JP4139215B2

JP4139215B2 - 消化を促進するための薬剤としての繊毛虫から得られた酵素の使用

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Publication number: JP4139215B2
Application number: JP2002538965A
Authority: JP
Inventors: マルクスハートマン
Original assignee: シリアンアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 2000-11-02
Filing date: 2001-11-02
Publication date: 2008-08-27
Anticipated expiration: 2021-11-02
Also published as: CA2427537A1; NO20031979D0; US20040033220A1; US20080292610A1; JP2004512375A; CN1262308C; NO20031979L; EP1330262A1; RU2299074C2; DK1330262T3; ES2239686T3; AU2002223666B2; DE50106273D1; PT1330262E; EP1330262B1; IL155515A; ATE295737T1; HK1057861A1; AU2366602A; PL361630A1

Description

【０００１】
本発明は、消化系疾患の治療のための、繊毛虫からの酵素を含む薬剤に関する。
【０００２】
消化系疾患は、一般医療および内科医療において果たす役割がますます大きくなっている。多くの場合、そのような消化系疾患は、いわゆる膵酵素の多少顕著な不足の結果である。健康な状態では、これらの酵素は、高度に特殊化された細胞、いわゆる小葉（acinic cell）によって膵臓で合成され、そして、体液腺（juice glands）および膵管を通ってエキソサイトーシスによって十二指腸内へ分泌される。膵臓の分泌物の一日の量は、約２リットルである。脂肪を消化するリパーゼの他に、膵臓の分泌物は、蛋白質（トリプシン、キモトリプシン、およびカルボキシペプチダーゼ）、ならびに、炭水化物（α−アミラーゼ）の消化のための酵素も含む。膵酵素の分泌は、ガストリン、セクレチン、およびパンクレオチミンのようなホルモンによる内因性制御メカニズムによって正確に制御される。この制御システムは、膵酵素の分泌の減少または外分泌性膵臓機能の完全な消滅(subsiding)を引き起こす、多数の原因によって妨害され得る。これもまた、小腸において糜汁が消化されず、消化系疾患が起こることの原因となる。外分泌性膵臓機能不全とも呼ばれる、消化管の疾患は、異なる原因を有し得る。薬剤によって引き起こされる消化不良の他に、アルコール消費によってしばしば引き起こされる慢性萎縮性胃炎および慢性膵炎、手術（（例えば、ビルロート(Billroth)ＩおよびＩＩ、迷走神経切断、膵臓切除）によって引き起こされる疾患、ならびに、嚢胞性線維症は、膵臓機能不全の病因（etiologic factors）である。いずれにせよ、それら症状は、しばしば患者を目立たなくし(nondescript)、そして平均寿命(expectation of life)を短くするため、慢性消化系疾患は、社会医学的に非常に重要であり、そのため、経済的に重要である。
【０００３】
膵臓由来の消化系疾患は、下痢、大量の排泄物(mass stools)、満腹感（sensations of repletion）、上腹部の病気、体重の減少等のような多くの病気を患者に引き起こす。
【０００４】
膵臓由来の消化系疾患または膵臓機能不全の原因および徴候にかかわらず、酵素による補充療法(substitution therapy)は、消化系疾患を和らげるために常に必要である。このことは、酵素、主に、リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ、更にそれだけでなく他の酵素、の欠乏は、外部から補わなければならないことを意味する。治療中、酵素は、主に食事の最中に、患者に経口で摂取され、胃を通過し、小腸へ到達し、そこで、それらは、糜汁の消化を行い、そのため、不足している内因性膵酵素の機能を身につける。また、それら酵素は、溶腸性製剤へ供給されなければならず、小さな粒径を有さなければならず、そして、消化管中で完全に生物学的に利用可能でなければならない。
【０００５】
膵酵素、特に、主要な酵素であるリパーゼおよびプロテアーゼ、の欠乏に基づく消化系疾患の治療のために、幅広い種類の酵素調製物が、常に市場に出ている。これらは、調製物コンビジム(Combizym)（登録商標）、フェスタル(Festal)（登録商標）、パンクレオン(Pankreon)（登録商標）、クレオン(Kreon)（登録商標）、パンジトラット(Panzytrat)（登録商標）、メテオジム(Meteozym)（登録商標）、もしくはエンザイム−レファックス(Enzym-Lefax) N（登録商標）のような豚からの膵酵素、または、シトラペプシン(Citrapepsin)（登録商標）のような胃の酵素に部分的に基づいている。ある程度、それら調製物は、コンビジム(Combizym)（登録商標）およびフェスタル(Festal)（登録商標）のような、カビ抽出物からの酵素も含み得る。
【０００６】
更に、魚または他の海洋動物からの酵素の使用（FR No. 1015566）、ならびに、オキアミ（オキアミ類(class Euphausiaceae)からの甲殻類動物）およびカラフトシシャモ（US 4,695,457）の胃腸管からの酵素の組成物が、一般的に記載されている。膵酵素を含む調製物は、屠殺場の廃棄物、例えば、豚の膵臓、から主に得られる。調製工程の最終生成物は、パンクレアチンである。パンクレアチンは、（通常、豚からの）膵臓組織の細胞からの均質化物(homogenizate)である。多数の小葉の破壊により、それは、膵酵素のほかに、広範な種類の他の酵素および蛋白質、ならびに、更なる高分子量および低分子量化合物を含む。パンクレアチンの合成(composition)は、その工業的調製工程によるものである。パンクレアチンを得るために、豚の膵臓を、屠殺後できるだけ迅速に冷凍し(deep-frozen)、回収し、そして機械的に破壊する。酵素の安定化および活性化のために、様々な添加物を、均質化物に添加する。この後、アセトンのような有機溶媒によって脱脂し、繊維性物質を除去し、そして凍結乾燥によって脱水乾燥する。特定の投与形態の調製物に対して、更なる本草薬的(galenic)処理を行い、マイクロペレット、タブレット、カプセル、ペースト、クリーム、ゲル、油および他の調製物にすることもできる。しばしば、パンクレアチンは、様々な支持材および緩衝物質と混合される。更に、粒状パンクレアチンは、ヒトの胃液の低ｐＨに対する保護のために、酸に安定なフィルムまたはラッカーによって被覆される。後者の２つの処理段階は、酸に不安定な膵酵素が、ターゲット部位、十二指腸（小腸）において、それらの消化機能を果たすことを保証すべきである。
【０００７】
パンクレアチンの通常の調製物の他に、最終生成物中のリパーゼ含有量は、クロロホルム、ブタノールおよびアセトンによる連続抽出によって増加され得る。パンクレアチンと同様に、酵素組成物は、オキアミ種のオーファウシア・スベルバ(Euphausia suberba)およびカラフトシシャモ（US-A-4,695,457参照）から得られる。この場合も、均質化物は、組織から最初に調製され、次いで、遠心分離、クロロホルムによる抽出、凍結乾燥、およびクロマトグラフィー段階によって更に精製される。それぞれの場合に、処理の目的は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびα−アミラーゼのような膵酵素の、できるだけ高い含有量である。更に、酵素組成物は、消化系疾患の治療のために、胃液に対してできるだけ耐性を有するべきである。また、酵素は、消化管中で、特に、十二指腸において、できるだけ迅速に放出され、それらの生理学的活性を示すべきである。アレルギーを回避するために、酵素組成物は、可能であれば、効果のない蛋白質を含まないべきであり、または、高い純度を有するべきである。また、調製工程は、製薬経済の(pharmaeconomical)局面において、安価であるべきである。
【０００８】
パンクレアチンについては、クロマトグラフィー法による更なる精製は通常行われないので、所望の酵素は、精製されても均質化されてもいない状態で得られる。細胞均質化物からの、このような蛋白質混合物の欠点は、それらが、豚の膵臓細胞の細胞内の細胞区画（サイトソル、核、細胞器官の膜）からの広範な種類の蛋白質を含むという点である。これらは、酵素活性を有さないか、または、所望の酵素活性を有さず、そのため、供給される投与形態当たりの活性物質の量を低減させる。同じことは、オキアミまたはカラフトシシャモの胃腸管からの濃縮された細胞均質化物が得られる場合に当てはまる。
【０００９】
屠殺場の廃棄物（魚の膵臓、胃腸管）およびオキアミからの酵素および酵素組成物の調製の別の欠点は、連続しない回収工程の方式である。通常、器官（膵臓）は、異なる段階で粉砕され、そして均質化される。次いで、均質化物は、脱脂され、そして乾燥される。多量の固体内容物が常に使用され、それにより、抽出および遠心分離段階による、連続した更なる処理が妨げられるので、これらの酵素回収段階は、連続して行うことができない。しかし、このような方法では、空間時間収率（space time yields）が更に高くなり、そのため、費用が更に低くなるので、酵素の回収のために、連続的または半連続的製造方法が最適である。しかし、酵素の連続的な回収は、それらが、細胞外の溶解された状態であり、かつ、細胞の粉砕または均質化により、最初に放出される必要がないことを要する。従って、パンクレアチン製造工程は、酵素の連続的な回収には適していない。
【００１０】
膵臓からの酵素の別の欠点は、それらの酸不安定性である。膵酵素は、中性またはアルカリ性加水分解酵素である。このことは、一方で、それらが、ｐＨ７〜ｐＨ８の間でそれらの活性の最大値を有し、かつ、酸性条件下で、大幅に減少した活性を有することを意味する。他方で、低ｐＨ値は、可逆的または不可逆的変性によって、それらの触媒機能を不活性化する。この理由のため、膵臓から得られる酵素(パンクレアチン)は、カプセル化または緩衝物質の添加の特別な方法によって、胃を通って移動する間、低ｐＨ値の胃液から保護されなければならない。そのような方法も、パンクレアチンに基づく薬剤の費用を増大させる。
【００１１】
また、特定のグループの患者に対して、膵酵素の使用の欠点は、パンクレアチンに由来する。通常、豚の膵臓が使用されるが、それは、宗教的な教えにより、ユダヤ教またはイスラム教の患者には許容され得ない。
【００１２】
最後に、豚からの膵酵素は、豚蛋白質アレルギーを有する、消化系疾患を患っている患者には、使用することができない。また、豚は、ヒト病原性インフルエンザウイルスの天然のリザーバーと考えられるので、そのようなウイルスによるパンクレアチンの汚染は、排除しなければならない。
【００１３】
従って、本発明の目的は、
１）細胞外状態であり、かつ、組織または細胞の均質化（破壊）なしに、細胞を含まない上清から得て精製することができ；
２）遺伝子工学によって得られるのではない無害の微生物のバイオテクノロジー的方法において連続して得ることができ；
３）酸性加水分解酵素であり、即ち、酸性ｐＨ値でそれらの活性の最大値を有し、かつ、膵臓からの酵素より酸に安定であり；
４）豚の組織または器官に由来しない、
薬剤のための酵素または酵素組成物を提供することである。
【００１４】
この目的は、加水分解酵素、リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、グリコシダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスファターゼからなる群から選択され、かつ、繊毛虫から得られる酵素を含む薬剤によって達成される。
【００１５】
特に、本発明は、消化を促進するために、および、消化系疾患の治療のために使用される薬剤に関する。
【００１６】
好ましくは、本発明による薬剤は、蛋白質、核酸、および炭水化物のような、食べ物に含まれる巨大分子、ならびに、脂肪またはリン脂質のような、食べ物の他の成分を、ヒトまたは動物の胃腸管において消化するために使用される酵素を含む。
【００１７】
他の酵素も、食べ物の成分の触媒による開裂によって、胃腸管において消化を促進し得るので、当業者は、以前使用されていたリパーゼ、プロテアーゼ、またはアミラーゼに属さない繊毛虫からの酵素も、本発明により、消化の促進のために、または、消化系疾患の治療のために、使用され得ることを理解する。
【００１８】
本発明の１つの態様では、酵素は、ｐＨ４−６にｐＨ最適値を有する。
【００１９】
本発明による薬剤は、テトラヒメナ属、コルピジウム(Colpidium)属、およびゾウリムシ属の繊毛虫から得られる酵素を含むことが好ましい。
【００２０】
好ましくは、本発明による薬剤は、薬学的に安全な補助剤およびキャリアーを含む。
【００２１】
本発明による薬剤は、特に、タブレット、マイクロペレット、油、ジュース、ゲル、座薬、カプセル、被覆されたタブレットの状態で使用される。
【００２２】
本発明は、消化系疾患、特に、薬剤によって引き起こされる消化不良、慢性萎縮性胃炎、慢性膵炎、急性膵炎、手術によって引き起こされる消化系疾患（消化不良）、または嚢胞性線維症によって引き起こされるもの、の治療のための薬剤の調製のための、加水分解酵素、リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、グリコシダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスホジエステラーゼ、および／またはホスファターゼからなる群から選ばれる、繊毛虫からの酵素の使用にも関する。
【００２３】
繊毛虫の目(order)の原生動物によって生成され、かつ、本発明による薬剤において使用される酵素は、消化系疾患の治療に特に適している。また、本発明による薬剤に含まれる、繊毛虫からの酵素および酵素組成物、ならびにそれらの調製物は、上記の膵酵素またはカラフトシシャモもしくはオキアミからの酵素の欠点を有さない。
【００２４】
酵素は、繊毛虫によって周辺の培養培地内へ放出される。例えば、表１は、繊毛虫の培養培地中の異なる酵素の酵素活性を示す。表１に示された酵素活性は、文献に記載されている通常の方法によって測定された。リパーゼの測定には、アゾ−カゼインテストを使用した(ムリカン(Muricane)、1986)。リパーゼおよびアミラーゼの測定は、菌類のアミラーゼおよび微生物のリパーゼのためのＦＩＰの方法の指示と同様に行った(デメースター(Demeester)ら、"薬学的酵素(Pharmaceutical Enzymes)"、A. ロウワーズ(Lauwers)およびS. シャルペ(Scharpe)[編集者]、マルセル・デッカー(Marcel Dekker)、ニューヨーク、1997、pp. 372-382)。酸性ホスファターゼおよびβ−ヘキソサミジナーゼ(hexosamidinase)に対して、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ基質、およびｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン基質が、それぞれ、キイ(Kiy)ら（１９９６）に記載されているように使用される。ホスホリパーゼＡ₁活性は、放射分析による酵素テストによって決定された（ハートマン(Hartmann)ら、２０００）。
【００２５】
【表１】

【００２６】
培養培地内へ酵素を放出する繊毛虫は、高細胞濃度で連続的に、安価な発酵培地上で低コストで発酵され得る。酵素は、潅流モジュール（マイクロフィルター）によって、発酵槽から細胞を含まないように濾過されることができ、そのため、発酵培地から、連続的に除去され得る。発酵プロセスは、安価な栄養培地（成分：脱脂乳培地および酵母抽出物）を連続的に供給することによって、長期間にわたって維持され得る。
【００２７】
【実施例】
実施例１
図１は、１４日間の発酵期間にわたって示された、繊毛虫の分泌反応速度論を示す。潅流モジュールによる連続的な発酵のために、以下の工程を使用した：
【００２８】
バイオリアクターシステムは、デジタルＤＣＵ制御ユニットおよびポンプユニットを有する、プロセッサーによって制御された２リットル発酵槽(バイオスタット(Biostat) MD、ブラウン・ディッセル・バイオテク(Braun Diessel Biotech)、メルスンゲン(Melsungen)、ドイツ)に基づいている。細胞を含まない上清の採取が、潅流モジュールによって行われ、パドルインペラー(paddle impeller)が、撹拌機として使用された。１ｍｌ／ｌのシリコーン油濃度を用いた。細胞のダメージを防ぐために、撹拌機の１分当たりの回転を、８００ｒｐｍに制限した。カスケードの調整によって、溶解した酸素の濃度を、６０％で一定に保った。通気速度は、第一の優先事項の制御品質として選択され、撹拌機の１分当たりの回転は、第二の優先事項の連続した制御として選択された。酸素濃度の測定は、アンペア測定型(amperemetric)Ｏ₂電極によって行った(インゴールド・メステクニク(Ingold Messtechnik)、シュタインバッハ)。二重壁(double-walled)容器およびサーモスタットによって、発酵槽中の温度を３０に保ち、かつ、４Ｍの酢酸を用いるDCU-制御型調整剤ポンプ(DCU-controlled correction agent pump)による連続発酵段階中に、ｐＨをｐＨ７に調整した。連続発酵段階において、脱脂乳培地を発酵槽へ供給し、酵素を含む消費された培地を、発酵プロセスから取り除いた。伝導度プローブによって制御されたポンプを使用することにより、作業容量を、２リットルで一定に保つことができた。約０．３μmの膜孔サイズを有する潅流モジュールによって、細胞を含まない上清を、粒子を含まないように採取した。潅流モジュールは、支持体上に巻きつけられた、それぞれ２ｍｍの外径および１ｍｍの内径ならびに２．８ｍの長さを有するＳ６／２ポリプロピレンキャピラリー（エンカ(Enka)、ウッパータル(Wuppertal)）から構成されていた。単位時間当たりの培地容量の交換を、潅流速度と定義した。脱脂乳培地の供給速度を、１日当たりの１つの発酵槽容量（２リットル）の潅流速度が調整されるように、蠕動ポンプの回転数によって制御することができた。オートクレーブの中に入れる前に、泡捕集器を発酵槽に完全に据え付け、グルコースなしの１．８リットルの脱脂乳培地を充填させた。オートクレーブの中に入れた後、２００ｍｌの１０％グルコース溶液を、注入口を通してポンプでくみ入れた。滅菌培養室(cabinet)における迅速な結合によって、培地と採取瓶との連結を行った。滅菌培養室では、接種培養物(inoculation culture)を、底部排水管を有する５００ｍｌの三角フラスコ内へ移し、可撓性チューブおよびばらばらの接種片を通して、バイオリアクター内へポンプでくみ入れた。
【００２９】
繊毛虫は、発酵中、ダメージを受けないままであるので、培養培地は、繊毛虫によって分泌された蛋白質のみを含み、細胞内成分を含まない。このため、発酵物または培養培地からの酵素は、わずかなクロマトグラフィー精製段階で高純度になり得る。
【００３０】
実施例２
図２は、実施例として、繊毛虫テトラヒメナの培養培地からのホスホリパーゼの精製のためのカラムクロマトグラフィー段階を示す。３つの連続したカラムクロマトグラフィー段階の溶出プロファイルを示す。詳細には、図２ａは、段階１としての疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出プロファイルを示し、図２ｂは、段階２としてのアニオン交換クロマトグラフィーの溶出プロファイルを示し、そして図２ｃは、段階３としてのサイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロファイルを示す。その後のクロマトグラフィーに対して、それぞれの前のクロマトグラフィーの活性画分を使用した。よって、酵素は、最終段階後に、ほぼ完全に均質に精製され得た（異質の活性なし、異質の蛋白質の含有量は低い）。この精製スキームと同様にすることにより、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼまたはβ−ヘキソサミニダーゼ(hexosaminidase)のような、繊毛虫からの他の酵素も精製され得た。
【００３１】
１つの条件的な(facultatively)病原性の典型（バランチジウム菌（Balantidium coli））以外、繊毛虫は、フリーリビング(free-living)（非寄生性）非病原性(apathogenic)微生物である。よって、繊毛虫テトラヒメナについてのＧＲＡＳ状態（“一般に安全と認識されている(generally recognized as safe)”）は、例えば、文献に記載されている（ティディケ(Tiedtke)、1994）。また、繊毛虫が、他の生物に移され得ない体内寄生虫を何ら有さない(do not harbor)ことが確実であると考えられている。また、テトラヒメナまたはコルピジウムのような、バイオテクノロジーに重要な繊毛虫種には、ウイルスや他の体内寄生虫は何ら存在しない。従って、毒性または発熱性不純物による酵素組成物の汚染を排除することができる。
【００３２】
図３は、異なるｐＨ値での、繊毛虫テトラヒメナの培養培地からの３つの酵素の相対的な酵素活性の表示を示す（ａ−ホスホリパーゼＡ₁、ｂ−トリアシルグリセロール−リパーゼ、ｃ−β−ヘキソサミニダーゼ）。
【００３３】
酸性加水分解酵素である、繊毛虫からの酵素は、酸性の最適ｐＨ値を有する。図３は、異なるｐＨ値での、繊毛虫テトラヒメナの培養培地からの３つの酵素の酵素活性を示す。詳細には、ホスホリパーゼＡ₁（図３ａ）、およびβ−ヘキソサミニダーゼ（図３ｂ）の相対的な酵素活性、ならびに、リパーゼ（図３ｃ）の絶対的な酵素活性を示す。
【００３４】
繊毛虫からの酵素に対する最適ｐＨ値が４．１〜６．５の間であることが明らかになる。繊毛虫からのプロテアーゼは、３と同じくらい低いｐＨ値であっても、高い酵素活性を示す。以下の表２に、細胞を含まない上清（培養培地）からの繊毛虫プロテアーゼの活性を、ｐＨ値の関数として示す。既に上述したように、酵素活性は、菌類のアミラーゼおよび微生物のリパーゼのためのＦＩＰの方法の指示と同様にすることによって決定した。
【００３５】
【表２】

【００３６】
このため、繊毛虫酵素は更に、膵酵素と比べて酸に対してより安定であった。従って、それらは、胃を通って移動した後に十二指腸において、膵酵素と比べてはるかに高い活性を有する。
【００３７】
図４は、胃液中で見られる典型的なｐＨ値（ｐＨ１．５）での１０分間の作用段階における、パンクレアチンと比べた、繊毛虫テトラヒメナからのプロテアーゼの酸安定性を示す。高モル濃度の酸性緩衝液（１Ｍのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５）の作用によって、３７で、低ｐＨ値をシミュレーションした。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１４日間の発酵期間にわたって示された、繊毛虫の分泌反応速度論を示す。
【図２】図２は、実施例として、繊毛虫テトラヒメナの培養培地からのホスホリパーゼの精製のためのカラムクロマトグラフィー段階を示す。
【図３】図３は、異なるｐＨ値での、繊毛虫テトラヒメナの培養培地からの３つの酵素の相対的な酵素活性の表示を示す（ａ−ホスホリパーゼＡ₁、ｂ−トリアシルグリセロール−リパーゼ、ｃ−β−ヘキソサミニダーゼ）。
【図４】図４は、胃液中で見られる典型的なｐＨ値（ｐＨ１．５）での１０分間の作用段階における、パンクレアチンと比べた、繊毛虫テトラヒメナからのプロテアーゼの酸安定性を示す。

Claims

リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、グリコシダーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスファターゼからなる群から選ばれる、繊毛虫からの酵素を含む消化系疾患治療用薬剤。
前記酵素が、ｐＨ４−６で最適ｐＨ値を有することを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
前記酵素が、テトラヒメナ属、コルピジウム属、およびゾウリムシ属から得られることを特徴とする、請求項１または２に記載の薬剤。
薬学的補助剤およびキャリアーを更に含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤。
タブレット、マイクロペレット、油、ジュース、ゲル、座薬、カプセル、被覆されたタブレットの状態であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤。
前記消化系疾患が、薬剤によって引き起こされる消化不良、慢性萎縮性胃炎、慢性膵炎、急性膵炎、手術によって引き起こされる消化系疾患（消化不良）によるか、または嚢胞性線維症によって引き起こされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。