の剤。 - 【請求項７】前記化合物が、式VII （上式中、点線は単結合または二重結合を表し； R1およびR2は単一基＝Ｏであるか、またはＨとOHであ
り；そして R6はＯである） により表される化合物である、請求項１〜３のいずれか
１項に記載の剤。 - 【請求項８】前記化合物が、式VIII （上式中、点線は単結合または二重結合を表し； R1,R2およびR3は単一基＝Ｏであるか、またはＨとOHで
あり；そして R4はCOOHまたはCOOHの医薬上許容される塩である） により表される化合物である、請求項１〜３のいずれか
１項に記載の剤。 - 【請求項９】前記化合物が、式IX （上式中、点線は単結合または二重結合を表し； R1,R2およびR3はＨとOR、またはＨとOCORであり、ここ
でＲはC1-5アルキル、フェニルまたはベンジルであり；
そして R4はCH2ORである） により表される化合物である、請求項１〜３のいずれか
１項に記載の剤。 - 【請求項１０】前記化合物がブレフェルジンA: である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
- 【請求項１１】前記哺乳類が霊長類である、請求項１〜
11のいずれか１項に記載の剤。 - 【請求項１２】前記化合物が、前記哺乳類における急性
血管損傷と同時に、またはその前の抗過形成性有効期間
内に投与される、請求項１〜10のいずれか１項に記載の
剤。 - 【請求項１３】前記損傷が血管再建によるものである、
請求項12に記載の剤。 - 【請求項１４】前記血管再建が、血管形成術、動脈内膜
切除術、整腹アテローム切除術、血管内レーザー剥離、
血管内ステント据付または血管移植片の吻合を含んで成
る、請求項13に記載の剤。 - 【請求項１５】前記化合物が、前記哺乳類における急性
血管損傷後の抗過形成性有効期間内に投与される、請求
項１〜11のいずれか１項に記載の剤。 - 【請求項１６】前記損傷が血管再建によるものである、
請求項15に記載の剤。 - 【請求項１７】前記血管再建が、血管形成術、動脈内膜
切除術、整腹アテローム切除術、血管内レーザー剥離、
血管内ステント据付または血管移植片の吻合を含んで成
る、請求項16に記載の剤。 - 【請求項１８】前記化合物が、血管移植片または移植臓
器の据付と同時に、またはその前の抗過形成性有効期間
内に投与される、請求項１〜11のいずれか１項に記載の
剤。 - 【請求項１９】前記化合物が、血管移植片または移植臓
器の据付の後の抗過形成性有効期間内に投与される、請
求項１〜11のいずれか１項に記載の剤。 - 【請求項２０】前記哺乳類に協同投与される式I,IIまた
はIIIの非ペプチド性PDGFアンタゴニストのPDGF活性抑
制有効量とヘパリンとを含んで成る剤であって、ここで
前記協同投与される抗原とヘパリンは併用すると前記PD
GF活性を抑制するのに有効である、請求項１〜19のいず
れか１項に記載の剤。 - 【請求項２１】前記非ペプチド性PDGFアンタゴニストお
よびヘパリンが、経口、静脈内、脈管周囲、経皮および
直腸投与方法から成る群より選ばれた投与方法により前
記哺乳類に投与される、請求項20に記載の剤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/483,216 | 1995-06-07 | ||
| US483,216 | 1995-06-07 | ||
| US08/483,216 US5618837A (en) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | PDGF antagonists III |
| PCT/US1996/009061 WO1996040112A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-06-04 | Use of brefeldin a and derivatives thereof in the treatment of hyperplasia and related disorders |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=23919165
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|---|---|---|---|
| JP50147297A Expired - Fee Related JP3190684B2 (ja) | 1995-06-07 | 1996-06-04 | 過形成および関連疾患の治療におけるブレフェルジンａおよびその誘導体の使用 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0831807B1 (ja) |
| JP (1) | JP3190684B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69635614T2 (ja) |
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| ES (1) | ES2253750T3 (ja) |
| WO (1) | WO1996040112A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| KR200490553Y1 (ko) * | 2016-08-11 | 2019-11-28 | 왕 중 김 | 일회용 앞치마 |
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| WO1999031084A1 (en) | 1997-12-18 | 1999-06-24 | Purdue Research Foundation | Brefeldin a derivatives |
| US8236048B2 (en) | 2000-05-12 | 2012-08-07 | Cordis Corporation | Drug/drug delivery systems for the prevention and treatment of vascular disease |
| US20050002986A1 (en) * | 2000-05-12 | 2005-01-06 | Robert Falotico | Drug/drug delivery systems for the prevention and treatment of vascular disease |
| MXPA03002871A (es) | 2000-09-29 | 2004-12-06 | Johnson & Johnson | Dispositivos medicos recubiertos. |
| US6696483B2 (en) | 2000-10-03 | 2004-02-24 | Oncopharmaceutical, Inc. | Inhibitors of angiogenesis and tumor growth for local and systemic administration |
| KR101501870B1 (ko) | 2003-08-27 | 2015-03-12 | 옵쏘테크 코포레이션 | 안구의 혈관신생성 장애를 치료하기 위한 조합 치료법 |
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| WO2010099138A2 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation |
| WO2010099363A1 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation |
| US8465912B2 (en) | 2009-02-27 | 2013-06-18 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation |
| WO2012149014A1 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Use of emt gene signatures in cancer drug discovery, diagnostics, and treatment |
| WO2013152252A1 (en) | 2012-04-06 | 2013-10-10 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Combination anti-cancer therapy |
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| WO1995021614A1 (en) * | 1994-02-09 | 1995-08-17 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | New protein trafficking inhibitors |
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Cited By (1)
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