JP4130179B2

JP4130179B2 - 骨髄腫を処置するためのｃ−ｋｉｔ阻害剤の使用

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Publication number: JP4130179B2
Application number: JP2003532044A
Authority: JP
Inventors: ケネス・シー・アンダーソン
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2002-09-26
Publication date: 2008-08-06
Anticipated expiration: 2022-09-26
Also published as: AU2002338807A1; JP2005504111A; US20040266779A1; EP1432422A2; US20090170862A1; WO2003028711A2; WO2003028711A3

Description

発明の詳細な説明

本発明は、骨髄腫を処置する薬剤を製造するためのｃ−ｋｉｔ阻害剤の使用；ｃ−ｋｉｔ阻害剤、特に本明細書の式Ｉで示される化合物の治療的有効量を骨髄腫に罹患した温血動物、特にヒトに投与することを含む該温血動物の処置方法；ｃ−ｋｉｔ阻害剤と、骨髄腫細胞のアポトーシスに影響を与える化合物、好ましくはデキサメタゾン、とを、要すれば少なくとも１種の医薬的に許容される担体と共に含む同時的、個別的または逐次的使用のための配合剤；および該配合剤を含む医薬組成物および商業的パッケージ；に関する。

本明細書で使用する用語「骨髄腫」は正常には骨髄に存在する型の細胞からなる腫瘍に関する。本明細書で使用する用語「多発性骨髄腫」は形質細胞の散在性悪性新生物を意味する。この疾患は多発性骨髄腫瘍病巣およびＭ成分（モノクローナル・イムノグロブリン断片）の分泌によって特徴付けられ、骨痛を起こす広範囲な溶骨性病変、病理的骨折、過カルシウム血症および正色性正赤血球性貧血を伴う。多発性骨髄腫は通常的な高用量化学療法の使用によっては治癒できない。

本明細書で定義する式Ｉで示される化合物、殊にＰＴＫ７８７（ＺＫ２２２５８４とも呼ばれる）はチロシンキナーゼ阻害剤であって、ＶＥＧＦＲのＡＴＰ結合部位に直接結合して血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）シグナルのトランスダクションを阻害するように設計されたものである。この薬剤はＫＤＲに対して最も特異的であるが、Ｆｌｔ−１およびＦｌｔ−４も阻害でき、またｃ−ｋｉｔも含む他のチロシンキナーゼ受容体にも活性を示す。ＰＴＫ７８７はマウスに正位性に移植したヒト癌腫数種の増殖を阻害するが、この癌腫にはＡ４３１扁平上皮癌、Ｌｓ１７４Ｔ結腸癌、ＨＴ−２９結腸癌およびＰＣ−３前立腺癌が含まれ、J. Wood, G. Bold, E. Buchdunger, et al. in Cancer Res. 60: 2178, 2000に報告されている。ＰＴＫ７８７はこれら癌細胞のいずれにも直接的効果を示さないが、腫瘍組織内では確かに血管密度を低下させるので、腫瘍組織内での一次的作用機序は血管形成阻害にあることが示唆されている。

驚くべきことに、今回、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、特に本明細書に定義する式Ｉで示される化合物および特にＰＴＫ７８７が骨髄腫細胞系統の増殖および患者骨髄腫由来であってＦｌｔ−１を発現する細胞の増殖を直接的に阻害することが発見された。これに加えて該化合物はトランスウェル細胞遊走検定法で試験すると骨髄腫細胞の遊走を阻害する。さらに該化合物、特にＰＴＫ７８７は骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）に付着する骨髄腫細胞の増殖と、ＢＭＳＣへの骨髄腫細胞の結合によって誘導されるＩＬ−６の分泌と、の双方を阻害できる。

それ故、本発明は骨髄腫を処置するための薬剤を製造するための、ｃ−ｋｉｔ阻害剤の使用に関するが、殊に式Ｉ：

［式中、
ｒは０〜２であり；
ｎは０〜２であり；
ｍは０〜４であり；
Ｒ_１およびＲ_２は
（ｉ）低級アルキルであるか、または
（ｉｉ）一緒になって部分構造式Ｉ^＊：

で示され、末端炭素原子２個を介して結合を達成する架橋構造を形成するか、または
（ｉｉｉ）一緒になって部分構造式Ｉ^＊＊：

［式中、環を構成する残基Ｔ_１、Ｔ_２、Ｔ_３およびＴ_４の１個または２個は窒素であり、他はいずれの場合もＣＨであり、この結合はＴ_１およびＴ_４を介して達成される］
で示される架橋構造を形成し；

Ａ、Ｂ、ＤおよびＥは相互に独立にＮまたはＣＨであるが、但し、この残基は２個を超えてＮであることはないものとし；
Ｇは低級アルキレン、アシルオキシまたはヒドロキシで置換された低級アルキレン、−ＣＨ₂−Ｏ−、−ＣＨ_２−Ｓ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−、オキサ（−Ｏ−）、チア（−Ｓ−）またはイミノ（−ＮＨ−）であり；
Ｑは低級アルキルであり；
ＲはＨまたは低級アルキルであり；
Ｘはイミノ、オキサまたはチアであり；
Ｙは非置換または置換のアリール、ピリジルまたは非置換または置換のシクロアルキルであり；そして
Ｚはアミノ、モノ置換またはジ置換のアミノ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシ、エーテル化またはエステル化されたヒドロキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、エステル化されたカルボキシ、アルカノイル、カルバモイル、Ｎ−モノ置換またはＮ，Ｎ−ジ置換のカルバモイル、アミジノ、グアニジノ、メルカプト、スルホ、フェニルチオ、フェニル−低級アルキルチオ、アルキルフェニルチオ、フェニルスルホニル、フェニル−低級アルキルスルフィニルまたはアルキルフェニルスルフィニルであり、ここに置換基Ｚが１個を超えて存在するならば、相互に同一であるかまたは相違し；
および波線で示される結合があれば一重結合または二重結合のいずれかであり；または
該化合物のＮ−オキシドはＮ原子の１個またはそれ以上が酸素原子を有する。］
で示されるｃ−ｋｉｔ阻害剤またはそのｃ−ｋｉｔ阻害剤に塩形成基が少なくとも１個あるならばその塩、の使用に関する。

式Ｉで示される化合物の定義に使用する残基および記号は参考のために本出願に引用する文献WO 98/35958に開示された意味を有する。

本発明は殊に、通常の化学療法に抵抗性の骨髄腫の治療に使用する薬剤を調製するためのｃ−ｋｉｔ阻害剤の使用に関する。

本明細書で使用する用語「ｃ−ｋｉｔ阻害剤」は、たとえば次項に記載するｃ−ｋｉｔ検定などで活性を示す化合物に関する：

バキュロウイルス・ドナー・ベクターｐＦｂａｃＧ０１（GIBCO）を用いて、ヒト・ｃ−ｋｉｔの細胞質キナーゼドメインのアミノ酸領域、アミノ酸５４４〜９７６を発現する組換えバキュロウイルスを作製する。ｃ−ｋｉｔの細胞質ドメインのコード配列をヒトの子宮ｃ−ＤＮＡライブラリー（Clontech）からＰＣＲによって増幅する。増幅したＤＮＡ断片とｐＦｂａｃＧ０１ベクターはＢａｍＨ１とＥｃｏＲＩを用いる消化により連結できるように適合させる。これらＤＮＡ断片の連結によってバキュロウイルスドナープラスミドｃ−ｋｉｔを得る。ウイルスの産生、Ｓｆ９細胞中での蛋白質の発現およびＧＳＴ−融合蛋白質の精製は次の通りに行う：

ウイルスの産生：ｃ−ｋｉｔのキナーゼドメインを含むトランスファーベクター（ｐＦｂａｃＧ０１−ｃ−ｋｉｔ）をＤＨ１０Ｂａｃ細胞系列（GIBCO）に遺伝子移入し、このトランスフェクトした細胞を選択寒天プレートに塗布する。融合配列の挿入がなかったウイルスゲノムを細菌内に有するコロニーは青色である。単一な白色コロニーを吊り上げ、標準的プラスミド精製操作によって細菌からウイルスＤＮＡ（バクミド：bacmid）を分離する。次に２５ｃｍ^２フラスコ中でセルフェクチン試薬（Cellfectin reagent）を用いてウイルスＤＮＡをＳｆ９またはＳｆ２１細胞（アメリカン・タイプカルチャー・コレクション）にトランスフェクトする。

Ｓｆ９細胞中でのプロテイン小規模発現の判定：遺伝子移入した細胞培養物からウイルス含有培地を収集し、力価を高めるための感染に使用する。感染２回後に得られるウイルス含有培地を大規模プロテイン発現に使用する。大規模プロテイン発現には、１００ｃｍ^２円形組織培養プレートに１プレート当り５×１０^７細胞で植菌し、ウイルス含有培地１ｍＬで感染させる（約５ＭＯＩ）。３日後、細胞をプレートから剥離し、５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。１００ｃｍ^２プレート１０〜２０枚からの細胞ペレットを氷冷溶菌緩衝液（２５ｍＭ―トリスＨＣｌ−ｐＨ７．５、２ｍＭ−ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ−ＤＴＴ、１ｍＭ−ＰＭＳＦ）５０ｍＬに再懸濁する。この細胞を氷冷下に１５分間攪拌し、次に５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。

ＧＳＴ標識プロテインの精製：遠心分離した細胞溶解液をグルタチオン−セファロースカラム（Pharmacia）２ｍＬに負荷し、２５ｍＭ−トリスＨＣｌ−ｐＨ７．５、２ｍＭ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ−ＤＴＴ、２００ｍＭ−ＮａＣｌの１０ｍＬで３回洗浄する。２５ｍＭ−トリスＨＣｌ−ｐＨ７．５、１０ｍＭ−還元グルタチオン、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＤＴＴ、１０％グリセリン混液１０回（１ｍＬづつ）によってＧＳＴ標識プロテインを溶離し、−７０℃で貯蔵する。

キナーゼ検定法：精製ＧＳＴ−ｃ−ｋｉｔを用いるチロシンプロテインキナーゼ検定法は酵素プロテイン２００〜１８００ｎｇ（比活性に依存して）、２０ｍＭ−トリスＨＣｌ−ｐＨ７．６、３ｍＭ−ＭｎＣｌ_２、３ｍＭ−ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ−ＤＴＴ、１０μＭ−Ｎａ_３ＶＯ_４、５μｇ／ｍＬのポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１、１％ＤＭＳＯ、１．０μＭ−ＡＴＰおよび０．１μＣｉ［γ^３３Ｐ］ＡＴＰを含む最終容量３０μＬ中で行う。活性は阻害剤の存在下または不在下に［γ^３３Ｐ］ＡＴＰからポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）基質への^３３Ｐの取り込みを測定して検定する。この検定（３０μＬ）は９６ウェルプレート中、下記の条件下に常温で２０分間行い、１２５ｍＭ−ＥＤＴＡ２０μＬを加えて停止させる。続いて反応混液４０μＬを予めメタノールに５分間浸漬し、水洗し、次に０．５％Ｈ_３ＰＯ_４に５分間浸漬し、および真空源との連絡を止めた真空マニフォルドに装着したImmobilon-PVDF膜（Millipore, Bedford, MA, 米国）に移す。サンプルを全てスポットし終わった後、真空源につなぎ、各ウェルを０．５％Ｈ_３ＰＯ_４２００μＬで洗浄する。膜を取外し、シェーカー上で４×１．０％Ｈ_３ＰＯ_４および１×エタノールで洗浄する。常温で乾燥し、Packard TopCount９６ウェルフレームに装着し、次にMicroscint TM（Packard）１０μＬ／ウェルを添加後、膜をカウントする。各化合物の４濃度（通常０．０１、０．１、１および１０ μＭ）における二重実験の阻害百分率の線形回帰分析によってＩＣ_５０値を算出する。プロテインキナーゼ活性の１単位は３７℃でプロテイン１ｍｇ当り毎分［γ³³Ｐ］ＡＴＰから基質プロテインへの^３３Ｐ−ＡＴＰ１ナノモルの移動であると定義する。

本発明に使用するｃ−ｋｉｔ阻害剤は前記検定において、好ましくは５０〜２５００ｎＭの間、より好ましくは２５０および２０００ｎＭの間、および最も好ましくは５００〜１２５０ｎＭの間、のＩＣ_５０値を示す。

さらに、本発明はｃ−ｋｉｔ阻害剤の治療的有効量を必要とする温血動物、特にヒトに投与することを含む骨髄腫、特に通常の化学療法に耐性の骨髄腫の処置方法に関し、好ましくは、本発明は前記式Ｉで示される化合物またはそのＮ原子の１個またはそれ以上が酸素原子を有する該化合物のＮ−オキシドまたは塩形成基を少なくとも１個有する該化合物ではその塩の治療的有効量を必要とする温血動物特にヒトに投与することを含む骨髄腫、特に通常の化学療法に耐性の骨髄腫の処置方法に関する。

本明細書で使用する用語「ＰＴＫ７８７」は式Ｉで示される化合物であって、式中、ｒ、ｎおよびｍは各々０であり；Ｒ_１およびＲ_２は一緒になって部分構造式Ｉ^＊で示される架橋構造を示し；Ａ、Ｂ、ＤおよびＥの各々がＣＨであり；Ｇはメチレンであり；Ｘはイミノであり；Ｙは４−クロロフェニルであり；波線で示される結合が二重結合であるものを意味する。

式Ｉで示される好適な化合物はＰＴＫ７８７である。さらに好ましくは、ＰＴＫ７８７はコハク酸塩の形で使用される。

本方法の記載では、活性成分についての記載はその医薬的に許容される塩も含むことを意味すると理解すべきである。例えば、活性成分が少なくとも１個の塩基性中心を有するならば、その活性成分が酸付加塩を形成できる。所望ならば、付加的に存在する塩基性中心を有するならば対応する酸付加塩も形成できる。酸性基（例えばＣＯＯＨ）を有する活性成分は塩基と共に塩を形成できる。本活性成分またはその医薬的に許容される塩は水和物の形でも結晶化に使用する別の溶媒を含んだままで使用してもよい。

本明細書および請求項を通して、骨髄腫は好ましくは多発性骨髄腫（ＭＭ）を意味する。

本明細書で使用する「処置」は骨髄腫に罹患している患者または該疾患の初期段階にある患者で該患者の疾患の進行を遅延させる効果を与える処置を含む。

デキサメタゾンは骨髄腫細胞にアポトーシスを起し、ＭＭを処置するための基本的薬剤である。驚くべきことに、ＰＴＫ７８７はデキサメタゾンのＭＭ細胞に対する効果を増強することが判明した。さらにその上、インターロイキン−６（ＩＬ−６）はＭＭ細胞にとって主な増殖因子であり、かつ生存因子であって、特にデキサメタゾンが誘導するアポトーシスからＭＭ細胞を保護することができる。本発明で、このＩＬ−６の保護効果をＰＴＫ７８７が克服することができることが証明された。

それ故、本発明はまた特に、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、好ましくは前記式Ｉで示される化合物と、骨髄腫細胞のアポトーシスを及ぼす化合物と、を同時的、個別的または逐次的使用のために含む、骨髄腫を処置する方法に使用する配合剤に関し、ここでは各活性成分はいずれの場合も遊離型または医薬的に許容される塩の形で存在し、要すれば少なくとも１種の医薬的に許容される担体が存在する。好ましくは、このような配合剤において骨髄腫細胞のアポトーシスを起こす化合物はデキサメタゾンである。

ＭＭ．１Ｓ細胞の遊走に対するＰＴＫ７８７の効果ＭＭ．１Ｓ細胞を濃度０μＭ−、１μＭ−、５μＭ−または１０μＭ−ＰＴＫ７８７と４時間接触させ、次にトランスウェル・システムの上室に添加する。下側のウェルに

を加え、細胞を５時間に下室まで遊走させる。ＶＥＧＦもＣＤ４０（○）も入れない下室は対照として用いる。遊走した細胞をBeckman Coulterカウンターで計数し、遊走係数を下記実施例２に記載のようにして算出する。本実験は三重に行い、標準偏差のバーを示す。

ＭＭ細胞系統および患者腫瘍細胞の増殖に対するＰＴＫ７８７用量に関連する効果ＭＭ．１Ｓ細胞およびＭＭ．１Ｒ細胞を、ＭＭ細胞系統および患者腫瘍細胞の増殖に対するＰＴＫ７８７用量に関連する効果ＲＰＭＩ８２２６および患者ＰＣＬ細胞を、ＭＭ細胞系統および患者腫瘍細胞の増殖に対するＰＴＫ７８７用量に関連する効果患者ＭＭ細胞およびＨＵＶＥ細胞を、

の存在下でインキュベーションした。
これに加え、ＨＵＶＥ細胞を

に接触させる。［^３Ｈ］−ｄＴの取込み百分率を標準品と比べて増殖を測定する。本実験は三重に行い、標準偏差バーを記載する。

各活性成分が遊離型または医薬的に許容される塩の型で存在し、要すれば医薬的に許容される担体少なくとも１種が存在するｃ−ｋｉｔ阻害剤と骨髄腫細胞のアポトーシスに影響する化合物とを含む配合剤を以後は本発明の配合剤と称する。

本発明の配合剤は製剤の組合せであるか、または医薬組成物であることができる。

本明細書で使用する「配合剤」は、前記各活性成分を独立に投与でき、または各活性成分を所定量の有効成分の組合せを用いて同時に投与でき、または各活性成分を異なる時点にも投与できるなどといった観点から特に一種の［パーツのキット］とも定義できる。このキットの各パーツはそれ故、たとえば同時的にまたは時系列的な差をつけて、すなわち異なる時点に、および等間隔または異なる時間間隔でこのキットの各パーツのいずれかの部分を投与することもできる。非常に好ましくは、各活性成分のいずれか一つのみを使用して得られるであろう効果よりも各パーツの組合せ使用における疾患治療効果が大きくなるように時間間隔を選択する。処方した製剤で投与すべき活性成分１と活性成分２との全量比は、たとえば処置する患者副集団の必要性に応じて、または患者の年齢、性別、体重等が相違する個々の患者の必要性に応じて変更できる。好ましくは、有益な効果が少なくとも１種あるが、これには、たとえば、第１活性成分と第２活性成分の効果の相互強化（特に相加作用以上の相乗作用）；追加的利点；副作用減少；第１および第２活性成分の一方または双方にとって非有効用量において有効な併用治療効果；および第１および第２活性成分の特に強い相乗作用などがありうる。

これに加えて、本発明は骨髄腫に対して併用治療的に有効な量の本発明の配合剤を必要とする温血動物に投与することを含む骨髄腫の処置法を提供する。

当業者は関連する試験モデルを選択して、ｃ−ｋｉｔ活性を阻害する化合物または本発明配合剤の本明細書に前記または後記する骨髄腫に対する有益な効果を証明することができる。ｃ−ｋｉｔ活性を阻害する化合物または本発明の配合剤の薬理学的活性は例えば適当な臨床試験でまたは下記実施例によって証明してもよい。適当な臨床試験には、例えば進行骨髄腫患者におけるラベルを公開した、非無作為の用量増加試験がある。このような研究では特に本発明の配合剤で観察される相乗作用について証明する。骨髄腫への有益な効果はそれ自体当業者に知られている試験の結果からまたは研究設計の変更によって直接判定できる。例えば、配合剤の第一の配合成分を固定用量で投与し、第二の配合成分の用量を極量（ＭＴＤ）に達するまで増量できる。あるいはプラセボで制御された二重盲検を行っても本明細書に記載する本発明の配合剤の利点を証明できる。

一般的事項
ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６ヒトＭＭ細胞系統はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；Rockville, MD）から入手する。患者由来のＭＭ細胞はY.T. Tai, G. Teoh, Y. Shima et al, J. Immunol. Methods 235:11, 2000に記載のようにして患者のＢＭサンプルから精製する。ヒトＭＭ細胞系統はすべて１０％ウシ胎児血漿（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタチオン（L-glut, GIBCO, Grand Island, NY）２ｍｍｏｌ／Ｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ（P／S、GIBCO）添加ＲＰＭＩ−１６４０培地（Sigma Chemical, St. Louis, MO）中で培養する。ＭＭ患者の細胞では、＞＝９５％がＣＤ３８＋、ＣＤ４５ＲＡ−である。骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）はＭＭ患者ならびに健康なドナーの吸引物からD. Gupta, S. Treon, Y. Shima et al, Leukemia, 2001およびS. Gartner, H.S. Kaplan in Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 77:4756, 1980に記載のようにして調製する。細胞は２０％ＦＢＳ、Ｌ−ｇｌｕｔ２ｍｍｏｌ／Ｌ、およびＰ／Ｓ１００μｇ／ｍＬ添加ISCOVE修正ダルベッコ培地で培養する。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ・Ｐ１６８）はClonetics, Biowhittakerから購入し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Clonetics, Biowhittaker）中に維持する。ＰＴＫ７８７はジメチルスルホキシド（DMSO; Sigma）に溶解し、使用するまで−２０℃で１００ｍＭ−ストック溶液として貯蔵する。全ての検定で化合物は０．０１μＭから１００μＭまでの範囲の濃度まで培養用培地で希釈する。全ての検定でＤＭＳＯ濃度を０．１％まで希釈する。

サイトカイン濃度は前記の共培養系からの上清中で測定する。ＶＥＧＦおよびＩＬ−６濃度は商品として入手可能なＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いて測定する。差の統計学的有意性は非対スチューデントｔ−検定を使用して判定する。有意性の最低水準はｐ＜０．０５とする。

細胞プロテイン溶解物、免疫沈澱およびウェスタンブロット分析
ＭＭ細胞を２％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ中で１２時間スターブし、次にＦＢＳ不含ＲＰＭＩ−１６４０中で、ＰＴＫ７８７またはＤＭＳＯ対照の存在下に１時間インキュベーションする。続いてこの細胞をK. Podar, Y.T. Tai, et al in Blood 98:428, 2001の記載に従って１００ｎＭ−ＶＥＧＦ_１６５で刺激する。次に細胞を１ｍＭ−ＰＭＳＦ、１ｍＭ−バナジン酸ナトリウムおよびProtease inhibitor cocktail（Boehringer Mannheim）添加ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解する。溶解物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で直接分析するか、またはＦｌｔ−１に対する抗体（Ａｂ）ならびにプロテインＧ・プラス−アガロース（共にSanta Cruz Biotechnology, CA、製品）と共に一夜インキュベーションする。全細胞溶解物（レーン当り３０μｇ）または免疫沈澱物を８％〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し；Hybond C Super paper（Amersham, Arlington Heights, IL）に移す；次にホスホ−ＥＲＫに対するマウスＭｏＡｂ、ホスホ−チロシン残基に対するマウスＭｏＡｂ、またはＦｌｔ−１またはＥＲＫ２に対するAbs（Santa Cruz）でプローブし；およびＨＲＰ−複合抗マウスまたは抗ウサギＡｂ（共にSanta Cruz）および強化化学発光（ＥＣＬ）基質溶液（Amersham）を使用して検出して証明する。

増殖および細胞生存率の検定
ＭＭ細胞を最初に２％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で１２時間スターブし、次に薬剤またはＤＭＳＯ対照の存在下に９６ウェルマイクロタイタープレート（Costar, Cambridge, MA）に塗布する。実験はまたＶＥＧＦ_１６５（R and D Systems）の存在下または不在下にも行う。増殖は［^３Ｈ］−チミジン（NEN Products, Boston, MA）の取り込みによって測定する。特定的には、細胞を４８時間培養の最後の６時間に［^３Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）でパルスし、automatic cell harvester（Cambridge Technology, Cambridge, MA）を用いてガラスフィルター上に収集し、LKB Betaplateシンチレーションカウンター（Wallac, Gaithersburg, MD）を使用してカウントする。細胞生存率の測定はCellTiter96 AQ_ueous One Solution Reagent（Promega, Madison, WI）を利用するＭＴＳ検定によって比色的に行う。細胞を４８時間培養の最後の２時間にＭＴＳと接触させ、ＥＬＩＳＡ plate reader（Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA）を用いて５７０ｎｍにおけるＯＤを測定して吸光度を測定する。

細胞周期分析
ＭＭ細胞（１×１０^６細胞）を薬剤またはＤＭＳＯ対照の存在下に２４、４８および７２時間培養する。次に細胞を燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、７０％エタノールで固定し、ＲＮＡｓｅ（Sigma）で処理する。次に細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ、５μｇ／ｍＬ）で染色し、Epics flow cytometer（Coulter Immunology, Hialeah, FL）を用いるＭソフトウェアで細胞周期の特徴を判定する。

実施例１ＭＭ細胞におけるＦｌｔ−１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ−４およびｃ−ｋｉｔの発現
ＶＥＧＦ受容体（Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−４、ＫＤＲ）およびｃ−ｋｉｔをＲＴ−ＰＣＲにより検出するために、RNeasy Mini-kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いて細胞系統から全ＲＮＡを抽出する。ＲＴ−ＰＣＲは全ＲＮＡ５μｇおよび正方向および逆方向プライマー各５０ｐＭを用いてthermal cycler（MJ Research, Watertown, MA）で行う。ＲＮＡはPlatinum Taq（Life Technologies, Gaithersburg, MD）を用いるSuperscript One-Step RT-PCRで３０サイクル以上にわたって増幅する。Ｆｌｔ−１、ＫＤＲおよびＦｌｔ−４を検出するプライマーは各々 R. Masood, J. Cai, et al in Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94:979, 1997; S. Dias, K. Hattori, et al, in J. Clin. Invest. 106:511, 2000;およびE. Fournier, P. Dubreuil, et al in Oncogene 11:921, 1995の記載に従って使用する。ＧＡＤＰＨの発現はＲＮＡサンプルの品質を測定するための対照として用いる。ＲＮＡサンプルがＤＮＡで汚染されていないことを確認するために、精製ＲＮＡを適当なプライマーおよび逆転写酵素不含Ｔａｑポリメラーゼとともにインキュベーションする。
ＰＣＲ産物の分析は、Ｆｌｔ−１がＭＭ細胞系統（ＭＭ．１Ｒ、ＭＭ．１Ｓ、ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６）ならびに血漿血球白血病（ＰＣＬ）患者由来の腫瘍細胞で発現されることを証明する。ｃ−ｋｉｔｍＲＮＡの発現は全てのＭＭ細胞系統に検出できる。対照的に、ＫＤＲはいずれのＭＭ細胞系統にも発現されない。また、Ｆｌｔ−４はＭＭ．１ＳおよびＭＭ．１Ｒ細胞にのみ発現される。

実施例２トランスウェル細胞遊走検定
遊走検定をポアサイズ８μｍ挿入物と２４ウェルプレートを用いて修正Boyden chamber systemで行う。検定前に、上室と下室をフィブロネクチン（１０μｇ／ｍＬ）で被覆する。ＭＭ．１Ｓ細胞を検定前に６時間２％ＲＰＭＩ培地でスターブし、次に薬剤またはＤＭＳＯ対照で４時間処理する。次にＭＭ細胞（２×１０⁶細胞／ｍＬ）をトランスウェルシステムの上室に入れる。下室にＲＰＭＩ（１％ＦＢＳ）、０ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ_１６５、またはＣＤ４０に対する活性化ＭｏＡｂ（１０ｎｇ／ｍＬ）を加える。次にプレートを３７℃で６時間インキュベーションし、下室の細胞を収集する。生存遊走細胞数はBeckman Coulterカウンターを用いてゲートし、測定する。遊走係数は細胞の遊走を対照と比較して算出する。本明細書では遊走係数をサンプル内生存遊走細胞（薬剤不在下または薬剤存在下、および±ＶＥＧＦ）百分率を対照内生存遊走細胞（無薬剤、無ＶＥＧＦ）百分率で割った商と定義する。
ＶＥＧＦはＭＭ．１Ｓ細胞の遊走を３．４倍（ｐ＝０．００１）増強すること、およびこの反応が１μＭ−ＰＴＫ７８７（ｐ＝０．００２）（図１）によって減少することが観察される。ＰＴＫ７８７（５μＭおよび１０μＭ）濃度がさらに高いとベースラインならびにＶＥＧＦ誘発ＭＭ．１Ｓ細胞遊走の両方を低下させる。対照的に、ＰＴＫ７８７はＣＤ４０が誘発するＭＭ．１Ｓ細胞の遊走を有意に阻害しない。

実施例３付着システム中でのＭＭ細胞の増殖
ＢＭＳＣ（１×１０⁴細胞／ウェル）を９６ウェルマイクロタイタープレートに塗布し、ＩＳＣＯＶＥ培地（２０％ＦＢＳ）中、３７℃で２４時間インキュベーションする。次にＭＭ細胞を薬剤またはＤＭＳＯ対照の存在下にＢＭＳＣ含有ウェル（５×１０^４細胞／ウェル）に加える。ＭＭ．１Ｓ細胞を使用する時は、ＢＭＳＣとＭＭ細胞との双方を２％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で１２時間スターブする。患者ＰＣＬ細胞を使用する時は、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地中で共培養を行う。ＢＭＳＣおよびＭＭ細胞は個別に培養して対照とする。４８時間後、増殖および細胞生存率を前記のようにして分析する。増殖検定のために全ての細胞が捕集されることを確認するために、収集の１０分前に１０×トリプシン（Sigma）を各ウェルに加える。

実施例４修正Boyden ChamberトランスウェルシステムにおけるＭＭ細胞の増殖
増殖は０．４ｍｍポアサイズ挿入物入り２４ウェルプレート（Costar）を使用して修正Boyden chamberトランスウェルシステムで測定する。ＢＭＳＣ（４×１０^４細胞／ウェル）を下室に塗布し、スターブし、前記のように薬剤中でインキュベーションする。次にＭＭ細胞（２０×１０^４細胞／ｍＬ）を上室に入れ（注入）、４８時間後に各室への［^３Ｈ］−チミジン取り込みを前記のように測定する。
図２〜図４に示すように、ＰＴＫ７８７はＭＭ．１Ｓ細胞、Ｄｅｘ−耐性ＭＭ．１Ｒ細胞、ＲＰＭＩ、患者血球白血病（ＰＣＬ）および患者ＭＭ細胞の増殖を用量依存性に減少する。ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）は有意ではないがＭＭ増殖の増加を中庸に刺激する。試験した殆どのＭＭ細胞系統に対するＰＴＫ７８７のＩＣ_５０は１〜５μＭの間である。ＨＵＶＥ細胞に対するＰＴＫ７８７のＩＣ_５０は０．１〜１μＭの間である。

実施例５ＭＭ．１Ｓ細胞増殖に及ぼすＰＴＫ７８７の効果
ＭＭ．１Ｓ細胞をトランスウェル共培養システムの上室に入れて、ＭＭ細胞とＢＭＳＣとの間の直接的接触は妨害されるが、体液性因子の拡散が可能になるようにする。両細胞型の間に接触がないに拘らず、ＢＭＳＣとインキュベーションしたＭＭ．１Ｓ細胞による［^３Ｈ］−ｄＴの取り込みは４８時間で約２．２倍（ｐ＜０．０００１）増加する。対照的に、この共培養システムではＢＭＳＣは［^３Ｈ］−ｄＴ取り込みの有意な増加を示さない。ＰＴＫ７８７（５μＭ）をこのシステムで使用する時には、ＭＭ．１Ｓ細胞の増殖は６２％（ｐ＜０．００１）低下する。

実施例６デキサメタゾンおよびＩＬ−６存在下でのＭＭ．１Ｓ細胞の増殖に及ぼすＰＴＫ７８７の効果
ＭＭ．１Ｓ細胞をデキサメタゾン（０．１または１μＭ）、ＰＴＫ７８７（５μＭ）、ＩＬ−６（２０および１００ｎｇ／ｍＬ）およびＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下または不在下に１％ＲＰＭＩ中で２４時間インキュベーションする。デキサメタゾンおよびＰＴＫ７８７はＭＭ．１Ｓ細胞の増殖を２４時間で各々５８％（ｐ＜０．００１）および３５％ｐ＜０．００１）阻害し、その生存率を各々８３％（ｐ＜０．００１）および４６％（ｐ＜０．００１）低下させる。ＩＬ−６はＭＭ．１Ｓの増殖をＤＭＳＯ対照に比べて１７％増強（ｐ＜０．００２）し、およびＭＭ．１Ｓ細胞をデキサメタゾンから保護する（ＩＬ−６存在下１６％阻害；ＩＬ−６不在下７０．５％阻害、ｐ＜０．００１）。予めＰＴＫ７８７に接触させた細胞にＩＬ−６を加えると、ＭＭ．１Ｓの増殖をさらに阻害（６４．７％対３９．３％、ｐ＜０．００１）し、細胞死を増加（５４％対６５％、ｐ＜０．０１）する。これに加え、ＰＴＫ７８７とデキサメタゾンの配合剤は、増殖を促進し、ならびにデキサメタゾンが誘導するアポトーシスからＭＭ．１Ｓ細胞の保護する、ＩＬ−６の性能を完全に阻止する。これらの効果はデキサメタゾン濃度０．１〜１μＭで認められた。さらに高濃度（１００ｎｇ／ｍＬ）のＩＬ−６でさえ、デキサメタゾンとＰＴＫ７８７との配合剤によるＭＭ．１Ｓ細胞の増殖阻害を低下させない。

実施例７ＭＭ細胞およびＢＭＳＣの増殖増加とＩＬ−６濃度増加との相関
ＭＭ．１Ｓ細胞とＢＭＳＣとの共培養物から得た上清液を４８時間に分離し、ＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡ検定で測定する。ＭＭ細胞とＢＭＳＣとの共培養物中ではＢＭＳＣ単独の培養物と比較してＩＬ−６濃度が上昇する（７．９倍、ｐ＜０．００１）。ＭＭ．１Ｓ細胞からのＩＬ−６分泌は検出限界以下である。ＰＴＫ７８７を共培養システムに加えると、接着ＭＭ細胞の増殖低下に関連してＩＬ−６濃度が有意に（７０％）低下する。トリパンブルー排除およびＭＴＳ検定で分析したＢＭＳＣ生存率は高く（９５％）維持されており、ＰＴＫ７８７がＢＭＳＣを殺さずにＩＬ−６の分泌を低下することを示唆する。

実施例８共培養システムにおけるＭＭ細胞の増殖に及ぼすＰＴＫ７８７の効果
ＭＭ．１Ｓ細胞または患者ＰＣＬ細胞をＢＭＳＣと共培養すると腫瘍細胞の増殖をＢＭＳＣとＭＭ細胞単独との組合せに比較して約１．８倍〜２．８に倍増大する。ＰＴＫ７８７（５μＭ）をこの共培養システムに添加すると、ＭＭ．１Ｓ細胞および患者ＰＣＬ細胞の両者の増殖が対照と比較して約７５％（ｐ＜０．０００１）も低下する。この効果はＢＭＳＣが正常ドナー由来であっても患者ＢＭ由来であっても観察される。

各実施例に示すようにＭＭ細胞はすべてｃ−ｋｉｔを発現する。ＭＭ細胞によるｃ−ｋｉｔの遍在的発現は、たとえば式Ｉで示される化合物またはＳＴＩ５７１Ｂ（WO 99/03854、特に実施例４および６に開示されているGleevec（登録商標）、Ｎ−｛５−［４−（４−メチルピペラジノメチル）ベンゾイルアミド］−２−メチルフェニル｝−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジンアミン・モノメシレート）として知られている化合物のようなｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼ阻害剤のＭＭ細胞増殖の阻害、それ故、骨髄腫の処置における使用の可能性を証明する。

さらにその上、各実施例は以下を証明する：
１）ＰＴＫ７８７（１〜５μＭ）はＭＭ細胞系統の増殖を阻止する。ＰＴＫ７８７はＶＥＧＦの存在下または不在下のいずれでも増殖を阻害し；
２）ＶＥＧＦが誘導するＭＭ．１Ｓ細胞の遊走は１μＭ−濃度のＰＴＫ７８７によってベースライン水準まで効果的に低下し；
３）デキサメタゾンおよびＰＴＫ７８７は独立にＭＭ．１Ｓ細胞の増殖を阻害するが、その阻害効果は少なくとも相加的であり；
４）重要なことは、ＰＴＫ７８７はＩＬ−６がＭＭ細胞増殖を刺激する効果を克服することであり、ＰＴＫ７８７は高ＩＬ−６濃度（１００ｎｇ／ｍＬ）の場合でさえ、デキサメタゾンがＭＭ細胞に誘発するアポトーシスに対してＩＬ−６が誘導する耐性を克服できることであり；
５）ＰＴＫ７８７は、ＢＭＳＣとの共培養でのＭＭ細胞増殖の増加を阻止する。ＰＴＫ７８７が共培養システムでＭＭ細胞の増殖を阻害できるという事実は、この薬剤がＭＭ細胞のＢＭＳＣへの付着によって与えられる保護を克服できることを示唆する。

要約すれば、各実施例はＰＴＫ７８７が臨床的に到達できる濃度でＭＭ細胞への直接的効果を有し、ならびにＢＭＳＣとＭＭ細胞との相互作用への効果も有することを示す。

ＰＴＫ７８７で本明細書に開示するモデルで得た結果ならびに他の試験および試験データは参考のために引用するCancer Research 2002, 62, 5019-5026に記載がある。

本発明の目的の一つは、骨髄腫に対して本発明の配合剤を併用治療的に有効な量で含む医薬組成物を提供することである。この組成物では配合相手は一緒に、順次に、または個別に投与でき、また一つの混合単位用量剤内でまたは別な単位用量剤２種としても投与できる。単位用量剤型は固定的配合剤であってもよい。

配合相手の個別投与のための医薬組成物および固定配合剤投与のための医薬組成物、すなわち本発明の配合相手少なくとも２種を含む単一ガレヌス製剤の医薬組成物はそれ自体公知の方法で製造でき；および哺乳類（ヒトを含む温血動物）への、たとえば経口投与または直腸投与のような経腸投与および非経口投与に適し；特に経口投与または非経口投与用に適する、治療的有効量の薬理学的に活性な配合相手少なくとも１種を単独でまたは医薬的に許容される担体１種またはそれ以上と組み合わせて含む。

新規医薬組成物は、たとえば約１０％〜約１００％、好ましくは約２０％〜約６０％の活性成分を含む。経口投与または非経口投与用の配合療法のための医薬製剤はたとえば糖衣錠、錠剤、カプセル剤または坐剤およびさらにアンプル剤のような単位用量剤型の製剤である。別に記載がなくてもこれらはそれ自体公知の方法、例えば通常の混合、顆粒化、糖衣、溶解または凍結乾燥工程などによって製造される。各薬剤単位を複数投与すれば必要な有効量を達成できるので、各用量型の個々の投与薬に含まれる配合相手の単位当り含量はそれ自体が有効量に達する必要がないことは認識されよう。

特に、本発明配合剤の各配合相手の治療的有効量は同時的にまたはいずれかの順序で逐次的に投与してもよく、各成分は個別に投与してもよく、または固定した配合剤として投与してもよい。例えば、本発明による骨髄腫の治療方法は、同時的にまたはいずれかの順序で逐次的な併用治療有効量、好ましくは相乗有効量、たとえば本明細書に記載する量に対応する日用量での（ｉ）遊離型または医薬的に許容される塩の形態の配合相手（ａ）の投与および（ｉｉ）遊離型または医薬的に許容される塩の形態の配合相手（ｂ）の投与を含む。本発明配合剤の個々の配合相手は治療経過内の異なる時間に個別に投与でき、または分割または単一配合剤型で同時的に投与できる。さらにその上、用語「投与」には生体内で配合相手自体に変換される配合相手のプロドラッグの使用も含む。本発明はそれ故、同時的または交互的な処置の計画全てを含むと理解されるべきであり、また用語「投与」はそのように解釈すべきである。

ｃ−ｋｉｔ活性を阻害するために使用する化合物の有効用量および本発明の配合剤に採用する配合相手の有効用量は、採用する特定化合物または採用する医薬組成物、投与形態、処置する骨髄腫の型、処置する骨髄腫の重症度に依存して変動させることができる。そこで、本発明配合剤の投与計画は投与経路および患者の直腸機能および肝機能を含む様々な因子に従って選択される。通常に熟練した医師、臨床医または獣医はｃ−ｋｉｔ活性を阻害する化合物の有効量または病状の進行を予防、反転、または抑止するために必要な本発明配合剤の単一活性成分の有効量を容易に判定し、処方できる。最適な的確さで毒性なく効果が得られる範囲の活性成分濃度を達成するためには標的部位に活性成分が到達する可能性に関する薬動力学に基づく投与計画が必要である。

Ｎ−｛５−［４−（４−メチルピペラジノメチル）ベンゾイルアミド］−２−メチルフェニル｝−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジンアミンモノメシレートを、好ましくは約５〜８５０ｍｇ／日、さらに好ましくは２５〜６００ｍｇ／日、および最も好ましくは１００〜３００ｍｇ／日の範囲の用量でヒトに投与する。本明細書に別段の記載がない限り、好ましくは毎日１回から４回本化合物を投与する。

温血動物が成人であれば、式Ｉで示される化合物、特にＰＴＫ７８７、の用量は好ましくは約１００〜１５００ｍｇ／日の範囲内、さらに好ましくは約２５０〜１２５０ｍｇ／日、最も好ましくは５００〜１０００ｍｇ／日である。

さらにその上、本発明は活性成分として本発明の配合剤を、その同時的、個別的または逐次的な骨髄腫の処置における使用に関する説明書とともに含む、商業用パッケージも提供する。

本発明は本明細書に定義する式Ｉで示される化合物の使用および骨髄腫を処置する薬剤を製造するための本発明配合剤の使用も提供する。

Claims

１−（４−クロロアニリノ）−４−（４−ピリジルメチル）フタラジンまたはその塩を有効成分とする骨髄腫処置用医薬。
骨髄腫が通常の化学療法に抵抗性である、請求項１に記載の医薬。
骨髄腫が多発性骨髄腫である、請求項１または２に記載の医薬。
デキサメタゾンと併用される、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬。
併用が、同時的、個別的または逐次的である、請求項４に記載の医薬。