ES2239686T3 - Uso de enzimas obtenidas de ciliados como medicamentos que fomentan la digestion. - Google Patents

Abstract

Enzima de ciliados para usar como medicamento, seleccionada del grupo compuesto por hidrolasas, lipasas, proteasas, amilasas, glicosidasas, fosfolipasas, fosfodiesterasas, fosfatasas.

Description

Uso de enzimas obtenidas de ciliados como medicamentos que fomentan la digestión.

La invención se refiere a un medicamento que contiene enzimas de ciliados para el tratamiento de trastornos digestivos.

Los trastornos digestivos juegan un papel cada vez más importante en medicina general y en medicina interna. En muchos casos, estos trastornos digestivos son consecuencia de un déficit más o menos acusado de las llamadas enzimas pancreáticas. En la persona sana, el páncreas (glándula salival abdominal) sintetiza estas enzimas a través de células altamente especializadas, las denominadas células acínicas, que se segregan por exocitosis a través de las glándulas salivales y el conducto principal (conducto pancreático) en el duodeno. La cantidad diaria de secreción pancreática asciende a aprox. 2 litros. Además de las lipasas que digieren las grasas, en la secreción pancreática se encuentran también enzimas para la digestión de proteínas (tripsina, quimiotripsina, y carboxipeptidasas), e hidratos de carbono (\alpha-amilasas). La secreción de enzimas pancreáticas está regulada de manera precisa por mecanismos de regulación endógenos, mediante hormonas tales como gastrina, secretina y pancreozima. Esta labor de regulación puede alterarse por múltiples factores, de manera que se produce una disminución de la secreción de enzimas pancreáticas, o la suspensión total de la función pancreática exocrina. Esto tiene como consecuencia, por su parte, que la papilla alimentaria no se digiere en el intestino delgado, y se produce un trastorno digestivo. Esta enfermedad, llamada también insuficiencia pancreática exocrina, del aparato digestivo puede tener diferentes orígenes. Además de dispepsias provocadas por medicamentos, gastritis atrófica crónica, y pancreatitis crónica, causada a menudo por el consumo de alcohol, los trastornos de origen quirúrgico (por ejemplo, operaciones de Billroth I y II, vagotomía, resección del páncreas) y la fibrosis quística son factores etiológicos de la insuficiencia pancreática. En cualquiera de estos casos, los trastornos digestivos crónicos tienen una considerable importancia en la medicina social y, por consiguiente, en el campo económico, dado que la sintomatología determina, con frecuencia, que un paciente pueda trabajar de forma limitada, o no pueda trabajar en absoluto, presentando, además, una menor esperanza de vida.

Los trastornos digestivos de origen pancreático provocan en los pacientes múltiples síntomas tales como vómitos, diarreas, sensación de plenitud, molestias de la boca del estómago, reducción de peso, etc.

Independientemente de las causas y de la extensión de los trastornos digestivos de origen pancreático, o de una insuficiencia pancreática, para eliminar los trastornos digestivos es siempre necesaria una terapia de sustitución con enzimas. Esto significa que se deben aportar de forma externa las enzimas deficitarias, predominantemente lipasas, proteasas y amilasas, así como, también, otras enzimas. Durante el tratamiento, los pacientes toman las enzimas por vía oral, a menudo en la mitad de la ingesta alimentaria, que llegan a través del estómago hasta el intestino delgado, y en donde llevan a cabo la digestión de la papilla alimentaria (quimo), asumiendo de esta forma la función de las enzimas pancreáticas deficitarias, propias del organismo. Con este fin, se deben utilizar preparados que dispongan de una cantidad suficiente de enzimas. Adicionalmente, las enzimas deben ser resistentes a los ácidos gástricos, tener un reducido tamaño de partícula, y ser completamente biodisponibles en el tracto digestivo.

Para el tratamiento de trastornos digestivos causados por el déficit de enzimas pancreáticas, en especial de las enzimas principales, lipasa y proteasa, hay disponibles en el comercio ya múltiples preparados enzimáticos. Se basan, en parte, en enzimas pancreáticas del cerdo tales como, por ejemplo, los preparados Combizym®, Festal®, Pankreon®, Kreon®, Panzytrat®, Meteozym® o Enzym-Lefax N®, o como es el caso de Citrapepsin®, en enzimas gástricas. Sin embargo, los preparados contienen también, en parte, extractos de hongos miceliados tales como, por ejemplo, Combizym® y Festal®. Adicionalmente, se ha descrito, en general, el uso de enzimas de peces y de otros animales marinos (documento FR Nº 1015566), así como composiciones de enzimas del tracto gastrointestinal de krill (tipo de cangrejo de la clase Euphausiaceae) y de peces capelín (documento US 4695457). Los preparados que contienen enzimas pancreáticas se obtienen, a menudo, de los despojos de los mataderos, o de glándulas salivales abdominales de cerdos. El producto final del proceso de producción es la pancreatina. La pancreatina es un homogeneizado de células del tejido pancreático (normalmente, del cerdo). Por la degradación de una multiplicidad de células acínicas, contiene, además de enzimas pancreáticas, múltiples enzimas y proteínas adicionales, así como compuestos de bajo y alto peso molecular adicionales. La composición de la pancreatina se determina a partir del proceso industrial para su preparación. Para la obtención de pancreatina, se ultracongelan las glándulas salivales abdominales de cerdo lo más rápidamente posible después del sacrificio, se combinan y se degradan de forma mecánica. Para estabilizar y activar las enzimas, se agregan al homogeneizado diversos aditivos. A continuación, tiene lugar el desengrasado con disolventes orgánicos tales como, por ejemplo, acetona, la separación de sustancias fibrosas, así como la deshidratación y secado por liofilización. Para la producción de determinadas formas de administración, se puede llevar a cabo un procesamiento galénico adicional para la obtención de microgranulados, comprimidos, cápsulas, pastas, cremas, geles, aceites u otras formulaciones. A menudo, se mezcla la pancreatina con diferentes materiales de vehículo y sustancias tamponantes. Adicionalmente, la pancreatina granulada se recubre con películas o lacas resistentes al ácido para protegerla contra el bajo valor de pH de los jugos gástricos humanos. Las dos etapas de procesamiento mencionadas en último lugar deben garantizar, en este caso, que las enzimas pancreáticas resistentes a los ácidos puedan desarrollar su función digestiva en el sitio apropiado, es decir, el duodeno (intestino delgado).

Además de la preparación habitual de pancreatina, el contenido en lipasa se puede incrementar en el producto final mediante una extracción escalonada con cloroformo, butanol y acetona. De manera similar a la pancreatina, se obtienen composiciones enzimáticas de la especie de krill Euphasia, y de los intestinos del pez capelín (Mallotus villosus) (véase el documento US-A-4695457). También en este caso, se prepara en primer lugar un homogeneizado de los tejidos, que se purifica adicionalmente, entonces, por centrifugación, extracción con cloroformo, liofilización y etapas cromatográficas. El objetivo de los procesamientos es, en cualquier caso, alcanzar el mayor contenido posible en enzimas pancreáticas tales como lipasas, proteasas y \alpha-amilasas. Además, la composición enzimática para el tratamiento de los trastornos digestivos debe tener la mayor resistencia posible a los ácidos gástricos. Adicionalmente, las enzimas se deben liberar lo más rápidamente posible en el tracto digestivo y, en particular, en el duodeno, y desarrollar su acción fisiológica. Para evitar alergias, la composición enzimática deberá estar exenta, dentro de lo posible, de proteínas inactivas, o exhibir un elevado grado de pureza. Por último, desde el punto de vista de los parámetros fármaco-económicos, el proceso de producción debe tener un coste favorable.

En el caso de la pancreatina, habitualmente no se produce una purificación adicional por métodos cromatográficos, de modo que las enzimas deseadas no están presentes de forma purificada ni homogénea. El inconveniente de estas mezclas de proteínas procedentes de homogeneizados celulares es que contienen múltiples proteínas de los compartimientos celulares intracelulares (citosol, núcleo celular, membranas de los orgánulos) de las células del páncreas porcino. Dichas mezclas carecen de actividad enzimática, o ésta no es deseada, con lo que la cantidad de principio activo por forma de administración aplicada disminuye de manera considerable. Lo mismo es válido para los homogeneizados celulares concentrados obtenidos de krill, o del tracto gastrointestinal del pez capelín.

Un inconveniente adicional de la preparación de enzimas y composiciones enzimáticas de los despojos de matadero (páncreas, tracto gastrointestinal de peces) y krill, es la realización discontinua del proceso de obtención. Normalmente, los órganos (glándulas salivales abdominales) se trituran y homogeneizan en distintas etapas. A continuación, el homogeneizado se desengrasa y se seca. Estas etapas de la obtención de enzimas no se pueden llevar a cabo de manera continua, puesto que siempre se debe trabajar con una fracción considerable de elementos sólidos que, a causa de las etapas de extracción y centrifugación, no se pueden co-procesar de manera continua. Sin embargo, para la obtención de enzimas resultan óptimos los procedimientos de producción continuos o parcialmente continuos, dado que los rendimientos de espacio-tiempo en estos procesos son más altos y, por lo tanto, disminuyen los costes. No obstante, la obtención continua de enzimas exige que éstas estén presentes de manera extracelular en forma disuelta, y que no se las deba liberar de las células por trituración u homogeneización. Por consiguiente, el proceso de preparación de pancreatina no es apropiado para la obtención continua de enzimas.

Un inconveniente adicional de las enzimas del páncreas es su labilidad frente a los ácidos. Las enzimas pancreáticas son hidrolasas neutras o alcalinas. Esto significa que, por una parte, desarrollan su actividad máxima entre pH 7 y pH 8 y que, bajo condiciones ácidas, tienen una actividad fuertemente reducida. Por otra parte, los valores de pH bajos inactivan su función catalítica por desnaturalización reversible o irreversible. Por este motivo, las enzimas obtenidas del páncreas (pancreatina) se deben proteger, mediante procedimientos especiales de encapsulación o de adición de sustancias tamponantes, contra el valor de pH bajo de los ácidos gástricos durante su paso a través del estómago. Estos procedimientos incrementan, igualmente, los costes de los medicamentos cuya acción se basa en la pancreatina.

Además, un inconveniente adicional para el uso de enzimas pancreáticas, en determinados grupos de pacientes con trastornos digestivos, es el origen de la pancreatina. Habitualmente, se utilizan las glándulas salivales abdominales de cerdo, lo cual resulta inaceptable para pacientes de las religiones judía o islámica, a causa de los correspondientes preceptos religiosos.

Por último, no se pueden usar enzimas pancreáticas del cerdo en pacientes con trastornos digestivos que padecen alergia a la albúmina porcina. Adicionalmente, el cerdo actúa como reservorio natural de virus de la gripe patógenos para el ser humano, de forma que no es posible excluir una contaminación de la pancreatina con estos virus.

Misión de la invención es, por lo tanto, poner a disposición enzimas o composiciones enzimáticas que:

1)

estén presentes de forma extracelular y que se puedan obtener y purificar a partir de un sustrato acelular, sin homogeneización (degradación) de tejidos o células;

2)

se puedan obtener de manera continua en el marco de un proceso biotecnológico, a partir de un microorganismo inofensivo y no modificado por tecnología génica;

3)

sean hidrolasas ácidas, es decir, que su actividad máxima se desarrolle con un valor de pH ácido, y que sean más resistentes a los ácidos que las enzimas del páncreas;

4)

no procedan de tejidos u órganos del cerdo.

Esta misión se resuelve por medio de un medicamento que contiene enzimas, seleccionadas del grupo compuesto por hidrolasas, lipasas, proteasas, amilasas, glicosidasas, fosfolipasas, fosfodiesterasas, fosfatasas, obtenidas de ciliados.

Objeto de la invención son, en particular, medicamentos que se utilizan para estimular la digestión y para el tratamiento de trastornos digestivos.

Preferentemente, los medicamentos según la invención contienen enzimas que se usan para la digestión de macromoléculas tales como proteínas, ácidos nucleicos e hidratos de carbono, presentes en los alimentos, así como otros componentes de los alimentos tales como, por ejemplo, grasas o fosfolípidos, en el tracto gastrointestinal del hombre o del animal.

El experto en la técnica sabe que, de acuerdo con la invención, también se pueden usar, para estimular la digestión, o para el tratamiento de trastornos digestivos, enzimas de ciliados que no pertenecen a las lipasas, proteasas o amilasas utilizadas hasta la fecha, dado que también otras enzimas pueden estimular la digestión en el tracto gastrointestinal mediante la degradación catalítica de componentes alimentarios.

En una forma de realización de la invención, las enzimas desarrollan su efecto óptimo a un pH de 4-6.

Los medicamentos según la invención contienen, preferentemente, enzimas procedentes de ciliados de los géneros Tetrahymena, Colpidium, y Paramecium.

Preferentemente, los medicamentos según la invención contienen coadyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables.

Los medicamentos según la invención se utilizan, de manera particular, en forma de comprimidos, microgranulados, aceites, jarabes, geles, supositorios, cápsulas, y grageas.

Objeto de la invención es también el uso de enzimas de ciliados, seleccionadas del grupo compuesto por hidrolasas, lipasas, proteasas, amilasas, glicosidasas, fosfolipasas, fosfodiesterasas, y/o fosfatasas, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos digestivos, en especial de la dispepsia de origen medicamentoso, gastritis atrófica crónica, pancreatitis crónica, pancreatitis aguda, un trastorno digestivo de origen quirúrgico (mala digestión), o causado por una fibrosis quística.

La enzimas que producen los protozoos del orden de los Ciliados y que se utilizan en los medicamentos según la invención, son adecuadas para el tratamiento de trastornos digestivos. Además, las enzimas y composiciones enzimáticas procedentes de ciliados, contenidas en los medicamentos según la invención, así como su preparación, no presentan los inconvenientes de las enzimas pancreáticas o enzimas del pez capelín, o del krill, anteriormente mencionados.

Los ciliados segregan las enzimas al medio de cultivo que los rodea. La Tabla 1 muestra, por ejemplo, actividades enzimáticas de diferentes enzimas en el medio de cultivo de ciliados. Las actividades enzimáticas representadas en la Tabla 1 se han determinado con métodos habituales, descritos en la bibliografía. Para la medición de las lipasas, se utiliza el ensayo de azo-caseína (Muricane, 1986). Para la determinación de las lipasas y amilasas, se ha procedido de acuerdo con la prescripción de métodos de la FIP para amilasas fúngicas y lipasas microbianas (Demeester et al., en "Pharmaceutical Enzymes", Lauwers, A. y Scharpé, S. [recopiladores], Marcel Dekker, Nueva York, 1997, págs. 372-382). Para la determinación de la fosfatasa ácida y de la \beta-hexosaminidasa se ha utilizado un sustrato de p-nitrofenilfosfato o un sustrato de p-nitrofenil-N-acetil-\beta-D-glucosamina, como los descritos por Kly et al. (1996). La actividad de la fosfolipasa A_{1} se determinó mediante el ensayo radiométrico de enzimas (Hartmann et al., 2000).

TABLA 1 Actividad enzimática en el medio de cultivo extracelular (U/l), después de 72 h de cultivo sobre medio de leche desnatada, en un fermentador de 2 l

Ciliado	Proteasa	Lipasa	\alpha-amilasa	\beta-hexosaminidasa	Fosfolipasa A_{1}	Fosfatasa ácida
Tetrahymena	800 U/l	164 U/l	20 U/l	500 U/l	10 U/l	1.0 U/l
Colpidium	12 U/l	-	-	40 U/l	1,5 U/l	2.0 \hskip0.3cm 80 U/l

Los ciliados que segregan enzimas al medio de cultivo se pueden fermentar con un coste favorable, sobre medios de fermentación de precio razonable, en una elevada densidad celular y de forma continua. En este caso, las enzimas se pueden separar por filtración desde el fermentador a través de un módulo de perfusión (microfiltro) de manera acelular, separándolas, de este modo, de manera continua desde el medio de fermentación. El proceso de fermentación se puede mantener durante largos espacios de tiempo, mediante el aporte constante de medios nutrientes económicos (componentes: medio de leche desnatada y extracto de levadura).

Ejemplo 1

La Figura 1 muestra la cinética de secreción de un ciliado representada durante un período de fermentación de 14 días. Para la fermentación continua con módulo de perfusión se procedió, en este caso, del modo siguiente:

El sistema de biorreactor se basa en un fermentador de 2 l controlado por un procesador (BIOSTAT MD, BRAUN DIESSEL BIOTECH, Melsungen, Alemania), con una unidad de control DCU digital, y una unidad de bomba. La recolección del sobrenadante acelular tuvo lugar a través de un módulo de perfusión, y como agitador se utilizó un impulsor de paletas. En este caso, se usó una concentración de aceite de silicona de 1 ml/l. El número de revoluciones del agitador se limitó a 800 rpm, para proteger contra daños celulares. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo constante en 60% con ayuda de una regulación en cascada. Se asignó, en este caso, primera prioridad al índice de ventilación como variable controlable, y segunda prioridad al número de revoluciones del agitador, como control en cascada. La medición de la concentración de oxígeno se llevó a cabo con ayuda de un electrodo de O_{2} de amperimetría (INGOLD MESSTECHNIK, Steinbach). La temperatura en el fermentador se mantuvo en 30ºC a través del recipiente de doble pared y un termostato, y la regulación del pH a pH 7 se realizó, durante la fase de fermentación continua, por medio de una bomba de medio corrector, controlada por DCU, con ácido acético 4M. En la fase de fermentación continua, se alimentó leche desnatada al fermentador, y el medio consumido, que contiene enzimas, se separó del proceso de fermentación. Mediante el uso de una bomba, controlada por una sonda de conductividad, fue posible mantener constante el volumen de trabajo en dos litros. El sobrenadante acelular se recolectó, exento de partículas, sobre un módulo de perfusión, con un tamaño de poro de membrana de aprox. 0,3 \mum. El módulo de perfusión estuvo compuesto por un capilar de polipropileno S6/2 (ENKA, Wuppertal), arrollado sobre un soporte, con diámetros externo e interno de 2 y 1 ml, respectivamente, y una longitud de 2,8 m. El intercambio del volumen de medio por unidad de tiempo se definió como velocidad de perfusión. El aporte del medio de leche desnatada se pudo regular mediante el número de revoluciones de una bomba de manguera, de manera que se ajustó a una velocidad de perfusión de un volumen de fermentador (dos litros) al día. Antes de introducirlo en el autoclave, el fermentador se ensambló por completo con el dispositivo para eliminar la espuma y se recubrió con 1,8 litros de medio de leche desnatada sin glucosa. Después del proceso de autoclave, se bombearon a través del conducto de entrada 200 ml de una solución de glucosa al 10%. La conexión del recipiente de medio y del recipiente de recolección se efectuó mediante acoplamientos rápidos en el gabinete estéril. El cultivo de inoculación se trasvasó, en el gabinete estéril, a un matraz de Erlenmeyer de 500 ml equipado con una boca de salida inferior, y se bombeó al biorreactor a través de un conducto flexible y un manguito de inoculación separado.

Durante la fermentación, los ciliados permanecen intactos, de modo que el medio de cultivo contiene solamente las proteínas segregadas por los ciliados, y ningún componente intracelular. Por este motivo, es posible alcanzar en las enzimas obtenidas del medio de fermentación o de cultivo un elevado grado de pureza, con escasas etapas de purificación cromatográfica.

Ejemplo 2

En la Figura 2 se representan, a modo de ejemplo, las etapas cromatográficas para la purificación de una fosfolipasa a partir del medio de cultivo de los ciliados Tetrahymena. Se representan los perfiles de elución de tres etapas sucesivas de cromatografía de columna. En este caso, se presentan individualmente, en la Figura 2a como etapa 1, el perfil de elución de una cromatografía de interacción hidrófoba, en la Figura 2b, como etapa 2, el perfil de elución de una cromatografía de intercambio de aniones, y en la Figura 2c, como etapa 3, el perfil de elución de una cromatografía por exclusión de tamaño. Para las cromatografías siguientes se utilizaron, respectivamente, las fracciones activas de las anteriores. De este modo la enzima se pudo purificar, tras la última etapa, hasta una homogeneidad prácticamente completa (ausencia de aditivos ajenos, reducida fracción de proteínas ajenas). De manera comparable con este esquema de purificación, es posible purificar también otras enzimas de ciliados, tales como proteasas, lipasas, amilasas o \beta-hexosaminidasas.

Los ciliados son microorganismos apatógenos, que viven de manera autónoma (no parasitarios), que incluyen hasta un representante patógeno facultativo (Balantidium coli). De esta forma, por ejemplo, en la bibliografía se confirma para los ciliados Tetrahymena la clasificación GRAS ("generalmente reconocido como seguro", de las siglas en inglés "general recognized as save") (Tiedtke, 1994). Además, se considera probado que los ciliados no hospedan endoparásitos que se puedan transferir a otros organismos. Para las clases de ciliados importantes para la biotecnología, tales como Tetrahymena o Colpidium, no existen, además, virus ni otros endoparásitos adicionales. Por consiguiente, se puede excluir la posibilidad de una contaminación de la composición enzimática con impurezas tóxicas o pirógenas.

La Figura 3 muestra la representación de las actividades enzimáticas relativas de 3 enzimas, a partir del medio de cultivo del ciliado Tetrahymena a diferentes valores de pH (a = fosfolipasa A_{1}, b = triacil-glicerol-lipasa, c = \beta-hexosaminidasa).

Las enzimas procedentes de ciliados desarrollan, como hidrolasas ácidas, su actividad óptima a un valor de pH ácido. En la Figura 3 aparecen las actividades enzimática de 3 enzimas procedentes del medio de cultivo del ciliado Tetrahymena a diferentes valores de pH. De forma individual, se representan las actividades enzimática de la fosfolipasa A_{1} (Fig. 3a), y de la hexosaminidasa (Fig. 3b), así como la actividad enzimática absoluta de la lipasa (Fig. 3c).

De aquí se deduce que las enzimas de ciliados ejercen su actividad óptima a un valor de pH que se encuentra entre pH 4,1 y 6,5. La proteasa de ciliados exhibe una elevada actividad enzimática, incluso con un valor de pH de 3. En la siguiente Tabla 2, se representa la actividad de la proteasa de ciliados procedente del sobrenadante acelular (medio de cultivo), en función del valor de pH. Como se ha señalado anteriormente, las actividades enzimáticas se determinaron de acuerdo con los métodos prescritos por la FIP para amilasa fúngica y lipasa microbiana.

TABLA 2

Valor de pH	3	4	5	6
Actividad de proteasa (Unidades/litro)	2266 \pm 19%	1854 \pm 12%	1483,2 \pm 11%	11948 \pm 25%

Por esta razón, las enzimas de ciliados son también más resistentes al ácido que las enzimas pancreáticas. Como consecuencia, después de su paso a través del estómago exhiben una actividad considerablemente mayor en el duodeno que las enzimas pancreáticas.

En la Figura 4 se representa la resistencia al ácido de una proteasa del ciliado Tetrahymena frente a la pancreatina, después de 10 minutos de una fase de influencia de un valor de pH como el que se encuentra típicamente en el jugo gástrico (pH 1,5). El reducido valor de pH se simuló mediante la acción de un tampón ácido de alta molaridad (glicina 1 M/HCl, pH 1,5) a 37ºC.

Claims (7)

1. Enzima de ciliados para usar como medicamento, seleccionada del grupo compuesto por hidrolasas, lipasas, proteasas, amilasas, glicosidasas, fosfolipasas, fosfodiesterasas, fosfatasas.

2. Enzima de ciliados según la reivindicación 1, caracterizada porque las enzimas desarrollan su actividad óptima a un pH entre pH 4 - 6.

3. Enzima de ciliados según una de las reivindicaciones 1 y/o 2, caracterizada porque las enzimas proceden de ciliados del género Tetrahymena, Colpidium, Paramecium.

4. Enzima de ciliados según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque contiene, adicionalmente, coadyuvantes y vehículos farmacéuticos.

5. Enzima de ciliados según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque se presenta en forma de comprimidos, microgranulados, aceites, jarabes, geles, supositorios, cápsulas, grageas.

6. Uso de enzimas de ciliados, seleccionadas del grupo compuesto por hidrolasas, lipasas, proteasas, amilasas, glicosidasas, fosfolipasas, fosfodiesterasas y/o fosfatasas, para la producción de un medicamento para el tratamiento de trastornos digestivos.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que los trastornos digestivos están causados por dispepsia de origen medicamentoso, gastritis atrófica crónica, pancreatitis crónica, pancreatitis aguda, un trastorno digestivo de origen quirúrgico (mala digestión), o por una fibrosis quística.