JP4162494B2 - 筋緊張性ジストロフィー２型に関連するイントロン、および使用方法 - Google Patents

Description

【０００１】
［継続出願データ］
本出願は、２００１年５月１１日に提出した米国仮出願第６０／２９０，３６５号、２００１年６月２９日に提出した米国仮出願第６０／３０２，０２２号、および２００１年１１月１３日に提出した米国仮出願第６０／３３７，８３１号（これらは、参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
［政府による財政支援］
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号 ＮＳ３５８７０の下で、政府支援によりなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
［背景］
ＤＭは、筋緊張症、筋ジストロフィー、心伝導欠陥、後虹彩白内障、および内分泌障害を含む外見上は無関係であり稀な臨床的特徴の一貫した集合を伴う優性遺伝性多臓器疾患である(Harper, Myotonic Drystrophy, W.B. Saunders, London, ed. 2, (1989))。ＤＭについては、約１００年前に初めて記載されたが、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）に関して遺伝子検査が利用可能になった後にようやく、２つ以上の遺伝的要因の存在が認識された(Thornton et al., Ann. Neurology, 35, 269 (1994), Ricker et al., Neurology, 44, 1448 (1994))。
【０００４】
ＤＭ１は、筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’非翻訳領域、およびすぐ隣りのホメオドメイン遺伝子ＳＩＸ５のプロモーター領域の両方に存在する、１９番染色体上のＣＴＧ反復の増大により引き起こされる(Groenen and Wieringa, Bioessays, 20, 901 (1998), Tapscott, Science, 289, 1701 (2000))。遺伝子の非コード領域のＣＴＧ増大(expansion)がどのようにして複雑なＤＭ表現型を引き起こすのかはいまだに明らかではない。提唱されているメカニズムとしては、（ｉ）ＤＭＰＫタンパク質のハプロ不全、（ｉｉ）ＳＩＸ５を含む隣接遺伝子発現の改変、および（ｉｉｉ）核内フォーカスとして蓄積し、細胞機能を崩壊するＲＮＡ中のＣＵＧ増大の病原的影響が挙げられる。幾つかのマウスモデルにより異なる態様のＤＭ１を開発した。ＣＵＧ反復を有するｍＲＮＡを発現するモデルは、筋緊張症およびＤＭ１の筋障害性の特徴を表し、ＤＭＰＫノックアウトは心臓異常を有し、ＳＩＸ５ノックアウトは、白内障を患う。総合すると、これらのデータは、各理論がＤＭ１の病因に寄与する可能性があり、ＤＭ１が、局所遺伝子病であり得ることを示唆すると解釈されてきた。
【０００５】
ＤＭの病態生理学的要因をより明確にするために、本発明者等は、ＤＭの臨床的特徴の多くを有するが、ＤＭ１ ＣＴＧ増大を伴わない家族について研究してきた。ＤＭ１について遺伝子検査が利用可能になった後、ＤＭ２および近位型筋緊張性筋障害（ＰＲＯＭＭ）を患う家族を判別し、連鎖解析によりＤＭ１遺伝子座の関与が排除され、同様に筋肉の塩化物およびナトリウムチャネル遺伝子の関与も排除された。その後、近位型筋緊張性ジストロフィー（ＰＤＭ）および筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）は、非ＤＭ１型の優性遺伝性多臓器筋緊張性障害の認識される表現型を広げると説明された。１９９８年には、ＤＭ２遺伝子座が３ｑ２１に位置付けられ、ＰＲＯＭＭの遺伝的要因は、多くの家族において同じ遺伝子座に位置することが実証された。
【０００６】
ＤＭの多臓器性の影響を引き起こす第２のヒト突然変異を明らかにし、分子レベルでこれらの疾患に共通するものを同定することにより、ＤＭの発病経路を決定する独自の手段が提供され、この疾患の診断方法を開発することが可能となる。
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、ヒト個体に筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）の危険性があるかどうかを検出する従来技術の進歩を表す。本発明者等は、ＤＭ２がジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）をコードするヌクレオチドのイントロン１の中のＣＣＴＧ増大により引き起こされることを発見した。この増大は、本発明以前にはヌクレオチド配列が完全に順序付けられなかったゲノムの領域に位置する。この領域の正確な配列を決定し、本明細書中に開示する。したがって、本発明は、単離されたポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドとしては、配列番号１のおよそヌクレオチド１〜１４４６８、配列番号１のおよそヌクレオチド１４４７４〜２２４００、配列番号１のおよそヌクレオチド１７５０１〜１７７０１、配列番号１のおよそヌクレオチド１７５０１〜１７７０１およびリピートトラクト、配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８０５８、リピートトラクトおよび配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８０５８、またはそれらの相補体が挙げられる。本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド１６７０１〜１７７０１由来の少なくとも約１５個の連続するヌクレオチド、配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８８６２由来の少なくとも約１５個の連続するヌクレオチド、またはそれらの相補体を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
本発明は、ジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）ゲノム配列のイントロン１内のリピートトラクトを含むポリヌクレオチドの検出方法を提供する。この方法は、ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域のヌクレオチドを増幅して、増幅されたポリヌクレオチドを形成し、ここで、該増幅されたポリヌクレオチドはリピートトラクトを含み、そして、上記増幅されたポリヌクレオチドを検出することを含む。あるいは、この方法は、ポリヌクレオチドを得るために、制限エンドヌクレアーゼで、ゲノムＤＮＡを消化し、ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１内のリピートトラクトを含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする、検出可能に標識したプローブを用いて、ハイブリダイズ用条件下にて該ポリヌクレオチドをプローブし、そして該ポリヌクレオチドにハイブリダイズした上記プローブを検出することを含む。
【０００９】
本発明はさらに、筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）を発症する危険性のない個体の判別方法を提供する。この方法は、１７６個以下のヌクレオチドのリピートトラクトを含む２つの危険性のない対立遺伝子に関して、個体のＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域を解析することを含む。例えば、この方法は、個体のＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域のヌクレオチドを増幅して、増幅されたポリヌクレオチドを形成し、ここで、該増幅されたポリヌクレオチドはリピートトラクトを含み、該増幅されたポリヌクレオチドのサイズを比較し、そして、２つの危険性のない対立遺伝子に関して、上記増幅されたポリヌクレオチドを解析することを含む。増幅行為は、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマー対を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含んでもよく、ここで該第１のプライマーおよび該第２のプライマーが、前記イントロン１領域内に位置する前記リピートトラクトに隣接する。前記第１のプライマーが、配列番号１のヌクレオチド１４４６９〜１７７０１から選択される少なくとも約１５個のヌクレオチドを含み、該第２のプライマーが、配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８６６１から選択される少なくとも約１５個のヌクレオチドを含む。あるいは、この方法は、個体のＺＮＦ９ゲノム配列内のイントロン１領域のヌクレオチドを増幅して、増幅されたポリヌクレオチドを形成し、ここで、該増幅されたポリヌクレオチドはリピートトラクトを含み、１７６個以下のヌクレオチドのリピートトラクトを含む２つの危険性のない対立遺伝子に関して、該増幅されたポリヌクレオチドの該リピートトラクトを解析することとを含んでもよい。
【００１０】
また、本発明は、ＤＭ２に罹っているか、またはＤＭ２を発症する危険性のある個体の判別方法を提供する。この方法は、少なくとも約７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含む１つの危険性のある対立遺伝子に関して、個体のＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域を解析することを含む。別の態様では、この方法は、ポリヌクレオチドを得るために、制限エンドヌクレアーゼで個体のゲノムＤＮＡを消化し、ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１内のリピートトラクトを含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする、検出可能に標識したプローブを用いて、ハイブリダイズ用条件下にて該ポリヌクレオチドをプローブし、該ポリヌクレオチドにハイブリダイズした該プローブを検出し、そして少なくとも約７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含む１つの危険性のある対立遺伝子に関して、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの該イントロン１領域を解析することを含む。さらに別の態様では、この方法は、個体のＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域のヌクレオチドを増幅して、増幅されたポリヌクレオチドを形成し、ここで、該増幅されたポリヌクレオチドはリピートトラクトを含み、そして、少なくとも７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含む１つの危険性のある対立遺伝子に関して、該増幅されたポリヌクレオチドの該リピートトラクトを解析することを含む。
【００１１】
本発明はまた、キットを提供する。本発明の一態様では、該キットは、個体がＤＭ２を発症する危険性がないかどうかを判別するためのものである。該キットは、配列番号１のヌクレオチド１４４６９〜１７７０１から選択される少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドを含む第１のプライマー、および配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８６６１から選択される少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドを含む第２のプライマーを含む。危険性のない個体は、１７６個以下のヌクレオチドのリピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列の２つの危険性のない対立遺伝子を有する。
【００１２】
別の態様では、キットは、個体がＤＭ２を発症する危険性があるかどうかを判別するためのものである。該キットは、少なくとも約２００個のヌクレオチドを含むプローブを含み、ここで該プローブが、配列番号１またはその相補体にハイブリダイズする。危険性のある個体は、少なくとも約７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列の１つの危険性のある対立遺伝子を有する。あるいは、このキットは、配列番号１のヌクレオチド１４４６９〜１７７０１、または配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８６６１から選択される少なくとも約１５個のヌクレオチドを有する第１のプライマー、および（ＣＣＴＧ）_nおよび（ＣＡＧＧ）_n（ここで、ｎは少なくとも４である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する第２のプライマーを含む。危険性のある個体は、少なくとも約７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列の１つの危険性のある対立遺伝子を有する。
【００１３】
さらに別の態様では、キットは、個体がＤＭ２に罹っているかどうかを判別するためのものである。このキットは、少なくとも約２００個のヌクレオチドを含むプローブを含み、ここで該プローブが、配列番号１またはその相補体にハイブリダイズする。危険性のある個体は、少なくとも約７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列の１つの危険性のある対立遺伝子を有し、そしてＤＭ２の症状を示す。あるいは、このキットは、配列番号１のヌクレオチド１４４６９〜１７７０１、または配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８６６１から選択される少なくとも約１５個のヌクレオチドを含む第１のプライマー、および（ＣＣＴＧ）_nおよび（ＣＡＧＧ）_n（ここで、ｎは少なくとも４である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む第２のプライマーを含む。危険性のある個体は、少なくとも約７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列の１つの危険性のある対立遺伝子を有する。
【００１４】
別記しない限り、複数を示す語句の記載がないもの（「a」、「an」、「the」）および「少なくとも１つ(at least one)」は交換可能に使用され、１つまたはそれ以上を意味する。
【００１５】
［発明の好ましい実施形態の詳細な説明］
組成
本発明は、ジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）ゲノム配列のイントロン１領域の一部を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さを有するヌクレオチド（リボヌクレオチドかデオキシヌクレオチドのいずれか）の重合体を指し、二本鎖および単一鎖のＤＮＡならびにＲＮＡの両方を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ゲノム配列、および調節配列および／またはイントロンのような他の配列を含む種々の機能を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、天然の供給源から直接得ることができるか、あるいは組換え技法、酵素技法または化学的技法を用いて調製することができる。ポリヌクレオチドは、その形態が線状でも環状でもあり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクターまたはクローニングベクターのようなベクターの一部、または断片であり得る。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは、その自然環境から取り出されたか、組換え技法を用いて生産されたか、または酵素的もしくは化学的に合成されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは精製されており、すなわちいかなる他のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および関連細胞産物または他の不純物も本質的に含まない。本明細書中で使用する場合、「ゲノム配列」には、プロセシングされていないプレＲＮＡ（すなわち、エキソンおよびイントロンの両方を含むＲＮＡ分子）、およびプレＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが含まれる。適切な調節配列の制御下に置かれると、ゲノム配列はｍＲＮＡを生産する。ゲノム配列の境界は、一般にその５’末端にある転写開始部位とその３’末端にある転写終結因子により決定される。ゲノム配列には典型的に、イントロンとエキソンが含まれる。調節配列は、それが操作可能に連結されたゲノム配列の発現を調節するポリヌクレオチドである。調節配列の非限定的な例としては、プロモーターが挙げられる。「操作可能に連結された」とは、このように記載される成分が、意図されるそれらの様式でそれらが機能することを可能にする関係にある並列を指す。調節配列に適合する条件下でゲノム配列の発現が達成されるような方法で調節配列が連結される場合に、調節配列は、ゲノム配列に「操作可能に連結される」。
【００１６】
ＺＮＦ９ゲノム配列は、ヒトゲノム中の３番染色体の位置３ｑ２１に位置する。ＺＮＦ９ゲノム配列に関連した配列タグ部位（ＳＴＳ）には、Ｎ２２２３８およびｓｔＧ５１１０７が含まれる。ＺＮＦ９ゲノム配列にコードされるポリペプチドは、７個のジンクフィンガードメインを含み、ステロール調節エレメントを結合することでＲＮＡ結合ポリペプチドとして機能する（Rajavashisth et al. Science, 245, 640-643を参照)。本明細書中で使用する場合、「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸のポリマーを指し、特定長のアミノ酸ポリマーを指すわけではない。ＺＮＦ９ゲノム配列は、５つのエキソンと４つのイントロンを含む（図４を参照）。
【００１７】
１人の個体から得られたＺＮＦ９ゲノム配列の配列を図７に開示する。この配列では、エキソン１は、ヌクレオチド４３３７〜４４１５に相当し、エキソン２は、ヌクレオチド１８６６２〜１８７９９に相当し、エキソン３は、ヌクレオチド７８８９６〜１８９８７に相当し、エキソン４は、ヌクレオチド１９１５６〜１９３５６に相当し、エキソン５は、ヌクレオチド１９８６５〜２０８４５に相当する。ヌクレオチド４４１６〜１８６６１に相当するイントロン１は、未知のサイズのギャップを含む。このギャップを、配列番号１においてヌクレオチド１４４６９〜１４４７３間に示してある。ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１には、ＴＧ／ＴＣＴＧ／ＣＣＴＧリピートトラクトが含まれ、これを本明細書中では「リピートトラクト」とも呼ぶ。リピートトラクトの特徴について以下により詳細に記載する。配列番号１では、リピートトラクトは、ヌクレオチド１７７０２〜１７８５８に相当する。ＺＮＦ９ゲノム配列では、転写開始部位は、エキソン１の第１ヌクレオチドであるヌクレオチド４３３７であり、転写終結部位は、ヌクレオチド２０８４５である。
【００１８】
ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１は、典型的に少なくとも約１４２４７個のヌクレオチドを含んでいる。エキソン１のすぐ隣りのイントロン１の配列（すなわち、イントロン１の５’末端）は、好ましくは配列番号１のヌクレオチド４４１６〜４４２６であり、より好ましくは配列番号１のヌクレオチド４４１６〜４４６６であり、最も好ましくは配列番号１のヌクレオチド４４１６〜４５１６である。エキソン２のすぐ隣りのイントロン１の配列（すなわち、イントロン１の３’末端）は、好ましくは配列番号１のヌクレオチド１８６４１〜１８６６１、より好ましくは配列番号１のヌクレオチド１８６１１〜１８６６１、最も好ましくは配列番号１のヌクレオチド１８５６１〜１８６６１である。ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１には、ＺＮＦ９の種々の対立遺伝子に存在するイントロン１領域により高度に保存される幾つかのヌクレオチド配列も含まれ、それらは、好ましくはヒトゲノムの他の場所には存在しない。例えば、ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１は、１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、最も好ましくは４つの以下の：ＧＣＣＧＣＡＧＴＧＣＧＧＧＴＣＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＣＧＧＡＣ（配列番号３９）と、プライマーＧＡＧＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＴＣＧ（配列番号２２）およびＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＣＡ（配列番号２３）を用いて、ＺＮＦ９、好ましくは配列番号１のイントロン１を増幅することで生成するヌクレオチド配列と、ＧＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＧＡ（配列番号１０）と、ＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧ（配列番号１１）、またはそれらの相補体を含む。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドの例としては、リピートトラクトの上流（すなわち５’）または下流（すなわち３’）に位置するポリヌクレオチドが挙げられる。リピートトラクトの上流に位置する本発明のポリヌクレオチドとしては、好ましくは配列番号１のおよそヌクレオチド１７５０１〜１７７０１、配列番号１のおよそヌクレオチド１７１０１〜１７７０１、配列番号１のおよそヌクレオチド１６７０１〜１７７０１（順番が進むにつれて好ましい）、最も好ましくは配列番号１のおよそヌクレオチド１５７０１〜１７７０１、またはそれらの相補体が挙げられる。リピートトラクトの下流に位置する本発明のポリヌクレオチドとしては、好ましくは配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８０５８、配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８４５８、配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８８５８（順番が進むにつれて好ましい）、最も好ましくは配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１９８５８、またはそれらの相補体が挙げられる。
【００２０】
任意であるが好ましくは、配列番号１の一部を含む本発明のポリヌクレオチド、はさらに、リピートトラクトまたはその相補体を含む。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、リピートトラクト、ならびにリピートトラクトの上流および下流に位置するポリヌクレオチドを含む。かかるポリヌクレオチドの上流ヌクレオチドは、配列番号１のおよそヌクレオチド１７５０１、およそヌクレオチド１７１０１、およそヌクレオチド１６７０１（順番が進むにつれて好ましい）、最も好ましくはおよそヌクレオチド１５７０１を起点とすることができる。かかるポリヌクレオチドの下流ヌクレオチドは、配列番号１のおよそヌクレオチド１８０５８、およそヌクレオチド１８４５８、およそヌクレオチド１８８５８（順番が進むにつれて好ましい）、最も好ましくはおよそヌクレオチド１９８５８を終点とすることができる。
【００２１】
本発明はまた、本明細書中でプライマーおよびプローブとも呼ばれる短いポリヌクレオチドも含む。本発明のこの態様のポリヌクレオチドは、ＺＮＦ９ゲノム配列のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその相補体を有する。好ましくは、かかるポリヌクレオチドには、リピートトラクトに隣接するイントロン１のヌクレオチド配列、エキソン２、またはそれらの相補体が含まれ、リピートトラクトのヌクレオチドおよびその相補体がさらに任意に含まれる。幾つかの実施形態では、本発明のこの態様のポリヌクレオチドとしては、配列番号１のおよそヌクレオチド１５７０１〜１６７００、配列番号１のおよそヌクレオチド１６７０１〜１７１００、配列番号１のおよそヌクレオチド１７１０１〜１７５００、配列番号１のおよそヌクレオチド１７５０１〜１７７０１、配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８０５８、配列番号１のおよそヌクレオチド１８０５９〜１８４５８、配列番号１のおよそヌクレオチド１８４５９〜１８８５８、配列番号１のおよそヌクレオチド１８８５９〜１９８５８、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、またはそれらの相補体から選択される連続するヌクレオチドが挙げられる。本発明のこの態様のポリヌクレオチドは、少なくとも約１５個の連続するヌクレオチド、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチド、少なくとも約２５個の連続するヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、少なくとも約３５０個のヌクレオチド（順番が進むにつれて好ましい）、最も好ましくは少なくとも約５００個のヌクレオチドを含む。
【００２２】
方法
疾患に関連したゲノム配列の同定により疾患の診断の改善が可能となる。本発明は、ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１における増大が筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）の疾患に関連することを開示している。増大は、本明細書中で「リピートトラクト」とも呼ばれるＴＧ／ＴＣＴＧ／ＣＣＴＧリピートトラクトで起こる。リピートトラクトは、少なくとも約１４個の連続するＴＧヌクレオチド（すなわち、ＴＧのジヌクレオチドが１４回反復）に始まり、次に少なくとも約３個の連続するＴＣＴＧヌクレオチド、続いて少なくとも４個の連続するＣＣＴＧヌクレオチドが続く。本明細書中で「危険性のない」リピートトラクトとも呼ばれる「正常」リピートトラクトは、約１７６個以下のヌクレオチド、より好ましくは１６４個以下、最も好ましくは１５４個以下のヌクレオチドを含む。ここでヌクレオチドの総数は、最初のＴＧの１番目のヌクレオチドから最後のＣＣＴＧの最後のヌクレオチドまでを計数することで決定される。４個を超える連続するＣＣＴＧヌクレオチドがリピートトラクト、好ましくは正常リピートトラクトに存在する場合、介在ＧＣＴＧおよび／またはＴＣＴＧヌクレオチドが存在してもよい。正常リピートトラクトの例を配列番号２、配列番号３、および配列番号４（図２Ｂを参照）、ならびに配列番号１のヌクレオチド１７７０２〜１７８５７に示す。正常リピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列を本明細書中では「正常対立遺伝子」と呼ぶ。本明細書中で使用する場合、ＺＮＦ９の「対立遺伝子」は、３番染色体の位置３ｑ２１上のＺＮＦ９ゲノム配列位置を占めるヌクレオチド配列の幾つかの代替的形態の１つを指す。ＺＮＦ９の２つの「正常」または「危険性のない」対立遺伝子を有する個体は、彼または彼女の一生の間にＤＭ２の症状を現すことはないだろう。このような個体を「危険性がない」とみなす。
【００２３】
ＺＮＦ９ゲノム配列の「危険性のある」リピートトラクトもまた、好ましくは約１６個の連続するＴＧヌクレオチド、次に好ましくは約９個の連続するＴＣＴＧヌクレオチド、続いて連続するＣＣＴＧヌクレオチドを含む。本明細書中で「ＣＣＴＧ反復」とも呼ばれる連続するＣＣＴＧヌクレオチド数は、少なくとも約７５個（すなわち、４個のヌクレオチドＣＣＴＧが少なくとも７５回反復）、より好ましくは少なくとも約１００個、最も好ましくは少なくとも約５００個である。典型的に、ＣＣＴＧ反復に他のヌクレオチドが存在しないことから、危険性のある対立遺伝子のＣＣＴＧ反復は中断されない。危険性のあるリピートトラクトの例を配列番号５に示す（図２Ｂを参照）。本明細書中で使用する場合、「危険性のある」とは、ＤＭ２に関連するＺＮＦ９ゲノム配列の対立遺伝子を有する個体を表す。本明細書中では、これには、少なくとも１つのＤＭ２の症状を示し得る個体、および今後少なくとも１つのＤＭ２の症状を発症し得る個体が含まれる。ＤＭ２に関連するＺＮＦ９ゲノム配列の対立遺伝子を本明細書中では「危険性のある対立遺伝子」と呼ぶ。この突然変異は優性であり、したがってＺＮＦ９の危険性のある対立遺伝子を有する個体は、彼または彼女の一生の間に少なくとも１つのＤＭ２の症状を現す可能性がある。典型的に、個体は、２つの正常対立遺伝子、または１つの正常対立遺伝子および１つの危険性のある対立遺伝子のどちらかを有する。
【００２４】
本発明は、ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１内のリピートトラクトを含むポリヌクレオチドの検出方法、ＤＭ２を発症する危険性のない個体の判別方法、およびＤＭ２に罹っているか、または発症する危険性のある個体の判別方法を含む。本発明の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡの検出を含めた、特定ポリヌクレオチドの既知の検出方法を含むことができる。例えば、リピートトラクトのすべてまたは一部を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を、プライマーを用いて使用することができる。あるいは、標識プローブを用いたサザンブロッティングハイブリダイゼーション技法を使用することができる。ポリヌクレオチド源は、ゲノムＤＮＡおよび／またはプロセシングされていないＲＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡを含む生物学的試料である。本明細書中で使用する場合、「生物学的試料」とは、例えば、血液、血漿、血清、または組織を含むが、これらに限定されない個体から得られる物質試料（固体または液体）を指す。個体は、ラット、マウス、ヒト、チンパンジー、またはゴリラ、好ましくはヒトであり得る。典型的に、リピートトラクト中のＣＣＴＧ反復数を含む、リピートトラクトヌクレオチド数は、リピートトラクトを含む検出ヌクレオチドのおおよその分子量で推量することができる。リピートトラクト中のヌクレオチド数を決定するために、核酸シーケンシングを含む他の技法も使用することができる。
【００２５】
本発明は、ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１内のリピートトラクトの少なくとも一部を含むポリヌクレオチドの検出方法を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１内の全リピートトラクトを含む。一態様では、上記方法は、個体のＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域内のヌクレオチドを増幅して、リピートトラクトを含む増幅されたポリヌクレオチドを形成し、該増幅されたポリヌクレオチドを検出することとを含む。好ましくは、ヌクレオチドはＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲでは、ポリヌクレオチド、好ましくはゲノムＤＮＡを含む生物学的試料に過剰モル濃度のプライマー対を添加する。プライマーは伸張されて相補的プライマー伸張産物を形成し、その産物は所望の増幅されたポリヌクレオチド合成用の鋳型として作用する。本明細書中で使用する場合、「プライマー対」という用語は、増幅されるポリヌクレオチド領域に隣接するように設計した２つのオリゴヌクレオチドを意味する。一方のプライマーは、増幅されるポリヌクレオチドの一方の末端にあるセンス鎖上に存在するヌクレオチドに相補的であり、もう一方のプライマーは、増幅されるポリヌクレオチドの他方の末端のアンチセンス鎖上に存在するヌクレオチドに相補的である。増幅されるポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドと呼ぶことができる。プライマーが相補的であるポリヌクレオチドのヌクレオチドを標的配列と呼ぶ。プライマーは、少なくとも約１５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約２５個のヌクレオチドを有することができる。典型的に、プライマーは、プライマーがハイブリダイズする標的配列と、少なくとも約９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、最も好ましくは約１００％の配列同一性を有する。ＰＣＲでポリヌクレオチドを増幅するための条件は、使用するプライマーのヌクレオチド配列によって様々であり、かかる条件を決定する方法は当該技術分野では日常的である。
【００２６】
ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域内のヌクレオチドを増幅することを含む方法は、ＤＭ２を発症する危険性のない個体を判別
するのに使用してもよい。この態様では、プライマー対は、リピートトラクトに隣接するプライマーを含む。第１のプライマーは、配列番号１のおよそヌクレオチド１７５０１〜１７７０１、配列番号１のおよそヌクレオチド１７１０１〜１７７０１、配列番号１のおよそヌクレオチド１６７０１〜１７７０１、最も好ましくは配列番号１のおよそヌクレオチド１５７０１〜１７７０１から選択される少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドを含む。第２のプライマーは、配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８０５８、配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８４５８、配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８８５８、最も好ましくは配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１９８５８の相補体から選択される少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、一方のプライマーは、ヌクレオチド配列ＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧ（配列番号１１）を含み、第２のプライマーは、ヌクレオチド配列ＧＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＧＡ（配列番号１０）を含む。
【００２７】
増幅後、増幅されたポリヌクレオチドのサイズを例えばゲル電気泳動により決定し、比較してもよい。増幅されたポリヌクレオチドは、染色（例えば臭化エチジウムを用いて）、または当業者に既知の適切な標識（放射性標識および非放射性標識を含む）で標識することにより可視化することができる。典型的な放射性標識としては、³³Ｐが挙げられる。非放射性標識としては、例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニンのようなリガンド、ならびにホスファターゼもしくはペルオキシダーゼのような酵素、またはルシフェリンのような化学発光物質、またはフルオレセインおよびその誘導体のような蛍光化合物が挙げられる。
【００２８】
危険性のある対立遺伝子におけるＣＣＴＧ反復の増大のサイズに起因して、ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域内のヌクレオチドを増幅するこの方法は、典型的に、危険性のある対立遺伝子由来の検出可能な増幅されたポリヌクレオチドを生じない。したがって、増幅されたポリヌクレオチドサイズの比較により２つのポリヌクレオチドの存在が示される場合、個体のリピートトラクトの両コピーが増幅されたため、個体は危険性がないとみなされる（例えば、図６Ｂのレーン１を参照）。上述のように増幅後にたった１つの増幅されたポリヌクレオチドが存在する場合、個体は危険性がないと断定することが不可能である（例えば、図６Ｂのレーン２および３を参照）。
【００２９】
増幅後に増幅されたポリヌクレオチドサイズを比較する代わりに、例えば増幅されたポリヌクレオチドの観察される分子量に基づいてリピートトラクトサイズを推論することで、あるいはリピートトラクトのヌクレオチド配列を決定することで、増幅されたポリヌクレオチドのリピートトラクトのサイズを決定してもよい。１７６個以下のヌクレオチドを有するリピートトラクトの存在、および少なくとも約７５回のＣＣＴＧ反復を有するリピートトラクトの欠如は、個体に危険性がないことを示している。少なくとも約７５回のＣＣＴＧ反復を有するリピートトラクトの存在は、個体が危険性のあることを示している。
【００３０】
あるいは、ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域内のヌクレオチドを増幅することを含む方法は、ＤＭ２に罹っているか、またはそれを発症する危険性のある個体を判別するのに使用してもよい。この態様では、プライマー対は、リピートトラクトを含まない標的配列を有する第１のプライマーを含む。第１のプライマーは、リピートトラクトの上流または下流のどちらかに位置する少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドを含む。リピートトラクトの上流にあるヌクレオチドから選択される場合、ヌクレオチドは、配列番号１のおよそヌクレオチド１７５０１〜１７７０１、配列番号１のおよそヌクレオチド１７１０１〜１７７０１、配列番号１のおよそヌクレオチド１６７０１〜１７７０１（順番が進むにつれ好ましい）、最も好ましくは配列番号１のおよそヌクレオチド１５７０１〜１７７０１である。リピートトラクトの下流にあるヌクレオチドから選択される場合、ヌクレオチドは、配列番号１のおよそヌクレチオド１７８５８〜１８０５８、配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８４５８、配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１８８５８（順番が進むにつれ好ましい）、最も好ましくは配列番号１のおよそヌクレオチド１７８５８〜１９８５８の相補体である。プライマー対の第２のプライマーは、（ＣＣＴＧ）_nまたは（ＣＡＧＧ）_n（ここで、ｎは少なくとも４、好ましくは少なくとも５である）のいずれかを含む。第２のプライマーは、リピートトラクト内の複数部位にてランダムに結合し、サイズは様々であるが、正常対立遺伝子を含有する増幅されたポリヌクレオチドよりも大きい増幅されたポリヌクレオチドを生じる。したがって、増幅されたポリヌクレオチドサイズを決定した後に、１つの増幅されたポリヌクレオチド、およびその１つの増幅されたポリヌクレオチドより大きいサイズ範囲を有する増幅されたポリヌクレオチド集団の存在は、個体が危険性のある対立遺伝子を有し、危険性があるとみなされることを示している（図６Ｄおよび実施例２を参照）。
【００３１】
任意であるが好ましくは、本発明のこの態様の第２のプライマーは、増幅効率を高めるように改変される。改変は、第２のプライマーの５’末端に存在するさらなるヌクレオチド配列を付加することを含む。かかるヌクレオチド配列を本明細書中では「ハンギングテイル」配列と呼ぶ。ハンギングテイル配列は、少なくとも約２０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２２個のヌクレオチドを含み、ヒトゲノム中の任意のヌクレオチド配列に対して無視できる相補性を有する。ハンギングテイルが、ヒトゲノム中の任意のヌクレオチド配列に対して無視できる相補性を有するかどうかは、本明細書中に記載するハイブリダイゼーション条件下でヒトゲノムとハンギングテイル配列をハイブリダイズすることで決定することができる。ハンギングテイル配列がヒトゲノムにハイブリダイズしない場合、それはヒトゲノム内の任意のヌクレオチド配列に対して無視できる相補性を有する。本発明のこの態様の第２のプライマーをこのようにして改変する場合、増幅はまた、増幅されたポリヌクレオチドに組み込まれる場合にハンギングテイルヌクレオチド配列に相補的であるようなヌクレオチド配列を有する第３のプライマーを含む。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、第１のプライマーは、ＣＬ３Ｎ５８−ＤＲ（５’−ＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧ（配列番号１１））であり、第２のプライマーは、ＪＪＰ４ＣＡＧＧ（５’−ＴＡＣＧＣＡＴＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＣＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧ（配列番号３６））であり、第３のプライマーは、ＪＪＰ３（５’−ＴＡＣＧＣＡＴＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＣＧ（配列番号３７））である。
【００３２】
ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１内のリピートトラクトを含むポリヌクレオチドの検出方法の別の態様では、ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを使用する。本明細書中で使用する場合、「ハイブリダイズする」、「ハイブリダイズ用」、および「ハイブリダイゼーション」は、プローブが標準条件下にて標的ポリヌクレオチドと非共有結合性の相互作用を形成することを意味する。標準的ハイブリダイズ用条件は、プローブを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる条件である。かかる条件は、当該技術分野で既知の技法（例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Mannual; Cold Spring Harbor Laboratory: New York (1989)を参照）を用いて、プローブと標的ポリヌクレオチドに関して容易に決定される。本発明で有用な好ましいプローブは、ハイブリダイゼーション緩衝液、好ましくはＲＡＰＩＤ−ＨＹＢ緩衝液(Amersham, Piscataway, NJ)中で、６０℃で１時間のプレハイブリダイゼーション、および６０℃で一晩のハイブリダイゼーションを使用することで、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。好ましくは、少なくとも総計４×１０⁷カウント毎分（ｃｐｍ）の標識プローブをハイブリダイゼーションに使用する。使用するプローブが少なくとも約２００個のヌクレオチドの場合、使用する洗浄条件は、２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ １Ｌは、ＮａＣｌ １７５．３ｇおよびクエン酸ナトリウム８８．２ｇを含有する、ｐＨ７．０）および０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する溶液中で室温にてそれぞれ５分間の洗浄を２回、続いて０．１５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で５２℃にてそれぞれ３０分間の洗浄を２〜３回である。プローブが少なくとも約２００個のヌクレオチドである場合に使用する他のハイブリダイゼーション条件は、上述と同じプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件を使用するが、使用する洗浄条件は、２×ＳＳＣおよび０．０５％ＳＤＳを含有する溶液中で室温にてそれぞれ５分間の洗浄を２回、続いて０．１５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で５０℃にて１５分間の洗浄を１回、次に０．１５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で５０℃にて１０分間の洗浄を１回である。使用するプローブが約２０〜約２２個のヌクレオチドである場合、上述と同じプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件を使用するが、使用する洗浄条件は、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４５℃にて１５分間の洗浄を２回である。標的ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は一般に、プローブに相補的な配列である。ハイブリダイズ用プローブは、非共有結合性の相互作用の形成を妨害しない１〜１０個の非ハイブリダイジングヌクレオチド、好ましくは５個より多くない、より好ましくは２個より多くないの非ハイブリダイジングヌクレオチドを含有してもよい。プローブの非ハイブリダイジングヌクレオチドは、ハイブリダイズ用プローブの末端に、またはその内部に位置していてもよい。したがって、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションが起こる限り、プローブは、標的ＤＮＡ配列のすべてのヌクレオチドに相補的である必要はない。プローブは、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、少なくとも約３５０個のヌクレオチド（順番が進むにつれて好ましい）、最も好ましくは少なくとも約５００個のヌクレオチドを有する。本発明のこの態様で有用な好ましいポリヌクレオチドは、ＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＡＴＧ（配列番号３８）、および配列番号１のヌクレオチド１６５０７〜１６９９２を含む。
【００３３】
本発明のこの態様の一実施形態では、上記方法は、ＤＭ２に罹っているか、または発症する危険性のある個体を判別することを含む。この方法は、ポリヌクレオチドを得るために、制限エンドヌクレアーゼで個体のゲノムＤＮＡを消化することと、検出可能に標識したプローブを用いて、ハイブリダイズ用条件下にて上記ポリヌクレオチドをプローブすることとを含む。エンドヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの消化は、当該技術分野では日常的であり、多数のエンドヌクレアーゼが知られている。好ましい制限エンドヌクレアーゼ酵素としては、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｏＢＩが挙げられる。典型的に、消化により得られるポリヌクレオチドを例えばゲル電気泳動で分画し、変性させて一本鎖ポリヌクレオチドを得て、次にハイブリダイズ用条件下でプローブにさらす。次に、ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブを検出し、続いてハイブリダイズしたポリヌクレチドサイズを決定してもよい。続いて、好ましくはリピートトラクト中のＣＣＴＧ反復数を決定することで、リピートトラクトを特徴付けてもよい。典型的に、リピートトラクト中のＣＣＴＧ反復数を含む、リピートトラクト中のヌクレオチド数は、リピートトラクトを含有する検出ポリヌクレオチドのおおよその分子量から推論することができる。少なくとも約７５回のＣＣＴＧ反復を有する１つのリピートトラクトの存在は、個体に危険性があることを示している。
【００３４】
本発明のこの態様の別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、組織試料、好ましくは筋組織または線維芽細胞、より好ましくは筋組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に使用してもよい。好ましくは、筋組織は、骨格筋である。この方法は、日常的であり、当該技術分野で既知である（例えば、Taneja et al., J. Cell. Biol., 128, 995-1002(2002)を参照）。本発明のこの態様で有用な好ましいポリヌクレオチドとしては、（ＣＡＧＧ）_n（ここで、ｎは少なくとも４、好ましくは少なくとも５である）が挙げられる。好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、蛍光標識を含む。危険性のある対立遺伝子を有する個体の細胞は、蛍光標識したポリヌクレオチドを含む多数の核を含み、一方、危険性のある対立遺伝子を有さない個体の細胞は、蛍光標識したポリヌクレオチドをむ核を含まないであろう。
【００３５】
本発明はまた、個体がＤＭ２を発症する危険性があるか否かを判別するためのキットを提供する。このキットには、少なくとも１回のアッセイに十分な量で、適切な包装材料中に上述のプライマーおよび／またはプローブが含まれる。任意に、緩衝液および溶液のような本発明を実施するのに必要な他の試薬も含まれる。包装されたポリペプチドまたはプライマー対の使用説明書も典型的に含まれる。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「包装材料」という語句は、キットの内容物を収容するのに使用される１つまたはそれ以上の物理的構造体を指す。包装材料は、既知の方法で構築され、好ましくは無菌で夾雑物を含まない環境を提供する。包装材料は、個体がＤＭ２を発症する危険性があるか否かを判別するのにポリヌクレオチドを使用することができることを示すラベルを有する。さらに、包装材料には、キット内の物質の使用方法を示す説明書が含まれる。本明細書中で使用する場合、「包装（package）」という用語は、ガラス、プラスチック、紙、フォイル等のような、プライマーおよび／またはプローブを決められた限度内で収容することが可能な固体マトリクスまたは材料を指す。したがって、例えば、パッケージは、ミリグラム量のプライマー対を入れるのに使用されるガラス製バイアルであり得る。「使用説明書」には典型的に、試薬濃度、または試薬と試料の混合すべき相対量、試薬／試料混合物の保持時間、温度、緩衝液条件等のような少なくとも１つのアッセイ方法のパラメータについて記載する具体的な表示が含まれている。
【００３７】
本発明を以下の実施例により説明する。特定の実施例、物質、量および手法は、本明細書中に記載する本発明の範囲および精神にしたがって、広範に解釈されるべきであることが理解されよう。
【００３８】
［実施例］
実施例１
筋緊張性ジストロフィー２型の分子ベースでの判別
筋緊張性ジストロフィー２型遺伝子座（近位型筋緊張性筋障害（ＰＲＯＭＭ）遺伝子座とも呼ばれる）はすでに染色体３ｑ２１に位置付けられている(Ranum et al., Nature Genet., 19, 196(1998), Day et al., Neuromuscul. Disord., 9, 19 (1999))。ポジショナルクローニングを用いて、ＤＭ２突然変異を判別した。本発明者等は、ＤＭ２／ＰＲＯＭＭ家族の成員を判別し、インフォームド・コンセントを得て、神経学的検査を実施し、血液試料を採取した。Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット＃Ｄ−５０００(Gentra Systems., Minneapolis, MN)を用いて、血液からゲノムＤＮＡを単離した。ＬＩＮＫＡＧＥコンピュータプログラムパッケージ（バージョン５．１）を用いて連鎖解析を行った(Lathrop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3443 (1984))。
【００３９】
１０個の組換え染色体を解析することで、ＤＭ２領域を２センチモルガン（ｃＭ）区間に限定した(Ranum et al., Nature genet., 19, 196 (1998))。１４個のＢＡＣにより部分的にカバーされるこの領域由来の配列データを用いて、８０個の短タンデム反復（ＳＴＲ）マーカーを開発した。配列データは、McPherson等(Nature 409, 934 (2001))からのもので、ＤＭ２領域にまたがるＢＡＣを判別し、配列タグ部位（ＳＴＳ）含量（content）マッピングにより順序付けた。その領域に位置するジ、トリおよびテトラヌクレオチド反復配列を用いて、さらなる多型ＳＴＲマーカーを開発した(McPherson et al., Nature 409, 934-41 (2001))。下記マーカー用のＰＣＲプライマーは、以下の通りである：ＣＬ３Ｎ４９（ＣＬ３Ｎ４９ Ｆ５’−ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡＴＴＴＧＴＧＴＧＣ（配列番号６）、ＣＬ３Ｎ４９ Ｒ５’−ＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＴＧＡＡＴＣ（配列番号７））、ＣＬ３Ｎ８８（ＣＬ３Ｎ８８ Ｆ５’−ＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧ（配列番号８）、ＣＬ３Ｎ８８ Ｒ５’−ＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣＧＴ（配列番号９））、ＣＬ３Ｎ５８（ＣＬ３Ｎ５８−Ｄ Ｆ５’−ＧＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＧＡ（配列番号１０）、ＣＬ３Ｎ５８−Ｄ Ｒ５’−ＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧ（配列番号１１））、ＣＬ３Ｎ５９（ＣＬ３Ｎ５９ Ｆ５’−ＧＣＴＧＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＣＡＧＧＡＡ（配列番号１２）、ＣＬ３Ｎ５９ Ｒ５’−ＡＴＴＴＧＣＣＡＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣ（配列番号１３））、ＣＬ３Ｎ８３（ＣＬ３Ｎ８３ Ｆ５’−ＧＴＧＴＧＴＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧ（配列番号１４）、ＣＬ３Ｎ８３ Ｒ５’−ＡＡＧＣＣＣＡＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＴＡ（配列番号１５））、ＣＬ３Ｎ８４（ＣＬ３Ｎ８４ Ｆ５’−ＴＣＡＴＴＣＣＣＡＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣ（配列番号１６）、ＣＬ３Ｎ８４ Ｒ５’−ＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡ（配列番号１７））、ＣＬ３Ｎ９９（ＣＬ３Ｎ９９ Ｆ５’−ＣＴＧＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＡＡＧＴ（配列番号１８）、ＣＬ３Ｎ９９ Ｒ５’−ＴＧＣＡＡＧＡＣＧＧＴＴＴＧＡＡＧＡＧＡ（配列番号１９））、ＣＬ３Ｎ９（ＣＬ３Ｎ９ Ｆ５’−ＡＧＡＣＡＣＴＣＡＡＣＣＧＣＴＧＡＣＣＴ（配列番号２０）、ＣＬ３Ｎ９ Ｒ５’−ＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ（配列番号２１））。
【００４０】
６４世帯の親子三人に連鎖不均衡解析を実施し、そこで罹患個体は、筋緊張症、筋ジストロフィー、心伝導欠陥、後虹彩白内障、および内分泌障害を含むＤＭの臨床的特徴を有していた(Harper, Myotonic Dystrophy, ed. 2, Saunders, London, (1989))が、ＤＭ１突然変異は有してなかった。ＧＥＮＥＨＵＮＴＥＲプログラム（バージョン１．０）(Kruglyak et al., Am. J. Hum. Genet., 58, 1347 (1996))を用いて実施した伝達不均衡試験（ＴＤＴ）(Spielman et al., Am. J. Hum. Genet., 52, 506 (1993))、および祖先伝来保存ハプロタイプの解析により、ＤＭ２遺伝子座がおよそ３２０キロベース（ｋｂ）に制限された（図１Ａ）。連鎖不均衡の領域にまたがる３つのＢＡＣに関するＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号は以下の通りであった：ＲＰ１１−８１４Ｌ２１（ＡＣ０２２９４４）、ＲＰ１１−７２３ｏ４（ＡＣ０２２９９３）、およびＲＰ１１−２２１ｅ２０（ＡＣ０２３５９８）。
【００４１】
ＤＭ２患者に見られる増大ＣＬ３Ｎ５８対立遺伝子
ＤＭ２による連鎖不均衡におけるマーカーの１つであるＣＬ３Ｎ５８（ｐ≦０．０００００１）が、異常分離パターンを示した。罹患個体すべてが、ＰＣＲによりホモ接合性のようであったが、罹患子は、彼等の罹患親から対立遺伝子を受け継いでいないようであった（図１ＢおよびＣ）。ゲノムＤＮＡからＤＭ２反復領域を増幅するためのＰＣＲには、２００μＭのｄＮＴＰ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．４μＭの各プライマー、および０．１Ｕ Ｔａｑを含有するＰＣＲ反応液中で、プライマーＣＬ３Ｎ５８−ＤＦ（５’−ＧＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＧＡ（配列番号１０））、およびＣＬ３Ｎ５８−ＤＲ（５’−ＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧ（配列番号１１））を使用した。反応は、３０回反復し、各サイクルは、９４℃で４５秒間、５７℃で４５秒間、７２℃で１分間であった。
【００４２】
異常分離パターンが反復増大または他の再配列により引き起こされた可能性を調査するために、サザン解析を行った。ＢｓｏＢＩで消化したゲノムＤＮＡ（５μｇ）を、１１０Ｖで４時間、０．８％アガロースゲルに流すことにより分離して、ハイボンドＮ＋膜(Amersham, Piscataway, NJ)に転写して、プライマープローブＡ Ｆ（５’−ＧＡＧＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＴＣＧ（配列番号２２））およびプローブＡ Ｒ（５’−ＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＣＡ（配列番号２３））を用いてＰＣＲにより生成し、³²Ｐ−α−デオキシアデノシン三リン酸(NEN, Boston, MA)でランダムプライム標識 (GibcoBRL, Carlsbad, CA)した４８５塩基対のＺＮＦ９プローブとハイブリダイズさせた。ＢｓｏＢＩによる部分消化を回避するために、本発明者等は、１２０μｌの消化容量中で酵素１２０Ｕを使用した。ＲＡＰＩＤ−ＨＹＢ緩衝液(Amersham, Piscataway, NJ)を用いて、６０℃で１時間、膜をプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、少なくとも総計４×１０⁷カウント毎分（ｃｐｍ）の標識プローブを用いて行い、インキュベーションは６０℃で一晩であった。洗浄条件は以下の通りであった：２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ １Ｌは、ＮａＣｌ １７５．３ｇおよびクエン酸ナトリウム８８．２ｇを含有する、ｐＨ７．０）および０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する溶液中で室温にてそれぞれ５分間の洗浄を２回、続いて０．１５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中で５２℃にてそれぞれ３０分間の洗浄を２〜３回。
【００４３】
サザン解析により、予測される正常対立遺伝子の他に、大きすぎてＰＣＲにより増幅することができない多様なサイズの増大対立遺伝子が検出され、それは罹患個体のみに見られた（図１ＢおよびＤ）。電気泳動条件の変更により、本発明者等は、１０〜４８ｋｂの増大範囲を分解することができた（図１Ｅ）。高分子量の増大をより正確にサイジングするために、ＥｃｏＲＩで消化したゲノムＤＮＡ（５μｇ）を、高分子量ＤＮＡマーカー(GibcoBRL)とともに３５Ｖで２４時間、０．４％アガロースゲルに流すことにより分離した。ＢｓｏＢＩ消化物は、バンドがより強力であり、より分離するため、ＤＭ２増大を有する個体を判別するためのスクリーニングツールとしてより有用であった。ＥｃｏＲＩ消化物は、大きな対立遺伝子を正確にサイジングするのにより良好に作用するが、多くの場合、バンドがスメアとして存在し、場合によってはあまり目立たなかった。洗浄条件は以下の通りであった：２×ＳＳＣおよび０．０５％ＳＤＳを含む溶液中で室温にてそれぞれ５分間の洗浄を２回、続いて０．１５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で５０℃にて１５分間の洗浄を１回、次に０．１５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有む溶液中で５０℃にて１０分間の洗浄を１回。
【００４４】
この増大がＤＭ２疾患プロセスに関与するかどうかを決定するために、（ｉ）６家族５１人の罹患個体（その疾患は、ＤＭ２遺伝子座に対する連鎖と密接に結びついていた）、（ｉｉ）祖先伝来の保存ＤＭ２ハロタイプを有するさらに２０世帯の家族のそれぞれから罹患個体を１人、および（ｉｉｉ）１３６０個の染色体を表す対照ゲノム試料パネルに、ＰＣＲおよびサザン解析を実施した。ＰＣＲにより、６世帯のＤＭ２家族のうちの５１人の罹患個体すべては、ホモ接合性のようであり、ＰＣＲによりたった１つだけバンドが検出できたが、続くサザン解析で増大対立遺伝子を有していた。６世帯の家族に関する疾患遺伝子座とＣＬ３Ｎ５８増大との間のΘ＝０．００での最大ロッド値は、ＭＮ１＝６．９、ＭＮ６＝１．５、ＭＮ１０＝８．２、ＭＮ１２＝２．８、Ｆ１３４＝１０．４、およびＦ０４７＝１．８であった。これらの家族に関する最大ロッド値は、疾患および増大突然変異が関連しており、したがって増大突然変異はＤＭ２の原因であるという強固な証拠を提供する。サザン解析によって検出された増大対立遺伝子は、祖先伝来の保存ＤＭ２ハロタイプを有するさらに２０世帯の家族すべての罹患代表者にも見られた。ＰＣＲおよびサザン解析により、増大を有する対照試料は判別されなかった。未関連の対照ＤＮＡ試料には、Centre d'Etude du Polymorphisme Humain（ＣＥＰＨ）の４０世帯の家族パネル由来の祖父母、筋ジストロフィーまたは運動失調と診断された患者の配偶者、および運動失調患者が含まれていた（ｎ＝１３６０個の染色体）。
【００４５】
ＤＭ２罹患対立遺伝子および正常対立遺伝子の解析
ＣＬ３Ｎ５８マーカーの配列は、複合反復モチーフ（ＴＧ）_n（ＴＣＴＧ）_n（ＣＣＴＧ）_nを含んでいた。本発明者等の対照群において、（ＴＧ）_n（ＴＣＴＧ）_n（ＣＣＴＧ）_nリピートトラクトのサイズは、１０４〜１７６ｂｐの範囲であった（ヘテロ接合性＝０．８９）（図２Ａ）。８個の正常対立遺伝子を上述のようにゲノムＤＮＡから増幅し、ＴＯＰＯクローニングキット(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてクローニングし、配列決定した。これら正常対立遺伝子すべてが、ＧＣＴＧおよびＴＣＴＧモチーフの両方、または１つまたはもしくは２つのＴＣＴＧモチーフが中断したＣＣＴＧリピートトラクトを有していた（図２Ｂ）。最大の正常対立遺伝子中のリピートトラクト（１７６ｂｐの複合ＴＧ／ＴＣＴＧ／ＣＣＴＧ反復）を配列決定し、２つの中断を有する２６個のＣＣＴＧ反復を含むことを示した。３５回（９４℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、７２℃で１分間）サイクルのＰＣＲ反応（２００μＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）、１４ｍＭの（ＮＨ₄）ＳＯ₄、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．４μＭの各プライマー、０．１％ツイーン−２０、１０％ジメチルスルホキシド、ＰｒｏｏｆＳｐｒｉｎｔｅｒ酵素(Hybaid-AGS, Ashford, Middlesex, UK)０．７５Ｕ）で、ＣＬ３Ｎ５８−Ｂ Ｆ（５’−ＴＧＡＧＣＣＧＧＡＡＴＣＡＴＡＣＣＡＧＴ（配列番号２４））、およびＣＬ３Ｎ５８−Ｄ Ｒを用いて、小さな増大対立遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅した。これらの増大もまたＴＯＰＯクローニングキットを用いてクローニングし、配列決定し、リピートトラクトのＣＣＴＧ部分が増大していることが実証された。対照試料由来の対立遺伝子と比較して、増大対立遺伝子上のＣＣＴＧリピートトラクトは中断されていなかった。配列決定した増大と一致して、ＣＣＴＧリピートトラクトの伸長が分子量増加の原因となると仮定して、サザン解析により非常に大きな対立遺伝子の増大サイズを推定した。増大対立遺伝子サイズの範囲は極めて広範囲であり、平均約５０００回の約７５〜１１，０００回のＣＣＴＧ反復を有していた（図２Ｃ）。
血液中に複数の対立遺伝子サイズを有する個体では、より短い増大が見られた。
【００４６】
ＤＭ２増大の不安定性
罹患患者の約２５％に、血液から単離したＤＮＡ中に２〜４個のバンドが観察され、様々なサイズの増大対立遺伝子を表した（図３Ａ、表１）。サイズによって分離しているバンドもあれば、ゲルの先端部で分解されない圧縮バンドとして出現するものもあれば、広範囲の分子量を示すものもあった。体細胞不安定性のさらなる例には、劇的に異なる増大対立遺伝子（１３ｋｂおよび２４ｋｂ）を有する、１組の遺伝的に確認された（ｐ≦０．００１）一卵性双生児（３１歳）が含まれた（図３Ｂ）。図３Ｂに記載した双生児が一卵性であることを確認するために、種々の染色体（Ｄ３Ｓ３６８４、ＳＣＡ１（ＣＡＧ−ａ＆ＣＡＧ−ｂ、Orr et al., Nature Genet., 4, 211-226 (1993)）、ＳＣＡ２（ＳＣＡ２−Ａ＆ＳＣＡ２−Ｂ、Pulst et al., Nature Genet, 269-276 (1996)）、ＳＣＡ３（ＭＪＤ５２＆ＭＪＤ２５、Kawaguchi et al., Nature Genet., 8, 221-228 (1994)）、ＳＣＡ６（Ｓ−５−Ｆ１＆Ｓ−５−Ｒ１、Zhuchenko et al., Nature Genet., 15, 62-69 (1997)）、ＳＣＡ８（ＳＣＡ８Ｆ３＆ＳＣＡ８ Ｒ２、Koob et al., Nature Genet., 21, 379-84（1999））由来の６個のＳＴＲマーカー、性別、および疾患状態にベイズの統計を使用した（ｐ＞０．００１）。ハプロタイプを確立するために、親および双生児の両方からのＤＮＡを使用した。体細胞不安定性のさらなる例には、罹患個体由来のリンパ球ＤＮＡの増大サイズが献血の間の３年の間隔中に約２ｋｂほどサイズが増加したという観察が含まれ（図３Ｃ）、血液試料を提供した時点での罹患個体の年齢には、増大サイズと
直接相関関係があった（ｒ＝０．４１、ｒ²＝０．１７、ｐ＝０．００８）（図３Ｄ）。罹患子の血中の増大サイズは、通常その親よりも短く、反復サイズの時間依存的体細胞変化は、この差の解釈を複雑にする（表１）。発症年齢および増大サイズとの間に有意な相関関係は観察されなかった。
【００４７】
【表１】

【００４８】
ＺＮＦ９ゲノム配列の構築
ＤＭ２増大（ＣＬ３Ｎ５８）は、利用可能な配列が完全に順序付けられていないゲノム領域に位置していた。ＤＭ２増大の位置を決定するために、ＢＡＣ ＲＰ１１−８１４Ｌ２１の一部を配列決定して、不完全な配列コンティグを構築した。以下のプライマー：７７ ３’（５’ＣＣＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＡＴＣＣＧＡＣＴ（配列番号２５））、６６ ３’（５’−ＴＧＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＧＡＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＣＡ（配列番号２６））、６６Ｂ ３’（５’−ＡＡＧＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＴＡＧＡＡ（配列番号２７））、３９−５’（５’−ＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣ（配列番号２８））、５２ ３’（５’−ＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＧＡＡＴＴＴＣＡ（配列番号２９））、５２ ５’（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣ（配列番号３０））、５９ ５’（５’−ＴＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣ（配列番号３１））、５９Ｂ ３’（５’−ＴＧＡＡＴＴＴＡＣＴＡＡＧＧＣＣＣＴＴＣＣＡ（配列番号３２））、および５９Ｃ ３’（５’−ＧＴＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣ（配列番号３３））を用いて、既知の配列コンティグの末端から配列決定することで、ＢＡＣ ＲＰ１１−８１４Ｌ２１（ＡＣ０２２９４４）由来の順序付けていない配列コンティグを関連付けた。これらの関連性は、Celera由来の配列とのオーバーラップによっても確証した（ｘ２ＨＴＢＫＵＡＤ８Ｃ）(Venter et al., Science 291, 1304-51(2001))。
【００４９】
Human Genome Project(McPherson et al., Nature 409, 934 (2001))からの本発明者等の配列決定データおよび配列は、細胞核酸結合タンパク質遺伝子とも呼ばれるジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）遺伝子のイントロン１に増大が位置することを示している（図４Ａ）。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号は、以下の通りである：ＤＭ２領域のゲノム配列（ＡＦ３８９８８６、ＡＦ３８９８８７）、ＣＬ３Ｎ５８配列（ＡＦ３８８５２５）、増大ＣＬ３Ｎ５８配列（ＡＦ３８８５２６）、ＺＮＦ９ ｍＲＮＡ（Ｍ２８３７２）、オリジナルＺＮＦ９ゲノム配列（Ｕ１９７６５）。ＺＮＦ９にオーバーラップするコンティグに関するCeleraアクセッション番号はｘ２ＨＴＢＫＵＡＤ８Ｃである。
【００５０】
ＺＮＦ９は、７つのジンクフィンガードメインを含有し、ＲＮＡ結合タンパク質であると考えられている(Rajavashisth et al., Science 245, 640(1989), Pellizzoni et al., J. Mol. Biol., 267, 264 (1997))。ＺＮＦ９に関して初めて報告されたゲノム配列(Pellizzoni et al, J. Mol. Biol., 281, 593 (1998))は、ＣＬ３Ｎ５８マーカーを含んでいなかったが、増大位置を確認するために、本発明者等は、さらなる配列を生成し、Celera由来の配列を使用し(Flink et al., Gene 163, 279 (1995))、サザンおよびＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。ＺＮＦ９遺伝子のゲノム組織を確認するために、プライマーＺＮＦ９−Ｅ５ Ｆ（５’−ＧＴＡＧＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡ（配列番号３４））およびＺＮＦ９−Ｅ５ Ｒ（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＴＣＴＧＡＣＴＣ（配列番号３５）（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターには下線を付記）を用いたＰＣＲにより生成したエキソン５プローブと、ＮｓｉＩで消化したゲノムＤＮＡ（５μｇ）とをハイブリダイズさせた。
【００５１】
ノーザン解析により、ＺＮＦ９ ＲＮＡの発現を種々の組織中で評価した。脳、心臓、筋肉、結腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺および末梢血白血球（ＰＢＬ）由来の組織を含むヒト複数組織ノーザンブロット(Clontech, Palo Alto, CA)を、ＵｌｔｒａＨｙｂハイブリダイゼーション緩衝液(Ambion, Austin, TX)中で６８℃で、ＺＮＦ９のエキソン５を含む４２３ｂｐのリボプローブとハイブリダイズさせた（図５、上部パネル）。上述のように、プライマーＺＮＦ９−Ｅ５ ＦおよびＺＮＦ９−Ｅ５ Ｒを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ産物を生成し、Ｍａｘｉｓｃｒｉｐｔキット(Ambion)を用いて、リボプローブに³²Ｐ−（α）−デオキシシトシン三リン酸(ICN, Costa Mesa, CA)を組み込むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に使用した。ＺＮＦ９転写物は、広範に発現され、ＤＭ２で顕著に冒される２つの組織である心臓および骨格筋で最も多いことがわかった。
【００５２】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＤＭ１細胞中のＣＵＧ増大を含有する核内フォーカスを検出するのに使用されてきた(Taneja et al., J. Cell Biol., 128, 995 (1995))。ＤＭ２も増大モチーフにより引き起こされるので、同様の反復含有核内フォーカスがＤＭ２中に見出されるかどうかを決定するために、本発明者等は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。簡潔に述べると、筋肉切片のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション(Reddy et al., Nature Genet., 13, 325 (1996)に、本発明者等は、Ｃｙ３で５’標識した０．２ｎｇ／μｌの２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチド(IDT, Coralville, Iowa)を使用した。（ＣＡＧＧ）_n、（ＣＣＵＧ）_n、および（ＣＡＧ）_nオリゴヌクレオチドはすべて、２０塩基長であった。ＳｐｏｔＣＣＤカメラを装備したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡(Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan)を用いて蛍光を可視化した。ＤＭ２／ＣＡＧＧスライドを用いて適切な露光時間を算定し、この露光設定を用いて他のプローブを撮影した。
【００５３】
蛍光標識した、ＣＣＵＧ反復に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを、対照、ＤＭ２、およびＤＭ１筋肉生検組織にハイブリダイズさせた。ＤＭ２筋肉生検材料は、３ｑに関連したＭＮ１家族の罹患成員（ＬＯＤ＝６．９）からものもので、サザン解析により検出されるＣＣＴＧ増大を有していた。同様に、ＤＭ１組織は、遺伝的に確認したＤＭ１患者から採取した。多くの強烈なＣＣＵＧ含有核内フォーカスがＤＭ２では観察されたが、対照筋肉では観察されなかった。ＤＭ２筋肉では、核１つ当たり１〜５個のフォーカスが見られたが、細胞質には１つもフォーカスは検出されなかった。一般に、ＤＭ１筋肉中のＣＵＧ増大に対するアンチセンスプローブを用いて見られた場合よりも、ＤＭ２にて、核１つ当たりより多くのフォーカスが見られた。センスＣＣＵＧプローブは核内フォーカスを示さず、プローブがＲＮＡにハイブリダイズするが、ＤＮＡにはハイブリダイズしないことを示した。本発明者等の結果により、ＣＣＴＧ増大が発現されるが、ＲＮＡフォーカスがプロセシングされていないＺＮＦ９転写物全体を含むかどうかはいまだにわかっていないことが示される。アンチセンスＣＣＵＧプローブは、ＤＭ１筋肉において核内フォーカスを示さなかった。ＣＵＧ反復に対するアンチセンスプローブもＤＭ２筋肉にてフォーカスにハイブリダイズするが、このシグナルは、非常に大きなＣＣＵＧリピートトラクト（１１，０００回の反復）に対する非特異的クロスハイブリダイゼーションによって引き起こされたと本発明者等は考える。
【００５４】
考察
これらの結果から、ＤＭ２が非翻訳ＣＣＴＧ増大により引き起こされることが実証される。ＤＭ２は、ＤＭ１に対して顕著な臨床的類似性を示すが、ＤＭ２の疾患進行は通常はより良性である。これらの疾患間の臨床的類似および分子学的類似は、ＲＮＡレベルで発現されるＣＵＧおよびＣＣＵＧ増大自体が病原となり、ＤＭ１とＤＭ２に共通の多臓器性の特徴を引き起こし得ることを示している。ＤＭ１およびＤＭ２反復モチーフの類似性、および増大がＲＮＡフォーカスとして蓄積する事実を考慮すると、ＤＭ２ ＣＵＧ増大に結合するＲＮＡ結合タンパク質は、ＤＭ２ ＣＣＵＧ増大にも結合して、ＲＮＡスプライシングおよび細胞代謝において類似の全体的な崩壊を引き起こし得る(Timchenko et al., Nucleic Acids Res., 24, 4407 (1996), Lu et al., Hum. Mol. Genet., 8, 53 (1999), Miller et al, EMBO J., 19, 4439 (2000))。これらのタンパク質のうちの１つが、ＵＧジヌクレオチドに対する優先的親和性を有することを示した(Takahashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 277, 518 (2000))が、それはＤＭ１およびＤＭ２増大の両方で見い出される。これらの同じＲＮＡ結合タンパク質がＤＭ２病因に関与する場合、ＣＣＵＧリピートトラクトに対するこれらのタンパク質の親和性はそれほど強力でないため、より長いＣＣＵＧリピートトラクトは中程度のＤＭ２表現型を引き起こすと推測することができる。あるいは、異なる組のＲＮＡ結合タンパク質がＣＣＵＧ増大に結合してもよい。
【００５５】
ＤＭ２は、そのそれぞれの遺伝子の転写されたが、非翻訳の部分に位置するミクロサテライト増大により引き起こされる優性疾患の第４の例である。分子レベルで、ＣＣＴＧ ＤＭ２増大は、ＤＭ１(Groenen et al., Bioessays 20, 901 (1998), Tapscott, Science 289, 1701 (2000))、およびＳＣＡ８(Koob et al., Nature Genet., 21, 379 (1999))の両方に関与した非翻訳ＣＴＧ増大、ならびにＳＣＡ１０(Matsuura et al., Nature Genet., 26, 191 (2000))におけるＡＴＴＣＴ増大に類似している。ＤＭ２テトラヌクレオチドおよびＳＣＡ１０ペンタヌクレオチド増大は一般に、三重反復疾患に関連した増大よりも長く、最大のＤＭ２およびＳＣＡ１０反復は、それぞれ１１，０００以上および４，５００の反復と推定される。
【００５６】
ＤＭ２における反復不安定性は、増大の複合反復モチーフ（ＴＧ）_n（ＴＣＴＧ）_n（ＣＣＴＧ）_n、および時間依存的体細胞不安定性により複雑である。類似の体細胞不安定性がＤＭ１およびＦＭＲ１に見られる(Wong et al., Am. J. Hum. Genet. 56, 114 (1995), Moutou et al., Hum. Mol. Genet. 6, 971 (1997), Helderman-van den Enden et al., J. Med. Genet. 36, 253 (1999), Lopez de Munain et al., Ann. Neurol. 35, 374 (1994))ものの、ＤＭ２に関するサイズ差はずっと大きく、１人の罹患個体の血液中で最大９０００回の反復を有し得る。ＤＭ２／ＰＲＯＭＭ家族において臨床的予測が報告されている(Schneider et al., Neurol., 55, 383 (2000))。
【００５７】
実施例２
反復アッセイ
多くの場合、増大対立遺伝子は大きすぎて、ＰＣＲで増幅することができない（図５Ａ、および上記実施例１）。罹患患個体はすべて、ＰＣＲによりホモ接合性のようであり（図５Ａ レーン２および３）、罹患子は多くの場合、彼等の罹患親由来の対立遺伝子を受け継いでないようである。幾つかの正常体はＤＭ２ヘミ接合体と区別することができない真のホモ接合体であり得るため、場合によっては、ＣＬ３Ｎ５８ ＰＣＲは、ＤＭ２増大に関して最も確実な試験ではない。サザンブロット解析は、罹患個体中の増大対立遺伝子の存在を検出し、また任意の非罹患ホモ接合体中の任意の増大の欠如を確認するのに使用することができる。しかしながら、場合によっては、サザンブロット解析により増大の可視化が困難であり得る。ＳＣＡ８のような他の増大疾患（図５Ｂ、レーン８）に見られるように、正常対立遺伝子と増大対立遺伝子との間の強度に１：１の相関関係は存在しない（図５Ｂ、レーン１〜４）ことに留意されたい。時には、増大対立遺伝子（複数可）は、バックグランドと区別できないほど、正常対立遺伝子よりも相当弱く出現し得る（図５Ｂ レーン６および７）。
【００５８】
サザンブロット解析が陰性または決定的でないような個体からのＤＭ２増大の存在を検出するために、ＤＭ１およびＳＣＡ１０反復増大の検出用に、Warner等(J. Med. Genet., 33, 1022-1-26 (1996))、ならびにMatsuuraおよびAshizawa(Ann. Neurol., 51, 271-272 (2002))により開発されたＰＣＲ版を改変することで、リピートアッセイまたは反復アッセイ（ＲＡ）と呼ばれるさらなるアッセイを開発した。このアッセイは、ＤＭ２増大の有無を信頼性高く判別することができるが、任意の検出増大のサイズを決定することはできない。
【００５９】
プライマーＣＬ３Ｎ５８−Ｄ Ｒ（５’−ＧＧＣＣＴＴＡＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧ（配列番号１１））、ＪＪＰ４ＣＡＧＧ（５’−ＴＡＣＧＣＡＴＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＣＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧ（配列番号３６））、およびＪＪＰ３（５’−ＴＡＣＧＣＡＴＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＣＧ（配列番号３７））を用いて、ゲノムＤＮＡからＤＭ２反復領域（ＴＧ／ＴＣＴＧ／ＣＣＴＧ）を増幅した。ＣＬ３Ｎ５８−Ｄ Ｒは、ＴＧ／ＴＣＴＧ／ＣＣＴＧリピートトラクトの上流にある特有の配列に結合する。ＪＪＰ４ＣＡＧＧは、任意の既知のヒト配列に対して無視できる相補性を有する５’ハンギングテイル配列を有する反復配列から構成されている。ＪＪＰ４ＣＡＧＧの反復部分は、増大ＣＣＴＧ領域内の複数部位にランダムに結合し、スメアとして可視化される様々なサイズのＰＣＲ産物を生じるであろう。ＪＪＰ３は、ＰＣＲ産物に組み込まれるとＪＪＰ４ＣＡＧＧのハンギングテイル配列に相補的であり、ＰＣＲ反応のエラー強さを高めるのに使用した。最適な増幅は、以下の緩衝液成分：（２００μＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ９．１）、１４ｍＭの（ＮＨ₄）ＳＯ₄、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．４μＭの各プライマー、０．１％ ツイーン−２０、１０％ ＤＭＳＯ、ＰｒｏｏｆＳｐｒｉｎｔｅｒ酵素(Hybaid-AGS)０．７５Ｕ）を有するＰＣＲ反応液２５μｌを用いて見出された。ＰＣＲ条件は、９５℃で１５分間の初期変性、３５回のＰＣＲサイクル（９４℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、７２℃で２分間）、および７２℃での１０分間のさらなる伸長から構成されていた。６×ローディング色素５μｌをＰＣＲ産物に添加して、２５μｌを１００ｍｌ当たり１μｌの臭化エチジウム溶液（１０μｇ／μｌ）を含む１％アガロースゲル上に載せて、１５０Ｖで４５分〜１時間流した。ゲルをハイボンドＮ＋膜(Amersham, Piscataway, NJ)に転写して、製造業者の説明書に従ってＲａｐｉｄ−Ｈｙｂ緩衝液(Amersham, Piscataway, NJ)を用いて、³³Ｐ−γ−ｄＡＴＰで末端標識した内部プライマーＣＬ３Ｎ５８Ｅ−Ｒ（５’−ＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＡＴＧ（配列番号３８））プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４５℃にて膜を洗浄し、Ｘ線フィルムに感光させた。
【００６０】
実施例３
１３３世帯の家族中のＤＭ２：ＤＭ１と共通する臨床的特徴は、ＣＵＧ／ＣＣＵＧ ＲＮＡ増大の病原的影響が多臓器性であることを実証する。
方法
家族の判別および臨床的研究
ＤＭ２またはＰＲＯＭＭの臨床的診断を有し、かつＤＭ１増大を伴わない被験体を、障害の危険性ある参加可能な家族の成員すべて、および罹患した子または危険性ある子を有する配偶者とともに研究に参加させた。ＣＣＴＧ ＤＭ２増大を有する被験体に対する見解を報告する。
【００６１】
疾患の理解が進歩するに従って含まれた追加の試験と共に、１０年以上の間にわたって研究を行った。被験体と面談し、臨床学的設定およびコミュニティ設定の両方で検査した。Nicollet and Dantec/Medtronikの筋電図検査用装置を含むポータブル筋電図検査用装置を用いて、電気生理学的評価を行った。直接的な検眼鏡検査法でその場での眼科的検査を実施し、数人の個体にはさらに、眼科診療室での細隙灯検査を行った。報告されたほとんどの結果について、筋生検材料を迅速に凍結し、切片とし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、異なるｐＨ値でのＡＴＰ分解酵素染色により線維型を判別した。臨床的結果は、各特定の特徴に関して試験した個体のパーセントで報告する。
【００６２】
遺伝的方法
ＤＭ２ ＣＣＴＧ反復にわたるＣＬ３Ｎ５８ＰＣＲ増幅、およびサザン解析を実施例１に記載するように行った。反復アッセイを実施例２に記載するように実施した。
【００６３】
結果
患者集団
本発明者等は、１３３のドイツおよびミネソタ州の家族からのＤＭ２を有すると遺伝的に診断された３５２人の被験体について研究した。たいていの家族は、罹患祖先を、ドイツまたはポーランドにさかのぼることができ、すべてが、ヨーロッパ系統であった。研究に関わった、疾患の危険性のある３３２人の男性および４２０人の女性のうち、１４７人の男性および２０８人の女性がＤＭ２増大に関して陽性であった。関係者の年齢は、８〜８５歳であり、平均年齢は４７歳であった。
【００６４】
ＤＭ２患者の臨床的特徴
筋肉の症状と徴候。ＤＭ１と同様に、筋緊張症および筋肉虚弱が、すべての年齢のＤＭ２被験体に報告された最も共通した症状である（表２）。同様に、首の屈曲、親指または指の屈曲、および肘の伸長を冒すＤＭ１における筋肉虚弱の特徴的なパターンがＤＭ２にも存在する(Harper et al., Neurology, 56, 336-340 (2001)）。ＤＭ１の特徴である顔面および足関節の背屈筋の虚弱は、ＤＭ２被験体では低度で存在した。ＤＭ２またはＰＲＯＭＭを患う被験体は、５０歳を過ぎると頻繁に症候性虚弱を発症し、しゃがんだ位置から立ち上がるのが困難であると訴え始めた。ほとんどのＤＭ２／ＰＲＯＭＭ被験体が医療配慮を求める理由は、股関節部の屈曲の虚弱であるが、ＤＭ１では、多くの場合、患者が他の問題に関する医学的援助を求めた後に、それが発症する。ＤＭ２に一般的である筋肉疼痛は、ＤＭ１においても一般的であるが、あまり認識されない。２１〜３４歳の年齢のＤＭ２患者では、３６％のみが虚弱を訴えたが、検査をすると、虚弱は５９％で実証された。
【００６５】
【表２】

【００６６】
筋生検。４２人のＤＭ２患者由来の筋生検は、日常的な研究ではＤＭ１生検と区別することはできず、中心に位置する核を有する線維（それは時には連鎖して生じる）、時には群を成して生じる角張った萎縮性線維、重度萎縮性（「核袋」）線維、肥厚性線維、不定期の壊死線維、繊維症および脂肪堆積を高い割合で伴った。線維型分布の一貫した異常性は見られず、２つの生検で、少し１型優勢であり、２つの生検で、少し２型が優勢であった。ＡＴＰ分解酵素染色により決定される両線維型の角張った萎縮性線維が、ほとんどの生検で明らかであった。
【００６７】
白内障。後嚢下虹彩白内障は、ＤＭ１患者とＤＭ２患者とで一致していた。２８〜７４歳の範囲の年齢の７５人の個体で、白内障を摘出する必要があった。２１歳以下の１０人の遺伝的に陽性の被験体では、２人に白内障が存在したが、これは、疾患の顕著なそして初期の特徴を示していた。ＤＭ１では、検眼鏡検査により明らかとなる白内障は典型的に、３０代〜５０代で発症し、２０代では生じる割合は小さい。
【００６８】
心臓の特徴。ＤＭ２患者では、心臓病には、頻繁な動悸、間欠性頻拍、および突発性失神が含まれる。これらの症状は、ＤＭ１およびＤＭ２の両方に存在し、年齢とともに頻度が増す（表２）。心伝導異常（房室ブロックまたは心室内ブロックのいずれか）は、ＤＭ２患者の２０％（９／４４）に見られた。伝導異常は、ＤＭ１でより頻繁であるが、いずれかの疾患を有する患者は、予想外の致命的な不整脈を発症し得る。消耗性で生死に関わる状態である心筋症は、５０歳以上のＤＭ２患者の７％に見られ、それはＤＭ１ではあまり報告されていない。
【００６９】
全身の変化。筋緊張性ジストロフィーの目立った特徴は、ほとんどすべての器官系の特異体質関与である。ＤＭ１の広範な臨床的呈示を含む特徴の多くは、ＤＭ２で反映される。１５０人の患者からの研究室結果により、血清ＣＫの増加（典型的に正常値の上限の５倍未満）、およびＧＧＴの増加が示された。２０人の患者に対するさらなる血清学的検査により、低ＩｇＧおよびＩｇＭが示されたが、ＩｇＡは正常であった。ＤＭ１と同様に、主な男性生殖機能不全の証拠が、ＦＳＨ増加、低または低〜正常テストステロンレベルとともに、男性の大部分に存在し、数人の男性では、精子過少症の証拠が見られた。血中グルコースレベルから、２３％が糖尿病であることがわかった（ｎ＝７９）。定石の糖負荷試験により、インスリン非感受性が示された（基底インスリンレベルの増加、またはインスリン増加の持続、ｎ＝１６）。ＤＭ２患者の２０〜３０％で報告される年齢非依存性多汗症は、ＤＭ１にも見られ、早期発症性男性前頭面脱毛は両方の疾患に共通している。
【００７０】
発症年齢。初期ＤＭ２症状は、年齢８〜６７歳から発生し、平均発症年齢は４８歳であると報告された。２１歳未満の個体については通常研究には登録していなかったが、１２人のかかる遺伝的に罹患した個体での報告の解析により、筋肉疼痛、筋緊張症、および多汗症の報告が示され、虚弱、心臓の症状、糖尿病または白内障による視覚障害は見られなかった。重度の先天型のＤＭ２は観察されなかった。
【００７１】
遺伝的および分子的特徴
診断方法および不安定性。ＤＭ２増大の無比のサイズおよび体細胞不安定性は、分子的検査、および遺伝的試験結果の解釈を複雑にする(図６）。ＤＭ２遺伝子座は、複合反復モチーフ（ＴＧ）_n（ＴＣＴＧ）_n（ＣＣＴＧ）_nを含有し、罹患した対立遺伝子ではＣＣＴＧ部分が増大している。増大対立遺伝子はあまりに大きすぎて、ＰＣＲで増幅することはできず、罹患患者をすべてホモ接合性であるかのように見せ（図６Ｂ、レーン２および３）、したがって真のホモ接合性である非罹患対照の１５％と区別することができない。罹患子は多くの場合、彼等の罹患親から対立遺伝子を受け継がないようなので、家族研究により、真のホモ接合性を増大保因者と区別することができる（図６Ｂ、レーン１〜３）。本発明者等は、増大対立遺伝子が増幅することができないことによる、この見かけの非メンデル遺伝パターンを、「ブランク対立遺伝子」の存在と呼ぶ。ブランク対立遺伝子の実証は、家族がＤＭ２増大を保有するが、それはまた非父性に起因して生じ得るという強力な証拠を提供する。
【００７２】
他の増大障害では、サザン解析（図６Ｃ）により、大きすぎてＰＣＲでは増幅することができない増大の存在を信頼性高く確認することができる。ＤＭ２反復の無比のサイズ（１１，０００回を超えるＣＣＴＧ反復）および体細胞不安定性のため、ゲノムサザンでは、既知の保因者において増大の２６％を検出することができない。検出される場合の増大対立遺伝子は、単一の分離したバンド、複数バンド、またはスメアとして出現することができる（図６Ｂ）。ＳＣＡ８（図６Ｄ、レーン８）のような他の増大障害（ここでは、増大対立遺伝子および正常対立遺伝子が等しい強度である）と比較して、検出可能なＤＭ２増大はほとんどが、常に正常対立遺伝子より強度が弱い。この強度差は、増大遺伝子の一部が別個の明らかなバンドをもたらす場合でさえも、増大対立遺伝子の残りは、サイズが著しく多様であり、拡散性の検出不可能なスメアを生じることを示している。
【００７３】
サザンブロットが決定的でない個体におけるＤＭ２増大の存在を検出するために、実施例２に記載した反復アッセイ（ＲＡ）を使用した。延長ＣＣＴＧリピートトラクト内の複数部位にハイブリダイズし、準備する（primes from）ＰＣＲプライマーを使用することで、このアッセイにより、ＤＭ２増大の有無が信頼性高く判別された。特異性を保証するために、ＰＣＲ産物をナイロン膜に転写して、内部オリゴヌクレオチドプローブでプローブした。プローブを使用すると、３２０個の対照染色体には偽陽性は見られなかった。対照的に、内部プローブを用いずに直接ＰＣＲ産物を可視化すると、５％の偽陽性が見られた。表３に詳述するように、ＤＭ２反復アッセイは、ＤＭ２増大を判別するための高感度でかつ特異的な方法であり、ゲノムサザン解析単独での７４％の検出割合を、両方法を用いると９９％に増加させる。試験試料すべてのうち３５２人の個体が、１３３世帯の家族から判別されたもので、サザンおよび／またはＲＡ解析により遺伝的に確認された。
【００７４】
【表３】

【００７５】
サザン解析で単一バンドを有する個体に関する発病の様々な尺度と反復サイズの相関関係を図８に示す。反復サイズ対初期症状の発症年齢（ｎ＝９１）については、正の相関関係ｒ＝０．２８が見られた（ｐ＝４．２×１０^-3、ｒ²＝０．０８）。反復サイズ対虚弱の発症年齢（ｎ＝５９）については、ｒ＝０．５３の正の相関係数が得られた（ｐ＝８．７×１０^-6、ｒ²＝０．２８）。反復サイズと白内障摘出年齢との間には有意な相関関係は観察されなかった（ｎ＝２９）。反復長と発症年齢、ならびに反復長と虚弱の発症との間の正の相関関係は、他のミクロサテライト増大障害すべてにおいて、より大きな増大は、より早期の発症年齢と関連することから、驚くべきことであった。年齢に伴うＣＣＴＧリピートトラクトの増加でこれらの正の相関を説明することができるかどうかを決定するために、多変量解析を実行し、反復長に対する年齢の影響が、症状の発症に対する反復長の見かけの影響の９８％を超えることを説明することを示した。
【００７６】
体細胞不安定性および年齢に伴う反復長の増加により複雑ではあるが、本発明者等は、サザン解析で親と子の両方が単一バンドを有する個体サブセットからの１９人の罹患親子ペアの反復長を比較した（図９Ａ）。驚くべきことに、本発明者等は、平均変化−１３Ｋｂ（−３２５０回のＣＣＴＧ反復）の、１９個の伝達のうち１６個において反復長の明らかな減少を観察した。ある例では、反復サイズは、罹患子では３８Ｋｂ小さかった（−９５００回のＣＣＴＧ反復）。２つの伝達では明らかなサイズ増加が見られた（＋８および１３Ｋｂ）。男性伝達と女性伝達では、世代間変化の度合いまたは傾向の差は見なれなかった。反復長におけるこれらの明らかな世代間変化は、任意の他のミクロサテライト障害よりもＰＭ２において相当大きい（図９Ｂ）
【００７７】
不安定性の系統例
図６Ｅに示す系統は、ＤＭ２家族において典型的な診断的難問および反復不安定性タイプを示す。世代間の反復サイズは、劇的に多様であり得る。例えば、ＩＩＩ−７の個体は、彼女の罹患親よりも小さな増大を有し、彼女の子の１人においてはより大きく、別の子においてはより小さい。体細胞不安定性は、１１ｋｂ（２７５０回のＣＣＴＧ）だけサイズが異なる増大サイズを伴う一卵性双生児ＩＩＩ−１およびＩＩＩ−２で顕著に説明される。家族の成員には、単一の別個の増大、複数の増大、および拡散性のバンドを有するものもいる。反復アッセイの利用例は、ＲＡ陽性であるが、サザン解析で陰性であった個体ＩＩ−５により実証される。
【００７８】
考察
臨床的特徴
この研究は、ＤＭ１とＤＭ２に共通の広範な特異体質的特徴を詳述し、疾患の病因におけるＣＵＧおよびＣＣＵＧ ＲＮＡ増大の多臓器性効果を実証する。ＤＭ２は、成人発症性ＤＭ１と密接に類似し、進行性虚弱、筋緊張症、疾患特異的筋組織学、不整脈、虹彩白内障、男性生殖機能不全、早期発症性脱毛、インスリン非感受性、および低ガンマグロブリン血症を含む非常に多くの共通の特徴を伴う。ＤＭ１およびＤＭ２の両方におけるこれらの外見上関連のない特徴の存在は、共通の病原メカニズムが両方の障害の原因となる可能性が高いことを示している。
【００７９】
ＤＭ２および成人発症性ＤＭ１の顕著な類似性にもかかわらず、違いが存在する。１つの明らかな相違点は、先天型のＤＭ２がないことである。ＤＭ２の他の差異としては、精神遅滞が明らかにないこと、明らかな中枢性過眠症が少ないこと、重度の遠位型虚弱、および顕著な筋萎縮症が挙げられる。ＤＭ１個体は、多くの場合、精神遅滞または無力性遠位型虚弱および筋緊張症のために病院を訪れるが、ＤＭ２患者は典型的に、近位型下肢虚弱を発症すると、まず医学的評価を求める。多くのＤＭ２の特徴（臨床的筋緊張症、遠位および顔面の虚弱）は、ＤＭ１よりも穏やかであるが、同様に激しく見えるものもあれば（白内障、生殖機能不全、およびインスリン非感受性）、ＤＭ２のほうがより重症であるものもあり得る（心筋症）。相当大きい遺伝的反復増大が存在するにもかかわらず、ＤＭ２の大体穏やかな表現型が、ＣＣＴＧ増大の病態生理学的影響が単にＣＴＧ増大より深刻でないことを示すかどうか、または二次プロセスがＤＭ１において病態生理学的メカニズムを増強しているかどうかはいまだに決定されていない。
【００８０】
本発明者等は、１３３世帯の家族から３８９人のＤＭ２陽性個体を判別した。ミネソタ州およびドイツの両方における多数のＤＭ２家族を判別する本発明者等の能力から、ＤＭ家族の９８％がＤＭ１増大を有するという初期概算は、少なくとも北ヨーロッパ集団では高すぎることが示される。ＤＭ１家族は、多くの場合、子供が重度に冒されると病院を訪れる。対照的に、先天的ＤＭ２がないことが、その外見上の診断の少なさを説明し得る。ＤＭ２患者は多くの場合、その複雑な基礎疾患に気がつかずに、単一性の疾患特徴に関して医学的配慮を求める。早期発症性白内障、糖尿病、精巣機能不全、および不整脈を含む疾患の一部として知られる多様な臨床的特徴の良好なモニタリングを促進することで、ＤＭ２の遺伝子診断は、患者管理を改善するであろう。
【００８１】
遺伝学
ＤＭ２増大の特有の遺伝的特徴は、以下の：ｉ）それが、第１の病原性テトラヌクレオチド増大であること、ｉｉ）増大が、任意の他の疾患で報告されるよりも大きいこと（ＤＭ１では１２Ｋｂであるのに対し、ＤＭ２では４４Ｋｂよりも大きい）、ｉｉｉ）無比の体細胞不安定性が存在することを含む。体細胞不安定性が激しいため、増大のおよそ１／４はサザン解析で検出することができず、ＤＭ１、ＳＣＡ８およびＳＣＡ１０のような大きな増大を有する障害の中でさえも、これまでに報告されていない診断的難問をもたらす。体細胞不安定性は、ＤＭ２の分子的診断を複雑にするが、ＲＡと組み合わせることで、９９％を超える程度にまで検出が改善される。
【００８２】
他の報告されているミクロサテライト増大障害では、リピートトラクトが大きいほど、早期発症と高められた疾患重篤性に関連する。臨床基準に基づいて、ＤＭ２／ＰＲＯＭＭ家族において予測が報告されてきたが、リピートトラクトが長いほどより早期の発症年齢に関連するという予測傾向は観察されなかった。体細胞異質性、および反復サイズは年齢とともにサイズを著しく増加させるという事実は、この分析を複雑にし、疾患発症に対する反復サイズの有意義な生物学的影響を隠してしまう可能性がある。また、病原的サイズ閾値を超える増大は、それらがどれほど大きくなろうと関係無く類似した影響を発揮すること、あるいは小さな反復が大きな反復よりも病原性であることさえも可能である。成人発症性ＤＭ１では、反復長と疾患発症との間の最も強固な相関関係は、１５０回未満のＣＴＧ反復に関するものであり、ＤＭ１に関するより大きな反復サイズにおける相関関係もまた、体細胞モザイク現象の増加、またはある長さを超える反復サイズが同程度の病状を引き起こすというシーリング効果のいずれかにより測定するのが困難であることを示し得る。血液以外の組織中のＤＭ２体細胞モザイク現象の決定は、増大の病原的影響を明瞭にするのを助長し得るが、他の組織（例えば、骨格筋）で観察される体細胞モザイク現象は、長さ依存的病理学的影響を不明瞭にし続け得る。母性および父性伝達の両方の後に見られる驚くほど短い反復を伴う、ＤＭ２における反復長の世代間差はまた、罹患個体それぞれの顕著な範囲の反復サイズ、および経時的反復長の増加により影響され得る。
【００８３】
本明細書中で引用したすべての特許、特許出願、および刊行物の完全な開示、ならびに電子的に利用可能なもの（例として、例えばＧｅｎｂａｎｋ、ｄｂＳＴＳ、およびＲｅｆＳｅｑでのヌクレオチド配列サブミッション、ならびに例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列サブミッション、およびＧｅｎｂａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるアノテーションしたコード領域からの翻訳を含む）は参照により本明細書に援用される。上記の詳細な説明および実施例は、理解を明瞭化するためだけに付与したものである。不必要な限定はそこから理解されるべきではない。本発明は、図示および記載した正確な詳述に限定されず、当業者に明らかな変更は、特許請求の範囲により規定される本発明内に含まれるであろう。
【００８４】
見出しはすべて、読者の利便性のためであり、明記しない限り、見出しに続く文書の意味を限定するのに使用すべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＤＭ２患者に見られる増大ＣＬ３Ｎ５８対立遺伝子。（Ａ）ＤＭ２の危険領域。黒色は、最少ＤＭ２危険領域を表し、白色は、ＤＭ２除外領域を表し、灰色は、組換えが起こった領域を表す。すでに公開されているマーカーとともに、組換え事象を規定し、連鎖不均衡を確立するマーカーを示す。ｐ値の相対的有意性を、マーカー名称の上のプラス（＋）で示す。「＋＋」は、０．０１以下、「＋＋＋」は、０．００１以下、「＋＋＋＋」は、０．０００１以下、「＋＋＋＋＋＋」は、０．０００００１以下である。連鎖不均衡領域内の３つのＢＡＣ（配向は未知）を示す。正確な縮尺率で描いていない。（Ｂ）３つの異なるＤＭ関連家族の系統。それぞれ核家族で表している。（Ｃ）ＣＬ３Ｎ５８マーカーのＰＣＲ解析。各個体の遺伝子型を示す。各対立遺伝子のサイズは、それぞれのレーンの下に塩基対（ｂｐ）で示す。増幅されない対立遺伝子は「−」で表す。（Ｄ）増大突然変異のサザンブロット解析。ＣＣＴＧ領域増大を有する個体を「ＥＸＰ」で表し、２つの正常な対立遺伝子を有する個体を「Ｎ」で表す。またブロットを、ＳＣＡ８負荷対照とハイブリダイズさせ、第１レーン以外はすべて均一に負荷されたことを示す。（Ｅ）増大の高分解能サイジング。レーン３は、対照試料由来のＤＮＡを含有している。各個体の増大対立遺伝子のＣＣＴＧ数を示し、「Ｎ」は、正常な長さのＣＣＴＧ領域を表す。
【図２】 ＤＭ２に罹患している対立遺伝子および正常対立遺伝子の解析。（Ａ）対照におけるＣＬ３Ｎ５８対立遺伝子の分布（ｎ＝１３６０）。対立遺伝子は、複合ＴＧ、ＴＣＴＧおよびＣＣＴＧリピートトラクトの総塩基対サイズで表す。（Ｂ）正常リピートトラクトおよび増大リピートトラクトの配列配置を示す、ＤＭ２増大領域の概略図。（Ｃ）６世帯のＤＭ２家族の５１人の罹患成員における増大対立遺伝子の分布。増大対立遺伝子サイズはすべて、複数のバンドで個体に含まれていた。（Ｂ）に対比して、それをＣＣＴＧ反復単位で示す。
【図３】 ＤＭ２増大の不安定性。（Ａ）血中の体細胞異質性。血液由来のＢｓｏＢＩで消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットから、数名の罹患個体にて複数の増大対立遺伝子が明らかとなった。サイズがはっきり区別されているものもあれば（レーン１および２）、広域に広がっているもののある（レーン３）。（Ｂ）一卵性双生児の血液由来のＥｃｏＲＩで消化したゲノムＤＮＡのサザンブロット（レーン４および５）。（Ｃ）増大対立遺伝子は、時間が経つとその長さが増加する。それぞれ２８歳（レーン６）および３１歳（レーン７）の一人の患者から採取した血液由来のＥｃｏＲＩで消化したゲノムＤＮＡ試料のサザンブロット。（Ｄ）単一対立遺伝子を有する個体中の増大対立遺伝子サイズと、その血液試料採取時の年齢との相関関係をとった。
【図４】 ＺＮＦ９遺伝子のゲノム組織。イントロン１中のＤＭ２増大の位置を示す。この遺伝子は、１．５ｋｂのｍＲＮＡを伴って１６．５ｋｂのゲノム配列にわたる。
【図５】 ＺＮＦ９ＲＮＡ発現のノーザン解析。上部のパネル：ＺＮＦ９のエキソン５を含むリボプローブをハイブリダイズさせたヒトの複数組織のノーザンブロット；下部パネル：負荷対照として使用したアクチン。それぞれキロベースサイズで１．５、２．０、１．８。
【図６】 （Ａ）反復アッセイＰＣＲ反応産物の概略図。（Ｂ）ＣＬ３Ｎ５８マーカーのＰＣＲ解析。レーン１は、非罹患母親からもので、２つの対立遺伝子を示す。レーン２および３は、罹患父親と罹患息子からのもので、それぞれたった１つの対立遺伝子を示す。ＰＣＲ対立遺伝子の正常なメンデル遺伝で予測されるように、レーン２およびレーン３に共有の対立遺伝子は存在しない。（Ｃ）増大突然変異のサザンブロット解析。レーン１〜４は、検出可能な増大バンドを有する罹患個体を示す。レーン５は、正常サイズのバンドのみを有する非罹患個体を示す。レーン６および７は、増大が検出できなかった罹患個体を示す。レーン８は、増大バンドを有する罹患ＳＣＡ８個体を示す。（Ｄ）ＤＭ２突然変異の反復アッセイ。レーン１〜５および８は、増大が陽性である罹患個体を示す。これは、反復アッセイにより正常対立遺伝子を超えるスメアで示される。レーン１、２、４、５、および８は、サザンブロット解析により増大を有していた罹患個体を示す。一方、レーン３は、サザンブロット解析では増大が検出できなかった罹患患者を示す。レーン６、７、９、および１０は、増大が陰性である罹患してない個体を示す。これは、反復アッセイにより、正常遺伝子を超えるスメアが見られないことで示される。（Ｅ）ＤＭ２家族の簡略系統。塗りつぶした記号は罹患個体を表す。各記号の下には、採血時の年齢、ＣＬ３Ｎ５８ＰＣＲ対立遺伝子サイズ（ここで、「Ｂ」は、増幅されないブランク対立遺伝子が明らかに存在することを示す）、およびサザンブロットにより検出される増大サイズ（「Ｎｋｂ」）またはＥｘｐ（＋）もしくはＥｘｐ（−）で表した反復アッセイの結果（ここで、Ｅｘｐは、サザン解析で増大しなかった個体に関する増大を指す）が記載してある。
【図７】 ヒトジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）ゲノム配列のヌクレオチド配列（配列番号１）。Ｎ：ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧ。
【図８】 反復長と臨床的重篤性との相関関係。
【図９】 反復長の世代間の変化。

Claims (41)

1. ジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）ゲノム配列のイントロン１内のリピートトラクト（ｒｅｐｅａｔ ｔｒａｃｔ）を含むポリヌクレオチドの検出方法であって、
   ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域のヌクレオチドを増幅して、リピートトラクトを含む増幅されたポリヌクレオチドを形成すること、および、
   該増幅されたポリヌクレオチドを検出すること、
   を含む方法。
2. ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１内のリピートトラクトを含むポリヌクレオチドの検出方法であって、
   ポリヌクレオチドを得るために、制限エンドヌクレアーゼでゲノムＤＮＡを消化すること、
   ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１内のリピートトラクトを含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする、検出可能に標識したプローブを用いて、ハイブリダイズ用条件下にて前記ポリヌクレオチドをプローブすること、および
   該ポリヌクレオチドにハイブリダイズした該プローブを検出すること、
   を含む方法。
3. 筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）を発症する危険性のない個体の判別方法であって、
   １７６個以下のヌクレオチドのリピートトラクトを含む２つのＤＭ２を発症する危険性のない対立遺伝子に関して、個体のＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域を解析すること、
   を含む方法。
4. ＤＭ２を発症する危険性のない個体の判別方法であって、
   個体のＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域のヌクレオチドを増幅して、リピートトラクトを含むポリヌクレオチドを増幅すること、
   該増幅されたポリヌクレオチドのサイズを比較すること、および
   ２つのＤＭ２を発症する危険性のない対立遺伝子に関して、該増幅されたポリヌクレオチドを解析すること、
   を含む方法。
5. 前記増幅は、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマー対を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含み、
   該第１のプライマーおよび該第２のプライマーは、前記イントロン１領域内に位置する前記リピートトラクトに隣接し、
   該第１のプライマーは、配列番号１のヌクレオチド１４４６９〜１７７０１から選択される少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、そして
   該第２のプライマーは、配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８６６１から選択される少なくとも２０個のヌクレオチドを含む、
   請求項４に記載の方法。
6. ＤＭ２を発症する危険性のない個体の判別方法であって、
   個体のＺＮＦ９ゲノム配列内のイントロン１領域のヌクレオチドを増幅して、リピートトラクトを含む増幅されたポリヌクレオチドを形成すること、および、
   １７６個以下のヌクレオチドのリピートトラクトを含む２つのＤＭ２を発症する危険性のない対立遺伝子に関して、該増幅されたポリヌクレオチドの該リピートトラクトを解析すること、
   を含む方法。
7. ＤＭ２に罹っているか、またはＤＭ２を発症する危険性のある個体の判別方法であって、
   少なくとも７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含む１つのＤＭ２を発症する危険性のある対立遺伝子に関して、個体のＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域を解析すること、
   を含む方法。
8. ＤＭ２に罹っているか、またはＤＭ２を発症する危険性のある個体の判別方法であって、
   ポリヌクレオチドを得るために、制限エンドヌクレアーゼで個体のゲノムＤＮＡを消化すること、
   ＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１内のリピートトラクトを含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする、検出可能に標識したプローブを用いて、ハイブリダイズ用条件下にて該ポリヌクレオチドをプローブすること、
   該ポリヌクレオチドにハイブリダイズした該プローブを検出すること、および
   少なくとも７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含む１つのＤＭ２を発症する危険性のある対立遺伝子に関して、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの該イントロン１領域を解析すること、
   を含む方法。
9. 前記プローブが、配列番号１由来の少なくとも２００個の連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む、
   請求項８に記載の方法。
10. ＤＭ２に罹っているか、またはそれを発症する危険性のある個体の判別方法であって、
    個体のＺＮＦ９ゲノム配列のイントロン１領域のヌクレオチドを増幅して、リピートトラクトを含む増幅されたポリヌクレオチドを形成すること、および
    少なくとも７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含む１つのＤＭ２を発症する危険性のある対立遺伝子に関して、該増幅されたポリヌクレオチドの該リピートトラクトを解析すること、
    を含む方法。
11. 前記増幅は、
    第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマー対を用いて、ＰＣＲを実施することを含み、
    該第１のプライマーは、前記イントロン１領域内に位置する前記ＣＣＴＧリピートトラクトに隣接し、
    該第１のプライマーは、配列番号１のヌクレオチド１４４６９〜１７７０１、または配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８６６１から選択される少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、
    該第２のプライマーは、前記ＣＣＴＧリピートトラクトにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、
    請求項１０に記載の方法。
12. 個体がＤＭ２を発症する危険性がないかどうかを判別するためのキットであって、
    該キットは、配列番号１のヌクレオチド１４４６９〜１７７０１から選択される少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む第１のプライマー、および配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８６６１から選択される少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、
    該ＤＭ２を発症する危険性のない個体は、１７６個以下のヌクレオチドのリピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列の２つのＤＭ２を発症する危険性のない対立遺伝子を含む、
    キット。
13. 個体がＤＭ２を発症する危険性があるかどうかを判別するためのキットであって、
    該キットは少なくとも２００個のヌクレオチドを含むプローブを含み、
    該プローブは配列番号１またはその相補体にハイブリダイズし、
    該危険性のある個体は、少なくとも７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列の１つのＤＭ２を発症する危険性のある対立遺伝子を含む、
    キット。
14. 個体がＤＭ２を発症する危険性があるかどうかを判別するためのキットであって、
    該キットは、配列番号１のヌクレオチド１４４６９〜１７７０１、または配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８６６１から選択される少なくとも２０個のヌクレオチドを含む第１のプライマー、ならびに（ＣＣＴＧ）_nおよび（ＣＡＧＧ）_n（ここで、ｎは少なくとも４である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む第２のプライマーを含み、
    該危険性のある個体は、少なくとも７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列の１つのＤＭ２を発症する危険性のある対立遺伝子を含む、
    キット。
15. 個体がＤＭ２に罹っているかどうかを判別するためのキットであって、
    該キットは少なくとも２００個のヌクレオチドを含むプローブを含み、
    該プローブは、配列番号１またはその相補体にハイブリダイズし、
    危険性のある個体は、少なくとも７５回の反復を含むリピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列の１つのＤＭ２を発症する危険性のある対立遺伝子を含み、かつＤＭ２の症状を示す、
    キット。
16. 個体がＤＭ２に罹っているかどうかを判別するためのキットであって、
    該キットは、配列番号１のヌクレオチド１４４６９〜１７７０１、または配列番号１の
    ヌクレオチド１７８５８〜１８６６１から選択される少なくとも２０個のヌクレオチドを含む第１のプライマー、ならびに（ＣＣＴＧ）_nおよび（ＣＡＧＧ）_n（ここで、ｎは少なくとも４である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む第２のプライマーを含み、
    危険性のある個体は、少なくとも７５回のＣＣＴＧ反復を含むリピートトラクトを含むＺＮＦ９ゲノム配列の１つのＤＭ２を発症する危険性のある対立遺伝子を含む、
    キット。
17. 配列番号１のヌクレオチド１７５０１〜１７７０１、およびその相補体を含む、
    単離されたポリヌクレオチド。
18. 配列番号１のヌクレオチド１７５０１〜１７７０１、およびＤＭ２を発症する危険性のあるリピートトラクト、ならびにそれらの相補体を含む、
    単離されたポリヌクレオチド。
19. 配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８０５８、およびその相補体を含む、
    単離されたポリヌクレオチド。
20. 配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８０５８、およびＤＭ２を発症する危険性のあるリピートトラクト、ならびにそれらの相補体を含む、
    単離されたポリヌクレオチド。
21. 配列番号１のヌクレオチド１６７０１〜１７７０１由来の少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、およびその相補体を含む、
    単離されたポリヌクレオチド。
22. 配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８８６２由来の少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、およびその相補体を含む、
    単離されたポリヌクレオチド。
23. 配列番号１のヌクレオチド１６７０１〜１７７０１由来の２０〜４１個の連続するヌクレオチド、およびその相補体を含む、
    請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
24. 配列番号１のヌクレオチド１６７０１〜１７７０１由来の２０〜４４個の連続するヌクレオチド、およびその相補体を含む、
    請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
25. 配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８８６２由来の２０〜４１個の連続するヌクレオチド、およびその相補体を含む、
    請求項２２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
26. 配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８８６２由来の２０〜４４個の連続するヌクレオチド、およびその相補体を含む、
    請求項２２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
27. ４１個以下の連続するヌクレオチドであって、配列番号１のヌクレオチド１６７０１〜１７７０１由来の少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、およびその相補体を含む、
    単離されたポリヌクレオチド。
28. 前記ヌクレオチドが４４個以下の連続するヌクレオチドである、
    請求項２７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
29. ４１個以下の連続するヌクレオチドであって、配列番号１のヌクレオチド１７８５８〜１８８６２由来の少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、およびその相補体を含む、
    単離されたポリヌクレオチド。
30. 前記ヌクレオチドが４４個以下の連続するヌクレオチドである、
    請求項２９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
31. ＤＭ２を発症する危険性のあるリピートトラクトが（ＴＧ）_x（ＴＣＴＧ）_y（ＣＣＴＧ）_zを含み、
    ｘが１４〜２５の整数であり、ｙが３〜１０の整数であり、そしてｚが７５〜１１，０００の整数である、
    請求項１８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
32. ＤＭ２を発症する危険性のあるリピートトラクトが７５〜１１，０００回のＣＣＴＧ反復を含む、
    請求項１８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
33. ＤＭ２を発症する危険性のあるリピートトラクトが、他のヌクレオチドによって中断されない、少なくとも７５回のＣＣＴＧ反復を含む、
    請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
34. ＤＭ２を発症する危険性のあるリピートトラクトが（ＴＧ）_x（ＴＣＴＧ）_y（ＣＣＴＧ）_zを含み、
    ｘが１４〜２５の整数であり、ｙが３〜１０の整数であり、そしてｚが７５〜１１，０００の整数である、
    請求項２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
35. ＤＭ２を発症する危険性のあるリピートトラクトが７５〜１１，０００回のＣＣＴＧ反復を含む、
    請求項２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
36. ＤＭ２を発症する危険性のあるリピートトラクトが、他のヌクレオチドによって中断されない、少なくとも７５回のＣＣＴＧ反復を含む、
    請求項３５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
37. ＺＮＦ９ゲノム配列が配列番号１のＺＮＦ９ゲノム配列である、
    請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
38. リピートトラクトが配列番号１のヌクレオチド１７７０１〜１７８５８に対応するリピートトラクトである、
    請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
39. ＺＮＦ９ゲノム配列が配列番号１のＺＮＦ９ゲノム配列である、
    請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のキット。
40. リピートトラクトが配列番号１のヌクレオチド１７７０１〜１７８５８に対応するリピートトラクトである、
    請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のキット。
41. リピートトラクトが配列番号１のヌクレオチド１７７０１〜１７８５８に対応するリピートトラクトである、
    請求項１８、２０、および３１〜３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

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