JP4115642B2 - Ｉｉ型セリンプロテイナーゼインヒビターまたはその前駆体をコードする遺伝子配列を含むトランスジェニック植物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般に、プロテアーゼ感受性ペプチドおよびそれをコードする遺伝子配列に関する。
ヌクレオチド配列および核酸配列は、本明細書において引用文献の後に記載する配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）によって言及する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯの一般的な要約は実施例の前に記載してある。
【０００２】
【従来の技術】
ナス科（Solanaceae）およびマメ科（Fabaceae）に属する幾つかの種類の植物は、傷に対する応答の結果としてその貯蔵器官や葉にセリンプロテイナーゼインヒビターを蓄積する（ブラウン（Brown）およびライアン（Ryan）、１９８４；リチャードソン（Richardson）、１９７７）。これらタンパク質の抑制活性は、微生物および動物由来の広範囲のプロテイナーゼに対して向けられるが、植物のプロテイナーゼに向けられることは稀である（リチャードソン、１９７７）。これらインヒビターは、病原体および捕食者に対して植物を保護することに関与していると思われている。ジャガイモの塊茎およびマメ科植物の種子では、これらインヒビターは貯蔵タンパク質の１０％またはそれ以上を占めることがあり（リチャードソン、１９７７）、トマトやジャガイモの葉（グリーン（Green）およびライアン、１９７２）およびアルファルファ（ブラウンおよびライアン、１９８４）では、昆虫の攻撃または他のタイプの傷から４８時間以内にプロテイナーゼインヒビターは可溶性タンパク質の２％のレベルまで蓄積することがある（ブラウン＆ライアン、１９８４；グラハム（Graham）ら、１９８６）。これらインヒビターはまた、野性型のトマト、リコペルシコン・ペルビアヌム（Lycopersicon peruvianum）の未熟果にも高レベル（全可溶性タンパク質の５０％まで）で存在する（ピアス（Pearce）ら、１９８８）。
【０００３】
トマトおよびジャガイモにおいて２つのファミリーのセリンプロテイナーゼインヒビターが存在する（ライアン、１９８４）。Ｉ型のインヒビターは、単一の反応部位でキモトリプシンを抑制する小さなタンパク質（モノマーの分子量８１００）である（メルビル（Melville）およびライアン、１９７０；プランケット（Plunkett）ら、１９８２）。II型ファミリーのインヒビターは、一般に、２つの反応部位を有しており、その一方はキモトリプシンを抑制し、他方はトリプシンを抑制する（ブライアント（Bryant）ら、１９７６；プランケットら、１９８２）。II型インヒビターは１２,３００のモノマー分子量を有する（プランケットら、１９８２）。プロテイナーゼインヒビターＩは、黄化タバコ（ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum））の葉中に蓄積し（クオ（Kuo）ら、１９８４）、フィトフトラ・パラシチカ・ヴァル・ニコチアナ（Phytophthora parasitica var. nicotianae）からのエリシタは、タバコ細胞懸濁培養液中でのプロテイナーゼインヒビターＩの蓄積を誘発することがわかった（リッカウアー（Rickauer）ら、１９８９）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
他のプロテイナーゼインヒビターを同定すること、および病原体や捕食者に対する保護の優れたトランスジェニック植物の開発での使用の可能性を探る必要性が存在する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明に従い、プロテイナーゼインヒビター前駆体をコードする遺伝子配列をクローニングした。該前駆体は複数のプロテイナーゼインヒビタードメインを有しており、プロテイナーゼインヒビター発現の優れた広範囲のトランスジェニック植物を開発するうえで有用であろう。かかる植物は、病原体や捕食者に対する防御特性が優れているであろう。本発明の遺伝構築物はまた、昆虫（それ自体捕食者であるか、または植物病原体の宿主として働く）による食物摂取に対するワクチンを開発するうえでも有用であろう。組換え前駆体またはモノマー性のインヒビターはまた、局所噴霧や動物が食物を消化するのを助けるのに有用であろう。
【０００６】
従って、本発明の一つの態様は、植物からのII型セリンプロテイナーゼインヒビター（ＰＩ）前駆体をコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子に関する。その際、該前駆体は少なくとも３つのＰＩモノマーを含み、該モノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位であり、該モノマーの他のもののうち少なくとも一つはトリプシン特異的な部位である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において「核酸分子」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡ）であって、一本鎖または二本鎖であり、直線状または共有結合により閉じたものである。核酸分子はまた、全遺伝子またはその実質部分に対応するゲノムＤＮＡ、そのフラグメントまたはその誘導体であってよい。ヌクレオチド配列は、ゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンの天然に存在するヌクレオチド配列に対応していてよく、または単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を有していてよい。核酸分子中のかかる変異はすべて、少なくとも一つのモノマーまたはその活性部位をコードする能力を保持しているか、または他の種の同じもしくは類似の遺伝子配列のためのハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして有用である。
【０００８】
ＰＩ前駆体は、好ましくは少なくとも４つのＰＩモノマー、さらに好ましくは少なくとも５つのＰＩモノマー、さらに一層好ましくは少なくとも６つのＰＩモノマーを含む。さらに好ましくは、ＰＩ前駆体はさらにシグナル配列を含む。本発明のＰＩ前駆体は、個々のモノマーに開裂するためのプロセシング部位であるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本明細書において使用する「前駆体」なる語は、前駆体分子そのものの有用性を限定したり、ＰＩ活性が発現される前に該分子がまずモノマーにプロセシングされることを要求することを意図するものではない。該前駆体分子はＰＩ活性を有しており、本発明は該前駆体および該前駆体の個々のモノマーに関する。
【００１０】
さらに、本発明は、ハイブリッドII型セリンＰＩ前駆体をコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子にも関する。その際、該前駆体は異なるＰＩからの少なくとも２つのモノマーを含む。かかる少なくとも２つのモノマーは、個々のモノマーにプロセシングされ得ないように修飾することもできるし、またはそのようにプロセシングされる能力を保持させることもできる。好ましくは、これらモノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、これらモノマーの他方はトリプシン特異的な部位を有する。少なくとも３つのモノマーを有するのが好ましく、少なくとも４つのモノマーを有するのがさらに好ましく、少なくとも５つのモノマーを有するのがさらに一層好ましく、少なくとも６つのモノマーを有するのがもっと一層好ましく、その場合、少なくとも２つは異なるＰＩからのものである。最も好ましい態様において、これらモノマーの少なくとも一つはチオニン（thionin）である。かかるハイブリッドＰＩ前駆体および／またはそのモノマーは、「多価」な、すなわち広範囲の病原体や捕食者に対して（たとえば、真菌および昆虫の両者に対して）活性な分子を生成させるのに特に有用である。従って、本明細書において「ＰＩ前駆体」というときはハイブリッド分子をも包含するものである。
【００１１】
本発明は、下記ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および対応アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を有するニコチアナ・アラタ（Ｎicotiana alata）由来の核酸分子の単離を例として挙げる。
【００１２】
【００１３】
しかしながら、上記例示は、本発明が他の植物からの等価なまたは実質的に同様の核酸分子をも包含することを理解したうえでのことである。「等価な」および「実質的に類似の」とは、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、抗体反応性、モノマー組成および／または前駆体のプロセシングによるモノマー生成のレベルにおいて等価および実質的に類似であることを意味する。たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列と比較した場合に少なくとも５５％、たとえば約６０〜６５％、７０〜７５％、８０〜８５％および９０％以上のパーセントの配列類似性を有するヌクレオチド配列は本発明の主題の核酸分子に「実質的に類似」していると考えられる。ただし、そのような実質的に類似の配列が、上記のように少なくとも３つのモノマー、好ましくは４つ、５つまたは６つのモノマーを有するＰＩ前駆体をコードすることを条件とする。
【００１４】
特に好ましい態様において、本発明の核酸分子はさらに、転写解読枠の５’側のシグナル配列および／またはコード領域の３’側のヌクレオチド配列をもコードして下記のような完全なヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびその実質的に類似性の変異体を提供する。
【００１５】
【００１６】
従って、本発明の好ましい態様は、ニコチアナ・アラタ由来のII型セリンＰＩ前駆体または該前駆体もしくは少なくとも一つのドメインに対して少なくとも５５％の類似性を有する配列をコードするかまたは該コード配列に相補的なＳＥＱＩＤ ＮＯ：１または２に示すヌクレオチドの配列を含む核酸分子を提供する。その際、該前駆体はシグナルペプチドおよび少なくとも５つのモノマーを含み、該モノマーのうちの一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、該モノマーの残りの４つはトリプシン特異的な部位を有する。
さらに好ましい態様において、該核酸分子はｃＤＮＡ分子であり、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１または２に一般に示すヌクレオチド配列または本明細書において定義するように該配列の全体またはそのドメインに実質的に類似な配列を含む。
【００１７】
本発明の他の態様は、キモトリプシン特異的な部位かまたはトリプシン特異的な部位のいずれかを有する単一のII型セリンＰＩをコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子に関する。その際、該ＰＩは、少なくとも３つのモノマーを有し、そのうち少なくとも一つがキモトリプシン部位を有し残りがトリプシン部位を有する前駆体ＰＩの一つのモノマーである。しかしながら、本発明の前駆体は、４つ、５つまたは６つのモノマーを有し、上記に定義のごとくであるのが好ましい。
【００１８】
最も好ましい態様において、植物は自家不和合性の遺伝子型Ｓ1Ｓ3、Ｓ3Ｓ3またはＳ6Ｓ6を有するニコチアナ・アラタ（リンク（Link）およびオット（Otto））であり、核酸分子は成熟植物の柱頭および花柱から単離しうる遺伝子配列から単離しうるまたは該配列に相補的なものである。対応ｍＲＮＡは約１.４ｋｂであり、ｃＤＮＡは６つの保存されたドメインを有し、そのうち最初の２つのドメインは１００％同一でありキモトリプシン特異的な部位（Ｌｅｕ−Ａｓｎ）を有する。第三、第四および第五のドメインは９５〜９８％の同一性を有し、トリプシンに特異的な部位（Ａｒｇ−Ａｓｎ）を有する。第六のドメインもまたトリプシン特異的な部位を有するが、主に３’配列の相違により（表１参照）第三、第四および第五のドメインに対する同一性は低い（７９〜９０％）。本発明の好ましいＰＩインヒビターは約４２〜４５ｋＤａの分子量を有し、約２９アミノ酸のシグナル配列を有する。
【００１９】
モノマー性ＰＩのＮ末端配列は、ＰＩ前駆体タンパク質の予測される配列中の６つの各繰り返しドメインにおいて表示されている。それゆえ、ＰＩ前駆体タンパク質は６つの部位で開裂されて７つのペプチドを生成すると思われる。これら７つのペプチドのうち６つのペプチド（ペプチド２、３、４、５、６および７）（図１、それぞれ、残基２５〜８２［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５］、８３〜１４０［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６］、１４１〜１９８［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７］、１９９〜２５６［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８］、２５７〜３１４［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９］および３１５〜３６８［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９］）はモノマー性ＰＩと同じ分子量（約６ｋＤａ）を有し、同じＮ末端配列を有する。ペプチド７はトリプシンまたはキモトリプシンに対する共通部位を有しない。ペプチド１（残基１〜２４［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４］、図１）は６ｋＤａよりも小さく、異なるＮ末端を有し、精製したモノマー性ＰＩ調製物中で検出されなかった。ペプチド１とペプチド７とは、これら２つのペプチド間で形成されたジスルフィド結合により正しいコンホメーションに保持されたペプチド１上の抑制部位として機能的なプロテイナーゼインヒビターを形成すると思われる。
【００２０】
本発明を一つの仮定に限定することを意図するものではないが、ＰＩ前駆体は、たとえばＡｓｎ−Ａｓｐ結合の開裂に関与するプロテアーゼによってプロセシングを受けて生物学的に活性なモノマーを生成するのかもしれない。さらに詳しくは、プロセシング感受性の配列はＲ1−Ｘ1−Ｘ2−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ1およびＸ2は以下に定義する通り）である。かかる配列の発見により、プロテアーゼ感受性配列の開裂により植物中でプロセシングを受けうるペプチドおよびポリペプチドを製造することが可能となるであろう。本発明の該観点に従い、アミノ酸配列：
−Ｘ1−Ｘ2−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
（式中、Ｘ1およびＸ2はいかなるアミノ酸であってもよいが、両方ともＬｙｓ残基であるのが好ましい）を含むプロテアーゼ感受性ペプチドが提供される。
【００２１】
プロテアーゼ感受性配列はまた、
Ｒ1−Ｘ1−Ｘ2−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｒ2
（式中、Ｘ1およびＸ2は同じであるのが好ましく、両方ともＬｙｓ残基であるのが好ましく、Ｒ1およびＲ2は同じかまたは異なるＤまたはＬアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非アミノ酸残基または分子、たとえば当業者に明らかなように、アルキル（たとえば、メチル、エチル）、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アシル、ジエニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ハロ（たとえば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ）、ハロアルキル、ニトロ、ヒドロキシ、チオール、スルホニル、カルボキシ、アルコキシ、アリールオキシおよびアルキルアリールオキシなどである）としても表示される。アルキル、置換アルキル、アルケニルおよび置換アルケニルなどは、直鎖および分枝鎖分子、低級（Ｃ1〜Ｃ6）および高級（Ｃ6以上）誘導体を意味する。「直鎖」なる語は、上記すべての置換基を包含する。
【００２２】
最も好ましい態様において、プロテアーゼ感受性ペプチドは
Ｒ1−Ｘ1−Ｘ2−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｒ2
（式中、Ｒ1およびＲ2は同じかまたは異なるペプチドまたはポリペプチドであり、Ｘ1およびＸ2はともにＬｙｓ残基である）である。
かかるプロテアーゼ感受性ペプチドは、適当な宿主中またはインビトロで発現させることにより大きな分子を該プロテアーゼ感受性ペプチド間に位置するペプチドにプロセシングすることができるように、同じかまたは異なるモノマー間に置くことができる。
【００２３】
本発明はまた、配列：
−Ｘ1−Ｘ2−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
（式中、Ｘ1およびＸ2は好ましくは同じであり、最も好ましくは両方ともＬｙｓ残基である）を含むプロテアーゼ感受性ペプチドをコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子にも関する。かかる核酸分子は、たとえば、プロテアーゼ感受性配列によって個々のペプチドまたはモノマーにプロセシングされうる前駆体ポリペプチドをコードする一層大きなヌクレオチド配列の一部であってよい。
【００２４】
本発明のプロテアーゼ感受性ペプチドは、複（ポリ）価および／または多価「前駆体」を生成するうえで特に有用であり、該前駆体は各モノマーが同じかまたは異なっており、各モノマーは抗ウイルス活性、抗細菌活性、抗真菌活性、抗病原体活性および／または抗捕食者活性などの同じかまたは異なる活性を有する。本発明の該観点を一つの仮定または提唱された作用機構に限定することを意図するものではないが、プロテアーゼはＡｓｎ残基に隣接して、さらに詳しくはＡｓｎ−Ａｓｐ残基間で作用すると思われる。
【００２５】
本発明はまた、植物から単離したII型セリンＰＩ前駆体にも関する。該前駆体は、少なくとも３つのＰＩモノマーを含み、これらモノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、これらモノマーの残りの少なくとも一つはトリプシン特異的な部位を有する。このＰＩ前駆体は、４つ、５つまたは６つのモノマーを有し、上記核酸分子によってコードされているのが好ましい。本発明はまた、該前駆体を構成する個々のモノマーにも関する。本発明はまた、上記のように異なるＰＩからの少なくとも２つのモノマーを含むハイブリッド組換えＰＩ前駆体分子にも関する。
【００２６】
単離したＰＩまたはＰＩ前駆体は、組換えの形態であっても、および／または生物学的に純粋であってもよい。「生物学的に純粋」とは、硫酸アンモニウム沈殿、セファデックスクロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーを含む少なくとも一つの精製工程を施したＰＩ、ＰＩ前駆体および／またはその混合物の調製物を意味する。該調製物は、重量、活性抗体、反応性および／またはアミノ酸含量により決定して少なくとも２０％のＰＩ、ＰＩ前駆体またはその混合物を含むのが好ましい。さらに好ましくは、該調製物は、３０〜４０％、５０〜６０％または少なくとも８０〜９０％のＰＩ、ＰＩ前駆体またはその混合物を含む。
【００２７】
ＰＩまたはその前駆体は、天然に存在するものであってもよいし、または上記核酸変異体によってコードされるような変異体であってもよい。ＰＩまたはその前駆体はまた、そのアミノ酸配列または炭水化物および／または脂質残基などの非タンパク質成分に対して置換、欠失および／または付加を有していてよい。
組換えおよび単離ＰＩ、ＰＩ前駆体およびその混合物は、研究室試薬として、抗体の産生に、局所的に投与する殺虫剤並びに経口的に摂取する殺虫剤として有用である。
組換えＰＩまたはＰＩ前駆体は、殺虫剤として、単独または１または２以上の担体またはＢＴ結晶タンパク質などの他の殺虫剤と組み合わせて提供される。
【００２８】
本発明のＰＩは、病害虫の増殖または感染および真菌、細菌および昆虫などの病原体に対して、植物の器官、たとえば柱頭を防御する働きを有すると考えられる。それゆえ、ＰＩ前駆体（このものは、モノマー性ＰＩ自体のモノマーにプロセシングされうる）を発現しうるトランスジェニック植物を生成するのに用いることのできる遺伝的構築物を開発する必要性が存在する。
【００２９】
従って、本発明の他の態様は、植物由来のII型セリンＰＩ前駆体またはそのモノマーをコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子を含む遺伝子構築物を包含する。その際、該前駆体は少なくとも３つのＰＩモノマーを含み、これらモノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、残るモノマーのうち少なくとも一つはトリプシン特異的な部位を有し、該遺伝子配列はさらに、該核酸分子の発現を可能にする発現手段、植物細胞中での複製を可能にする複製手段、または該核酸分子の植物細胞ゲノム中への安定な組み込みを可能にする組み込み手段を含む。発現は、発育に伴ってまたは感染に応答して、たとえば存在するＰＩ制御配列によって、制御されるのが好ましい。核酸分子の発現が高められることによって、天然に存在する植物中に認められるレベルに比べてＰＩの内生レベルが大きくなるのが好ましい。または、本発明のＰＩ前駆体ｃＤＮＡはプロモーター配列を得るのに用いることができ、該プロモーター配列を今度は遺伝子構築やその操作に用いて等価な内生プロモーターの過剰発現を可能とすることができる。他の態様において、ＰＩ前駆体は上記のようなハイブリッド分子である。
【００３０】
本発明のさらに別の態様は、上記遺伝子配列および／または核酸分子を有し、必要によりＰＩおよび／またはＰＩ前駆体またはハイブリッドＰＩ前駆体の産生レベルを上昇させ、高め、あるいは一層迅速にすることのできるトランスジェニック植物に関する。この植物は穀物植物またはタバコ植物であるのが好ましいが、ＰＩまたはＰＩ前駆体の核酸分子を発現することができる限り他の植物を用いることもできる。トランスジェニック植物がＰＩ前駆体を産生する場合には、該植物は該前駆体をさらにモノマーにプロセシングしてもよいし、またはプロセシングしなくてもよい。または、該遺伝子配列は、昆虫に伝播するためのウイルスまたは細菌ベクターの一部であってもよく、それによって昆虫中の病原体を制御し、結果的に該病原体の植物への伝播を妨害することができる。
【００３１】
本発明のさらに他の態様において、ＰＩ前駆体またはその１または２以上のモノマーに対する抗体が提供される。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、発現ライブラリーにおいてＰＩまたはＰＩ前駆体クローンをスクリーニングするうえで、または発酵液、上澄み液または植物抽出液中のＰＩまたはＰＩ前駆体を精製するうえで有用である。
本発明の遺伝子構築物はまた、昆虫の消化管中に住まわせて、該昆虫自体または該昆虫中の植物病原体に有害な作用をさせたり、または動物の消化管中への導入を容易にして植物物質の消化を容易にしたりするために用いることもできる。
【００３２】
つぎに、本発明を以下の図面および実施例により記載するが、これらに限られるものではない。
図面：
図１は、ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびニコチアナ・アラタＰＩタンパク質の対応アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。該アミノ酸配列は、成熟タンパク質の最初のアミノ酸を１としてナンバーを付してある。シグナル配列はヌクレオチド１〜９７によりコードされており、これらアミノ酸残基にはマイナスの番号を付してある。インヒビターの反応部位残基は囲ってある。ニコチアナ・アラタＰＩ配列は、６つの類似のドメイン（ドメイン１、残基１〜５８、ドメイン２、残基５９〜１１６、ドメイン３、残基１１７〜１７４、ドメイン４、残基１７５〜２３２、ドメイン５、残基２３３〜２９０、ドメイン６、残基２９１〜３４３）を有する。
【００３３】
図２は、ニコチアナ・アラタの種々の器官からのＲＮＡのゲルブロット分析を示す写真表示である。ニコチアナ・アラタの器官およびニコチアナ・タバクム（Ｎ.tabacum）およびニコチアナ・シルベストリス（Ｎ.sylvestris）の柱頭および花柱から単離したＲＮＡのゲルブロットは、ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２とハイブリダイズした。Ｓｔ、柱頭および花柱；Ｏｖ、子房；Ｐｏ、花粉；Ｐｅ、花弁；Ｓｅ、萼片；Ｌ、傷のない葉；Ｌ４、傷から４時間後の葉；Ｌ２４、傷から２４時間後の葉；Ｎｔ、ニコチアナ・タバクムの柱頭および花柱；Ｎｓ、ニコチアナ・シルベストリスの柱頭および花柱；Ｎａ、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片。
ＮＡ−ＰＩ−２クローンは、２つのｍＲＮＡ種（１.０および１.４ｋｂ）とハイブリダイズした。大きい方のｍＲＮＡは柱頭および花柱において主としてみられ、一方、小さい方のｍＲＮＡ種は他の組織において一層明らかに認められた。高厳格洗浄後、柱頭および花柱からの１.０ｋｂ ｍＲＮＡはＮＡ−ＰＩ−２プローブにもはやハイブリダイズしない。
【００３４】
図３は、柱頭および花柱でのＮＡ−ＰＩ−２に相同なＲＮＡのインシトゥ局在を示す写真表示である。
（ａ）32Ｐ標識したＮＡ−ＰＩ−２ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた後の１ｃｍ長の芽の柱頭および花柱の縦方向の凍結切片の放射能写真；
（ｂ）トルイジンブルーで染色した（ａ）と同じ切片。ｃ、皮層；ｖ、維管束；ｔｔ、導管；ｓ、柱頭組織。
ｃＤＮＡプローブは柱頭の細胞を強く標識し、維管束への幾つかのハイブリダイゼーションも認められる。表皮、皮層または導管へのハイブリダイゼーションは認められなかった。スケール棒＝２００μｍ。
【００３５】
図４は、ニコチアナ・アラタのゲノムＤＮＡのゲルブロット分析を示す写真表示である。制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIIIで消化し放射性標識したＮＡ−ＰＩ−２でプローブしたニコチアナ・アラタゲノムＤＮＡのゲルブロット分析。サイズマーカー（ｋｂ）は、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片である。ＥｃｏＲＩにより２つのハイブリダイズする断片（１１ｋｂおよび７.８ｋｂ）が得られたが、ＨｉｎｄIIIからは３つの大きなハイブリダイズする断片（１６.６、１３.５および１０.５ｋｂ）が得られた。ＮＡ−ＰＩ−２クローンは、少なくとも２つの成員からなる小さな多重遺伝子族に属すると思われる。
【００３６】
図５は、ニコチアナ・アラタの種々の器官におけるＰＩ活性のグラフ表示である。種々の器官からの緩衝液溶解性の抽出物について、トリプシンおよびキモトリプシンを抑制する能力を試験した。柱頭および萼片抽出物が、トリプシン（Ａ）およびキモトリプシン（Ｂ）の両方に対する最も有効なインヒビターであった。
【００３７】
図６は、ニコチアナ・アラタの柱頭からのＰＩ精製の工程を示す。
（ａ）柱頭抽出物からの硫酸アンモニウム沈殿したタンパク質のセファデックスＧ−５０ゲル濾過クロマトグラフィー。ＰＩ活性はプロフィールの後期に溶出した。
（ｂ）ゲル濾過カラムからのフラクションの２０％ｗ／ｖ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（レムリ（Laemmli）、１９７０）。ゲルを銀染色し、分子量マーカー（ファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンにて示す。約６ｋＤのタンパク質（矢印）がプロテイナーゼインヒビター活性とともに溶出した。
（ｃ）精製手順の種々の段階でのＰＩ含有フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。レーン１、粗製の柱頭抽出物（５μｇ）；レーン２、８０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムにより沈殿させた柱頭タンパク質（５μｇ）；レーン３、キモトリプシンアフィニティーカラムから溶出したＰＩタンパク質（１μｇ）。
ＰＩは６ｋＤのタンパク質であり、柱頭からの非フラクション化緩衝液可溶性抽出物中の主要な成分である。
【００３８】
図７は、ニコチアナ・アラタおよびジャガイモおよびトマトＰＩIIｃＤＮＡからのＮＡ−ＰＩ−２クローンによりコードされるＰＩタンパク質のハイドロパシー（hydropathy）プロットを示すグラフ表示である。線よりも上にある値は疎水性の領域を示し、線よりも下の値は親水性の領域を示す。推定シグナルペプチドには陰影を施してある。疎水性プロフィールは、カイト（Kyte）およびドゥーリトル（Doolittle）（１９８２）の予測則および９の連続アミノ酸の連なりを用いて作成した。
（ａ）ニコチアナ・アラタＰＩタンパク質のハイドロパシープロフィール。予測された前駆体タンパク質中の６つの繰り返しドメインをＩ〜ＶＩとして表示してある。６ｋＤ ＰＩ種を産生するための推定開裂部位を含む親水性領域には矢印を付してある。これら部位における開裂により生成されるペプチドに対応する領域は、キモトリプシンインヒビターに対してはＣで、トリプシンに対してはＴで、２つの両側の配列に対してはｘで表示してある。
【００３９】
（ｂ）ジャガイモＰＩIIタンパク質のハイドロパシープロフィール（サンチェス−セラーノ（Sanchez−Serrano）ら、１９８６）。ＰＩIIタンパク質中の２つの繰り返しドメインをＩおよびIIで表示してある。ＰＣＩ−１を産生するための推定開裂部位には矢印を付してあり、ＰＣＩ−１の領域にはマークを付してある。
（ｃ）トマトＰＩIIｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのハイドロパシープロフィール（グラハムら、１９８５）。２つのドメインにはＩおよびIIの表示を付してあり、プロセシング部位の可能性のある残基には矢印を付してある。これら部位は親水性と予測される領域中には存在せず、それゆえ、開裂産物にはマークを付していない。
【００４０】
図８は、生育中の花の柱頭中のＰＩタンパク質のイムノブロット分析を示す。
（ａ）ニコチアナ・アラタの生育中の花。
（ｂ）（ａ）に示す生育の各段階における柱頭タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、５μｇの各抽出物を負荷した。ペプチドゲルを銀染色し、分子量マーカー（ＬＫＢ・ロー・モレキュラー・ウエイト（ＬＫＢ Low Molecular weight）およびファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンで示してある。
（ｃ）抗ＰＩ抗血清でプローブした（ｂ）と同じゲルのイムノブロット。
生育中の花の柱頭には、抗ＰＩ抗体に結合する約４２ｋＤ、３２ｋＤ、１８ｋＤおよび６ｋＤの４つのタンパク質が含まれる。４２ｋＤおよび１８ｋＤ成分は、花が成熟するにつれて濃度が減少していくのに対して、６ｋＤ ＰＩタンパク質は開花の直前に最大濃度に達する。３２ｋＤ成分（二重線として現れる）のレベルは、花の発育の間有意に変化しない。
【００４１】
図９は、ニコチアナ・アラタからの６ｋＤプロテイナーゼインヒビター種の分離および同定を示す。
Ａ．逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる６ｋＤ ＰＩの分離
４つの主要なピークが、約１５.５分（ピーク１）、２０.５分（ピーク２）、２２.５分（ピーク３）、２４分（ピーク４）の保持時間にて得られた。各ピークにおけるペプチドは、Ｎ末端分析および質量分析の両者の組み合わせにより同定した。Ｃ１およびＴ１〜Ｔ４についてはＢを参照。
Ｂ．ＰＩ前駆体タンパク質から得られた５つの相同なペプチド：Ｃ１、キモトリプシンインヒビター、Ｔ１〜Ｔ４、トリプシンインヒビター。太線は、これらインヒビターの反応部位を示す。前駆体タンパク質は、シグナル配列を除いて描写してある。図中点線部は、６つの繰り返しドメインの領域（アミノ酸１〜３４３、図１）。図中斜線部は、非繰り返し配列（アミノ酸３４４〜３６８、図１）。矢印は、前駆体タンパク質におけるプロセシング部位を示す。
【００４２】
Ｃ．ｃＤＮＡクローンから予測され精製タンパク質のＮ末端シークエンシングにより確認されたＣ１およびＴ１〜Ｔ４のアミノ酸配列。各ペプチドのカルボキシ末端におけるアミノ酸は、電子スプレー（electro−spray）質量分析計を用いた正確な質量測定により得られた。Ｃ１およびＴ１インヒビターは、５つのアミノ酸において異なっている（太字）。これらアミノ酸のうちの２つは反応部位に位置しており（下線）、他の２〜３の残基はカルボキシ末端に位置している。ペプチドＴ２〜Ｔ４は３つのアミノ酸が変化しており（囲み）、これらはＣ１とＴ１との間では保存されている。ペプチドＴ２およびＴ３は互いに同一である。質量分析を用い、Ｎ末端およびＣ末端における正確でないトリミングのために他の形態のＣ１およびＴ１〜Ｔ４が存在することを示した。すなわち、幾つかの形態は残基１または残基５３が失われており、他のものは残基１および残基５３の両方が失われている（表２参照）。
【００４３】
図１０は、前駆体ＰＩタンパク質のプロセシング部位の周辺のアミノ酸配列を示す。
太字で示した配列は、精製ＰＩタンパク質から得たアミノ末端配列である。マイナスの番号を付した配列は、ｃＤＮＡクローンから予測されるフランキング配列である。予測された前駆体タンパク質は、この配列の６つの繰り返しを含む。
【００４４】
図１１は、バクロウイルス発現系で生成されたＰＩ前駆体、およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎによるアフィニティー精製ＰＩ前駆体の消化後に得られた生成物を示す。
Ａ．組換えバクロウイルスにより生成されたＰＩ前駆体
発育の緑芽段階におけるニコチアナ・アラタ柱頭からアフィニティーおよびＨＰＬＣ精製したＰＩ前駆体（レーン１）および組換えバクロウイルスにより生成されたアフィニティー精製ＰＩ前駆体（レーン２）を含むイムノブロット。電気泳動的にニトロセルロースに移す前に、タンパク質を１５％ｗ／ｖＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分画した。このブロットを、柱頭からの６ｋＤ ＰＩ種に対してウサギ中で産生させた抗体とともにインキュベートした。組換えウイルスは、柱頭によって産生されたＰＩ前駆体タンパク質と同じサイズの４２ｋＤの免疫反応性のタンパク質を産生した（矢印）。
【００４５】
Ｂ．エンドプロテイナーゼＡｓｐ−ＮによるＰＩ前駆体の開裂
銀染色した１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。１、バクロウイルスにより産生され酵素なしでインキュベートしたＰＩ前駆体。２、前駆体なしでインキュベートした酵素。６ｋＤ、ニコチアナ・アラタ柱頭から精製した約６ｋＤのＰＩペプチド。１ｍ、５ｍ、３０ｍ、１分、５分および３０分のインキュベーション後に産生された反応生成物。２ｈおよび２４ｈ、２時間および２４時間のインキュベーション後の反応生成物。約６〜７ｋＤのペプチドは、前駆体のインキュベーションの１分以内に酵素により検出された。２４時間後には６〜７ｋＤのペプチドのみが検出された。レーン１における４２ｋＤよりも小さなバンドは、バクロウイルス発現系における翻訳の成熟前の停止により生成された末端の欠失した形態の前駆体によるものである。
【００４６】
図１２は、Ａｓｐ−Ｎ消化により前駆体から得られたペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分取クロマトグラフィーである。ＰＩ前駆体のＡｓｐ−Ｎ消化によって生成されたペプチドのＨＰＬＣプロフィールを示す。主要なピークは、１９分（Ａｓｐ−Ｎ１と称する）および２１分（Ａｓｐ−Ｎ２と称する）の保持時間を有していた。これらピークフラクション（１＆２）中のペプチドは、柱頭からの６ｋＤペプチドよりもＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でわずかにゆっくりとした移動度を有していた。Ａｓｐ−Ｎ１およびＡｓｐ−Ｎ２のプロテイナーゼ抑制活性をトリプシンおよびキモトリプシンに対して試験した。
【００４７】
図１３は、柱頭からのＰＩ前駆体、ＰＩペプチド、該ＰＩ前駆体からインビトロで生成したＰＩペプチドのトリプシンおよびキモトリプシン抑制活性の比較を示す。
材料および方法において記載するように、１.０μｇのトリプシンまたはキモトリプシンを抑制する能力についてＰＩ前駆体またはＰＩペプチド（０〜１.０μｇ）を試験した。抑制活性は、プロテイナーゼをＰＩとともにインキュベートした後に残留するプロテイナーゼ活性のパーセントとして表し、ＰＩなしでインキュベートしたプロテイナーゼの活性を１００％の残留活性とした。実験は２回行い、その平均値をプロットした。平均値からの変動は８％またはそれ以下であった。
【００４８】
図１４は、コントロールの人工食餌、ダイズバウマン−バーク（Bowman−Birk）インヒビターおよびニコチアナ・アラタＰＩ上で飼育したテレオグリルス・コモデュス（Ｔ.commodus）若虫の発育曲線を示すグラフ表示である。縦軸は、各処置におけるコオロギの平均体重（＋／−標準誤差）をｍｇで示す。横軸は週を示す。ニコチアナ・アラタＰＩで飼育したコオロギは、実験を通じてコントロールの食餌およびダイズインヒビターを含有する食餌で飼育した両コオロギに比べて低平均体重を示した。
【００４９】
【００５０】
【実施例】
実施例１
１．材料および方法
植物材料
自家不和合性の遺伝子型Ｓ1Ｓ3、Ｓ3Ｓ3およびＳ6Ｓ6を有するニコチアナ・アラタ（リンクおよびオット）植物を、すでに記載されているように（アンダーソンら、１９８９）、標準温室（glasshouse）条件下にて保持した。傷に対する応答の誘発を回避するために器官を液体窒素中に直接回収し、必要なときまで−７０℃で貯蔵した。遺伝子発現に対する傷の影響を調べるため、透析クリップで中心葉脈を押し潰すことによって葉を傷つけた。傷をつけてから４時間および２４時間後に葉を回収した。
【００５１】
ＰＩをコードするｃＤＮＡクローンの同定およびシークエンシング
ニコチアナ・アラタ（遺伝子型Ｓ3Ｓ3）の成熟花から単離した柱頭および花柱からポリアデニル化ＲＮＡを調製し、ラムダｇｔ１０（アンダーソンら、１９８９）中でｃＤＮＡライブラリーを構築するのに用いた。ニコチアナ・アラタ（遺伝子型Ｓ3Ｓ3およびＳ6Ｓ6）の柱頭および花柱からのｍＲＮＡから一本鎖の３２Ｐ標識ｃＤＮＡを調製し、Ｓ遺伝子型特異的でない高度に発現されたクローンについてライブラリーをスクリーニングするのに用いた（アンダーソンら、１９８９）。
【００５２】
両Ｓ遺伝子型からのｃＤＮＡプローブに強くハイブリダイズしたプラークを選択し、クロスハイブリダイゼーションに基づいてグループに分けた。各グループの最も長いクローンをＭ１３ｍｐ１８およびｐＧＥＭ３ｚｆ＋中にサブクローニングし、アプライドバイオシステムズモデル３７３Ａ自動シークエンサーを用いてシークエンシングを行った。標準アプライドバイオシステムズプロトコールに従い、染色プライマーおよび染色ターミネーターの両サイクルシークエンシングを行った。ＳｅｑＥｄTM配列編集ソフトウエア（アプライド・バイオシステムズ）を用いて共通配列を作成した。これらクローンに相同な配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースでサーチした。ニコチアナ・アラタＰＩクローンの６つのドメイン間での配列の類似性の程度が高いため、非繰り返し３’配列（ヌクレオチド１１１７〜１１３７、１１８８〜１２０３および１２４７〜１２６７）、および繰り返し領域の開始の前の５’配列（ヌクレオチド７４〜９８）に対してシークエンシングプライマーを作成した。加えて、ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物をエンドヌクレアーゼＨａｅIIIで制限処理することにより、ヌクレオチド６２２および９７０で切断して３つのフラグメントを生成させた。これらフラグメントをｐＧＥＭ７ｚｆ＋中にサブクローニングし、Ｍ１３前プライマーおよび逆プライマーを用いて両方向にシークエンシングを行った。ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物の繰り返し特性のため、培養物を６時間以上増殖させた場合にファージミドおよびプラスミドベクターの両方で不安定となった。
【００５３】
ＲＮＡゲルブロット分析
全ＲＮＡを単離し、すでに記載されたようにして（アンダーソンら、１９８９）、１.２％ｗ／ｖアガロース／ホルムアデヒドゲル上で分離した。ＲＮＡをHybond−Ｎ（アマーシャム）に移し、ランダムヘキサヌクレオチドを用いて32Ｐで標識したｐＮＡ−ＰＩ−２からの挿入物でプローブを行った（１×１０8ｃｐｍμｇ−１；１×１０7ｃｐｍｍｌ-1）（ファインベルク（Feinberg）およびフォーゲルスタイン（Vogelstein）、１９８３）。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション（６８℃にて）をアンダーソンらによる記載（１９８９）と同様にして行った。フィルターを２×ＳＳＣ、０.１％ｗ／ｖ ＳＤＳまたは０.２×ＳＤＳ、１％ｗ／ｖ ＳＤＳ中で６８℃で洗浄した。
【００５４】
インシトゥハイブリダイゼーション
インシトゥハイブリダイゼーションをコーニッシュ（Cornish）ら（１９８７）による記載に従って行った。ｐＮＡ−ＰＩ−２からの挿入物（１００ｎｇ）をランダムヘキサヌクレオチドプライミングにより１０8ｃｐｍμｇ-1の比活性に標識することによりプローブを調製した（ファインベルクおよびフォーゲルスタイン、１９８３）。標識したプローブを沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０μｌ）中に再懸濁させ、５μｌを切片に適用した。切片をカバーグラスで覆い、５０％ｖ／ｖホルムアデヒドを入れた閉じた箱中で４０℃にて一夜インキュベートした。インキュベーション後、切片を室温にて４×ＳＳＣ、室温にて２×ＳＳＣ、および４０℃にて１×ＳＳＣ中で順番に４０分間洗浄した。スライドを乾燥させ、室温にてＸ線フィルム（CronexＭＲＦ３２、デュポン）に直接暴露した。ハイブリダイズした切片を水中の０.０２５％ｗ／ｖトルイジンブルーで対比染色し、Eukitt（カール・ツァイス（Carl Zeiss）、フライブルク、ＦＲＧ）中に積載した。放射能写真を切片上に移して、合成物を示した。
【００５５】
ＤＮＡゲルブロット分析
バーナツキー（Bernatzky）およびタンクスレイ（Tanksley）（１９８６）の手順により、ニコチアナ・アラタの若葉からゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡ（１０μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで完全に消化し、０.９％ｗ／ｖアガロースゲル上の電気泳動により分離し、２０×ＳＳＣ中のウエットブロッティングによりHybond−Ｎ（アマーシャム）に移した。フィルターをプローブし、ＲＮＡブロット分析の場合と同様にして洗浄した。
【００５６】
タンパク質抽出物の調製
組織を液体窒素中で凍結し、乳鉢および乳棒中で細かい粉末に破砕することにより植物材料から可溶性タンパク質を抽出した。粉末化した組織を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１４μＭβ−メルカプトエタノールからなる緩衝液中に抽出した。１０,０００ｇで１５分間遠心分離することにより不溶性の物質を除いた。ブラッドフォード（Bradford）（１９７６）の方法によりウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用いてタンパク質濃度を評価した。
【００５７】
プロテイナーゼインヒビターアッセイ
リッカウアー（１９８９）の記載に従い、タンパク質抽出物および精製タンパク質をトリプシンおよびキモトリプシンに対する抑制活性についてアッセイした。１μｇのトリプシン（ＴＰＣＫ−処理；シグマ）および３μｇのキモトリプシン（ＴＬＣＫ−処理；シグマ）に対して抑制活性を測定した。トリプシンおよびキモトリプシンによるそれぞれの合成基質、Ｎ−α−Ｐ−トシル−Ｌ−アルギニンメチルエステル（ＴＡＭＥ）およびＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステル（ＢＴＥＥ）の加水分解の速度を、これら酵素の抑制されなかった活性とした。抽出物の抑制活性は、プロテアーゼを抽出物とともにプレインキュベートした後に残留するコントロールのプロテアーゼ活性のパーセントとして表した。柱頭からのＰＩペプチド、ＰＩ前駆体およびＡｓｐ−Ｎプロセシングしたペプチドを、クリステラー（Christeller）ら（１９８９）による記載に従って抑制活性についてアッセイした。
【００５８】
ニコチアナ・アラタＰＩタンパク質の精製
柱頭（１０００；１０ｇ）を液体Ｎ2中で細かい粉末に破砕し、緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１４μＭ β−メルカプトエタノール、４ｍｌ／ｇ組織）中に抽出した。最初の精製工程であるゲル濾過の前に抽出物を濃縮するため、抑制活性を８０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムで沈殿させたが、すべてのプロテイナーゼ抑制活性を沈殿させるには濃縮が必要であった。
【００５９】
硫酸アンモニウムペレットを５ｍｌの０.１５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.１中に再懸濁し、同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−５０カラム（２ｃｍ×１００ｃｍ）上に負荷した。このカラムから溶出しプロテイナーゼ抑制活性を有するフラクション（１０ｍｌ）をプールし、キモトリプシン−セファロースＣＬ４Ｂのアフィニティーカラム［製造業者の指示により１００ｍｇのＴＬＣＫ−処理α−キモトリプシン（シグマ）を１５ｍｌのセファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア）に架橋させたもの］に負荷した。結合したタンパク質を７ｍ尿素、ｐＨ３で溶出する（５ｍｌフラクション）前に、カラムを１０容量の０.１５Ｍ ＫＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８.１で洗浄した。溶出液を２００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８で直ちに中和し、脱イオン水に対して充分に透析した。
【００６０】
アミノ酸配列分析
精製ＰＩタンパク質を、ガス相シークエンサー上の自動エドマン分解に供する前に逆相ＨＰＬＣマイクロポアカラム上のクロマトグラフィーにかけた（マウ（Mau）ら、１９８６）。グレゴ（Grego）ら（１９８５）の記載に従い、フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸をＨＰＬＣにより分析した。
【００６１】
ニコチアナ・アラタＰＩに対するポリクローナル抗血清の製造
以下のようにしてグルタルアルデヒドを用いて精製プロテイナーゼインヒビター（図６ｃ、レーン３）を担体タンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（シグマ）にコンジュゲートした。１ｍｇのＰＩタンパク質を
Ｈ2Ｏ（１.５ｍｌ）中に溶解し、０.５ｍｌの０.４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）中のＫＬＨ（０.３ｍｇ）と混合した。２０ｍＭグルタルアルデヒド（１ｍｌ）を室温で撹拌しながら５分間かけて滴下した。混合物を室温で３０分間撹拌し、グリシン（０.２５ｍｌ）を加え、混合物をさらに３０分間撹拌した。ついで、コンジュゲートしたタンパク質を通常の食塩水（０.８％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）に対して充分に透析した。各注射についで１００μｇの当量のＰＩタンパク質を用いた。最初の注射にはフロイントの完全アジュバントを用い、その後の２回のブースター注射には不完全アジュバントを用いた。抗血清のＩｇＧフラクションを製造業者の指示に従ってプロテインＡセファロース（ファルマシア）上で分離した。
【００６２】
タンパク質ゲルブロット分析
タンパク質抽出物を１５％ｗ／ｖ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し（レムリ、１９７０）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｔｒａｎｓ−ＢｌｏｔＲＳｅｍｉ−ｄｒｙ電気泳動トランスファーセル（１２Ｖ、２０分）を用いて２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、２０％ｖ／ｖメタノール中のニトロセルロースに移した。負荷およびタンパク質の移動は、膜上のタンパク質をPonceau Ｓ（ハーロウ（Harlow）およびレイン（Lane）、１９８８）で染色することによりチェックした。膜を３％ｗ／ｖウシ血清アルブミン中で１時間ブロックし、抗ＰＩ抗体（１％ｗ／ｖＢＳＡ、トリス緩衝食塩水中に２μｇ／ｍｌ）とともに室温にて一夜インキュベートした。製造業者の推奨に従い、ビオチン化ロバ抗ウサギＩｇＧ（１／５００希釈、アマーシャム）およびアマーシャムビオチン−ストレプトアビジンシステムを用いて結合抗体を検出した。
【００６３】
エンドプロテイナーゼＡｓｐ−ＮによるＰＩ前駆体のタンパク質加水分解
アフィニティー精製したＰＩ前駆体（１.２５ｍｇ）を１００ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ８.５中のエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（２μｇ）とともに３７℃にて全量１ｍｌで４８時間インキュベートした。反応生成物を、分析的ブラウンリー（Brownlee）ＲＰ−３００アクアポア（Aquapore）カラム（Ｃ８、７μｍ、４.６×１００ｍｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより分離した。カラムを０.１％ｖ／ｖＴＦＡ中で平衡化し、ペプチドを以下のプログラムで溶出した：０〜２５％Ｂ（０.０８９％ｖ／ｖＴＦＡ中の６０％ｖ／ｖアセトニトリル）を５分間かけて負荷し、ついで２５〜４２％勾配のＢを４０分間かけて負荷し、最後に４２〜１００％勾配のＢを５分間かけて負荷する。流速は１.０ｍｌ／分であり、ペプチドを２１５ｎｍにおける吸光度により検出した。各ピークを手動で回収し、凍結乾燥した。ＵＶ検出器上での２１５ｎｍにおける各ピークで得られた応答により濃度を推定した。
【００６４】
２．ＰＩ前駆体遺伝子のクローニング
ＰＩｃＤＮＡクローンの単離および特徴付け
ｃＤＮＡライブラリー（ニコチアナ・アラタの成熟花の柱頭および花柱から単離したｍＲＮＡより調製）を、自家不和合性の遺伝子型を伴わない高度に発現された遺伝子のクローンについてスクリーニングした。ジャガイモおよびトマトのII型プロテイナーゼインヒビター（ソーンバーグ（Thornburg）ら、１９８７；グラハム（Graham）ら、１９８５）とある程度の配列同一性を有するタンパク質をコードするクローンを選択した。最も大きいクローン（ＮＡ−ＰＩ−２）は１１９１ヌクレオチドの転写解読枠を有し、１３６０塩基対の長さであった。このニコチアナ・アラタクローン（ＮＡ−ＰＩ−２）の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）および予測されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を図１に示す。Ｎ−グリコシル化の可能性のある部位は存在しない。
【００６５】
驚くべきことに、このニコチアナ・アラタｃＤＮＡクローンは、完全ではないが高度の配列同一性を有する６つの繰り返しドメインを有するタンパク質をコードしている（図１）。これら各ドメインには反応性部位の可能性のある部位が含まれている（図１中に明示してある）。ニコチアナ・アラタＰＩの推定反応部位の残基は、キモトリプシンを特異的に抑制する２つの部位（Ｌｅｕ５−Ａｓｎ６、Ｌｅｕ６３−Ａｓｎ６４）およびトリプシンに対して特異的な４つの部位（Ａｒｇ１２１−Ａｓｎ１２２、Ａｒｇ１７９−Ａｓｎ１８０、Ａｒｇ２３７−Ａｓｎ２３８およびＡｒｇ２９５−Ａｓｎ２９６）を有するインヒビターと一致している。
【００６６】
ＮＡ−ＰＩ−２の繰り返し構造がクローニングによる人為的な産物でないことを確かめるため、別の３つのｃＤＮＡクローンをシークエンシングしたところ、ＮＡ−ＰＩ−２と同一であることがわかった。
表１は、ＰＩ前駆体の６つのドメインのアミノ酸同一性のパーセントを比較したものである。
【００６７】
ＰＩ ｍＲＮＡの一過性で空間的な発現
ニコチアナ・アラタの種々の組織から単離した全ＲＮＡを、図２に示すＲＮＡゲルブロット分析においてＰＩ ｃＤＮＡクローンでプローブした。１.０および１.４ｋｂの２つのハイブリダイズするメッセージが、花柱（柱頭を含む）から単離した全ＲＮＡ中に存在した。大きい方のメッセージ（この組織において主要なものである）のみが、ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２（１.４ｋｂ）をコードするのに充分なサイズである。小さい方のメッセージは、より高い厳格さにおいてはｃＤＮＡプローブで検出されない。約１.４ｋｂの相同なメッセージはまた、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・シルベストリスの花柱から単離したＲＮＡ中にも存在した（図２）。
【００６８】
花の他の器官（花粉を除く）では、両メッセージとも低レベルで検出することができたが、より小さいＲＮＡ種が一層たくさん認められた。花粉ＲＮＡにはハイブリダイゼーションは認められなかった。葉のＲＮＡにはハイブリダイズする種が認められなかったが、機械的な傷をつけてから２４時間後には１.０および１.４ｋｂの２つの種が検出された。この場合には、小さい方のメッセージ（１.０ｋｂ）の方がたくさん認められた。
【００６９】
未熟な（１ｃｍ長）芽の花柱の縦切片への放射性標識したニコチアナ・アラタＰＩｃＤＮＡのインシトゥハイブリダイゼーションを図３に示す。該ｃＤＮＡに相同なＲＮＡは柱頭の細胞に強く結合し、維管束へは弱く結合した。皮層組織、導管組織または花柱の表皮ではハイブリダイゼーションは検出されなかった。同じパターンのハイブリダイゼーションは、成熟した受容性の（receptive）花においても観察された。ハイブリダイゼーションの前にリボヌクレアーゼＡで処理したコントロールの切片は標識されなかった。
【００７０】
ゲノムＤＮＡブロット分析
ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２を図４に示すＤＮＡゲルブロット（ＥｃｏＲＩかＨｉｎｄIIIのいずれかで消化したゲノムＤＮＡが含まれる）上でプローブとして用いた。ＥｃｏＲＩにより２つのハイブリダイズするフラグメント（１１ｋｂおよび７.８ｋｂ）が得られ、ＨｉｎｄIIIからは３つの大きなハイブリダイズするフラグメント（１６.６、１３.５および１０.５ｋｂ）が得られた。
【００７１】
ニコチアナ・アラタの種々の組織中でのＰＩ活性の分布
ニコチアナ・アラタの種々の器官の粗製抽出物によるトリプシンおよびキモトリプシンの抑制を図５に示す。柱頭抽出物がトリプシンおよびキモトリプシンの両方に対して最も有効なインヒビターであった。柱頭抽出物は萼片抽出物に比べて８倍までの抑制活性を有し、花柱、花弁、葉および傷つけた葉からの抽出物に比べると２０倍以上の抑制活性を有していた。
【００７２】
ニコチアナ・アラタ柱頭からのＰＩの精製
ニコチアナ・アラタの柱頭を緩衝液中に抽出し、８０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムで沈殿させることにより抑制活性を濃縮した。沈殿を再溶解し、セファデックスＧ−５０上でゲル濾過することにより分画した。図６ａおよび６ｂに図示したプロフィールにおいて、プロテイナーゼインヒビターに比べて抽出物中の殆どのタンパク質は早く溶出した。プロテイナーゼ抑制活性を有するフラクションをプールし、キモトリプシン−セファロースのアフィニティーカラムに負荷した。ＰＩ活性は約６ｋＤのタンパク質とともに溶出し、図示６ｃに示す２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で単一のバンドとして移動するように思われた。精製の種々の段階におけるＰＩの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した（図６ｃ）。精製したインヒビターは、粗製の抽出物中の存在する抑制活性の約５０％を表していた。
【００７３】
６ｋＤ ＰＩタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列
精製ＰＩタンパク質からＮ末端アミノ酸配列ＤＲＩＣＴＮＣＣＡＧ（Ｔ／Ｋ）ＫＧ（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を得た。このアミノ酸配列は、図１中の位置２５、８３、１４１、１９９、２５７および３１５から開始されるｃＤＮＡクローンの導かれた配列中の６つの領域に対応する。このＮ末端配列の位置１１には、トレオニンおよびリジンの両方が検出された。このことは、図１において下線を引いた配列で始まる６つのペプチドの混合物からなる精製インヒビターと一致する。最初の２つのペプチドは該位置にトレオニンを含み、一方、他の４つのペプチドは該位置にリジンを有する。予測された前駆体タンパク質中の６つの繰り返しドメインに対するこれらペプチドの相対位置を図７に図示する。これら６つの予測された６ｋＤペプチドのうち５つは、キモトリプシンかまたはトリプシンのいずれかに対する反応部位を有している（図１および７）。６番目のペプチドは他の５つのペプチドよりもアミノ酸が４つ短く（５８アミノ酸）、抑制部位を含有していないので活性でない。Ｎ末端からのペプチド（図７におけるｘ）はキモトリプシン反応性の可能性のある部位を有するが、はるかに短い（２４アミノ酸）。
【００７４】
ニコチアナ・アラタ中でのＰＩタンパク質の分布
キーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートした精製ＰＩタンパク質に対してポリクローナル抗血清を産生させた。該抗体はイムノブロット分析において精製６ｋＤ ＰＩタンパク質と強く反応し、成熟花からの全柱頭および花柱抽出物において６ｋＤおよび３２ｋＤタンパク質（二重線として出現）にのみ結合した。図８は、抗ＰＩ抗血清でプローブした、発育の種々の段階（１ｃｍ長の芽から成熟した花まで）での花からのタンパク質抽出物を含有するイムノブロットである。長さが１ｃｍから５ｃｍの芽では、６ｋＤおよび３２ｋＤタンパク質に加えて約１８ｋＤおよび４２ｋＤの大きな交差反応性タンパク質が検出された。これら１８ｋＤおよび４２ｋＤタンパク質は成熟につれて濃度が減少したが、６ｋＤタンパク質は開花の直前にピーク濃度に達した。３２ｋＤタンパク質は花の成熟の間、比較的一定に推移した。
【００７５】
【００７６】
実施例２
ＰＩモノマーの精製および同定
１．材料および方法
逆相クロマトグラフィーによる６ｋＤ ＰＩ種の分離
柱頭（２１,０００）を破砕し、ＰＩタンパク質の精製についての記載と同様にして抽出した。セファデックスＧ−５０ゲル濾過カラム（５ｃｍ×８００ｃｍ、分離当たり３０００の柱頭）上でのゲル濾過の後、ペプチドを凍結乾燥し、ベックマンＨＰＬＣシステムゴールド（Gold）上のブラウンリーＲＰ−３００Ｃ８逆相カラム（１０×２５０ｍｍ）に負荷し、０.１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトニトリル勾配（０〜１０％を５分間、１０〜２５％を４０分間、および２５〜６０％を１０分間）により５ｍｌ／分にて溶出した。ピークのフラクション（フラクション１、２、３および４）を回収し、凍結乾燥した。
【００７７】
電子スプレー質量分析
改変ヒューレット−パッカード（Hewlett−Packard）モデルＨＰ１０９０Ｌ液体クロマトグラフ上のブラウンリーＲＰ−３００Ｃ８逆相カラム（１５０×２０ｍｍ内径の融解石英毛管カラム）上に水（２.０μｌ）中の各ＰＩ調製物（フラクション１、２、３および４）（２０ピコモル）を負荷し、１μｌ／分の流速および２５℃のカラム温度にてアセトニトリルの直線勾配（０.０５％ｖ／ｖ ＴＦＡから０.０４５％ｖ／ｖ ＴＦＡ／６０％ｖ／ｖアセトニトリル、３０分間）で溶出することにより、ＨＰＬＣ溶出液のオンライン質量分析を行った。６ｍｍ行路長のＵ字型軸ビーム毛管流セルを有するスペクトラルフィジックス（Spectral Physics）前光学スキャニング検出器（ＬＣパッキングス（ＬＣ Packings）、オランダ）を用い溶出液を２１５ｎｍにてモニターした。電子スプレーイオン化（ＥＡＩ）源（アナリティカ（Analytica）、ブランフォード、コネチカット州）を備えたフィニガン−マット（Finningan−Mat）トリプル四極子質量分析計（モデルＴＳＱ−７００、サンホセ、カリフォルニア州）で質量スペクトルを得た。電子スプレー針を−４ｋＶの電圧差にて陽イオンモードで操作した。被覆（sheath）液は２−メトキシエタノールであり、手動ポンプ駆動により１μｌ／分にて分配した（ハーバード・アパレイタス（Harvard Apparatus）、サウスナチック、マサチューセッツ州）。窒素乾燥ガス条件は以下の通りであった；ヒーターの温度、２７５℃；圧力、１５ｐｓｉ；流速、１５ｓｔｄＬ／分。窒素被覆ガスを３３ｐｓｉで供給した。ガス状窒素を沸騰した液体窒素源から得た。ペプチドを上記オンライン毛管ＲＰ−ＨＰＬＣにより１.０μｌ／分にてＥＳＩ源中に導入した。３秒の速度にてｍ／ｚ４００〜２０００でスキャニングしてスペクトルを得た。データの回収および換算をフィニガンＢＩＯＭＡＳＳTMソフトウエアを用いてＤｅｃ５１００コンピューター上で行った。
【００７８】
２．結果
ニコチアナ・アラタ柱頭からの個々の６ｋＤ ＰＩ種の分離および同定
精製した６ｋＤ ＰＩ調製物中に存在すると予測された約６ｋＤの６つのペプチドのうち５つを逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより互いに分離した。４つのピークが得られ（図９ａ）、各ピーク中のペプチドを電子スプレー質量分析により同定した（表２）。ＰＩ前駆体中での位置およびキモトリプシンまたはトリプシン活性部位の存在に従ってペプチドをＣ１、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４と称した（図９ｂ）。最初のＨＰＬＣピーク（図９ａ）はキモトリプシンインヒビターＣ１に対応し、第二のピークはＴ２およびＴ３（互いに同一）およびＴ４（Ｔ２およびＴ３とは位置３２における一つのアミノ酸のみが異なる）の混合物からなる。第三のピークにはペプチドＴ１が含まれ、第四のピークはＴ１、Ｔ２／Ｔ３およびＴ４の混合物からなる（表２）。
【００７９】
プロセシングの部位は正確には決定しなかったが、図１０に示す配列中のアスパラギン酸残基（Ｎ）とアスパラギン残基（Ｄ）との間に位置していると思われる。アスパラギン残基に対する特異性を有するプロテアーゼは、未熟なダイズ種子およびカボチャの子葉からの液胞から単離されている（スコット（Scott）ら、１９９２、ハラ−ニシムラ（Hara−Nishimura）ら、１９９１）。このことは、ニコチアナ・アラタの柱頭中の乳頭およびその下の分泌細胞の液胞中のＰＩの免疫金（immunogold）局在と一致する（アトキンソン、１９９２）。ニコチアナ・アラタＰＩの場合は、ペプチドホルモンと類似のプロセシングも可能である。なぜなら、可能な各６ｋＤペプチドは二塩基性残基（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、図１０中の位置−２＆−３）を側部に有するからである。しかしながら、かかるシステムは植物においては記載されておらず、これら二塩基性残基は分子表面にプロセシング部位を呈示する予測された親水性ループの形成に預かっていると考える方がよいようである。
【００８０】
質量分析からのデータは、いったん最初の開裂が起こったら新たなカルボキシ末端はトリミングされていくことを示している（図１０）。ＥＥＫＫＮ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）は完全に除去されるがトリミングは完全ではなく、ときにはさらにアミノ酸が除去される。立体障害がトリミングがさらに進むのを防ぐ。場合によってはアスパラギン酸もＮ末端から除去される。
【００８１】
実施例３
組換えバクロウイルスベクターを用いた昆虫細胞（Ｓｆ９）培養液中でのＰＩ前駆体の製造
ＰＩ前駆体をコードするｃＤＮＡ（図１）をプラスミドベクターｐＶＬ１３９２のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。該プラスミドベクターは、ＢａｍＨ１部位にマルチクローニング部位が挿入されている他はｐＶＬ９４１（ルックナウ（Lucknow）およびサマーズ（Summers）、１９８９）と同じである。ｐＲＨ１１と称するプラスミドは、多核体（polyhedrin）プロモーターによって指令される転写の方向に関して正しい方向にてＰＩｃＤＮＡを含有する。バクロウイルスＤＮＡおよびｐＲＨ１１をスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞に同時トランスフェクションすることにより組換えバクロウイルスを得た。組換えウイルス（相同組換えによって得られた）をプラーク精製し、タンパク質産生のために昆虫細胞に感染させる前に増幅させた。組換えバクロウイルスの産生、該ウイルスの滴定およびＳｆ９細胞の維持および感染に関するすべての手順はキング（King）およびポッセ（Posse）（１９９２）から得た。ＰＩ前駆体を産生させるため、大フラスコ（１７５ｃｍ2）中の単層のＳｆ９細胞が集密に達した時点で高力価の組換えウイルスで５〜１０ｐｆｕ／細胞の多数の感染により感染させた。感染の４日後に培養液を回収し、遠心分離により清澄化し、柱頭からの６ｋＤ ＰＩ種について記載したのと同様にしてキモトリプシン−セファロースアフィニティーカラムに適用することによりＰＩ前駆体を精製した。７Ｍ尿素、ｐＨ３中でカラムから溶出したＰＩ前駆体を１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）で直ちに中和し、Milli−Ｑ水に対して充分に透析し、ダイアフロー（Diaflow）ＹＭ１０フィルターを用いた超遠心分離により２０〜５０倍に濃縮し、−２０℃にて凍結保存した。
【００８２】
感染した昆虫細胞から前駆体を産生させるため、ＰＩ前駆体をコードするｃＤＮＡクローンをバクロウイルスベクター中に組み込んだ。昆虫細胞は４２ｋＤのタンパク質を産生したが、このものは柱頭からの６ｋＤ ＰＩペプチドに対して産生させた抗体と交差反応し、キモトリプシンアフィニティーカラムに結合した。この４２ｋＤタンパク質は、ニコチアナ・アラタの未熟な柱頭中で産生される４２ｋＤ前駆体とサイズが同じであり（図１１）、Ｎ末端配列ＬｙｓＡｌａＣｙｓＴｈｒＬｅｕＡｓｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を有しており、シグナル配列が昆虫細胞によって正確にプロセシングされたことを示している（図１）。これら結果に基づき、バクロウイルス発現系で産生された該４２ｋＤタンパク質は、いまやＰＩ前駆体と呼ぶことになるであろう。この４２ｋＤ ＰＩ前駆体はキモトリプシンに対しては抑制活性を有するが、トリプシンに対しては抑制活性を有していなかった（図１３）。このＰＩ前駆体をエンドプロテイナーゼＡｓｐＮによってプロセシングして約６ｋＤの安定なペプチドが得られ、これを逆相ＨＰＬＣにより部分精製した（図１２）。これらペプチドは柱頭から分離した６ｋＤペプチドに等価なトリプシンおよびキモトリプシンに対する抑制活性を有しており、トリプシン抑制活性を活性化するには前駆体のプロセシングが必要であるが、キモトリプシン活性についてはすべてについて必要でないことを示していた。ＡｓｐＮはアスパラギン酸残基に隣接して（図１０におけるＡｓｎ−１とＡｓｐ１との間）特異的に開裂しトリミング活性を有しないので、インビトロで生成したペプチドはＣ末端に配列ＥＥＫＫＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）が存在する他は柱頭で産生させたものと同じであろう。このことは、活性な６ｋＤ ＰＩペプチドを得るにはＮ末端およびＣ末端の正確なプロセシングを必要としないことの新たな証拠を提供する。Ａｓｐ−Ｎ１はトリプシンに比べてキモトリプシンの抑制において一層有効であり、それゆえ主としてＣ１類似体であると思われる（図９ｂ）。Ａｓｐ−Ｎ２は一層有効なトリプシンインヒビターであり、おそらくＴ１〜Ｔ４類似体を含有している。
【００８３】
実施例４
種々の昆虫からの未分画消化管抽出物におけるプロテアーゼ活性に対するＰＩの効果
クリステラーら（１９９２）の手順を用いて消化管プロテアーゼに対するＰＩの活性を以下のようにして測定した。インヒビターの１μＭのアリコート（０〜１０μｌ、消化管中に存在するプロテアーゼに対して少なくとも５倍過剰）を１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０）（１５０μｌ）と混合し、各昆虫消化管抽出物（０〜１５μｌ）と３０℃にて２０分間プレインキュベートした。Ｃ14−標識したカゼイン基質（４００μｇタンパク質、比活性２５,０００〜７５,０００ｄｐｍ ｍｇ-1）（５０μｌ）を加えることにより反応を開始し、反応を停止させるために冷３０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（５０μｌ）を加えるまで反応を続けた。氷上で３０分間インキュベートした後、未消化のタンパク質を２０℃にて１０,０００ｇで５分間遠心分離にかけてペレット化した。上澄み液を除き、シンチレーション液と混合し、放射能を測定した。ルシラ・セリカタ（Ｌ.sericata）およびクリソムヤ・ルフィファシエス（Ｃ.rufifacies）の場合に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）を用いた他はｐＨ１０にてアッセイを行った。
【００８４】
表３は、レピドプテラ（Lepidoptera）、コレオプテラ（Coleoptera）、オルトプテラ（Orthoptera）およびジプテラ（Diptera）の種々の成員の消化管中のプロテアーゼに対するプールした６ｋＤ ＰＩペプチド（Ｃ１、Ｔ１、Ｔ２／Ｔ３、Ｔ４）、トリプシンインヒビターＴ２／Ｔ３およびＴ４の混合物、およびキモトリプシンインヒビターＣ１の抑制活性を示す。殆どの場合、プールしたペプチドおよびトリプシンインヒビターは、試験した昆虫に依存して３７〜７９％の範囲の抑制程度にて消化管プロテアーゼに対して等価な効果を有していた。
これらインヒビターは、ジャガイモ塊茎の蛾であるフトリマエ・オペルクレラ（Ｐ.opercullela）の消化管プロテアーゼに対しては殆ど効果は認められなかった。キモトリプシンインヒビターＣ１もまたプロテアーゼの活性に影響を与えたが、５つの場合（ウイセアナ・セルビナタ（Ｗ.cervinata）、ルシラ・セリカタ、コステリトラ・ゼアランディカ（Ｃ.zealandica）、プラノトルトリックス・オクト（Ｐ.octo）、サトウキビ地虫（sugar cane grub））にはトリプシンインヒビターよりも有効性が低かった。
【００８５】
実験の詳細は図１４の説明に記載してある。ニコチアナ・アラタＰＩは、コオロギの体重を減少させるうえでダイズバウマン−バークインヒビターよりも一層有効であった。昆虫の中腸の酵素を抑制するプロテイナーゼインヒビターの能力と昆虫飼育試験において昆虫の生育を遅らせるうえでの有効性との間に良好な相関関係が存在することが示された（クリステラーら、１９９２）。図１４は、インビトロアッセイで黒色野生コオロギ（テレオグリルス・コモデュス（Ｔ.commodus））の消化管プロテアーゼを７０％抑制したプールＰＩが、１０週間の期間にわたって行った飼育試験においてコオロギの生育を３０％遅らせたことを示している。インビトロアッセイと飼育試験との間の相関関係は、最近になってヘリコベルパ・アルミゲラ（Helicoverpa armigera）の生育および発達について研究しているジョンストン（Johnston）と彼の同僚（１９９３）によって確かめられた。
【００８６】
【表１】
【００８７】
【表２】
【００８８】
表３の説明
ＮａＰＩ＝プールしたニコチアナ・アラタプロテイナーゼインヒビター
Ｃ１＝ニコチアナ・アラタキモトリプシンインヒビター（ＨＰＬＣからのピーク１）
Ｔ２／Ｔ３、Ｔ４＝ニコチアナ・アラタトリプシンインヒビター（ＨＰＬＣからのピーク２）
ヘリオチス・アルミゲラ（Heliothis armigera）、ヘリコベルパ・アルニゲラ（Helicoverpa armigera）、タバコの青虫、レピドプテラ
ヘリオチス・プンクチゲラ（Heliothis punctigera）、ヘリコベルパ・プンクチゲラ（Helicoverpa punctigera） 自生の青虫、レピドプテラ
テレオグリルス・コモデュス 黒色野生コオロギ、オルトプテラ
アグロチス・インフサ（Agrotis infusa） 普通のネキリガ、成虫はモンヤガ（Bogong moth）として知られる、レピドプテラ
【００８９】
ウイセアナ・セルビナタ ポリナ（Porina）、ニュージーランドに自生、レピドプテラ
ルシラ・セリカタ 緑クロバエ、ジプテラ、ｐＨ８にてアッセ
クリソムヤ・ルフィファシエス 毛深い蛆クロバエ、ジプテラ、ｐＨ８にてアッセイ
アホジウス・タスマニア（Aphodius tasmaniae） タスマニアの草地虫＝黒頭牧草コフキコガネ（cockchafer）、コレオプテラ
コステリトラ・ゼアランディカ ニュージーランドの草地虫、コレオプテラ
スポドプテラ・リトゥラ（Spodoptera litura） 熱帯産アワヨトウの幼虫
（armyworm）、レピドプテラ
フトリマエ・オペルクレラ ジャガイモ塊茎の蛾、レピドプテラ
エピフィアス・ポストビッタナ（Epiphyas postvittana） 薄褐色のリンゴ蛾（ハマキムシ（leafroller））、レピドプテラ
プラノトルトリックス・オクト 緑頭のハマキムシ、レピドプテラ
クテノプセウスチス・オブリクアナ（Ctenopseustis obliquana） 褐色頭のハマキムシ、レピドプテラ
サトウキビ地虫
【００９０】
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【配列表】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【図面の簡単な説明】
【図１−１】 ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびニコチアナ・アラタＰＩタンパク質の対応アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。該アミノ酸配列は、成熟タンパク質の最初のアミノ酸を１としてナンバーを付してある。シグナル配列はヌクレオチド１〜９７によりコードされており、これらアミノ酸残基にはマイナスの番号を付してある。インヒビターの反応部位残基は囲ってある。
【図１−２】 図１−１の続き。
【図１−３】 図１−２の続き。
【図１−４】 図１−３の続き。
【図１−５】 図１−４の続き。
【図２】 ニコチアナ・アラタの種々の器官からのＲＮＡのゲルブロット分析を示す写真表示である。ニコチアナ・アラタの器官およびニコチアナ・タバクム（Ｎ.tabacum）およびニコチアナ・シルベストリス（Ｎ.sylvestris）の柱頭および花柱から単離したＲＮＡのゲルブロットは、ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２とハイブリダイズした。Ｓｔ、柱頭および花柱；Ｏｖ、子房；Ｐｏ、花粉；Ｐｅ、花弁；Ｓｅ、萼片；Ｌ、傷のない葉；Ｌ４、傷から４時間後の葉；Ｌ２４、傷から２４時間後の葉；Ｎｔ、ニコチアナ・タバクムの柱頭および花柱；Ｎｓ、ニコチアナ・シルベストリスの柱頭および花柱；Ｎａ、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片。
【図３】 柱頭および花柱でのＮＡ−ＰＩ−２に相同なＲＮＡのインシトゥ局在を示す写真表示である。（ａ）32Ｐ標識したＮＡ−ＰＩ−２ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた後の１ｃｍ長の芽の柱頭および花柱の縦方向の凍結切片の放射能写真；（ｂ）トルイジンブルーで染色した（ａ）と同じ切片。ｃ、皮層；ｖ、維管束；ｔｔ、導管；ｓ、柱頭組織。
【図４】 ニコチアナ・アラタのゲノムＤＮＡのゲルブロット分析を示す写真表示である。制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIIIで消化し放射性標識したＮＡ−ＰＩ−２でプローブしたニコチアナ・アラタゲノムＤＮＡのゲルブロット分析。サイズマーカー（ｋｂ）は、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片である。
【図５】 ニコチアナ・アラタの種々の器官におけるＰＩ活性のグラフ表示である。種々の器官からの緩衝液溶解性の抽出物について、トリプシンおよびキモトリプシンを抑制する能力を試験した。柱頭および萼片抽出物が、トリプシン（Ａ）およびキモトリプシン（Ｂ）の両方に対する最も有効なインヒビターであった。
【図６】 ニコチアナ・アラタの柱頭からのＰＩ精製の工程を示す。（ａ）柱頭抽出物からの硫酸アンモニウム沈殿したタンパク質のセファデックスＧ−５０ゲル濾過クロマトグラフィー。ＰＩ活性はプロフィールの後期に溶出した。（ｂ）ゲル濾過カラムからのフラクションの２０％ｗ／ｖ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（レムリ（Ｌaemmli）、１９７０）。ゲルを銀染色し、分子量マーカー（ファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンにて示す。約６ｋＤのタンパク質（矢印）がプロテイナーゼインヒビター活性とともに溶出した。（ｃ）精製手順の種々の段階でのＰＩ含有フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。レーン１、粗製の柱頭抽出物（５μｇ）；レーン２、８０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムにより沈殿させた柱頭タンパク質（５μｇ）；レーン３、キモトリプシンアフィニティーカラムから溶出したＰＩタンパク質（１μｇ）。
【図７】 ニコチアナ・アラタ（ａ）およびジャガイモ（ｂ）およびトマト（ｃ）ＰＩIIｃＤＮＡからのＮＡ−ＰＩ−２クローンによりコードされるＰＩタンパク質のハイドロパシー（hydropathy）プロットを示すグラフ表示である。線よりも上にある値は疎水性の領域を示し、線よりも下の値は親水性の領域を示す。推定シグナルペプチドには陰影を施してある。疎水性プロフィールは、カイト（Kyte）およびドゥーリトル（Doolittle）（１９８２）の予測則および９の連続アミノ酸の連なりを用いて作成した。
【図８】 生育中の花の柱頭中のＰＩタンパク質のイムノブロット分析を示す。
（ａ）ニコチアナ・アラタの生育中の花。
（ｂ）（ａ）に示す生育の各段階における柱頭タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、５μｇの各抽出物を負荷した。ペプチドゲルを銀染色し、分子量マーカー（ＬＫＢ・ロー・モレキュラー・ウエイト（ＬＫＢ Low Molecular weight）およびファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンで示してある。
（ｃ）抗ＰＩ抗血清でプローブした（ｂ）と同じゲルのイムノブロット。
【図９】 ニコチアナ・アラタからの６ｋＤプロテイナーゼインヒビター種の分離および同定を示す。（Ａ）逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる６ｋＤＰＩの分離。（Ｂ）ＰＩ前駆体タンパク質から得られた５つの相同なペプチド：Ｃ１、キモトリプシンインヒビター、Ｔ１〜Ｔ４、トリプシンインヒビター。太線は、これらインヒビターの反応部位を示す。前駆体タンパク質は、シグナル配列を除いて描写してある。図中点線部は、６つの繰り返しドメインの領域（アミノ酸１〜３４３、図１）。図中斜線部は、非繰り返し配列（アミノ酸３４４〜３６８、図１）。矢印は、前駆体タンパク質におけるプロセシング部位を示す。（Ｃ）ｃＤＮＡクローンから予測され精製タンパク質のＮ末端シークエンシングにより確認されたＣ１およびＴ１〜Ｔ４のアミノ酸配列。
【図１０】 前駆体ＰＩタンパク質のプロセシング部位の周辺のアミノ酸配列を示す。太字で示した配列は、精製ＰＩタンパク質から得たアミノ末端配列である。マイナスの番号を付した配列は、ｃＤＮＡクローンから予測されるフランキング配列である。予測された前駆体タンパク質は、この配列の６つの繰り返しを含む。
【図１１】 バクロウイルス発現系で生成されたＰＩ前駆体（Ａ）、およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎによるアフィニティー精製ＰＩ前駆体（Ｂ）の消化後に得られた生成物を示す。
【図１２】 Ａｓｐ−Ｎ消化により前駆体から得られたペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分取クロマトグラフィーを示す。
【図１３】 柱頭からのＰＩ前駆体、ＰＩペプチド、該ＰＩ前駆体からインビトロで生成したＰＩペプチドのトリプシンおよびキモトリプシン抑制活性の比較を示す。
【図１４】 コントロールの人工食餌、ダイズバウマン−バーク（Bowman−Birk）インヒビターおよびニコチアナ・アラタＰＩ上で飼育したテレオグリルス・コモデュス（Ｔ.commodus）若虫の発育曲線を示すグラフ表示である。縦軸は、各処置におけるコオロギの平均体重（＋／−標準誤差）をｍｇで示す。横軸は週を示す。ニコチアナ・アラタＰＩで飼育したコオロギは、実験を通じてコントロールの食餌およびダイズインヒビターを含有する食餌で飼育した両コオロギに比べて低平均体重を示した。
【発明の属する技術分野】
本発明は一般に、プロテアーゼ感受性ペプチドおよびそれをコードする遺伝子配列に関する。
ヌクレオチド配列および核酸配列は、本明細書において引用文献の後に記載する配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）によって言及する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯの一般的な要約は実施例の前に記載してある。
【０００２】
【従来の技術】
ナス科（Solanaceae）およびマメ科（Fabaceae）に属する幾つかの種類の植物は、傷に対する応答の結果としてその貯蔵器官や葉にセリンプロテイナーゼインヒビターを蓄積する（ブラウン（Brown）およびライアン（Ryan）、１９８４；リチャードソン（Richardson）、１９７７）。これらタンパク質の抑制活性は、微生物および動物由来の広範囲のプロテイナーゼに対して向けられるが、植物のプロテイナーゼに向けられることは稀である（リチャードソン、１９７７）。これらインヒビターは、病原体および捕食者に対して植物を保護することに関与していると思われている。ジャガイモの塊茎およびマメ科植物の種子では、これらインヒビターは貯蔵タンパク質の１０％またはそれ以上を占めることがあり（リチャードソン、１９７７）、トマトやジャガイモの葉（グリーン（Green）およびライアン、１９７２）およびアルファルファ（ブラウンおよびライアン、１９８４）では、昆虫の攻撃または他のタイプの傷から４８時間以内にプロテイナーゼインヒビターは可溶性タンパク質の２％のレベルまで蓄積することがある（ブラウン＆ライアン、１９８４；グラハム（Graham）ら、１９８６）。これらインヒビターはまた、野性型のトマト、リコペルシコン・ペルビアヌム（Lycopersicon peruvianum）の未熟果にも高レベル（全可溶性タンパク質の５０％まで）で存在する（ピアス（Pearce）ら、１９８８）。
【０００３】
トマトおよびジャガイモにおいて２つのファミリーのセリンプロテイナーゼインヒビターが存在する（ライアン、１９８４）。Ｉ型のインヒビターは、単一の反応部位でキモトリプシンを抑制する小さなタンパク質（モノマーの分子量８１００）である（メルビル（Melville）およびライアン、１９７０；プランケット（Plunkett）ら、１９８２）。II型ファミリーのインヒビターは、一般に、２つの反応部位を有しており、その一方はキモトリプシンを抑制し、他方はトリプシンを抑制する（ブライアント（Bryant）ら、１９７６；プランケットら、１９８２）。II型インヒビターは１２,３００のモノマー分子量を有する（プランケットら、１９８２）。プロテイナーゼインヒビターＩは、黄化タバコ（ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum））の葉中に蓄積し（クオ（Kuo）ら、１９８４）、フィトフトラ・パラシチカ・ヴァル・ニコチアナ（Phytophthora parasitica var. nicotianae）からのエリシタは、タバコ細胞懸濁培養液中でのプロテイナーゼインヒビターＩの蓄積を誘発することがわかった（リッカウアー（Rickauer）ら、１９８９）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
他のプロテイナーゼインヒビターを同定すること、および病原体や捕食者に対する保護の優れたトランスジェニック植物の開発での使用の可能性を探る必要性が存在する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明に従い、プロテイナーゼインヒビター前駆体をコードする遺伝子配列をクローニングした。該前駆体は複数のプロテイナーゼインヒビタードメインを有しており、プロテイナーゼインヒビター発現の優れた広範囲のトランスジェニック植物を開発するうえで有用であろう。かかる植物は、病原体や捕食者に対する防御特性が優れているであろう。本発明の遺伝構築物はまた、昆虫（それ自体捕食者であるか、または植物病原体の宿主として働く）による食物摂取に対するワクチンを開発するうえでも有用であろう。組換え前駆体またはモノマー性のインヒビターはまた、局所噴霧や動物が食物を消化するのを助けるのに有用であろう。
【０００６】
従って、本発明の一つの態様は、植物からのII型セリンプロテイナーゼインヒビター（ＰＩ）前駆体をコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子に関する。その際、該前駆体は少なくとも３つのＰＩモノマーを含み、該モノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位であり、該モノマーの他のもののうち少なくとも一つはトリプシン特異的な部位である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において「核酸分子」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡ）であって、一本鎖または二本鎖であり、直線状または共有結合により閉じたものである。核酸分子はまた、全遺伝子またはその実質部分に対応するゲノムＤＮＡ、そのフラグメントまたはその誘導体であってよい。ヌクレオチド配列は、ゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンの天然に存在するヌクレオチド配列に対応していてよく、または単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を有していてよい。核酸分子中のかかる変異はすべて、少なくとも一つのモノマーまたはその活性部位をコードする能力を保持しているか、または他の種の同じもしくは類似の遺伝子配列のためのハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして有用である。
【０００８】
ＰＩ前駆体は、好ましくは少なくとも４つのＰＩモノマー、さらに好ましくは少なくとも５つのＰＩモノマー、さらに一層好ましくは少なくとも６つのＰＩモノマーを含む。さらに好ましくは、ＰＩ前駆体はさらにシグナル配列を含む。本発明のＰＩ前駆体は、個々のモノマーに開裂するためのプロセシング部位であるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本明細書において使用する「前駆体」なる語は、前駆体分子そのものの有用性を限定したり、ＰＩ活性が発現される前に該分子がまずモノマーにプロセシングされることを要求することを意図するものではない。該前駆体分子はＰＩ活性を有しており、本発明は該前駆体および該前駆体の個々のモノマーに関する。
【００１０】
さらに、本発明は、ハイブリッドII型セリンＰＩ前駆体をコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子にも関する。その際、該前駆体は異なるＰＩからの少なくとも２つのモノマーを含む。かかる少なくとも２つのモノマーは、個々のモノマーにプロセシングされ得ないように修飾することもできるし、またはそのようにプロセシングされる能力を保持させることもできる。好ましくは、これらモノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、これらモノマーの他方はトリプシン特異的な部位を有する。少なくとも３つのモノマーを有するのが好ましく、少なくとも４つのモノマーを有するのがさらに好ましく、少なくとも５つのモノマーを有するのがさらに一層好ましく、少なくとも６つのモノマーを有するのがもっと一層好ましく、その場合、少なくとも２つは異なるＰＩからのものである。最も好ましい態様において、これらモノマーの少なくとも一つはチオニン（thionin）である。かかるハイブリッドＰＩ前駆体および／またはそのモノマーは、「多価」な、すなわち広範囲の病原体や捕食者に対して（たとえば、真菌および昆虫の両者に対して）活性な分子を生成させるのに特に有用である。従って、本明細書において「ＰＩ前駆体」というときはハイブリッド分子をも包含するものである。
【００１１】
本発明は、下記ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および対応アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を有するニコチアナ・アラタ（Ｎicotiana alata）由来の核酸分子の単離を例として挙げる。
【００１２】
しかしながら、上記例示は、本発明が他の植物からの等価なまたは実質的に同様の核酸分子をも包含することを理解したうえでのことである。「等価な」および「実質的に類似の」とは、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、抗体反応性、モノマー組成および／または前駆体のプロセシングによるモノマー生成のレベルにおいて等価および実質的に類似であることを意味する。たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列と比較した場合に少なくとも５５％、たとえば約６０〜６５％、７０〜７５％、８０〜８５％および９０％以上のパーセントの配列類似性を有するヌクレオチド配列は本発明の主題の核酸分子に「実質的に類似」していると考えられる。ただし、そのような実質的に類似の配列が、上記のように少なくとも３つのモノマー、好ましくは４つ、５つまたは６つのモノマーを有するＰＩ前駆体をコードすることを条件とする。
【００１４】
特に好ましい態様において、本発明の核酸分子はさらに、転写解読枠の５’側のシグナル配列および／またはコード領域の３’側のヌクレオチド配列をもコードして下記のような完全なヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびその実質的に類似性の変異体を提供する。
【００１５】
従って、本発明の好ましい態様は、ニコチアナ・アラタ由来のII型セリンＰＩ前駆体または該前駆体もしくは少なくとも一つのドメインに対して少なくとも５５％の類似性を有する配列をコードするかまたは該コード配列に相補的なＳＥＱＩＤ ＮＯ：１または２に示すヌクレオチドの配列を含む核酸分子を提供する。その際、該前駆体はシグナルペプチドおよび少なくとも５つのモノマーを含み、該モノマーのうちの一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、該モノマーの残りの４つはトリプシン特異的な部位を有する。
さらに好ましい態様において、該核酸分子はｃＤＮＡ分子であり、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１または２に一般に示すヌクレオチド配列または本明細書において定義するように該配列の全体またはそのドメインに実質的に類似な配列を含む。
【００１７】
本発明の他の態様は、キモトリプシン特異的な部位かまたはトリプシン特異的な部位のいずれかを有する単一のII型セリンＰＩをコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子に関する。その際、該ＰＩは、少なくとも３つのモノマーを有し、そのうち少なくとも一つがキモトリプシン部位を有し残りがトリプシン部位を有する前駆体ＰＩの一つのモノマーである。しかしながら、本発明の前駆体は、４つ、５つまたは６つのモノマーを有し、上記に定義のごとくであるのが好ましい。
【００１８】
最も好ましい態様において、植物は自家不和合性の遺伝子型Ｓ1Ｓ3、Ｓ3Ｓ3またはＳ6Ｓ6を有するニコチアナ・アラタ（リンク（Link）およびオット（Otto））であり、核酸分子は成熟植物の柱頭および花柱から単離しうる遺伝子配列から単離しうるまたは該配列に相補的なものである。対応ｍＲＮＡは約１.４ｋｂであり、ｃＤＮＡは６つの保存されたドメインを有し、そのうち最初の２つのドメインは１００％同一でありキモトリプシン特異的な部位（Ｌｅｕ−Ａｓｎ）を有する。第三、第四および第五のドメインは９５〜９８％の同一性を有し、トリプシンに特異的な部位（Ａｒｇ−Ａｓｎ）を有する。第六のドメインもまたトリプシン特異的な部位を有するが、主に３’配列の相違により（表１参照）第三、第四および第五のドメインに対する同一性は低い（７９〜９０％）。本発明の好ましいＰＩインヒビターは約４２〜４５ｋＤａの分子量を有し、約２９アミノ酸のシグナル配列を有する。
【００１９】
モノマー性ＰＩのＮ末端配列は、ＰＩ前駆体タンパク質の予測される配列中の６つの各繰り返しドメインにおいて表示されている。それゆえ、ＰＩ前駆体タンパク質は６つの部位で開裂されて７つのペプチドを生成すると思われる。これら７つのペプチドのうち６つのペプチド（ペプチド２、３、４、５、６および７）（図１、それぞれ、残基２５〜８２［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５］、８３〜１４０［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６］、１４１〜１９８［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７］、１９９〜２５６［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８］、２５７〜３１４［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９］および３１５〜３６８［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９］）はモノマー性ＰＩと同じ分子量（約６ｋＤａ）を有し、同じＮ末端配列を有する。ペプチド７はトリプシンまたはキモトリプシンに対する共通部位を有しない。ペプチド１（残基１〜２４［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４］、図１）は６ｋＤａよりも小さく、異なるＮ末端を有し、精製したモノマー性ＰＩ調製物中で検出されなかった。ペプチド１とペプチド７とは、これら２つのペプチド間で形成されたジスルフィド結合により正しいコンホメーションに保持されたペプチド１上の抑制部位として機能的なプロテイナーゼインヒビターを形成すると思われる。
【００２０】
本発明を一つの仮定に限定することを意図するものではないが、ＰＩ前駆体は、たとえばＡｓｎ−Ａｓｐ結合の開裂に関与するプロテアーゼによってプロセシングを受けて生物学的に活性なモノマーを生成するのかもしれない。さらに詳しくは、プロセシング感受性の配列はＲ1−Ｘ1−Ｘ2−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ1およびＸ2は以下に定義する通り）である。かかる配列の発見により、プロテアーゼ感受性配列の開裂により植物中でプロセシングを受けうるペプチドおよびポリペプチドを製造することが可能となるであろう。本発明の該観点に従い、アミノ酸配列：
−Ｘ1−Ｘ2−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
（式中、Ｘ1およびＸ2はいかなるアミノ酸であってもよいが、両方ともＬｙｓ残基であるのが好ましい）を含むプロテアーゼ感受性ペプチドが提供される。
【００２１】
プロテアーゼ感受性配列はまた、
Ｒ1−Ｘ1−Ｘ2−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｒ2
（式中、Ｘ1およびＸ2は同じであるのが好ましく、両方ともＬｙｓ残基であるのが好ましく、Ｒ1およびＲ2は同じかまたは異なるＤまたはＬアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非アミノ酸残基または分子、たとえば当業者に明らかなように、アルキル（たとえば、メチル、エチル）、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アシル、ジエニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ハロ（たとえば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ）、ハロアルキル、ニトロ、ヒドロキシ、チオール、スルホニル、カルボキシ、アルコキシ、アリールオキシおよびアルキルアリールオキシなどである）としても表示される。アルキル、置換アルキル、アルケニルおよび置換アルケニルなどは、直鎖および分枝鎖分子、低級（Ｃ1〜Ｃ6）および高級（Ｃ6以上）誘導体を意味する。「直鎖」なる語は、上記すべての置換基を包含する。
【００２２】
最も好ましい態様において、プロテアーゼ感受性ペプチドは
Ｒ1−Ｘ1−Ｘ2−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｒ2
（式中、Ｒ1およびＲ2は同じかまたは異なるペプチドまたはポリペプチドであり、Ｘ1およびＸ2はともにＬｙｓ残基である）である。
かかるプロテアーゼ感受性ペプチドは、適当な宿主中またはインビトロで発現させることにより大きな分子を該プロテアーゼ感受性ペプチド間に位置するペプチドにプロセシングすることができるように、同じかまたは異なるモノマー間に置くことができる。
【００２３】
本発明はまた、配列：
−Ｘ1−Ｘ2−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
（式中、Ｘ1およびＸ2は好ましくは同じであり、最も好ましくは両方ともＬｙｓ残基である）を含むプロテアーゼ感受性ペプチドをコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子にも関する。かかる核酸分子は、たとえば、プロテアーゼ感受性配列によって個々のペプチドまたはモノマーにプロセシングされうる前駆体ポリペプチドをコードする一層大きなヌクレオチド配列の一部であってよい。
【００２４】
本発明のプロテアーゼ感受性ペプチドは、複（ポリ）価および／または多価「前駆体」を生成するうえで特に有用であり、該前駆体は各モノマーが同じかまたは異なっており、各モノマーは抗ウイルス活性、抗細菌活性、抗真菌活性、抗病原体活性および／または抗捕食者活性などの同じかまたは異なる活性を有する。本発明の該観点を一つの仮定または提唱された作用機構に限定することを意図するものではないが、プロテアーゼはＡｓｎ残基に隣接して、さらに詳しくはＡｓｎ−Ａｓｐ残基間で作用すると思われる。
【００２５】
本発明はまた、植物から単離したII型セリンＰＩ前駆体にも関する。該前駆体は、少なくとも３つのＰＩモノマーを含み、これらモノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、これらモノマーの残りの少なくとも一つはトリプシン特異的な部位を有する。このＰＩ前駆体は、４つ、５つまたは６つのモノマーを有し、上記核酸分子によってコードされているのが好ましい。本発明はまた、該前駆体を構成する個々のモノマーにも関する。本発明はまた、上記のように異なるＰＩからの少なくとも２つのモノマーを含むハイブリッド組換えＰＩ前駆体分子にも関する。
【００２６】
単離したＰＩまたはＰＩ前駆体は、組換えの形態であっても、および／または生物学的に純粋であってもよい。「生物学的に純粋」とは、硫酸アンモニウム沈殿、セファデックスクロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーを含む少なくとも一つの精製工程を施したＰＩ、ＰＩ前駆体および／またはその混合物の調製物を意味する。該調製物は、重量、活性抗体、反応性および／またはアミノ酸含量により決定して少なくとも２０％のＰＩ、ＰＩ前駆体またはその混合物を含むのが好ましい。さらに好ましくは、該調製物は、３０〜４０％、５０〜６０％または少なくとも８０〜９０％のＰＩ、ＰＩ前駆体またはその混合物を含む。
【００２７】
ＰＩまたはその前駆体は、天然に存在するものであってもよいし、または上記核酸変異体によってコードされるような変異体であってもよい。ＰＩまたはその前駆体はまた、そのアミノ酸配列または炭水化物および／または脂質残基などの非タンパク質成分に対して置換、欠失および／または付加を有していてよい。
組換えおよび単離ＰＩ、ＰＩ前駆体およびその混合物は、研究室試薬として、抗体の産生に、局所的に投与する殺虫剤並びに経口的に摂取する殺虫剤として有用である。
組換えＰＩまたはＰＩ前駆体は、殺虫剤として、単独または１または２以上の担体またはＢＴ結晶タンパク質などの他の殺虫剤と組み合わせて提供される。
【００２８】
本発明のＰＩは、病害虫の増殖または感染および真菌、細菌および昆虫などの病原体に対して、植物の器官、たとえば柱頭を防御する働きを有すると考えられる。それゆえ、ＰＩ前駆体（このものは、モノマー性ＰＩ自体のモノマーにプロセシングされうる）を発現しうるトランスジェニック植物を生成するのに用いることのできる遺伝的構築物を開発する必要性が存在する。
【００２９】
従って、本発明の他の態様は、植物由来のII型セリンＰＩ前駆体またはそのモノマーをコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子を含む遺伝子構築物を包含する。その際、該前駆体は少なくとも３つのＰＩモノマーを含み、これらモノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、残るモノマーのうち少なくとも一つはトリプシン特異的な部位を有し、該遺伝子配列はさらに、該核酸分子の発現を可能にする発現手段、植物細胞中での複製を可能にする複製手段、または該核酸分子の植物細胞ゲノム中への安定な組み込みを可能にする組み込み手段を含む。発現は、発育に伴ってまたは感染に応答して、たとえば存在するＰＩ制御配列によって、制御されるのが好ましい。核酸分子の発現が高められることによって、天然に存在する植物中に認められるレベルに比べてＰＩの内生レベルが大きくなるのが好ましい。または、本発明のＰＩ前駆体ｃＤＮＡはプロモーター配列を得るのに用いることができ、該プロモーター配列を今度は遺伝子構築やその操作に用いて等価な内生プロモーターの過剰発現を可能とすることができる。他の態様において、ＰＩ前駆体は上記のようなハイブリッド分子である。
【００３０】
本発明のさらに別の態様は、上記遺伝子配列および／または核酸分子を有し、必要によりＰＩおよび／またはＰＩ前駆体またはハイブリッドＰＩ前駆体の産生レベルを上昇させ、高め、あるいは一層迅速にすることのできるトランスジェニック植物に関する。この植物は穀物植物またはタバコ植物であるのが好ましいが、ＰＩまたはＰＩ前駆体の核酸分子を発現することができる限り他の植物を用いることもできる。トランスジェニック植物がＰＩ前駆体を産生する場合には、該植物は該前駆体をさらにモノマーにプロセシングしてもよいし、またはプロセシングしなくてもよい。または、該遺伝子配列は、昆虫に伝播するためのウイルスまたは細菌ベクターの一部であってもよく、それによって昆虫中の病原体を制御し、結果的に該病原体の植物への伝播を妨害することができる。
【００３１】
本発明のさらに他の態様において、ＰＩ前駆体またはその１または２以上のモノマーに対する抗体が提供される。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、発現ライブラリーにおいてＰＩまたはＰＩ前駆体クローンをスクリーニングするうえで、または発酵液、上澄み液または植物抽出液中のＰＩまたはＰＩ前駆体を精製するうえで有用である。
本発明の遺伝子構築物はまた、昆虫の消化管中に住まわせて、該昆虫自体または該昆虫中の植物病原体に有害な作用をさせたり、または動物の消化管中への導入を容易にして植物物質の消化を容易にしたりするために用いることもできる。
【００３２】
つぎに、本発明を以下の図面および実施例により記載するが、これらに限られるものではない。
図面：
図１は、ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびニコチアナ・アラタＰＩタンパク質の対応アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。該アミノ酸配列は、成熟タンパク質の最初のアミノ酸を１としてナンバーを付してある。シグナル配列はヌクレオチド１〜９７によりコードされており、これらアミノ酸残基にはマイナスの番号を付してある。インヒビターの反応部位残基は囲ってある。ニコチアナ・アラタＰＩ配列は、６つの類似のドメイン（ドメイン１、残基１〜５８、ドメイン２、残基５９〜１１６、ドメイン３、残基１１７〜１７４、ドメイン４、残基１７５〜２３２、ドメイン５、残基２３３〜２９０、ドメイン６、残基２９１〜３４３）を有する。
【００３３】
図２は、ニコチアナ・アラタの種々の器官からのＲＮＡのゲルブロット分析を示す写真表示である。ニコチアナ・アラタの器官およびニコチアナ・タバクム（Ｎ.tabacum）およびニコチアナ・シルベストリス（Ｎ.sylvestris）の柱頭および花柱から単離したＲＮＡのゲルブロットは、ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２とハイブリダイズした。Ｓｔ、柱頭および花柱；Ｏｖ、子房；Ｐｏ、花粉；Ｐｅ、花弁；Ｓｅ、萼片；Ｌ、傷のない葉；Ｌ４、傷から４時間後の葉；Ｌ２４、傷から２４時間後の葉；Ｎｔ、ニコチアナ・タバクムの柱頭および花柱；Ｎｓ、ニコチアナ・シルベストリスの柱頭および花柱；Ｎａ、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片。
ＮＡ−ＰＩ−２クローンは、２つのｍＲＮＡ種（１.０および１.４ｋｂ）とハイブリダイズした。大きい方のｍＲＮＡは柱頭および花柱において主としてみられ、一方、小さい方のｍＲＮＡ種は他の組織において一層明らかに認められた。高厳格洗浄後、柱頭および花柱からの１.０ｋｂ ｍＲＮＡはＮＡ−ＰＩ−２プローブにもはやハイブリダイズしない。
【００３４】
図３は、柱頭および花柱でのＮＡ−ＰＩ−２に相同なＲＮＡのインシトゥ局在を示す写真表示である。
（ａ）32Ｐ標識したＮＡ−ＰＩ−２ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた後の１ｃｍ長の芽の柱頭および花柱の縦方向の凍結切片の放射能写真；
（ｂ）トルイジンブルーで染色した（ａ）と同じ切片。ｃ、皮層；ｖ、維管束；ｔｔ、導管；ｓ、柱頭組織。
ｃＤＮＡプローブは柱頭の細胞を強く標識し、維管束への幾つかのハイブリダイゼーションも認められる。表皮、皮層または導管へのハイブリダイゼーションは認められなかった。スケール棒＝２００μｍ。
【００３５】
図４は、ニコチアナ・アラタのゲノムＤＮＡのゲルブロット分析を示す写真表示である。制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIIIで消化し放射性標識したＮＡ−ＰＩ−２でプローブしたニコチアナ・アラタゲノムＤＮＡのゲルブロット分析。サイズマーカー（ｋｂ）は、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片である。ＥｃｏＲＩにより２つのハイブリダイズする断片（１１ｋｂおよび７.８ｋｂ）が得られたが、ＨｉｎｄIIIからは３つの大きなハイブリダイズする断片（１６.６、１３.５および１０.５ｋｂ）が得られた。ＮＡ−ＰＩ−２クローンは、少なくとも２つの成員からなる小さな多重遺伝子族に属すると思われる。
【００３６】
図５は、ニコチアナ・アラタの種々の器官におけるＰＩ活性のグラフ表示である。種々の器官からの緩衝液溶解性の抽出物について、トリプシンおよびキモトリプシンを抑制する能力を試験した。柱頭および萼片抽出物が、トリプシン（Ａ）およびキモトリプシン（Ｂ）の両方に対する最も有効なインヒビターであった。
【００３７】
図６は、ニコチアナ・アラタの柱頭からのＰＩ精製の工程を示す。
（ａ）柱頭抽出物からの硫酸アンモニウム沈殿したタンパク質のセファデックスＧ−５０ゲル濾過クロマトグラフィー。ＰＩ活性はプロフィールの後期に溶出した。
（ｂ）ゲル濾過カラムからのフラクションの２０％ｗ／ｖ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（レムリ（Laemmli）、１９７０）。ゲルを銀染色し、分子量マーカー（ファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンにて示す。約６ｋＤのタンパク質（矢印）がプロテイナーゼインヒビター活性とともに溶出した。
（ｃ）精製手順の種々の段階でのＰＩ含有フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。レーン１、粗製の柱頭抽出物（５μｇ）；レーン２、８０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムにより沈殿させた柱頭タンパク質（５μｇ）；レーン３、キモトリプシンアフィニティーカラムから溶出したＰＩタンパク質（１μｇ）。
ＰＩは６ｋＤのタンパク質であり、柱頭からの非フラクション化緩衝液可溶性抽出物中の主要な成分である。
【００３８】
図７は、ニコチアナ・アラタおよびジャガイモおよびトマトＰＩIIｃＤＮＡからのＮＡ−ＰＩ−２クローンによりコードされるＰＩタンパク質のハイドロパシー（hydropathy）プロットを示すグラフ表示である。線よりも上にある値は疎水性の領域を示し、線よりも下の値は親水性の領域を示す。推定シグナルペプチドには陰影を施してある。疎水性プロフィールは、カイト（Kyte）およびドゥーリトル（Doolittle）（１９８２）の予測則および９の連続アミノ酸の連なりを用いて作成した。
（ａ）ニコチアナ・アラタＰＩタンパク質のハイドロパシープロフィール。予測された前駆体タンパク質中の６つの繰り返しドメインをＩ〜ＶＩとして表示してある。６ｋＤ ＰＩ種を産生するための推定開裂部位を含む親水性領域には矢印を付してある。これら部位における開裂により生成されるペプチドに対応する領域は、キモトリプシンインヒビターに対してはＣで、トリプシンに対してはＴで、２つの両側の配列に対してはｘで表示してある。
【００３９】
（ｂ）ジャガイモＰＩIIタンパク質のハイドロパシープロフィール（サンチェス−セラーノ（Sanchez−Serrano）ら、１９８６）。ＰＩIIタンパク質中の２つの繰り返しドメインをＩおよびIIで表示してある。ＰＣＩ−１を産生するための推定開裂部位には矢印を付してあり、ＰＣＩ−１の領域にはマークを付してある。
（ｃ）トマトＰＩIIｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのハイドロパシープロフィール（グラハムら、１９８５）。２つのドメインにはＩおよびIIの表示を付してあり、プロセシング部位の可能性のある残基には矢印を付してある。これら部位は親水性と予測される領域中には存在せず、それゆえ、開裂産物にはマークを付していない。
【００４０】
図８は、生育中の花の柱頭中のＰＩタンパク質のイムノブロット分析を示す。
（ａ）ニコチアナ・アラタの生育中の花。
（ｂ）（ａ）に示す生育の各段階における柱頭タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、５μｇの各抽出物を負荷した。ペプチドゲルを銀染色し、分子量マーカー（ＬＫＢ・ロー・モレキュラー・ウエイト（ＬＫＢ Low Molecular weight）およびファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンで示してある。
（ｃ）抗ＰＩ抗血清でプローブした（ｂ）と同じゲルのイムノブロット。
生育中の花の柱頭には、抗ＰＩ抗体に結合する約４２ｋＤ、３２ｋＤ、１８ｋＤおよび６ｋＤの４つのタンパク質が含まれる。４２ｋＤおよび１８ｋＤ成分は、花が成熟するにつれて濃度が減少していくのに対して、６ｋＤ ＰＩタンパク質は開花の直前に最大濃度に達する。３２ｋＤ成分（二重線として現れる）のレベルは、花の発育の間有意に変化しない。
【００４１】
図９は、ニコチアナ・アラタからの６ｋＤプロテイナーゼインヒビター種の分離および同定を示す。
Ａ．逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる６ｋＤ ＰＩの分離
４つの主要なピークが、約１５.５分（ピーク１）、２０.５分（ピーク２）、２２.５分（ピーク３）、２４分（ピーク４）の保持時間にて得られた。各ピークにおけるペプチドは、Ｎ末端分析および質量分析の両者の組み合わせにより同定した。Ｃ１およびＴ１〜Ｔ４についてはＢを参照。
Ｂ．ＰＩ前駆体タンパク質から得られた５つの相同なペプチド：Ｃ１、キモトリプシンインヒビター、Ｔ１〜Ｔ４、トリプシンインヒビター。太線は、これらインヒビターの反応部位を示す。前駆体タンパク質は、シグナル配列を除いて描写してある。図中点線部は、６つの繰り返しドメインの領域（アミノ酸１〜３４３、図１）。図中斜線部は、非繰り返し配列（アミノ酸３４４〜３６８、図１）。矢印は、前駆体タンパク質におけるプロセシング部位を示す。
【００４２】
Ｃ．ｃＤＮＡクローンから予測され精製タンパク質のＮ末端シークエンシングにより確認されたＣ１およびＴ１〜Ｔ４のアミノ酸配列。各ペプチドのカルボキシ末端におけるアミノ酸は、電子スプレー（electro−spray）質量分析計を用いた正確な質量測定により得られた。Ｃ１およびＴ１インヒビターは、５つのアミノ酸において異なっている（太字）。これらアミノ酸のうちの２つは反応部位に位置しており（下線）、他の２〜３の残基はカルボキシ末端に位置している。ペプチドＴ２〜Ｔ４は３つのアミノ酸が変化しており（囲み）、これらはＣ１とＴ１との間では保存されている。ペプチドＴ２およびＴ３は互いに同一である。質量分析を用い、Ｎ末端およびＣ末端における正確でないトリミングのために他の形態のＣ１およびＴ１〜Ｔ４が存在することを示した。すなわち、幾つかの形態は残基１または残基５３が失われており、他のものは残基１および残基５３の両方が失われている（表２参照）。
【００４３】
図１０は、前駆体ＰＩタンパク質のプロセシング部位の周辺のアミノ酸配列を示す。
太字で示した配列は、精製ＰＩタンパク質から得たアミノ末端配列である。マイナスの番号を付した配列は、ｃＤＮＡクローンから予測されるフランキング配列である。予測された前駆体タンパク質は、この配列の６つの繰り返しを含む。
【００４４】
図１１は、バクロウイルス発現系で生成されたＰＩ前駆体、およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎによるアフィニティー精製ＰＩ前駆体の消化後に得られた生成物を示す。
Ａ．組換えバクロウイルスにより生成されたＰＩ前駆体
発育の緑芽段階におけるニコチアナ・アラタ柱頭からアフィニティーおよびＨＰＬＣ精製したＰＩ前駆体（レーン１）および組換えバクロウイルスにより生成されたアフィニティー精製ＰＩ前駆体（レーン２）を含むイムノブロット。電気泳動的にニトロセルロースに移す前に、タンパク質を１５％ｗ／ｖＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分画した。このブロットを、柱頭からの６ｋＤ ＰＩ種に対してウサギ中で産生させた抗体とともにインキュベートした。組換えウイルスは、柱頭によって産生されたＰＩ前駆体タンパク質と同じサイズの４２ｋＤの免疫反応性のタンパク質を産生した（矢印）。
【００４５】
Ｂ．エンドプロテイナーゼＡｓｐ−ＮによるＰＩ前駆体の開裂
銀染色した１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。１、バクロウイルスにより産生され酵素なしでインキュベートしたＰＩ前駆体。２、前駆体なしでインキュベートした酵素。６ｋＤ、ニコチアナ・アラタ柱頭から精製した約６ｋＤのＰＩペプチド。１ｍ、５ｍ、３０ｍ、１分、５分および３０分のインキュベーション後に産生された反応生成物。２ｈおよび２４ｈ、２時間および２４時間のインキュベーション後の反応生成物。約６〜７ｋＤのペプチドは、前駆体のインキュベーションの１分以内に酵素により検出された。２４時間後には６〜７ｋＤのペプチドのみが検出された。レーン１における４２ｋＤよりも小さなバンドは、バクロウイルス発現系における翻訳の成熟前の停止により生成された末端の欠失した形態の前駆体によるものである。
【００４６】
図１２は、Ａｓｐ−Ｎ消化により前駆体から得られたペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分取クロマトグラフィーである。ＰＩ前駆体のＡｓｐ−Ｎ消化によって生成されたペプチドのＨＰＬＣプロフィールを示す。主要なピークは、１９分（Ａｓｐ−Ｎ１と称する）および２１分（Ａｓｐ−Ｎ２と称する）の保持時間を有していた。これらピークフラクション（１＆２）中のペプチドは、柱頭からの６ｋＤペプチドよりもＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でわずかにゆっくりとした移動度を有していた。Ａｓｐ−Ｎ１およびＡｓｐ−Ｎ２のプロテイナーゼ抑制活性をトリプシンおよびキモトリプシンに対して試験した。
【００４７】
図１３は、柱頭からのＰＩ前駆体、ＰＩペプチド、該ＰＩ前駆体からインビトロで生成したＰＩペプチドのトリプシンおよびキモトリプシン抑制活性の比較を示す。
材料および方法において記載するように、１.０μｇのトリプシンまたはキモトリプシンを抑制する能力についてＰＩ前駆体またはＰＩペプチド（０〜１.０μｇ）を試験した。抑制活性は、プロテイナーゼをＰＩとともにインキュベートした後に残留するプロテイナーゼ活性のパーセントとして表し、ＰＩなしでインキュベートしたプロテイナーゼの活性を１００％の残留活性とした。実験は２回行い、その平均値をプロットした。平均値からの変動は８％またはそれ以下であった。
【００４８】
図１４は、コントロールの人工食餌、ダイズバウマン−バーク（Bowman−Birk）インヒビターおよびニコチアナ・アラタＰＩ上で飼育したテレオグリルス・コモデュス（Ｔ.commodus）若虫の発育曲線を示すグラフ表示である。縦軸は、各処置におけるコオロギの平均体重（＋／−標準誤差）をｍｇで示す。横軸は週を示す。ニコチアナ・アラタＰＩで飼育したコオロギは、実験を通じてコントロールの食餌およびダイズインヒビターを含有する食餌で飼育した両コオロギに比べて低平均体重を示した。
【００４９】
【実施例】
実施例１
１．材料および方法
植物材料
自家不和合性の遺伝子型Ｓ1Ｓ3、Ｓ3Ｓ3およびＳ6Ｓ6を有するニコチアナ・アラタ（リンクおよびオット）植物を、すでに記載されているように（アンダーソンら、１９８９）、標準温室（glasshouse）条件下にて保持した。傷に対する応答の誘発を回避するために器官を液体窒素中に直接回収し、必要なときまで−７０℃で貯蔵した。遺伝子発現に対する傷の影響を調べるため、透析クリップで中心葉脈を押し潰すことによって葉を傷つけた。傷をつけてから４時間および２４時間後に葉を回収した。
【００５１】
ＰＩをコードするｃＤＮＡクローンの同定およびシークエンシング
ニコチアナ・アラタ（遺伝子型Ｓ3Ｓ3）の成熟花から単離した柱頭および花柱からポリアデニル化ＲＮＡを調製し、ラムダｇｔ１０（アンダーソンら、１９８９）中でｃＤＮＡライブラリーを構築するのに用いた。ニコチアナ・アラタ（遺伝子型Ｓ3Ｓ3およびＳ6Ｓ6）の柱頭および花柱からのｍＲＮＡから一本鎖の３２Ｐ標識ｃＤＮＡを調製し、Ｓ遺伝子型特異的でない高度に発現されたクローンについてライブラリーをスクリーニングするのに用いた（アンダーソンら、１９８９）。
【００５２】
両Ｓ遺伝子型からのｃＤＮＡプローブに強くハイブリダイズしたプラークを選択し、クロスハイブリダイゼーションに基づいてグループに分けた。各グループの最も長いクローンをＭ１３ｍｐ１８およびｐＧＥＭ３ｚｆ＋中にサブクローニングし、アプライドバイオシステムズモデル３７３Ａ自動シークエンサーを用いてシークエンシングを行った。標準アプライドバイオシステムズプロトコールに従い、染色プライマーおよび染色ターミネーターの両サイクルシークエンシングを行った。ＳｅｑＥｄTM配列編集ソフトウエア（アプライド・バイオシステムズ）を用いて共通配列を作成した。これらクローンに相同な配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースでサーチした。ニコチアナ・アラタＰＩクローンの６つのドメイン間での配列の類似性の程度が高いため、非繰り返し３’配列（ヌクレオチド１１１７〜１１３７、１１８８〜１２０３および１２４７〜１２６７）、および繰り返し領域の開始の前の５’配列（ヌクレオチド７４〜９８）に対してシークエンシングプライマーを作成した。加えて、ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物をエンドヌクレアーゼＨａｅIIIで制限処理することにより、ヌクレオチド６２２および９７０で切断して３つのフラグメントを生成させた。これらフラグメントをｐＧＥＭ７ｚｆ＋中にサブクローニングし、Ｍ１３前プライマーおよび逆プライマーを用いて両方向にシークエンシングを行った。ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物の繰り返し特性のため、培養物を６時間以上増殖させた場合にファージミドおよびプラスミドベクターの両方で不安定となった。
【００５３】
ＲＮＡゲルブロット分析
全ＲＮＡを単離し、すでに記載されたようにして（アンダーソンら、１９８９）、１.２％ｗ／ｖアガロース／ホルムアデヒドゲル上で分離した。ＲＮＡをHybond−Ｎ（アマーシャム）に移し、ランダムヘキサヌクレオチドを用いて32Ｐで標識したｐＮＡ−ＰＩ−２からの挿入物でプローブを行った（１×１０8ｃｐｍμｇ−１；１×１０7ｃｐｍｍｌ-1）（ファインベルク（Feinberg）およびフォーゲルスタイン（Vogelstein）、１９８３）。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション（６８℃にて）をアンダーソンらによる記載（１９８９）と同様にして行った。フィルターを２×ＳＳＣ、０.１％ｗ／ｖ ＳＤＳまたは０.２×ＳＤＳ、１％ｗ／ｖ ＳＤＳ中で６８℃で洗浄した。
【００５４】
インシトゥハイブリダイゼーション
インシトゥハイブリダイゼーションをコーニッシュ（Cornish）ら（１９８７）による記載に従って行った。ｐＮＡ−ＰＩ−２からの挿入物（１００ｎｇ）をランダムヘキサヌクレオチドプライミングにより１０8ｃｐｍμｇ-1の比活性に標識することによりプローブを調製した（ファインベルクおよびフォーゲルスタイン、１９８３）。標識したプローブを沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０μｌ）中に再懸濁させ、５μｌを切片に適用した。切片をカバーグラスで覆い、５０％ｖ／ｖホルムアデヒドを入れた閉じた箱中で４０℃にて一夜インキュベートした。インキュベーション後、切片を室温にて４×ＳＳＣ、室温にて２×ＳＳＣ、および４０℃にて１×ＳＳＣ中で順番に４０分間洗浄した。スライドを乾燥させ、室温にてＸ線フィルム（CronexＭＲＦ３２、デュポン）に直接暴露した。ハイブリダイズした切片を水中の０.０２５％ｗ／ｖトルイジンブルーで対比染色し、Eukitt（カール・ツァイス（Carl Zeiss）、フライブルク、ＦＲＧ）中に積載した。放射能写真を切片上に移して、合成物を示した。
【００５５】
ＤＮＡゲルブロット分析
バーナツキー（Bernatzky）およびタンクスレイ（Tanksley）（１９８６）の手順により、ニコチアナ・アラタの若葉からゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡ（１０μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで完全に消化し、０.９％ｗ／ｖアガロースゲル上の電気泳動により分離し、２０×ＳＳＣ中のウエットブロッティングによりHybond−Ｎ（アマーシャム）に移した。フィルターをプローブし、ＲＮＡブロット分析の場合と同様にして洗浄した。
【００５６】
タンパク質抽出物の調製
組織を液体窒素中で凍結し、乳鉢および乳棒中で細かい粉末に破砕することにより植物材料から可溶性タンパク質を抽出した。粉末化した組織を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１４μＭβ−メルカプトエタノールからなる緩衝液中に抽出した。１０,０００ｇで１５分間遠心分離することにより不溶性の物質を除いた。ブラッドフォード（Bradford）（１９７６）の方法によりウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用いてタンパク質濃度を評価した。
【００５７】
プロテイナーゼインヒビターアッセイ
リッカウアー（１９８９）の記載に従い、タンパク質抽出物および精製タンパク質をトリプシンおよびキモトリプシンに対する抑制活性についてアッセイした。１μｇのトリプシン（ＴＰＣＫ−処理；シグマ）および３μｇのキモトリプシン（ＴＬＣＫ−処理；シグマ）に対して抑制活性を測定した。トリプシンおよびキモトリプシンによるそれぞれの合成基質、Ｎ−α−Ｐ−トシル−Ｌ−アルギニンメチルエステル（ＴＡＭＥ）およびＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステル（ＢＴＥＥ）の加水分解の速度を、これら酵素の抑制されなかった活性とした。抽出物の抑制活性は、プロテアーゼを抽出物とともにプレインキュベートした後に残留するコントロールのプロテアーゼ活性のパーセントとして表した。柱頭からのＰＩペプチド、ＰＩ前駆体およびＡｓｐ−Ｎプロセシングしたペプチドを、クリステラー（Christeller）ら（１９８９）による記載に従って抑制活性についてアッセイした。
【００５８】
ニコチアナ・アラタＰＩタンパク質の精製
柱頭（１０００；１０ｇ）を液体Ｎ2中で細かい粉末に破砕し、緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１４μＭ β−メルカプトエタノール、４ｍｌ／ｇ組織）中に抽出した。最初の精製工程であるゲル濾過の前に抽出物を濃縮するため、抑制活性を８０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムで沈殿させたが、すべてのプロテイナーゼ抑制活性を沈殿させるには濃縮が必要であった。
【００５９】
硫酸アンモニウムペレットを５ｍｌの０.１５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.１中に再懸濁し、同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−５０カラム（２ｃｍ×１００ｃｍ）上に負荷した。このカラムから溶出しプロテイナーゼ抑制活性を有するフラクション（１０ｍｌ）をプールし、キモトリプシン−セファロースＣＬ４Ｂのアフィニティーカラム［製造業者の指示により１００ｍｇのＴＬＣＫ−処理α−キモトリプシン（シグマ）を１５ｍｌのセファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア）に架橋させたもの］に負荷した。結合したタンパク質を７ｍ尿素、ｐＨ３で溶出する（５ｍｌフラクション）前に、カラムを１０容量の０.１５Ｍ ＫＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８.１で洗浄した。溶出液を２００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８で直ちに中和し、脱イオン水に対して充分に透析した。
【００６０】
アミノ酸配列分析
精製ＰＩタンパク質を、ガス相シークエンサー上の自動エドマン分解に供する前に逆相ＨＰＬＣマイクロポアカラム上のクロマトグラフィーにかけた（マウ（Mau）ら、１９８６）。グレゴ（Grego）ら（１９８５）の記載に従い、フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸をＨＰＬＣにより分析した。
【００６１】
ニコチアナ・アラタＰＩに対するポリクローナル抗血清の製造
以下のようにしてグルタルアルデヒドを用いて精製プロテイナーゼインヒビター（図６ｃ、レーン３）を担体タンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（シグマ）にコンジュゲートした。１ｍｇのＰＩタンパク質を
Ｈ2Ｏ（１.５ｍｌ）中に溶解し、０.５ｍｌの０.４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）中のＫＬＨ（０.３ｍｇ）と混合した。２０ｍＭグルタルアルデヒド（１ｍｌ）を室温で撹拌しながら５分間かけて滴下した。混合物を室温で３０分間撹拌し、グリシン（０.２５ｍｌ）を加え、混合物をさらに３０分間撹拌した。ついで、コンジュゲートしたタンパク質を通常の食塩水（０.８％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）に対して充分に透析した。各注射についで１００μｇの当量のＰＩタンパク質を用いた。最初の注射にはフロイントの完全アジュバントを用い、その後の２回のブースター注射には不完全アジュバントを用いた。抗血清のＩｇＧフラクションを製造業者の指示に従ってプロテインＡセファロース（ファルマシア）上で分離した。
【００６２】
タンパク質ゲルブロット分析
タンパク質抽出物を１５％ｗ／ｖ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し（レムリ、１９７０）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｔｒａｎｓ−ＢｌｏｔＲＳｅｍｉ−ｄｒｙ電気泳動トランスファーセル（１２Ｖ、２０分）を用いて２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、２０％ｖ／ｖメタノール中のニトロセルロースに移した。負荷およびタンパク質の移動は、膜上のタンパク質をPonceau Ｓ（ハーロウ（Harlow）およびレイン（Lane）、１９８８）で染色することによりチェックした。膜を３％ｗ／ｖウシ血清アルブミン中で１時間ブロックし、抗ＰＩ抗体（１％ｗ／ｖＢＳＡ、トリス緩衝食塩水中に２μｇ／ｍｌ）とともに室温にて一夜インキュベートした。製造業者の推奨に従い、ビオチン化ロバ抗ウサギＩｇＧ（１／５００希釈、アマーシャム）およびアマーシャムビオチン−ストレプトアビジンシステムを用いて結合抗体を検出した。
【００６３】
エンドプロテイナーゼＡｓｐ−ＮによるＰＩ前駆体のタンパク質加水分解
アフィニティー精製したＰＩ前駆体（１.２５ｍｇ）を１００ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ８.５中のエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（２μｇ）とともに３７℃にて全量１ｍｌで４８時間インキュベートした。反応生成物を、分析的ブラウンリー（Brownlee）ＲＰ−３００アクアポア（Aquapore）カラム（Ｃ８、７μｍ、４.６×１００ｍｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより分離した。カラムを０.１％ｖ／ｖＴＦＡ中で平衡化し、ペプチドを以下のプログラムで溶出した：０〜２５％Ｂ（０.０８９％ｖ／ｖＴＦＡ中の６０％ｖ／ｖアセトニトリル）を５分間かけて負荷し、ついで２５〜４２％勾配のＢを４０分間かけて負荷し、最後に４２〜１００％勾配のＢを５分間かけて負荷する。流速は１.０ｍｌ／分であり、ペプチドを２１５ｎｍにおける吸光度により検出した。各ピークを手動で回収し、凍結乾燥した。ＵＶ検出器上での２１５ｎｍにおける各ピークで得られた応答により濃度を推定した。
【００６４】
２．ＰＩ前駆体遺伝子のクローニング
ＰＩｃＤＮＡクローンの単離および特徴付け
ｃＤＮＡライブラリー（ニコチアナ・アラタの成熟花の柱頭および花柱から単離したｍＲＮＡより調製）を、自家不和合性の遺伝子型を伴わない高度に発現された遺伝子のクローンについてスクリーニングした。ジャガイモおよびトマトのII型プロテイナーゼインヒビター（ソーンバーグ（Thornburg）ら、１９８７；グラハム（Graham）ら、１９８５）とある程度の配列同一性を有するタンパク質をコードするクローンを選択した。最も大きいクローン（ＮＡ−ＰＩ−２）は１１９１ヌクレオチドの転写解読枠を有し、１３６０塩基対の長さであった。このニコチアナ・アラタクローン（ＮＡ−ＰＩ−２）の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）および予測されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を図１に示す。Ｎ−グリコシル化の可能性のある部位は存在しない。
【００６５】
驚くべきことに、このニコチアナ・アラタｃＤＮＡクローンは、完全ではないが高度の配列同一性を有する６つの繰り返しドメインを有するタンパク質をコードしている（図１）。これら各ドメインには反応性部位の可能性のある部位が含まれている（図１中に明示してある）。ニコチアナ・アラタＰＩの推定反応部位の残基は、キモトリプシンを特異的に抑制する２つの部位（Ｌｅｕ５−Ａｓｎ６、Ｌｅｕ６３−Ａｓｎ６４）およびトリプシンに対して特異的な４つの部位（Ａｒｇ１２１−Ａｓｎ１２２、Ａｒｇ１７９−Ａｓｎ１８０、Ａｒｇ２３７−Ａｓｎ２３８およびＡｒｇ２９５−Ａｓｎ２９６）を有するインヒビターと一致している。
【００６６】
ＮＡ−ＰＩ−２の繰り返し構造がクローニングによる人為的な産物でないことを確かめるため、別の３つのｃＤＮＡクローンをシークエンシングしたところ、ＮＡ−ＰＩ−２と同一であることがわかった。
表１は、ＰＩ前駆体の６つのドメインのアミノ酸同一性のパーセントを比較したものである。
【００６７】
ＰＩ ｍＲＮＡの一過性で空間的な発現
ニコチアナ・アラタの種々の組織から単離した全ＲＮＡを、図２に示すＲＮＡゲルブロット分析においてＰＩ ｃＤＮＡクローンでプローブした。１.０および１.４ｋｂの２つのハイブリダイズするメッセージが、花柱（柱頭を含む）から単離した全ＲＮＡ中に存在した。大きい方のメッセージ（この組織において主要なものである）のみが、ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２（１.４ｋｂ）をコードするのに充分なサイズである。小さい方のメッセージは、より高い厳格さにおいてはｃＤＮＡプローブで検出されない。約１.４ｋｂの相同なメッセージはまた、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・シルベストリスの花柱から単離したＲＮＡ中にも存在した（図２）。
【００６８】
花の他の器官（花粉を除く）では、両メッセージとも低レベルで検出することができたが、より小さいＲＮＡ種が一層たくさん認められた。花粉ＲＮＡにはハイブリダイゼーションは認められなかった。葉のＲＮＡにはハイブリダイズする種が認められなかったが、機械的な傷をつけてから２４時間後には１.０および１.４ｋｂの２つの種が検出された。この場合には、小さい方のメッセージ（１.０ｋｂ）の方がたくさん認められた。
【００６９】
未熟な（１ｃｍ長）芽の花柱の縦切片への放射性標識したニコチアナ・アラタＰＩｃＤＮＡのインシトゥハイブリダイゼーションを図３に示す。該ｃＤＮＡに相同なＲＮＡは柱頭の細胞に強く結合し、維管束へは弱く結合した。皮層組織、導管組織または花柱の表皮ではハイブリダイゼーションは検出されなかった。同じパターンのハイブリダイゼーションは、成熟した受容性の（receptive）花においても観察された。ハイブリダイゼーションの前にリボヌクレアーゼＡで処理したコントロールの切片は標識されなかった。
【００７０】
ゲノムＤＮＡブロット分析
ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２を図４に示すＤＮＡゲルブロット（ＥｃｏＲＩかＨｉｎｄIIIのいずれかで消化したゲノムＤＮＡが含まれる）上でプローブとして用いた。ＥｃｏＲＩにより２つのハイブリダイズするフラグメント（１１ｋｂおよび７.８ｋｂ）が得られ、ＨｉｎｄIIIからは３つの大きなハイブリダイズするフラグメント（１６.６、１３.５および１０.５ｋｂ）が得られた。
【００７１】
ニコチアナ・アラタの種々の組織中でのＰＩ活性の分布
ニコチアナ・アラタの種々の器官の粗製抽出物によるトリプシンおよびキモトリプシンの抑制を図５に示す。柱頭抽出物がトリプシンおよびキモトリプシンの両方に対して最も有効なインヒビターであった。柱頭抽出物は萼片抽出物に比べて８倍までの抑制活性を有し、花柱、花弁、葉および傷つけた葉からの抽出物に比べると２０倍以上の抑制活性を有していた。
【００７２】
ニコチアナ・アラタ柱頭からのＰＩの精製
ニコチアナ・アラタの柱頭を緩衝液中に抽出し、８０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムで沈殿させることにより抑制活性を濃縮した。沈殿を再溶解し、セファデックスＧ−５０上でゲル濾過することにより分画した。図６ａおよび６ｂに図示したプロフィールにおいて、プロテイナーゼインヒビターに比べて抽出物中の殆どのタンパク質は早く溶出した。プロテイナーゼ抑制活性を有するフラクションをプールし、キモトリプシン−セファロースのアフィニティーカラムに負荷した。ＰＩ活性は約６ｋＤのタンパク質とともに溶出し、図示６ｃに示す２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で単一のバンドとして移動するように思われた。精製の種々の段階におけるＰＩの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した（図６ｃ）。精製したインヒビターは、粗製の抽出物中の存在する抑制活性の約５０％を表していた。
【００７３】
６ｋＤ ＰＩタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列
精製ＰＩタンパク質からＮ末端アミノ酸配列ＤＲＩＣＴＮＣＣＡＧ（Ｔ／Ｋ）ＫＧ（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を得た。このアミノ酸配列は、図１中の位置２５、８３、１４１、１９９、２５７および３１５から開始されるｃＤＮＡクローンの導かれた配列中の６つの領域に対応する。このＮ末端配列の位置１１には、トレオニンおよびリジンの両方が検出された。このことは、図１において下線を引いた配列で始まる６つのペプチドの混合物からなる精製インヒビターと一致する。最初の２つのペプチドは該位置にトレオニンを含み、一方、他の４つのペプチドは該位置にリジンを有する。予測された前駆体タンパク質中の６つの繰り返しドメインに対するこれらペプチドの相対位置を図７に図示する。これら６つの予測された６ｋＤペプチドのうち５つは、キモトリプシンかまたはトリプシンのいずれかに対する反応部位を有している（図１および７）。６番目のペプチドは他の５つのペプチドよりもアミノ酸が４つ短く（５８アミノ酸）、抑制部位を含有していないので活性でない。Ｎ末端からのペプチド（図７におけるｘ）はキモトリプシン反応性の可能性のある部位を有するが、はるかに短い（２４アミノ酸）。
【００７４】
ニコチアナ・アラタ中でのＰＩタンパク質の分布
キーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートした精製ＰＩタンパク質に対してポリクローナル抗血清を産生させた。該抗体はイムノブロット分析において精製６ｋＤ ＰＩタンパク質と強く反応し、成熟花からの全柱頭および花柱抽出物において６ｋＤおよび３２ｋＤタンパク質（二重線として出現）にのみ結合した。図８は、抗ＰＩ抗血清でプローブした、発育の種々の段階（１ｃｍ長の芽から成熟した花まで）での花からのタンパク質抽出物を含有するイムノブロットである。長さが１ｃｍから５ｃｍの芽では、６ｋＤおよび３２ｋＤタンパク質に加えて約１８ｋＤおよび４２ｋＤの大きな交差反応性タンパク質が検出された。これら１８ｋＤおよび４２ｋＤタンパク質は成熟につれて濃度が減少したが、６ｋＤタンパク質は開花の直前にピーク濃度に達した。３２ｋＤタンパク質は花の成熟の間、比較的一定に推移した。
【００７５】
実施例２
ＰＩモノマーの精製および同定
１．材料および方法
逆相クロマトグラフィーによる６ｋＤ ＰＩ種の分離
柱頭（２１,０００）を破砕し、ＰＩタンパク質の精製についての記載と同様にして抽出した。セファデックスＧ−５０ゲル濾過カラム（５ｃｍ×８００ｃｍ、分離当たり３０００の柱頭）上でのゲル濾過の後、ペプチドを凍結乾燥し、ベックマンＨＰＬＣシステムゴールド（Gold）上のブラウンリーＲＰ−３００Ｃ８逆相カラム（１０×２５０ｍｍ）に負荷し、０.１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトニトリル勾配（０〜１０％を５分間、１０〜２５％を４０分間、および２５〜６０％を１０分間）により５ｍｌ／分にて溶出した。ピークのフラクション（フラクション１、２、３および４）を回収し、凍結乾燥した。
【００７７】
電子スプレー質量分析
改変ヒューレット−パッカード（Hewlett−Packard）モデルＨＰ１０９０Ｌ液体クロマトグラフ上のブラウンリーＲＰ−３００Ｃ８逆相カラム（１５０×２０ｍｍ内径の融解石英毛管カラム）上に水（２.０μｌ）中の各ＰＩ調製物（フラクション１、２、３および４）（２０ピコモル）を負荷し、１μｌ／分の流速および２５℃のカラム温度にてアセトニトリルの直線勾配（０.０５％ｖ／ｖ ＴＦＡから０.０４５％ｖ／ｖ ＴＦＡ／６０％ｖ／ｖアセトニトリル、３０分間）で溶出することにより、ＨＰＬＣ溶出液のオンライン質量分析を行った。６ｍｍ行路長のＵ字型軸ビーム毛管流セルを有するスペクトラルフィジックス（Spectral Physics）前光学スキャニング検出器（ＬＣパッキングス（ＬＣ Packings）、オランダ）を用い溶出液を２１５ｎｍにてモニターした。電子スプレーイオン化（ＥＡＩ）源（アナリティカ（Analytica）、ブランフォード、コネチカット州）を備えたフィニガン−マット（Finningan−Mat）トリプル四極子質量分析計（モデルＴＳＱ−７００、サンホセ、カリフォルニア州）で質量スペクトルを得た。電子スプレー針を−４ｋＶの電圧差にて陽イオンモードで操作した。被覆（sheath）液は２−メトキシエタノールであり、手動ポンプ駆動により１μｌ／分にて分配した（ハーバード・アパレイタス（Harvard Apparatus）、サウスナチック、マサチューセッツ州）。窒素乾燥ガス条件は以下の通りであった；ヒーターの温度、２７５℃；圧力、１５ｐｓｉ；流速、１５ｓｔｄＬ／分。窒素被覆ガスを３３ｐｓｉで供給した。ガス状窒素を沸騰した液体窒素源から得た。ペプチドを上記オンライン毛管ＲＰ−ＨＰＬＣにより１.０μｌ／分にてＥＳＩ源中に導入した。３秒の速度にてｍ／ｚ４００〜２０００でスキャニングしてスペクトルを得た。データの回収および換算をフィニガンＢＩＯＭＡＳＳTMソフトウエアを用いてＤｅｃ５１００コンピューター上で行った。
【００７８】
２．結果
ニコチアナ・アラタ柱頭からの個々の６ｋＤ ＰＩ種の分離および同定
精製した６ｋＤ ＰＩ調製物中に存在すると予測された約６ｋＤの６つのペプチドのうち５つを逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより互いに分離した。４つのピークが得られ（図９ａ）、各ピーク中のペプチドを電子スプレー質量分析により同定した（表２）。ＰＩ前駆体中での位置およびキモトリプシンまたはトリプシン活性部位の存在に従ってペプチドをＣ１、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４と称した（図９ｂ）。最初のＨＰＬＣピーク（図９ａ）はキモトリプシンインヒビターＣ１に対応し、第二のピークはＴ２およびＴ３（互いに同一）およびＴ４（Ｔ２およびＴ３とは位置３２における一つのアミノ酸のみが異なる）の混合物からなる。第三のピークにはペプチドＴ１が含まれ、第四のピークはＴ１、Ｔ２／Ｔ３およびＴ４の混合物からなる（表２）。
【００７９】
プロセシングの部位は正確には決定しなかったが、図１０に示す配列中のアスパラギン酸残基（Ｎ）とアスパラギン残基（Ｄ）との間に位置していると思われる。アスパラギン残基に対する特異性を有するプロテアーゼは、未熟なダイズ種子およびカボチャの子葉からの液胞から単離されている（スコット（Scott）ら、１９９２、ハラ−ニシムラ（Hara−Nishimura）ら、１９９１）。このことは、ニコチアナ・アラタの柱頭中の乳頭およびその下の分泌細胞の液胞中のＰＩの免疫金（immunogold）局在と一致する（アトキンソン、１９９２）。ニコチアナ・アラタＰＩの場合は、ペプチドホルモンと類似のプロセシングも可能である。なぜなら、可能な各６ｋＤペプチドは二塩基性残基（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、図１０中の位置−２＆−３）を側部に有するからである。しかしながら、かかるシステムは植物においては記載されておらず、これら二塩基性残基は分子表面にプロセシング部位を呈示する予測された親水性ループの形成に預かっていると考える方がよいようである。
【００８０】
質量分析からのデータは、いったん最初の開裂が起こったら新たなカルボキシ末端はトリミングされていくことを示している（図１０）。ＥＥＫＫＮ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）は完全に除去されるがトリミングは完全ではなく、ときにはさらにアミノ酸が除去される。立体障害がトリミングがさらに進むのを防ぐ。場合によってはアスパラギン酸もＮ末端から除去される。
【００８１】
実施例３
組換えバクロウイルスベクターを用いた昆虫細胞（Ｓｆ９）培養液中でのＰＩ前駆体の製造
ＰＩ前駆体をコードするｃＤＮＡ（図１）をプラスミドベクターｐＶＬ１３９２のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。該プラスミドベクターは、ＢａｍＨ１部位にマルチクローニング部位が挿入されている他はｐＶＬ９４１（ルックナウ（Lucknow）およびサマーズ（Summers）、１９８９）と同じである。ｐＲＨ１１と称するプラスミドは、多核体（polyhedrin）プロモーターによって指令される転写の方向に関して正しい方向にてＰＩｃＤＮＡを含有する。バクロウイルスＤＮＡおよびｐＲＨ１１をスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞に同時トランスフェクションすることにより組換えバクロウイルスを得た。組換えウイルス（相同組換えによって得られた）をプラーク精製し、タンパク質産生のために昆虫細胞に感染させる前に増幅させた。組換えバクロウイルスの産生、該ウイルスの滴定およびＳｆ９細胞の維持および感染に関するすべての手順はキング（King）およびポッセ（Posse）（１９９２）から得た。ＰＩ前駆体を産生させるため、大フラスコ（１７５ｃｍ2）中の単層のＳｆ９細胞が集密に達した時点で高力価の組換えウイルスで５〜１０ｐｆｕ／細胞の多数の感染により感染させた。感染の４日後に培養液を回収し、遠心分離により清澄化し、柱頭からの６ｋＤ ＰＩ種について記載したのと同様にしてキモトリプシン−セファロースアフィニティーカラムに適用することによりＰＩ前駆体を精製した。７Ｍ尿素、ｐＨ３中でカラムから溶出したＰＩ前駆体を１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）で直ちに中和し、Milli−Ｑ水に対して充分に透析し、ダイアフロー（Diaflow）ＹＭ１０フィルターを用いた超遠心分離により２０〜５０倍に濃縮し、−２０℃にて凍結保存した。
【００８２】
感染した昆虫細胞から前駆体を産生させるため、ＰＩ前駆体をコードするｃＤＮＡクローンをバクロウイルスベクター中に組み込んだ。昆虫細胞は４２ｋＤのタンパク質を産生したが、このものは柱頭からの６ｋＤ ＰＩペプチドに対して産生させた抗体と交差反応し、キモトリプシンアフィニティーカラムに結合した。この４２ｋＤタンパク質は、ニコチアナ・アラタの未熟な柱頭中で産生される４２ｋＤ前駆体とサイズが同じであり（図１１）、Ｎ末端配列ＬｙｓＡｌａＣｙｓＴｈｒＬｅｕＡｓｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を有しており、シグナル配列が昆虫細胞によって正確にプロセシングされたことを示している（図１）。これら結果に基づき、バクロウイルス発現系で産生された該４２ｋＤタンパク質は、いまやＰＩ前駆体と呼ぶことになるであろう。この４２ｋＤ ＰＩ前駆体はキモトリプシンに対しては抑制活性を有するが、トリプシンに対しては抑制活性を有していなかった（図１３）。このＰＩ前駆体をエンドプロテイナーゼＡｓｐＮによってプロセシングして約６ｋＤの安定なペプチドが得られ、これを逆相ＨＰＬＣにより部分精製した（図１２）。これらペプチドは柱頭から分離した６ｋＤペプチドに等価なトリプシンおよびキモトリプシンに対する抑制活性を有しており、トリプシン抑制活性を活性化するには前駆体のプロセシングが必要であるが、キモトリプシン活性についてはすべてについて必要でないことを示していた。ＡｓｐＮはアスパラギン酸残基に隣接して（図１０におけるＡｓｎ−１とＡｓｐ１との間）特異的に開裂しトリミング活性を有しないので、インビトロで生成したペプチドはＣ末端に配列ＥＥＫＫＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）が存在する他は柱頭で産生させたものと同じであろう。このことは、活性な６ｋＤ ＰＩペプチドを得るにはＮ末端およびＣ末端の正確なプロセシングを必要としないことの新たな証拠を提供する。Ａｓｐ−Ｎ１はトリプシンに比べてキモトリプシンの抑制において一層有効であり、それゆえ主としてＣ１類似体であると思われる（図９ｂ）。Ａｓｐ−Ｎ２は一層有効なトリプシンインヒビターであり、おそらくＴ１〜Ｔ４類似体を含有している。
【００８３】
実施例４
種々の昆虫からの未分画消化管抽出物におけるプロテアーゼ活性に対するＰＩの効果
クリステラーら（１９９２）の手順を用いて消化管プロテアーゼに対するＰＩの活性を以下のようにして測定した。インヒビターの１μＭのアリコート（０〜１０μｌ、消化管中に存在するプロテアーゼに対して少なくとも５倍過剰）を１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０）（１５０μｌ）と混合し、各昆虫消化管抽出物（０〜１５μｌ）と３０℃にて２０分間プレインキュベートした。Ｃ14−標識したカゼイン基質（４００μｇタンパク質、比活性２５,０００〜７５,０００ｄｐｍ ｍｇ-1）（５０μｌ）を加えることにより反応を開始し、反応を停止させるために冷３０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（５０μｌ）を加えるまで反応を続けた。氷上で３０分間インキュベートした後、未消化のタンパク質を２０℃にて１０,０００ｇで５分間遠心分離にかけてペレット化した。上澄み液を除き、シンチレーション液と混合し、放射能を測定した。ルシラ・セリカタ（Ｌ.sericata）およびクリソムヤ・ルフィファシエス（Ｃ.rufifacies）の場合に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）を用いた他はｐＨ１０にてアッセイを行った。
【００８４】
表３は、レピドプテラ（Lepidoptera）、コレオプテラ（Coleoptera）、オルトプテラ（Orthoptera）およびジプテラ（Diptera）の種々の成員の消化管中のプロテアーゼに対するプールした６ｋＤ ＰＩペプチド（Ｃ１、Ｔ１、Ｔ２／Ｔ３、Ｔ４）、トリプシンインヒビターＴ２／Ｔ３およびＴ４の混合物、およびキモトリプシンインヒビターＣ１の抑制活性を示す。殆どの場合、プールしたペプチドおよびトリプシンインヒビターは、試験した昆虫に依存して３７〜７９％の範囲の抑制程度にて消化管プロテアーゼに対して等価な効果を有していた。
これらインヒビターは、ジャガイモ塊茎の蛾であるフトリマエ・オペルクレラ（Ｐ.opercullela）の消化管プロテアーゼに対しては殆ど効果は認められなかった。キモトリプシンインヒビターＣ１もまたプロテアーゼの活性に影響を与えたが、５つの場合（ウイセアナ・セルビナタ（Ｗ.cervinata）、ルシラ・セリカタ、コステリトラ・ゼアランディカ（Ｃ.zealandica）、プラノトルトリックス・オクト（Ｐ.octo）、サトウキビ地虫（sugar cane grub））にはトリプシンインヒビターよりも有効性が低かった。
【００８５】
実験の詳細は図１４の説明に記載してある。ニコチアナ・アラタＰＩは、コオロギの体重を減少させるうえでダイズバウマン−バークインヒビターよりも一層有効であった。昆虫の中腸の酵素を抑制するプロテイナーゼインヒビターの能力と昆虫飼育試験において昆虫の生育を遅らせるうえでの有効性との間に良好な相関関係が存在することが示された（クリステラーら、１９９２）。図１４は、インビトロアッセイで黒色野生コオロギ（テレオグリルス・コモデュス（Ｔ.commodus））の消化管プロテアーゼを７０％抑制したプールＰＩが、１０週間の期間にわたって行った飼育試験においてコオロギの生育を３０％遅らせたことを示している。インビトロアッセイと飼育試験との間の相関関係は、最近になってヘリコベルパ・アルミゲラ（Helicoverpa armigera）の生育および発達について研究しているジョンストン（Johnston）と彼の同僚（１９９３）によって確かめられた。
【００８６】
【表１】
【表２】
表３の説明
ＮａＰＩ＝プールしたニコチアナ・アラタプロテイナーゼインヒビター
Ｃ１＝ニコチアナ・アラタキモトリプシンインヒビター（ＨＰＬＣからのピーク１）
Ｔ２／Ｔ３、Ｔ４＝ニコチアナ・アラタトリプシンインヒビター（ＨＰＬＣからのピーク２）
ヘリオチス・アルミゲラ（Heliothis armigera）、ヘリコベルパ・アルニゲラ（Helicoverpa armigera）、タバコの青虫、レピドプテラ
ヘリオチス・プンクチゲラ（Heliothis punctigera）、ヘリコベルパ・プンクチゲラ（Helicoverpa punctigera） 自生の青虫、レピドプテラ
テレオグリルス・コモデュス 黒色野生コオロギ、オルトプテラ
アグロチス・インフサ（Agrotis infusa） 普通のネキリガ、成虫はモンヤガ（Bogong moth）として知られる、レピドプテラ
【００８９】
ウイセアナ・セルビナタ ポリナ（Porina）、ニュージーランドに自生、レピドプテラ
ルシラ・セリカタ 緑クロバエ、ジプテラ、ｐＨ８にてアッセ
クリソムヤ・ルフィファシエス 毛深い蛆クロバエ、ジプテラ、ｐＨ８にてアッセイ
アホジウス・タスマニア（Aphodius tasmaniae） タスマニアの草地虫＝黒頭牧草コフキコガネ（cockchafer）、コレオプテラ
コステリトラ・ゼアランディカ ニュージーランドの草地虫、コレオプテラ
スポドプテラ・リトゥラ（Spodoptera litura） 熱帯産アワヨトウの幼虫
（armyworm）、レピドプテラ
フトリマエ・オペルクレラ ジャガイモ塊茎の蛾、レピドプテラ
エピフィアス・ポストビッタナ（Epiphyas postvittana） 薄褐色のリンゴ蛾（ハマキムシ（leafroller））、レピドプテラ
プラノトルトリックス・オクト 緑頭のハマキムシ、レピドプテラ
クテノプセウスチス・オブリクアナ（Ctenopseustis obliquana） 褐色頭のハマキムシ、レピドプテラ
サトウキビ地虫
【００９０】
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【００９８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１−１】 ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびニコチアナ・アラタＰＩタンパク質の対応アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。該アミノ酸配列は、成熟タンパク質の最初のアミノ酸を１としてナンバーを付してある。シグナル配列はヌクレオチド１〜９７によりコードされており、これらアミノ酸残基にはマイナスの番号を付してある。インヒビターの反応部位残基は囲ってある。
【図１−２】 図１−１の続き。
【図１−３】 図１−２の続き。
【図１−４】 図１−３の続き。
【図１−５】 図１−４の続き。
【図２】 ニコチアナ・アラタの種々の器官からのＲＮＡのゲルブロット分析を示す写真表示である。ニコチアナ・アラタの器官およびニコチアナ・タバクム（Ｎ.tabacum）およびニコチアナ・シルベストリス（Ｎ.sylvestris）の柱頭および花柱から単離したＲＮＡのゲルブロットは、ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２とハイブリダイズした。Ｓｔ、柱頭および花柱；Ｏｖ、子房；Ｐｏ、花粉；Ｐｅ、花弁；Ｓｅ、萼片；Ｌ、傷のない葉；Ｌ４、傷から４時間後の葉；Ｌ２４、傷から２４時間後の葉；Ｎｔ、ニコチアナ・タバクムの柱頭および花柱；Ｎｓ、ニコチアナ・シルベストリスの柱頭および花柱；Ｎａ、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片。
【図３】 柱頭および花柱でのＮＡ−ＰＩ−２に相同なＲＮＡのインシトゥ局在を示す写真表示である。（ａ）32Ｐ標識したＮＡ−ＰＩ−２ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた後の１ｃｍ長の芽の柱頭および花柱の縦方向の凍結切片の放射能写真；（ｂ）トルイジンブルーで染色した（ａ）と同じ切片。ｃ、皮層；ｖ、維管束；ｔｔ、導管；ｓ、柱頭組織。
【図４】 ニコチアナ・アラタのゲノムＤＮＡのゲルブロット分析を示す写真表示である。制限酵素ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIIIで消化し放射性標識したＮＡ−ＰＩ−２でプローブしたニコチアナ・アラタゲノムＤＮＡのゲルブロット分析。サイズマーカー（ｋｂ）は、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片である。
【図５】 ニコチアナ・アラタの種々の器官におけるＰＩ活性のグラフ表示である。種々の器官からの緩衝液溶解性の抽出物について、トリプシンおよびキモトリプシンを抑制する能力を試験した。柱頭および萼片抽出物が、トリプシン（Ａ）およびキモトリプシン（Ｂ）の両方に対する最も有効なインヒビターであった。
【図６】 ニコチアナ・アラタの柱頭からのＰＩ精製の工程を示す。（ａ）柱頭抽出物からの硫酸アンモニウム沈殿したタンパク質のセファデックスＧ−５０ゲル濾過クロマトグラフィー。ＰＩ活性はプロフィールの後期に溶出した。（ｂ）ゲル濾過カラムからのフラクションの２０％ｗ／ｖ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（レムリ（Ｌaemmli）、１９７０）。ゲルを銀染色し、分子量マーカー（ファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンにて示す。約６ｋＤのタンパク質（矢印）がプロテイナーゼインヒビター活性とともに溶出した。（ｃ）精製手順の種々の段階でのＰＩ含有フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。レーン１、粗製の柱頭抽出物（５μｇ）；レーン２、８０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムにより沈殿させた柱頭タンパク質（５μｇ）；レーン３、キモトリプシンアフィニティーカラムから溶出したＰＩタンパク質（１μｇ）。
【図７】 ニコチアナ・アラタ（ａ）およびジャガイモ（ｂ）およびトマト（ｃ）ＰＩIIｃＤＮＡからのＮＡ−ＰＩ−２クローンによりコードされるＰＩタンパク質のハイドロパシー（hydropathy）プロットを示すグラフ表示である。線よりも上にある値は疎水性の領域を示し、線よりも下の値は親水性の領域を示す。推定シグナルペプチドには陰影を施してある。疎水性プロフィールは、カイト（Kyte）およびドゥーリトル（Doolittle）（１９８２）の予測則および９の連続アミノ酸の連なりを用いて作成した。
【図８】 生育中の花の柱頭中のＰＩタンパク質のイムノブロット分析を示す。
（ａ）ニコチアナ・アラタの生育中の花。
（ｂ）（ａ）に示す生育の各段階における柱頭タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、５μｇの各抽出物を負荷した。ペプチドゲルを銀染色し、分子量マーカー（ＬＫＢ・ロー・モレキュラー・ウエイト（ＬＫＢ Low Molecular weight）およびファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンで示してある。
（ｃ）抗ＰＩ抗血清でプローブした（ｂ）と同じゲルのイムノブロット。
【図９】 ニコチアナ・アラタからの６ｋＤプロテイナーゼインヒビター種の分離および同定を示す。（Ａ）逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる６ｋＤＰＩの分離。（Ｂ）ＰＩ前駆体タンパク質から得られた５つの相同なペプチド：Ｃ１、キモトリプシンインヒビター、Ｔ１〜Ｔ４、トリプシンインヒビター。太線は、これらインヒビターの反応部位を示す。前駆体タンパク質は、シグナル配列を除いて描写してある。図中点線部は、６つの繰り返しドメインの領域（アミノ酸１〜３４３、図１）。図中斜線部は、非繰り返し配列（アミノ酸３４４〜３６８、図１）。矢印は、前駆体タンパク質におけるプロセシング部位を示す。（Ｃ）ｃＤＮＡクローンから予測され精製タンパク質のＮ末端シークエンシングにより確認されたＣ１およびＴ１〜Ｔ４のアミノ酸配列。
【図１０】 前駆体ＰＩタンパク質のプロセシング部位の周辺のアミノ酸配列を示す。太字で示した配列は、精製ＰＩタンパク質から得たアミノ末端配列である。マイナスの番号を付した配列は、ｃＤＮＡクローンから予測されるフランキング配列である。予測された前駆体タンパク質は、この配列の６つの繰り返しを含む。
【図１１】 バクロウイルス発現系で生成されたＰＩ前駆体（Ａ）、およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎによるアフィニティー精製ＰＩ前駆体（Ｂ）の消化後に得られた生成物を示す。
【図１２】 Ａｓｐ−Ｎ消化により前駆体から得られたペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分取クロマトグラフィーを示す。
【図１３】 柱頭からのＰＩ前駆体、ＰＩペプチド、該ＰＩ前駆体からインビトロで生成したＰＩペプチドのトリプシンおよびキモトリプシン抑制活性の比較を示す。
【図１４】 コントロールの人工食餌、ダイズバウマン−バーク（Bowman−Birk）インヒビターおよびニコチアナ・アラタＰＩ上で飼育したテレオグリルス・コモデュス（Ｔ.commodus）若虫の発育曲線を示すグラフ表示である。縦軸は、各処置におけるコオロギの平均体重（＋／−標準誤差）をｍｇで示す。横軸は週を示す。ニコチアナ・アラタＰＩで飼育したコオロギは、実験を通じてコントロールの食餌およびダイズインヒビターを含有する食餌で飼育した両コオロギに比べて低平均体重を示した。
Claims (2)
- ニコチアナ属植物からのマルチドメインII型セリンプロテイナーゼインヒビター（ＰＩ）前駆体 をコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子を含む遺伝子構築物を有するトランスジェニック植物であって、該ＰＩ前駆体は少なくとも３つのドメインからなり、該少なくとも３つのドメインは該ドメイン内でプロセシングしたときに少なくとも３つのペプチドを生成し、該少なくとも３つのペプチドのうち少なくとも１つはキモトリプシン特異的な部位を有し、該少なくとも３つのペプチドの残りの少なくとも１つはトリプシン特異的な部位を有し、該ＰＩ前駆体をコードするヌクレオチド配列が、ドメイン１（配列番号３のアミノ酸残基１〜５８）またはドメイン２（配列番号３のアミノ酸残基５９〜１１６）から選ばれる少なくとも１つのドメイン、およびドメイン３（配列番号３のアミノ酸残基１１７〜１７４）、ドメイン４（配列番号３のアミノ酸残基１７５〜２３２）、ドメイン５（配列番号３のアミノ酸残基２３３〜２９０）およびドメイン６（配列番号３のアミノ酸残基２９１〜３４３）よりなる群から選ばれる少なくとも２つのドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、該遺伝子構築物はさらに該核酸分子の発現を可能とする発現手段、植物細胞中での複製を可能とする複製手段、または植物細胞ゲノム中への該核酸分子の安定な組み込みを可能とする組み込み手段を含むことを特徴とするトランスジェニック植物。
- 図１に示すアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸残基２５〜８２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；アミノ酸残基８３〜１４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；アミノ酸残基１４１〜１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；アミノ酸残基１９９〜２５６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；およびアミノ酸残基２５７〜３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９） よりなる群から選ばれた１または２以上のＰＩモノマーを産生する請求項１に記載のトランスジェニック植物。
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