JP2000175581A - Ｉｉ型セリンプロテイナ―ゼインヒビタ―またはその前駆体をコ―ドする遺伝子配列を含むトランスジェニック植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 II型セリンプロテイナーゼインヒビター
（ＰＩ）又はその前駆体遺伝子配列を含む形質転換植物
の提供。 【解決手段】 上記ＰＩ前駆体又はそのモノマーをコー
ドするか又は該コード配列に相補的な配列をコードする
ヌクレオチドの配列を含む核酸分子を含む遺伝子構築物
を有する形質転換植物であって、該核酸分子はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１に示すヌクレオチド配列を含むか又は該
配列中の等価数の繰り返しドメインに対して少なくとも
６０〜６５％のヌクレオチド類似性を有する配列を含
み、該前駆体は少なくとも３つのＰＩモノマーを含み、
これら３つのモノマーのうち少なくとも一つはキモトリ
プシンの残りの少なくとも一つはトリプシンの特異的部
位を有し、該遺伝子構築物は更に該核酸分子の発現を可
能とする発現手段、植物細胞中での複製を可能とする複
製手段、又は植物細胞ゲノム中への該核酸分子の安定な
組込みを可能とする組込手段を含む形質転換植物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は一般に、プロテアー
ゼ感受性ペプチドおよびそれをコードする遺伝子配列に
関する。ヌクレオチド配列および核酸配列は、本明細書
において引用文献の後に記載する配列番号（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ）によって言及する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯの一般
的な要約は実施例の前に記載してある。

【０００２】

【従来の技術】ナス科（Solanaceae）およびマメ科（Fa
baceae）に属する幾つかの種類の植物は、傷に対する応
答の結果としてその貯蔵器官や葉にセリンプロテイナー
ゼインヒビターを蓄積する（ブラウン（Brown）および
ライアン（Ryan）、１９８４；リチャードソン（Richar
dson）、１９７７）。これらタンパク質の抑制活性は、
微生物および動物由来の広範囲のプロテイナーゼに対し
て向けられるが、植物のプロテイナーゼに向けられるこ
とは稀である（リチャードソン、１９７７）。これらイ
ンヒビターは、病原体および捕食者に対して植物を保護
することに関与していると思われている。ジャガイモの
塊茎およびマメ科植物の種子では、これらインヒビター
は貯蔵タンパク質の１０％またはそれ以上を占めること
があり（リチャードソン、１９７７）、トマトやジャガ
イモの葉（グリーン（Green）およびライアン、１９７
２）およびアルファルファ（ブラウンおよびライアン、
１９８４）では、昆虫の攻撃または他のタイプの傷から
４８時間以内にプロテイナーゼインヒビターは可溶性タ
ンパク質の２％のレベルまで蓄積することがある（ブラ
ウン＆ライアン、１９８４；グラハム（Graham）ら、１
９８６）。これらインヒビターはまた、野性型のトマ
ト、リコペルシコン・ペルビアヌム（Lycopersicon per
uvianum）の未熟果にも高レベル（全可溶性タンパク質
の５０％まで）で存在する（ピアス（Pearce）ら、１９
８８）。

【０００３】トマトおよびジャガイモにおいて２つのフ
ァミリーのセリンプロテイナーゼインヒビターが存在す
る（ライアン、１９８４）。Ｉ型のインヒビターは、単
一の反応部位でキモトリプシンを抑制する小さなタンパ
ク質（モノマーの分子量８１００）である（メルビル
（Melville）およびライアン、１９７０；プランケット
（Plunkett）ら、１９８２）。II型ファミリーのインヒ
ビターは、一般に、２つの反応部位を有しており、その
一方はキモトリプシンを抑制し、他方はトリプシンを抑
制する（ブライアント（Bryant）ら、１９７６；プラン
ケットら、１９８２）。II型インヒビターは１２,３０
０のモノマー分子量を有する（プランケットら、１９８
２）。プロテイナーゼインヒビターＩは、黄化タバコ
（ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum））の葉
中に蓄積し（クオ（Kuo）ら、１９８４）、フィトフト
ラ・パラシチカ・ヴァル・ニコチアナ（Phytophthora p
arasitica var. nicotianae）からのエリシタは、タバ
コ細胞懸濁培養液中でのプロテイナーゼインヒビターＩ
の蓄積を誘発することがわかった（リッカウアー（Rick
auer）ら、１９８９）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】他のプロテイナーゼイ
ンヒビターを同定すること、および病原体や捕食者に対
する保護の優れたトランスジェニック植物の開発での使
用の可能性を探る必要性が存在する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明に従い、プロテイ
ナーゼインヒビター前駆体をコードする遺伝子配列をク
ローニングした。該前駆体は複数のプロテイナーゼイン
ヒビタードメインを有しており、プロテイナーゼインヒ
ビター発現の優れた広範囲のトランスジェニック植物を
開発するうえで有用であろう。かかる植物は、病原体や
捕食者に対する防御特性が優れているであろう。本発明
の遺伝構築物はまた、昆虫（それ自体捕食者であるか、
または植物病原体の宿主として働く）による食物摂取に
対するワクチンを開発するうえでも有用であろう。組換
え前駆体またはモノマー性のインヒビターはまた、局所
噴霧や動物が食物を消化するのを助けるのに有用であろ
う。

【０００６】従って、本発明の一つの態様は、植物から
のII型セリンプロテイナーゼインヒビター（ＰＩ）前駆
体をコードするかまたは該コード配列に相補的なヌクレ
オチドの配列を含む核酸分子に関する。その際、該前駆
体は少なくとも３つのＰＩモノマーを含み、該モノマー
のうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な部位で
あり、該モノマーの他のもののうち少なくとも一つはト
リプシン特異的な部位である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明において「核酸分子」と
は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡ）であっ
て、一本鎖または二本鎖であり、直線状または共有結合
により閉じたものである。核酸分子はまた、全遺伝子ま
たはその実質部分に対応するゲノムＤＮＡ、そのフラグ
メントまたはその誘導体であってよい。ヌクレオチド配
列は、ゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンの天然に
存在するヌクレオチド配列に対応していてよく、または
単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失および／ま
たは付加を有していてよい。核酸分子中のかかる変異は
すべて、少なくとも一つのモノマーまたはその活性部位
をコードする能力を保持しているか、または他の種の同
じもしくは類似の遺伝子配列のためのハイブリダイゼー
ションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
プライマーとして有用である。

【０００８】ＰＩ前駆体は、好ましくは少なくとも４つ
のＰＩモノマー、さらに好ましくは少なくとも５つのＰ
Ｉモノマー、さらに一層好ましくは少なくとも６つのＰ
Ｉモノマーを含む。さらに好ましくは、ＰＩ前駆体はさ
らにシグナル配列を含む。本発明のＰＩ前駆体は、個々
のモノマーに開裂するためのプロセシング部位であるア
ミノ酸配列を含む。

【０００９】本明細書において使用する「前駆体」なる
語は、前駆体分子そのものの有用性を限定したり、ＰＩ
活性が発現される前に該分子がまずモノマーにプロセシ
ングされることを要求することを意図するものではな
い。該前駆体分子はＰＩ活性を有しており、本発明は該
前駆体および該前駆体の個々のモノマーに関する。

【００１０】さらに、本発明は、ハイブリッドII型セリ
ンＰＩ前駆体をコードするかまたは該コード配列に相補
的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子にも関する。そ
の際、該前駆体は異なるＰＩからの少なくとも２つのモ
ノマーを含む。かかる少なくとも２つのモノマーは、個
々のモノマーにプロセシングされ得ないように修飾する
こともできるし、またはそのようにプロセシングされる
能力を保持させることもできる。好ましくは、これらモ
ノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異的な
部位を有し、これらモノマーの他方はトリプシン特異的
な部位を有する。少なくとも３つのモノマーを有するの
が好ましく、少なくとも４つのモノマーを有するのがさ
らに好ましく、少なくとも５つのモノマーを有するのが
さらに一層好ましく、少なくとも６つのモノマーを有す
るのがもっと一層好ましく、その場合、少なくとも２つ
は異なるＰＩからのものである。最も好ましい態様にお
いて、これらモノマーの少なくとも一つはチオニン（th
ionin）である。かかるハイブリッドＰＩ前駆体および
／またはそのモノマーは、「多価」な、すなわち広範囲
の病原体や捕食者に対して（たとえば、真菌および昆虫
の両者に対して）活性な分子を生成させるのに特に有用
である。従って、本明細書において「ＰＩ前駆体」とい
うときはハイブリッド分子をも包含するものである。

【００１１】本発明は、下記ヌクレオチド配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１）および対応アミノ酸配列（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３）を有するニコチアナ・アラタ（Ｎicotian
a alata）由来の核酸分子の単離を例として挙げる。

【００１２】 aag gct tgt acc tta aac Lys Ala Cys Thr Leu Asn tgt gat cca aga att gcc tat gga gtt tgc ccg cgt tca gaa gaa aag Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys aag aat gat cgg ata tgc acc aac tgt tgc gca ggc acg aag ggt tgt Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys aag tac ttc agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp cct aga aat cca aag gct tgt acc tta aac tgt gat cca aga att gcc Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala tat gga gtt tgc ccg cgt tca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys acc aac tgt tgc gca ggc acg aag ggt tgt aag tac ttc agt gat gat Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aga aat cca aag gct Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala tgt cct cgg aat tgc gat cca aga att gcc tat ggg att tgc cca ctt Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu gca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc acc aac tgt tgc gca ggc Ala Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly aaa aag ggt tgt aag tac ttt agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu gga gag tct gat cct aaa aat cca aag gcc tgt cct cgg aat tgt gat Gly Glu Ser Asp Pro Lys Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp gga aga att gcc tat ggg att tgc cca ctt tca gaa gaa aag aag aat Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn gat cgg ata tgc acc aac tgc tgc gca ggc aaa aag ggt tgt aag tac Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr ttt agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aaa Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys aat cca aag gct tgt cct cgg aat tgt gat gga aga att gcc tat ggg Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly att tgc cca ctt tca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc aca aac Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn tgt tgc gca ggc aaa aag ggc tgt aag tac ttt agt gat gat gga act Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aga aat cca aag gcc tgt cct Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Pro cgg aat tgt gat gga aga att gcc tat gga att tgc cca ctt tca gaa Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu gaa aag aag aat gat cgg ata tgc acc aat tgt tgc gca ggc aag aag Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys ggc tgt aag tac ttt agt gat gat gga act ttt att tgt gaa gga gaa Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Ile Cys Glu Gly Glu tct gaa tat gcc agc aaa gtg gat gaa tat gtt ggt gaa gtg gag aat Ser Glu Tyr Ala Ser Lys Val Asp Glu Tyr Val Gly Glu Val Glu Asn gat ctc cag aag tct aag gtt gct gtt tcc Asp Leu Gln Lys Ser Lys Val Ala Val Ser

【００１３】しかしながら、上記例示は、本発明が他の
植物からの等価なまたは実質的に同様の核酸分子をも包
含することを理解したうえでのことである。「等価な」
および「実質的に類似の」とは、ヌクレオチド配列、ア
ミノ酸配列、抗体反応性、モノマー組成および／または
前駆体のプロセシングによるモノマー生成のレベルにお
いて等価および実質的に類似であることを意味する。た
とえば、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１の配列と比較した場合に
少なくとも５５％、たとえば約６０〜６５％、７０〜７
５％、８０〜８５％および９０％以上のパーセントの配
列類似性を有するヌクレオチド配列は本発明の主題の核
酸分子に「実質的に類似」していると考えられる。ただ
し、そのような実質的に類似の配列が、上記のように少
なくとも３つのモノマー、好ましくは４つ、５つまたは
６つのモノマーを有するＰＩ前駆体をコードすることを
条件とする。

【００１４】特に好ましい態様において、本発明の核酸
分子はさらに、転写解読枠の５’側のシグナル配列およ
び／またはコード領域の３’側のヌクレオチド配列をも
コードして下記のような完全なヌクレオチド配列（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）およびその実質的に類似性の変異体
を提供する。

【００１５】 cgagtaagta tggctgttca cagagttagt ttccttgctc tcctcctctt atttggaatg tctctgcttg taagcaatgt ggaacatgca gatgcc aag gct tgt acc tta aac Lys Ala Cys Thr Leu Asn tgt gat cca aga att gcc tat gga gtt tgc ccg cgt tca gaa gaa aag Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys aag aat gat cgg ata tgc acc aac tgt tgc gca ggc acg aag ggt tgt Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys aag tac ttc agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp cct aga aat cca aag gct tgt acc tta aac tgt gat cca aga att gcc Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala tat gga gtt tgc ccg cgt tca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys acc aac tgt tgc gca ggc acg aag ggt tgt aag tac ttc agt gat gat Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aga aat cca aag gct Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala tgt cct cgg aat tgc gat cca aga att gcc tat ggg att tgc cca ctt Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu gca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc acc aac tgt tgc gca ggc Ala Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly aaa aag ggt tgt aag tac ttt agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu gga gag tct gat cct aaa aat cca aag gcc tgt cct cgg aat tgt gat Gly Glu Ser Asp Pro Lys Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp gga aga att gcc tat ggg att tgc cca ctt tca gaa gaa aag aag aat Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn gat cgg ata tgc acc aac tgc tgc gca ggc aaa aag ggt tgt aag tac Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr ttt agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aaa Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys aat cca aag gct tgt cct cgg aat tgt gat gga aga att gcc tat ggg Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly att tgc cca ctt tca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc aca aac Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn tgt tgc gca ggc aaa aag ggc tgt aag tac ttt agt gat gat gga act Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aga aat cca aag gcc tgt cct Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Pro cgg aat tgt gat gga aga att gcc tat gga att tgc cca ctt tca gaa Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu gaa aag aag aat gat cgg ata tgc acc aat tgt tgc gca ggc aag aag Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys ggc tgt aag tac ttt agt gat gat gga act ttt att tgt gaa gga gaa Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Ile Cys Glu Gly Glu tct gaa tat gcc agc aaa gtg gat gaa tat gtt ggt gaa gtg gag aat Ser Glu Tyr Ala Ser Lys Val Asp Glu Tyr Val Gly Glu Val Glu Asn gat ctc cag aag tct aag gtt gct gtt tcc taagtcctaa ctaataatat Asp Leu Gln Lys Ser Lys Val Ala Val Ser gtagtctatg tatgaaacaa aggcatgcca atatgctctg tcttgcctgt aatctgtaat atggtagtgg agcttttcca ctgcctgttt aataagaaat ggagcactag tttgttttag ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa

【００１６】従って、本発明の好ましい態様は、ニコチ
アナ・アラタ由来のII型セリンＰＩ前駆体または該前駆
体もしくは少なくとも一つのドメインに対して少なくと
も５５％の類似性を有する配列をコードするかまたは該
コード配列に相補的なＳＥＱＩＤ ＮＯ：１または２に
示すヌクレオチドの配列を含む核酸分子を提供する。そ
の際、該前駆体はシグナルペプチドおよび少なくとも５
つのモノマーを含み、該モノマーのうちの一つはキモト
リプシン特異的な部位を有し、該モノマーの残りの４つ
はトリプシン特異的な部位を有する。さらに好ましい態
様において、該核酸分子はｃＤＮＡ分子であり、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１または２に一般に示すヌクレオチド配列
または本明細書において定義するように該配列の全体ま
たはそのドメインに実質的に類似な配列を含む。

【００１７】本発明の他の態様は、キモトリプシン特異
的な部位かまたはトリプシン特異的な部位のいずれかを
有する単一のII型セリンＰＩをコードするかまたは該コ
ード配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子
に関する。その際、該ＰＩは、少なくとも３つのモノマ
ーを有し、そのうち少なくとも一つがキモトリプシン部
位を有し残りがトリプシン部位を有する前駆体ＰＩの一
つのモノマーである。しかしながら、本発明の前駆体
は、４つ、５つまたは６つのモノマーを有し、上記に定
義のごとくであるのが好ましい。

【００１８】最も好ましい態様において、植物は自家不
和合性の遺伝子型Ｓ₁Ｓ₃、Ｓ₃Ｓ₃またはＳ₆Ｓ₆を有する
ニコチアナ・アラタ（リンク（Link）およびオット（Ot
to））であり、核酸分子は成熟植物の柱頭および花柱か
ら単離しうる遺伝子配列から単離しうるまたは該配列に
相補的なものである。対応ｍＲＮＡは約１.４ｋｂであ
り、ｃＤＮＡは６つの保存されたドメインを有し、その
うち最初の２つのドメインは１００％同一でありキモト
リプシン特異的な部位（Ｌｅｕ−Ａｓｎ）を有する。第
三、第四および第五のドメインは９５〜９８％の同一性
を有し、トリプシンに特異的な部位（Ａｒｇ−Ａｓｎ）
を有する。第六のドメインもまたトリプシン特異的な部
位を有するが、主に３’配列の相違により（表１参照）
第三、第四および第五のドメインに対する同一性は低い
（７９〜９０％）。本発明の好ましいＰＩインヒビター
は約４２〜４５ｋＤａの分子量を有し、約２９アミノ酸
のシグナル配列を有する。

【００１９】モノマー性ＰＩのＮ末端配列は、ＰＩ前駆
体タンパク質の予測される配列中の６つの各繰り返しド
メインにおいて表示されている。それゆえ、ＰＩ前駆体
タンパク質は６つの部位で開裂されて７つのペプチドを
生成すると思われる。これら７つのペプチドのうち６つ
のペプチド（ペプチド２、３、４、５、６および７）
（図１、それぞれ、残基２５〜８２［ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５］、８３〜１４０［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６］、１
４１〜１９８［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７］、１９９〜２５
６［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８］、２５７〜３１４［ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：９］および３１５〜３６８［ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：９］）はモノマー性ＰＩと同じ分子量（約６ｋＤ
ａ）を有し、同じＮ末端配列を有する。ペプチド７はト
リプシンまたはキモトリプシンに対する共通部位を有し
ない。ペプチド１（残基１〜２４［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４］、図１）は６ｋＤａよりも小さく、異なるＮ末端を
有し、精製したモノマー性ＰＩ調製物中で検出されなか
った。ペプチド１とペプチド７とは、これら２つのペプ
チド間で形成されたジスルフィド結合により正しいコン
ホメーションに保持されたペプチド１上の抑制部位とし
て機能的なプロテイナーゼインヒビターを形成すると思
われる。

【００２０】本発明を一つの仮定に限定することを意図
するものではないが、ＰＩ前駆体は、たとえばＡｓｎ−
Ａｓｐ結合の開裂に関与するプロテアーゼによってプロ
セシングを受けて生物学的に活性なモノマーを生成する
のかもしれない。さらに詳しくは、プロセシング感受性
の配列はＲ₁−Ｘ₁−Ｘ₂−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｒ₂（式中、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｘ₁およびＸ₂は以下に定義する通り）であ
る。かかる配列の発見により、プロテアーゼ感受性配列
の開裂により植物中でプロセシングを受けうるペプチド
およびポリペプチドを製造することが可能となるであろ
う。本発明の該観点に従い、アミノ酸配列： −Ｘ₁−Ｘ₂−Ａｓｎ−Ａｓｐ− （式中、Ｘ₁およびＸ₂はいかなるアミノ酸であってもよ
いが、両方ともＬｙｓ残基であるのが好ましい）を含む
プロテアーゼ感受性ペプチドが提供される。

【００２１】プロテアーゼ感受性配列はまた、 Ｒ₁−Ｘ₁−Ｘ₂−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｒ₂ （式中、Ｘ₁およびＸ₂は同じであるのが好ましく、両方
ともＬｙｓ残基であるのが好ましく、Ｒ₁およびＲ₂は同
じかまたは異なるＤまたはＬアミノ酸、ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質、または非アミノ酸残基または分
子、たとえば当業者に明らかなように、アルキル（たと
えば、メチル、エチル）、置換アルキル、アルケニル、
置換アルケニル、アシル、ジエニル、アリールアルキ
ル、アリールアルケニル、アリール、置換アリール、複
素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキ
ル、ハロ（たとえば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ）、ハロアル
キル、ニトロ、ヒドロキシ、チオール、スルホニル、カ
ルボキシ、アルコキシ、アリールオキシおよびアルキル
アリールオキシなどである）としても表示される。アル
キル、置換アルキル、アルケニルおよび置換アルケニル
などは、直鎖および分枝鎖分子、低級（Ｃ₁〜Ｃ₆）およ
び高級（Ｃ₆以上）誘導体を意味する。「直鎖」なる語
は、上記すべての置換基を包含する。

【００２２】最も好ましい態様において、プロテアーゼ
感受性ペプチドは Ｒ₁−Ｘ₁−Ｘ₂−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｒ₂ （式中、Ｒ₁およびＲ₂は同じかまたは異なるペプチドま
たはポリペプチドであり、Ｘ₁およびＸ₂はともにＬｙｓ
残基である）である。かかるプロテアーゼ感受性ペプチ
ドは、適当な宿主中またはインビトロで発現させること
により大きな分子を該プロテアーゼ感受性ペプチド間に
位置するペプチドにプロセシングすることができるよう
に、同じかまたは異なるモノマー間に置くことができ
る。

【００２３】本発明はまた、配列： −Ｘ₁−Ｘ₂−Ａｓｎ−Ａｓｐ− （式中、Ｘ₁およびＸ₂は好ましくは同じであり、最も好
ましくは両方ともＬｙｓ残基である）を含むプロテアー
ゼ感受性ペプチドをコードするかまたは該コード配列に
相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子にも関す
る。かかる核酸分子は、たとえば、プロテアーゼ感受性
配列によって個々のペプチドまたはモノマーにプロセシ
ングされうる前駆体ポリペプチドをコードする一層大き
なヌクレオチド配列の一部であってよい。

【００２４】本発明のプロテアーゼ感受性ペプチドは、
複（ポリ）価および／または多価「前駆体」を生成する
うえで特に有用であり、該前駆体は各モノマーが同じか
または異なっており、各モノマーは抗ウイルス活性、抗
細菌活性、抗真菌活性、抗病原体活性および／または抗
捕食者活性などの同じかまたは異なる活性を有する。本
発明の該観点を一つの仮定または提唱された作用機構に
限定することを意図するものではないが、プロテアーゼ
はＡｓｎ残基に隣接して、さらに詳しくはＡｓｎ−Ａｓ
ｐ残基間で作用すると思われる。

【００２５】本発明はまた、植物から単離したII型セリ
ンＰＩ前駆体にも関する。該前駆体は、少なくとも３つ
のＰＩモノマーを含み、これらモノマーのうち少なくと
も一つはキモトリプシン特異的な部位を有し、これらモ
ノマーの残りの少なくとも一つはトリプシン特異的な部
位を有する。このＰＩ前駆体は、４つ、５つまたは６つ
のモノマーを有し、上記核酸分子によってコードされて
いるのが好ましい。本発明はまた、該前駆体を構成する
個々のモノマーにも関する。本発明はまた、上記のよう
に異なるＰＩからの少なくとも２つのモノマーを含むハ
イブリッド組換えＰＩ前駆体分子にも関する。

【００２６】単離したＰＩまたはＰＩ前駆体は、組換え
の形態であっても、および／または生物学的に純粋であ
ってもよい。「生物学的に純粋」とは、硫酸アンモニウ
ム沈殿、セファデックスクロマトグラフィーおよび／ま
たはアフィニティークロマトグラフィーを含む少なくと
も一つの精製工程を施したＰＩ、ＰＩ前駆体および／ま
たはその混合物の調製物を意味する。該調製物は、重
量、活性抗体、反応性および／またはアミノ酸含量によ
り決定して少なくとも２０％のＰＩ、ＰＩ前駆体または
その混合物を含むのが好ましい。さらに好ましくは、該
調製物は、３０〜４０％、５０〜６０％または少なくと
も８０〜９０％のＰＩ、ＰＩ前駆体またはその混合物を
含む。

【００２７】ＰＩまたはその前駆体は、天然に存在する
ものであってもよいし、または上記核酸変異体によって
コードされるような変異体であってもよい。ＰＩまたは
その前駆体はまた、そのアミノ酸配列または炭水化物お
よび／または脂質残基などの非タンパク質成分に対して
置換、欠失および／または付加を有していてよい。組換
えおよび単離ＰＩ、ＰＩ前駆体およびその混合物は、研
究室試薬として、抗体の産生に、局所的に投与する殺虫
剤並びに経口的に摂取する殺虫剤として有用である。組
換えＰＩまたはＰＩ前駆体は、殺虫剤として、単独また
は１または２以上の担体またはＢＴ結晶タンパク質など
の他の殺虫剤と組み合わせて提供される。

【００２８】本発明のＰＩは、病害虫の増殖または感染
および真菌、細菌および昆虫などの病原体に対して、植
物の器官、たとえば柱頭を防御する働きを有すると考え
られる。それゆえ、ＰＩ前駆体（このものは、モノマー
性ＰＩ自体のモノマーにプロセシングされうる）を発現
しうるトランスジェニック植物を生成するのに用いるこ
とのできる遺伝的構築物を開発する必要性が存在する。

【００２９】従って、本発明の他の態様は、植物由来の
II型セリンＰＩ前駆体またはそのモノマーをコードする
かまたは該コード配列に相補的なヌクレオチドの配列を
含む核酸分子を含む遺伝子構築物を包含する。その際、
該前駆体は少なくとも３つのＰＩモノマーを含み、これ
らモノマーのうち少なくとも一つはキモトリプシン特異
的な部位を有し、残るモノマーのうち少なくとも一つは
トリプシン特異的な部位を有し、該遺伝子配列はさら
に、該核酸分子の発現を可能にする発現手段、植物細胞
中での複製を可能にする複製手段、または該核酸分子の
植物細胞ゲノム中への安定な組み込みを可能にする組み
込み手段を含む。発現は、発育に伴ってまたは感染に応
答して、たとえば存在するＰＩ制御配列によって、制御
されるのが好ましい。核酸分子の発現が高められること
によって、天然に存在する植物中に認められるレベルに
比べてＰＩの内生レベルが大きくなるのが好ましい。ま
たは、本発明のＰＩ前駆体ｃＤＮＡはプロモーター配列
を得るのに用いることができ、該プロモーター配列を今
度は遺伝子構築やその操作に用いて等価な内生プロモー
ターの過剰発現を可能とすることができる。他の態様に
おいて、ＰＩ前駆体は上記のようなハイブリッド分子で
ある。

【００３０】本発明のさらに別の態様は、上記遺伝子配
列および／または核酸分子を有し、必要によりＰＩおよ
び／またはＰＩ前駆体またはハイブリッドＰＩ前駆体の
産生レベルを上昇させ、高め、あるいは一層迅速にする
ことのできるトランスジェニック植物に関する。この植
物は穀物植物またはタバコ植物であるのが好ましいが、
ＰＩまたはＰＩ前駆体の核酸分子を発現することができ
る限り他の植物を用いることもできる。トランスジェニ
ック植物がＰＩ前駆体を産生する場合には、該植物は該
前駆体をさらにモノマーにプロセシングしてもよいし、
またはプロセシングしなくてもよい。または、該遺伝子
配列は、昆虫に伝播するためのウイルスまたは細菌ベク
ターの一部であってもよく、それによって昆虫中の病原
体を制御し、結果的に該病原体の植物への伝播を妨害す
ることができる。

【００３１】本発明のさらに他の態様において、ＰＩ前
駆体またはその１または２以上のモノマーに対する抗体
が提供される。抗体はモノクローナルであってもポリク
ローナルであってもよく、発現ライブラリーにおいてＰ
ＩまたはＰＩ前駆体クローンをスクリーニングするうえ
で、または発酵液、上澄み液または植物抽出液中のＰＩ
またはＰＩ前駆体を精製するうえで有用である。本発明
の遺伝子構築物はまた、昆虫の消化管中に住まわせて、
該昆虫自体または該昆虫中の植物病原体に有害な作用を
させたり、または動物の消化管中への導入を容易にして
植物物質の消化を容易にしたりするために用いることも
できる。

【００３２】つぎに、本発明を以下の図面および実施例
により記載するが、これらに限られるものではない。 図面：図１は、ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物の核酸配列（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびニコチアナ・アラタＰＩタ
ンパク質の対応アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
を示す。該アミノ酸配列は、成熟タンパク質の最初のア
ミノ酸を１としてナンバーを付してある。シグナル配列
はヌクレオチド１〜９７によりコードされており、これ
らアミノ酸残基にはマイナスの番号を付してある。イン
ヒビターの反応部位残基は囲ってある。ニコチアナ・ア
ラタＰＩ配列は、６つの類似のドメイン（ドメイン１、
残基１〜５８、ドメイン２、残基５９〜１１６、ドメイ
ン３、残基１１７〜１７４、ドメイン４、残基１７５〜
２３２、ドメイン５、残基２３３〜２９０、ドメイン
６、残基２９１〜３４３）を有する。

【００３３】図２は、ニコチアナ・アラタの種々の器官
からのＲＮＡのゲルブロット分析を示す写真表示であ
る。ニコチアナ・アラタの器官およびニコチアナ・タバ
クム（Ｎ.tabacum）およびニコチアナ・シルベストリス
（Ｎ.sylvestris）の柱頭および花柱から単離したＲＮ
Ａのゲルブロットは、ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２
とハイブリダイズした。Ｓｔ、柱頭および花柱；Ｏｖ、
子房；Ｐｏ、花粉；Ｐｅ、花弁；Ｓｅ、萼片；Ｌ、傷の
ない葉；Ｌ４、傷から４時間後の葉；Ｌ２４、傷から２
４時間後の葉；Ｎｔ、ニコチアナ・タバクムの柱頭およ
び花柱；Ｎｓ、ニコチアナ・シルベストリスの柱頭およ
び花柱；Ｎａ、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断
片。ＮＡ−ＰＩ−２クローンは、２つのｍＲＮＡ種
（１.０および１.４ｋｂ）とハイブリダイズした。大き
い方のｍＲＮＡは柱頭および花柱において主としてみら
れ、一方、小さい方のｍＲＮＡ種は他の組織において一
層明らかに認められた。高厳格洗浄後、柱頭および花柱
からの１.０ｋｂ ｍＲＮＡはＮＡ−ＰＩ−２プローブに
もはやハイブリダイズしない。

【００３４】図３は、柱頭および花柱でのＮＡ−ＰＩ−
２に相同なＲＮＡのインシトゥ局在を示す写真表示であ
る。 （ａ）³²Ｐ標識したＮＡ−ＰＩ−２ ｃＤＮＡプローブ
とハイブリダイズさせた後の１ｃｍ長の芽の柱頭および
花柱の縦方向の凍結切片の放射能写真； （ｂ）トルイジンブルーで染色した（ａ）と同じ切片。
ｃ、皮層；ｖ、維管束；ｔｔ、導管；ｓ、柱頭組織。ｃ
ＤＮＡプローブは柱頭の細胞を強く標識し、維管束への
幾つかのハイブリダイゼーションも認められる。表皮、
皮層または導管へのハイブリダイゼーションは認められ
なかった。スケール棒＝２００μｍ。

【００３５】図４は、ニコチアナ・アラタのゲノムＤＮ
Ａのゲルブロット分析を示す写真表示である。制限酵素
ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIIIで消化し放射性標識した
ＮＡ−ＰＩ−２でプローブしたニコチアナ・アラタゲノ
ムＤＮＡのゲルブロット分析。サイズマーカー（ｋｂ）
は、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片である。Ｅ
ｃｏＲＩにより２つのハイブリダイズする断片（１１ｋ
ｂおよび７.８ｋｂ）が得られたが、ＨｉｎｄIIIからは
３つの大きなハイブリダイズする断片（１６.６、１３.
５および１０.５ｋｂ）が得られた。ＮＡ−ＰＩ−２ク
ローンは、少なくとも２つの成員からなる小さな多重遺
伝子族に属すると思われる。

【００３６】図５は、ニコチアナ・アラタの種々の器官
におけるＰＩ活性のグラフ表示である。種々の器官から
の緩衝液溶解性の抽出物について、トリプシンおよびキ
モトリプシンを抑制する能力を試験した。柱頭および萼
片抽出物が、トリプシン（Ａ）およびキモトリプシン
（Ｂ）の両方に対する最も有効なインヒビターであっ
た。

【００３７】図６は、ニコチアナ・アラタの柱頭からの
ＰＩ精製の工程を示す。 （ａ）柱頭抽出物からの硫酸アンモニウム沈殿したタン
パク質のセファデックスＧ−５０ゲル濾過クロマトグラ
フィー。ＰＩ活性はプロフィールの後期に溶出した。 （ｂ）ゲル濾過カラムからのフラクションの２０％ｗ／
ｖ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（レムリ（Laemml
i）、１９７０）。ゲルを銀染色し、分子量マーカー
（ファルマシアペプチドマーカー）はキロダルトンにて
示す。約６ｋＤのタンパク質（矢印）がプロテイナーゼ
インヒビター活性とともに溶出した。 （ｃ）精製手順の種々の段階でのＰＩ含有フラクション
のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。レーン１、粗製の柱頭
抽出物（５μｇ）；レーン２、８０％ｗ／ｖ硫酸アンモ
ニウムにより沈殿させた柱頭タンパク質（５μｇ）；レ
ーン３、キモトリプシンアフィニティーカラムから溶出
したＰＩタンパク質（１μｇ）。ＰＩは６ｋＤのタンパ
ク質であり、柱頭からの非フラクション化緩衝液可溶性
抽出物中の主要な成分である。

【００３８】図７は、ニコチアナ・アラタおよびジャガ
イモおよびトマトＰＩIIｃＤＮＡからのＮＡ−ＰＩ−２
クローンによりコードされるＰＩタンパク質のハイドロ
パシー（hydropathy）プロットを示すグラフ表示であ
る。線よりも上にある値は疎水性の領域を示し、線より
も下の値は親水性の領域を示す。推定シグナルペプチド
には陰影を施してある。疎水性プロフィールは、カイト
（Kyte）およびドゥーリトル（Doolittle）（１９８
２）の予測則および９の連続アミノ酸の連なりを用いて
作成した。 （ａ）ニコチアナ・アラタＰＩタンパク質のハイドロパ
シープロフィール。予測された前駆体タンパク質中の６
つの繰り返しドメインをＩ〜ＶＩとして表示してある。
６ｋＤ ＰＩ種を産生するための推定開裂部位を含む親
水性領域には矢印を付してある。これら部位における開
裂により生成されるペプチドに対応する領域は、キモト
リプシンインヒビターに対してはＣで、トリプシンに対
してはＴで、２つの両側の配列に対してはｘで表示して
ある。

【００３９】（ｂ）ジャガイモＰＩIIタンパク質のハイ
ドロパシープロフィール（サンチェス−セラーノ（Sanc
hez−Serrano）ら、１９８６）。ＰＩIIタンパク質中の
２つの繰り返しドメインをＩおよびIIで表示してある。
ＰＣＩ−１を産生するための推定開裂部位には矢印を付
してあり、ＰＣＩ−１の領域にはマークを付してある。 （ｃ）トマトＰＩIIｃＤＮＡによってコードされるポリ
ペプチドのハイドロパシープロフィール（グラハムら、
１９８５）。２つのドメインにはＩおよびIIの表示を付
してあり、プロセシング部位の可能性のある残基には矢
印を付してある。これら部位は親水性と予測される領域
中には存在せず、それゆえ、開裂産物にはマークを付し
ていない。

【００４０】図８は、生育中の花の柱頭中のＰＩタンパ
ク質のイムノブロット分析を示す。 （ａ）ニコチアナ・アラタの生育中の花。 （ｂ）（ａ）に示す生育の各段階における柱頭タンパク
質のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、５μｇの各抽出物を負荷
した。ペプチドゲルを銀染色し、分子量マーカー（ＬＫ
Ｂ・ロー・モレキュラー・ウエイト（ＬＫＢ Low Molec
ular weight）およびファルマシアペプチドマーカー）
はキロダルトンで示してある。 （ｃ）抗ＰＩ抗血清でプローブした（ｂ）と同じゲルの
イムノブロット。生育中の花の柱頭には、抗ＰＩ抗体に
結合する約４２ｋＤ、３２ｋＤ、１８ｋＤおよび６ｋＤ
の４つのタンパク質が含まれる。４２ｋＤおよび１８ｋ
Ｄ成分は、花が成熟するにつれて濃度が減少していくの
に対して、６ｋＤ ＰＩタンパク質は開花の直前に最大
濃度に達する。３２ｋＤ成分（二重線として現れる）の
レベルは、花の発育の間有意に変化しない。

【００４１】図９は、ニコチアナ・アラタからの６ｋＤ
プロテイナーゼインヒビター種の分離および同定を示
す。 Ａ．逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる６ｋＤ Ｐ
Ｉの分離 ４つの主要なピークが、約１５.５分（ピーク１）、２
０.５分（ピーク２）、２２.５分（ピーク３）、２４分
（ピーク４）の保持時間にて得られた。各ピークにおけ
るペプチドは、Ｎ末端分析および質量分析の両者の組み
合わせにより同定した。Ｃ１およびＴ１〜Ｔ４について
はＢを参照。 Ｂ．ＰＩ前駆体タンパク質から得られた５つの相同なペ
プチド：Ｃ１、キモトリプシンインヒビター、Ｔ１〜Ｔ
４、トリプシンインヒビター。太線は、これらインヒビ
ターの反応部位を示す。前駆体タンパク質は、シグナル
配列を除いて描写してある。図中点線部は、６つの繰り
返しドメインの領域（アミノ酸１〜３４３、図１）。図
中斜線部は、非繰り返し配列（アミノ酸３４４〜３６
８、図１）。矢印は、前駆体タンパク質におけるプロセ
シング部位を示す。

【００４２】Ｃ．ｃＤＮＡクローンから予測され精製タ
ンパク質のＮ末端シークエンシングにより確認されたＣ
１およびＴ１〜Ｔ４のアミノ酸配列。各ペプチドのカル
ボキシ末端におけるアミノ酸は、電子スプレー（electr
o−spray）質量分析計を用いた正確な質量測定により得
られた。Ｃ１およびＴ１インヒビターは、５つのアミノ
酸において異なっている（太字）。これらアミノ酸のう
ちの２つは反応部位に位置しており（下線）、他の２〜
３の残基はカルボキシ末端に位置している。ペプチドＴ
２〜Ｔ４は３つのアミノ酸が変化しており（囲み）、こ
れらはＣ１とＴ１との間では保存されている。ペプチド
Ｔ２およびＴ３は互いに同一である。質量分析を用い、
Ｎ末端およびＣ末端における正確でないトリミングのた
めに他の形態のＣ１およびＴ１〜Ｔ４が存在することを
示した。すなわち、幾つかの形態は残基１または残基５
３が失われており、他のものは残基１および残基５３の
両方が失われている（表２参照）。

【００４３】図１０は、前駆体ＰＩタンパク質のプロセ
シング部位の周辺のアミノ酸配列を示す。太字で示した
配列は、精製ＰＩタンパク質から得たアミノ末端配列で
ある。マイナスの番号を付した配列は、ｃＤＮＡクロー
ンから予測されるフランキング配列である。予測された
前駆体タンパク質は、この配列の６つの繰り返しを含
む。

【００４４】図１１は、バクロウイルス発現系で生成さ
れたＰＩ前駆体、およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−
Ｎによるアフィニティー精製ＰＩ前駆体の消化後に得ら
れた生成物を示す。 Ａ．組換えバクロウイルスにより生成されたＰＩ前駆体 発育の緑芽段階におけるニコチアナ・アラタ柱頭からア
フィニティーおよびＨＰＬＣ精製したＰＩ前駆体（レー
ン１）および組換えバクロウイルスにより生成されたア
フィニティー精製ＰＩ前駆体（レーン２）を含むイムノ
ブロット。電気泳動的にニトロセルロースに移す前に、
タンパク質を１５％ｗ／ｖＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル上での電気泳動により分画した。このブロットを、
柱頭からの６ｋＤ ＰＩ種に対してウサギ中で産生させ
た抗体とともにインキュベートした。組換えウイルス
は、柱頭によって産生されたＰＩ前駆体タンパク質と同
じサイズの４２ｋＤの免疫反応性のタンパク質を産生し
た（矢印）。

【００４５】Ｂ．エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎによ
るＰＩ前駆体の開裂 銀染色した１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。
１、バクロウイルスにより産生され酵素なしでインキュ
ベートしたＰＩ前駆体。２、前駆体なしでインキュベー
トした酵素。６ｋＤ、ニコチアナ・アラタ柱頭から精製
した約６ｋＤのＰＩペプチド。１ｍ、５ｍ、３０ｍ、１
分、５分および３０分のインキュベーション後に産生さ
れた反応生成物。２ｈおよび２４ｈ、２時間および２４
時間のインキュベーション後の反応生成物。約６〜７ｋ
Ｄのペプチドは、前駆体のインキュベーションの１分以
内に酵素により検出された。２４時間後には６〜７ｋＤ
のペプチドのみが検出された。レーン１における４２ｋ
Ｄよりも小さなバンドは、バクロウイルス発現系におけ
る翻訳の成熟前の停止により生成された末端の欠失した
形態の前駆体によるものである。

【００４６】図１２は、Ａｓｐ−Ｎ消化により前駆体か
ら得られたペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分取クロマト
グラフィーである。ＰＩ前駆体のＡｓｐ−Ｎ消化によっ
て生成されたペプチドのＨＰＬＣプロフィールを示す。
主要なピークは、１９分（Ａｓｐ−Ｎ１と称する）およ
び２１分（Ａｓｐ−Ｎ２と称する）の保持時間を有して
いた。これらピークフラクション（１＆２）中のペプチ
ドは、柱頭からの６ｋＤペプチドよりもＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ上でわずかにゆっくりとした移動度を有していた。Ａ
ｓｐ−Ｎ１およびＡｓｐ−Ｎ２のプロテイナーゼ抑制活
性をトリプシンおよびキモトリプシンに対して試験し
た。

【００４７】図１３は、柱頭からのＰＩ前駆体、ＰＩペ
プチド、該ＰＩ前駆体からインビトロで生成したＰＩペ
プチドのトリプシンおよびキモトリプシン抑制活性の比
較を示す。材料および方法において記載するように、
１.０μｇのトリプシンまたはキモトリプシンを抑制す
る能力についてＰＩ前駆体またはＰＩペプチド（０〜
１.０μｇ）を試験した。抑制活性は、プロテイナーゼ
をＰＩとともにインキュベートした後に残留するプロテ
イナーゼ活性のパーセントとして表し、ＰＩなしでイン
キュベートしたプロテイナーゼの活性を１００％の残留
活性とした。実験は２回行い、その平均値をプロットし
た。平均値からの変動は８％またはそれ以下であった。

【００４８】図１４は、コントロールの人工食餌、ダイ
ズバウマン−バーク（Bowman−Birk）インヒビターおよ
びニコチアナ・アラタＰＩ上で飼育したテレオグリルス
・コモデュス（Ｔ.commodus）若虫の発育曲線を示すグ
ラフ表示である。縦軸は、各処置におけるコオロギの平
均体重（＋／−標準誤差）をｍｇで示す。横軸は週を示
す。ニコチアナ・アラタＰＩで飼育したコオロギは、実
験を通じてコントロールの食餌およびダイズインヒビタ
ーを含有する食餌で飼育した両コオロギに比べて低平均
体重を示した。

【００４９】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯの要約 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ニコチアナ・アラタＰＩ前駆体のコード領域 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ニコチアナ・アラタＰＩ前駆体の完全長のヌクレオチ ド配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応するアミノ酸配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１〜２４(ペプチド１) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基２５〜８２(ペプチド２) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基８３〜１４０(ペプチド ３) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１４１〜１９８(ペプチ ド４) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基１９９〜２５６(ペプチ ド５) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基２５７〜３１４(ペプチ ド６) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基３１５〜３６８(ペプチ ド７) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ ６ｋＤ ＰＩタンパク質のＮ末端アミノ酸配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ ６ｋＤ ＰＩタンパク質のＮ末端アミノ酸配列

【００５０】

【実施例】実施例１ １．材料および方法植物材料 自家不和合性の遺伝子型Ｓ₁Ｓ₃、Ｓ₃Ｓ₃およびＳ₆Ｓ₆を
有するニコチアナ・アラタ（リンクおよびオット）植物
を、すでに記載されているように（アンダーソンら、１
９８９）、標準温室（glasshouse）条件下にて保持し
た。傷に対する応答の誘発を回避するために器官を液体
窒素中に直接回収し、必要なときまで−７０℃で貯蔵し
た。遺伝子発現に対する傷の影響を調べるため、透析ク
リップで中心葉脈を押し潰すことによって葉を傷つけ
た。傷をつけてから４時間および２４時間後に葉を回収
した。

【００５１】ＰＩをコードするｃＤＮＡクローンの同定
およびシークエンシング ニコチアナ・アラタ（遺伝子型Ｓ₃Ｓ₃）の成熟花から単
離した柱頭および花柱からポリアデニル化ＲＮＡを調製
し、ラムダｇｔ１０（アンダーソンら、１９８９）中で
ｃＤＮＡライブラリーを構築するのに用いた。ニコチア
ナ・アラタ（遺伝子型Ｓ₃Ｓ₃およびＳ₆Ｓ₆）の柱頭およ
び花柱からのｍＲＮＡから一本鎖の３２Ｐ標識ｃＤＮＡ
を調製し、Ｓ遺伝子型特異的でない高度に発現されたク
ローンについてライブラリーをスクリーニングするのに
用いた（アンダーソンら、１９８９）。

【００５２】両Ｓ遺伝子型からのｃＤＮＡプローブに強
くハイブリダイズしたプラークを選択し、クロスハイブ
リダイゼーションに基づいてグループに分けた。各グル
ープの最も長いクローンをＭ１３ｍｐ１８およびｐＧＥ
Ｍ３ｚｆ＋中にサブクローニングし、アプライドバイオ
システムズモデル３７３Ａ自動シークエンサーを用いて
シークエンシングを行った。標準アプライドバイオシス
テムズプロトコールに従い、染色プライマーおよび染色
ターミネーターの両サイクルシークエンシングを行っ
た。ＳｅｑＥｄ^TM配列編集ソフトウエア（アプライド・
バイオシステムズ）を用いて共通配列を作成した。これ
らクローンに相同な配列をＧｅｎＢａｎｋデータベース
でサーチした。ニコチアナ・アラタＰＩクローンの６つ
のドメイン間での配列の類似性の程度が高いため、非繰
り返し３’配列（ヌクレオチド１１１７〜１１３７、１
１８８〜１２０３および１２４７〜１２６７）、および
繰り返し領域の開始の前の５’配列（ヌクレオチド７４
〜９８）に対してシークエンシングプライマーを作成し
た。加えて、ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物をエンドヌクレア
ーゼＨａｅIIIで制限処理することにより、ヌクレオチ
ド６２２および９７０で切断して３つのフラグメントを
生成させた。これらフラグメントをｐＧＥＭ７ｚｆ＋中
にサブクローニングし、Ｍ１３前プライマーおよび逆プ
ライマーを用いて両方向にシークエンシングを行った。
ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物の繰り返し特性のため、培養物
を６時間以上増殖させた場合にファージミドおよびプラ
スミドベクターの両方で不安定となった。

【００５３】ＲＮＡゲルブロット分析 全ＲＮＡを単離し、すでに記載されたようにして（アン
ダーソンら、１９８９）、１.２％ｗ／ｖアガロース／
ホルムアデヒドゲル上で分離した。ＲＮＡをHybond−Ｎ
（アマーシャム）に移し、ランダムヘキサヌクレオチド
を用いて³²Ｐで標識したｐＮＡ−ＰＩ−２からの挿入物
でプローブを行った（１×１０⁸ｃｐｍμｇ−１；１×
１０⁷ｃｐｍｍｌ^-1）（ファインベルク（Feinberg）お
よびフォーゲルスタイン（Vogelstein）、１９８３）。
プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーシ
ョン（６８℃にて）をアンダーソンらによる記載（１９
８９）と同様にして行った。フィルターを２×ＳＳＣ、
０.１％ｗ／ｖ ＳＤＳまたは０.２×ＳＤＳ、１％ｗ／
ｖ ＳＤＳ中で６８℃で洗浄した。

【００５４】インシトゥハイブリダイゼーション インシトゥハイブリダイゼーションをコーニッシュ（Co
rnish）ら（１９８７）による記載に従って行った。ｐ
ＮＡ−ＰＩ−２からの挿入物（１００ｎｇ）をランダム
ヘキサヌクレオチドプライミングにより１０⁸ｃｐｍμ
ｇ^-1の比活性に標識することによりプローブを調製した
（ファインベルクおよびフォーゲルスタイン、１９８
３）。標識したプローブを沈殿させ、ハイブリダイゼー
ション緩衝液（５０μｌ）中に再懸濁させ、５μｌを切
片に適用した。切片をカバーグラスで覆い、５０％ｖ／
ｖホルムアデヒドを入れた閉じた箱中で４０℃にて一夜
インキュベートした。インキュベーション後、切片を室
温にて４×ＳＳＣ、室温にて２×ＳＳＣ、および４０℃
にて１×ＳＳＣ中で順番に４０分間洗浄した。スライド
を乾燥させ、室温にてＸ線フィルム（CronexＭＲＦ３
２、デュポン）に直接暴露した。ハイブリダイズした切
片を水中の０.０２５％ｗ／ｖトルイジンブルーで対比
染色し、Eukitt（カール・ツァイス（Carl Zeiss）、フ
ライブルク、ＦＲＧ）中に積載した。放射能写真を切片
上に移して、合成物を示した。

【００５５】ＤＮＡゲルブロット分析 バーナツキー（Bernatzky）およびタンクスレイ（Tanks
ley）（１９８６）の手順により、ニコチアナ・アラタ
の若葉からゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡ（１０μ
ｇ）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄIIIで完全に消化し、０.９％ｗ／ｖアガロースゲル上
の電気泳動により分離し、２０×ＳＳＣ中のウエットブ
ロッティングによりHybond−Ｎ（アマーシャム）に移し
た。フィルターをプローブし、ＲＮＡブロット分析の場
合と同様にして洗浄した。

【００５６】タンパク質抽出物の調製 組織を液体窒素中で凍結し、乳鉢および乳棒中で細かい
粉末に破砕することにより植物材料から可溶性タンパク
質を抽出した。粉末化した組織を、１００ｍＭトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ８.５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ₂、１４μＭβ−メルカプトエタノールからなる緩
衝液中に抽出した。１０,０００ｇで１５分間遠心分離
することにより不溶性の物質を除いた。ブラッドフォー
ド（Bradford）（１９７６）の方法によりウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を標準として用いてタンパク質濃度を
評価した。

【００５７】プロテイナーゼインヒビターアッセイ リッカウアー（１９８９）の記載に従い、タンパク質抽
出物および精製タンパク質をトリプシンおよびキモトリ
プシンに対する抑制活性についてアッセイした。１μｇ
のトリプシン（ＴＰＣＫ−処理；シグマ）および３μｇ
のキモトリプシン（ＴＬＣＫ−処理；シグマ）に対して
抑制活性を測定した。トリプシンおよびキモトリプシン
によるそれぞれの合成基質、Ｎ−α−Ｐ−トシル−Ｌ−
アルギニンメチルエステル（ＴＡＭＥ）およびＮ−ベン
ゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステル（ＢＴＥＥ）の加
水分解の速度を、これら酵素の抑制されなかった活性と
した。抽出物の抑制活性は、プロテアーゼを抽出物とと
もにプレインキュベートした後に残留するコントロール
のプロテアーゼ活性のパーセントとして表した。柱頭か
らのＰＩペプチド、ＰＩ前駆体およびＡｓｐ−Ｎプロセ
シングしたペプチドを、クリステラー（Christeller）
ら（１９８９）による記載に従って抑制活性についてア
ッセイした。

【００５８】ニコチアナ・アラタＰＩタンパク質の精製 柱頭（１０００；１０ｇ）を液体Ｎ₂中で細かい粉末に
破砕し、緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.
５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１４μＭ
β−メルカプトエタノール、４ｍｌ／ｇ組織）中に抽出
した。最初の精製工程であるゲル濾過の前に抽出物を濃
縮するため、抑制活性を８０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム
で沈殿させたが、すべてのプロテイナーゼ抑制活性を沈
殿させるには濃縮が必要であった。

【００５９】硫酸アンモニウムペレットを５ｍｌの０.
１５Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.１中
に再懸濁し、同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−
５０カラム（２ｃｍ×１００ｃｍ）上に負荷した。この
カラムから溶出しプロテイナーゼ抑制活性を有するフラ
クション（１０ｍｌ）をプールし、キモトリプシン−セ
ファロースＣＬ４Ｂのアフィニティーカラム［製造業者
の指示により１００ｍｇのＴＬＣＫ−処理α−キモトリ
プシン（シグマ）を１５ｍｌのセファロースＣＬ４Ｂ
（ファルマシア）に架橋させたもの］に負荷した。結合
したタンパク質を７ｍ尿素、ｐＨ３で溶出する（５ｍｌ
フラクション）前に、カラムを１０容量の０.１５Ｍ Ｋ
Ｃｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８.１で洗浄した。
溶出液を２００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８で直
ちに中和し、脱イオン水に対して充分に透析した。

【００６０】アミノ酸配列分析 精製ＰＩタンパク質を、ガス相シークエンサー上の自動
エドマン分解に供する前に逆相ＨＰＬＣマイクロポアカ
ラム上のクロマトグラフィーにかけた（マウ（Mau）
ら、１９８６）。グレゴ（Grego）ら（１９８５）の記
載に従い、フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ
酸をＨＰＬＣにより分析した。

【００６１】ニコチアナ・アラタＰＩに対するポリクロ
ーナル抗血清の製造 以下のようにしてグルタルアルデヒドを用いて精製プロ
テイナーゼインヒビター（図６ｃ、レーン３）を担体タ
ンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ）（シグマ）にコンジュゲートした。１ｍｇのＰＩ
タンパク質をＨ₂Ｏ（１.５ｍｌ）中に溶解し、０.５ｍ
ｌの０.４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）中のＫＬＨ
（０.３ｍｇ）と混合した。２０ｍＭグルタルアルデヒ
ド（１ｍｌ）を室温で撹拌しながら５分間かけて滴下し
た。混合物を室温で３０分間撹拌し、グリシン（０.２
５ｍｌ）を加え、混合物をさらに３０分間撹拌した。つ
いで、コンジュゲートしたタンパク質を通常の食塩水
（０.８％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）に対して充分に透析した。
各注射についで１００μｇの当量のＰＩタンパク質を用
いた。最初の注射にはフロイントの完全アジュバントを
用い、その後の２回のブースター注射には不完全アジュ
バントを用いた。抗血清のＩｇＧフラクションを製造業
者の指示に従ってプロテインＡセファロース（ファルマ
シア）上で分離した。

【００６２】タンパク質ゲルブロット分析 タンパク質抽出物を１５％ｗ／ｖ ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル中で電気泳動し（レムリ、１９７０）、Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ Ｔｒａｎｓ−ＢｌｏｔＲＳｅｍｉ−ｄｒ
ｙ電気泳動トランスファーセル（１２Ｖ、２０分）を用
いて２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、２
０％ｖ／ｖメタノール中のニトロセルロースに移した。
負荷およびタンパク質の移動は、膜上のタンパク質をPo
nceau Ｓ（ハーロウ（Harlow）およびレイン（Lane）、
１９８８）で染色することによりチェックした。膜を３
％ｗ／ｖウシ血清アルブミン中で１時間ブロックし、抗
ＰＩ抗体（１％ｗ／ｖＢＳＡ、トリス緩衝食塩水中に２
μｇ／ｍｌ）とともに室温にて一夜インキュベートし
た。製造業者の推奨に従い、ビオチン化ロバ抗ウサギＩ
ｇＧ（１／５００希釈、アマーシャム）およびアマーシ
ャムビオチン−ストレプトアビジンシステムを用いて結
合抗体を検出した。

【００６３】エンドプロテイナーゼＡｓｐ−ＮによるＰ
Ｉ前駆体のタンパク質加水分解 アフィニティー精製したＰＩ前駆体（１.２５ｍｇ）を
１００ｍＭ ＮＨ₄ＨＣＯ₃、ｐＨ８.５中のエンドプロテ
イナーゼＡｓｐ−Ｎ（２μｇ）とともに３７℃にて全量
１ｍｌで４８時間インキュベートした。反応生成物を、
分析的ブラウンリー（Brownlee）ＲＰ−３００アクアポ
ア（Aquapore）カラム（Ｃ８、７μｍ、４.６×１００
ｍｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより分離した。カラムを
０.１％ｖ／ｖＴＦＡ中で平衡化し、ペプチドを以下の
プログラムで溶出した：０〜２５％Ｂ（０.０８９％ｖ
／ｖＴＦＡ中の６０％ｖ／ｖアセトニトリル）を５分間
かけて負荷し、ついで２５〜４２％勾配のＢを４０分間
かけて負荷し、最後に４２〜１００％勾配のＢを５分間
かけて負荷する。流速は１.０ｍｌ／分であり、ペプチ
ドを２１５ｎｍにおける吸光度により検出した。各ピー
クを手動で回収し、凍結乾燥した。ＵＶ検出器上での２
１５ｎｍにおける各ピークで得られた応答により濃度を
推定した。

【００６４】２．ＰＩ前駆体遺伝子のクローニングＰＩｃＤＮＡクローンの単離および特徴付け ｃＤＮＡライブラリー（ニコチアナ・アラタの成熟花の
柱頭および花柱から単離したｍＲＮＡより調製）を、自
家不和合性の遺伝子型を伴わない高度に発現された遺伝
子のクローンについてスクリーニングした。ジャガイモ
およびトマトのII型プロテイナーゼインヒビター（ソー
ンバーグ（Thornburg）ら、１９８７；グラハム（Graha
m）ら、１９８５）とある程度の配列同一性を有するタ
ンパク質をコードするクローンを選択した。最も大きい
クローン（ＮＡ−ＰＩ−２）は１１９１ヌクレオチドの
転写解読枠を有し、１３６０塩基対の長さであった。こ
のニコチアナ・アラタクローン（ＮＡ−ＰＩ−２）の核
酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）および予測されるアミ
ノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を図１に示す。Ｎ−
グリコシル化の可能性のある部位は存在しない。

【００６５】驚くべきことに、このニコチアナ・アラタ
ｃＤＮＡクローンは、完全ではないが高度の配列同一性
を有する６つの繰り返しドメインを有するタンパク質を
コードしている（図１）。これら各ドメインには反応性
部位の可能性のある部位が含まれている（図１中に明示
してある）。ニコチアナ・アラタＰＩの推定反応部位の
残基は、キモトリプシンを特異的に抑制する２つの部位
（Ｌｅｕ５−Ａｓｎ６、Ｌｅｕ６３−Ａｓｎ６４）およ
びトリプシンに対して特異的な４つの部位（Ａｒｇ１２
１−Ａｓｎ１２２、Ａｒｇ１７９−Ａｓｎ１８０、Ａｒ
ｇ２３７−Ａｓｎ２３８およびＡｒｇ２９５−Ａｓｎ２
９６）を有するインヒビターと一致している。

【００６６】ＮＡ−ＰＩ−２の繰り返し構造がクローニ
ングによる人為的な産物でないことを確かめるため、別
の３つのｃＤＮＡクローンをシークエンシングしたとこ
ろ、ＮＡ−ＰＩ−２と同一であることがわかった。表１
は、ＰＩ前駆体の６つのドメインのアミノ酸同一性のパ
ーセントを比較したものである。

【００６７】ＰＩ ｍＲＮＡの一過性で空間的な発現 ニコチアナ・アラタの種々の組織から単離した全ＲＮＡ
を、図２に示すＲＮＡゲルブロット分析においてＰＩ
ｃＤＮＡクローンでプローブした。１.０および１.４ｋ
ｂの２つのハイブリダイズするメッセージが、花柱（柱
頭を含む）から単離した全ＲＮＡ中に存在した。大きい
方のメッセージ（この組織において主要なものである）
のみが、ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２（１.４ｋ
ｂ）をコードするのに充分なサイズである。小さい方の
メッセージは、より高い厳格さにおいてはｃＤＮＡプロ
ーブで検出されない。約１.４ｋｂの相同なメッセージ
はまた、ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・シル
ベストリスの花柱から単離したＲＮＡ中にも存在した
（図２）。

【００６８】花の他の器官（花粉を除く）では、両メッ
セージとも低レベルで検出することができたが、より小
さいＲＮＡ種が一層たくさん認められた。花粉ＲＮＡに
はハイブリダイゼーションは認められなかった。葉のＲ
ＮＡにはハイブリダイズする種が認められなかったが、
機械的な傷をつけてから２４時間後には１.０および１.
４ｋｂの２つの種が検出された。この場合には、小さい
方のメッセージ（１.０ｋｂ）の方がたくさん認められ
た。

【００６９】未熟な（１ｃｍ長）芽の花柱の縦切片への
放射性標識したニコチアナ・アラタＰＩｃＤＮＡのイン
シトゥハイブリダイゼーションを図３に示す。該ｃＤＮ
Ａに相同なＲＮＡは柱頭の細胞に強く結合し、維管束へ
は弱く結合した。皮層組織、導管組織または花柱の表皮
ではハイブリダイゼーションは検出されなかった。同じ
パターンのハイブリダイゼーションは、成熟した受容性
の（receptive）花においても観察された。ハイブリダ
イゼーションの前にリボヌクレアーゼＡで処理したコン
トロールの切片は標識されなかった。

【００７０】ゲノムＤＮＡブロット分析 ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２を図４に示すＤＮＡゲ
ルブロット（ＥｃｏＲＩかＨｉｎｄIIIのいずれかで消
化したゲノムＤＮＡが含まれる）上でプローブとして用
いた。ＥｃｏＲＩにより２つのハイブリダイズするフラ
グメント（１１ｋｂおよび７.８ｋｂ）が得られ、Ｈｉ
ｎｄIIIからは３つの大きなハイブリダイズするフラグ
メント（１６.６、１３.５および１０.５ｋｂ）が得ら
れた。

【００７１】ニコチアナ・アラタの種々の組織中でのＰ
Ｉ活性の分布 ニコチアナ・アラタの種々の器官の粗製抽出物によるト
リプシンおよびキモトリプシンの抑制を図５に示す。柱
頭抽出物がトリプシンおよびキモトリプシンの両方に対
して最も有効なインヒビターであった。柱頭抽出物は萼
片抽出物に比べて８倍までの抑制活性を有し、花柱、花
弁、葉および傷つけた葉からの抽出物に比べると２０倍
以上の抑制活性を有していた。

【００７２】ニコチアナ・アラタ柱頭からのＰＩの精製 ニコチアナ・アラタの柱頭を緩衝液中に抽出し、８０％
ｗ／ｖ硫酸アンモニウムで沈殿させることにより抑制活
性を濃縮した。沈殿を再溶解し、セファデックスＧ−５
０上でゲル濾過することにより分画した。図６ａおよび
６ｂに図示したプロフィールにおいて、プロテイナーゼ
インヒビターに比べて抽出物中の殆どのタンパク質は早
く溶出した。プロテイナーゼ抑制活性を有するフラクシ
ョンをプールし、キモトリプシン−セファロースのアフ
ィニティーカラムに負荷した。ＰＩ活性は約６ｋＤのタ
ンパク質とともに溶出し、図示６ｃに示す２０％ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル上で単一のバンドとして移動
するように思われた。精製の種々の段階におけるＰＩの
純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した（図６ｃ）。精
製したインヒビターは、粗製の抽出物中の存在する抑制
活性の約５０％を表していた。

【００７３】６ｋＤ ＰＩタンパク質のＮ末端のアミノ
酸配列 精製ＰＩタンパク質からＮ末端アミノ酸配列ＤＲＩＣＴ
ＮＣＣＡＧ（Ｔ／Ｋ）ＫＧ（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を得た。このアミ
ノ酸配列は、図１中の位置２５、８３、１４１、１９
９、２５７および３１５から開始されるｃＤＮＡクロー
ンの導かれた配列中の６つの領域に対応する。このＮ末
端配列の位置１１には、トレオニンおよびリジンの両方
が検出された。このことは、図１において下線を引いた
配列で始まる６つのペプチドの混合物からなる精製イン
ヒビターと一致する。最初の２つのペプチドは該位置に
トレオニンを含み、一方、他の４つのペプチドは該位置
にリジンを有する。予測された前駆体タンパク質中の６
つの繰り返しドメインに対するこれらペプチドの相対位
置を図７に図示する。これら６つの予測された６ｋＤペ
プチドのうち５つは、キモトリプシンかまたはトリプシ
ンのいずれかに対する反応部位を有している（図１およ
び７）。６番目のペプチドは他の５つのペプチドよりも
アミノ酸が４つ短く（５８アミノ酸）、抑制部位を含有
していないので活性でない。Ｎ末端からのペプチド（図
７におけるｘ）はキモトリプシン反応性の可能性のある
部位を有するが、はるかに短い（２４アミノ酸）。

【００７４】ニコチアナ・アラタ中でのＰＩタンパク質
の分布 キーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートし
た精製ＰＩタンパク質に対してポリクローナル抗血清を
産生させた。該抗体はイムノブロット分析において精製
６ｋＤ ＰＩタンパク質と強く反応し、成熟花からの全
柱頭および花柱抽出物において６ｋＤおよび３２ｋＤタ
ンパク質（二重線として出現）にのみ結合した。図８
は、抗ＰＩ抗血清でプローブした、発育の種々の段階
（１ｃｍ長の芽から成熟した花まで）での花からのタン
パク質抽出物を含有するイムノブロットである。長さが
１ｃｍから５ｃｍの芽では、６ｋＤおよび３２ｋＤタン
パク質に加えて約１８ｋＤおよび４２ｋＤの大きな交差
反応性タンパク質が検出された。これら１８ｋＤおよび
４２ｋＤタンパク質は成熟につれて濃度が減少したが、
６ｋＤタンパク質は開花の直前にピーク濃度に達した。
３２ｋＤタンパク質は花の成熟の間、比較的一定に推移
した。

【００７５】 表１ ニコチアナ・アラタＰＩ １ ２ ３ ４ ５ ６ ニコチアナ・アラタ １ １００ ８８ ８８ ９０ ７９ ２ ８８ ８８ ９０ ７９ ３ ９７ ９５ ８６ ４ ９８ ９０ ５ ９０ ６

【００７６】実施例２ ＰＩモノマーの精製および同定 １．材料および方法逆相クロマトグラフィーによる６ｋＤ ＰＩ種の分離 柱頭（２１,０００）を破砕し、ＰＩタンパク質の精製
についての記載と同様にして抽出した。セファデックス
Ｇ−５０ゲル濾過カラム（５ｃｍ×８００ｃｍ、分離当
たり３０００の柱頭）上でのゲル濾過の後、ペプチドを
凍結乾燥し、ベックマンＨＰＬＣシステムゴールド（Go
ld）上のブラウンリーＲＰ−３００Ｃ８逆相カラム（１
０×２５０ｍｍ）に負荷し、０.１％ｖ／ｖトリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトニトリル勾配（０〜１０
％を５分間、１０〜２５％を４０分間、および２５〜６
０％を１０分間）により５ｍｌ／分にて溶出した。ピー
クのフラクション（フラクション１、２、３および４）
を回収し、凍結乾燥した。

【００７７】電子スプレー質量分析 改変ヒューレット−パッカード（Hewlett−Packard）モ
デルＨＰ１０９０Ｌ液体クロマトグラフ上のブラウンリ
ーＲＰ−３００Ｃ８逆相カラム（１５０×２０ｍｍ内径
の融解石英毛管カラム）上に水（２.０μｌ）中の各Ｐ
Ｉ調製物（フラクション１、２、３および４）（２０ピ
コモル）を負荷し、１μｌ／分の流速および２５℃のカ
ラム温度にてアセトニトリルの直線勾配（０.０５％ｖ
／ｖ ＴＦＡから０.０４５％ｖ／ｖ ＴＦＡ／６０％ｖ
／ｖアセトニトリル、３０分間）で溶出することによ
り、ＨＰＬＣ溶出液のオンライン質量分析を行った。６
ｍｍ行路長のＵ字型軸ビーム毛管流セルを有するスペク
トラルフィジックス（SpectralPhysics）前光学スキャ
ニング検出器（ＬＣパッキングス（ＬＣ Packings）、
オランダ）を用い溶出液を２１５ｎｍにてモニターし
た。電子スプレーイオン化（ＥＡＩ）源（アナリティカ
（Analytica）、ブランフォード、コネチカット州）を
備えたフィニガン−マット（Finningan−Mat）トリプル
四極子質量分析計（モデルＴＳＱ−７００、サンホセ、
カリフォルニア州）で質量スペクトルを得た。電子スプ
レー針を−４ｋＶの電圧差にて陽イオンモードで操作し
た。被覆（sheath）液は２−メトキシエタノールであ
り、手動ポンプ駆動により１μｌ／分にて分配した（ハ
ーバード・アパレイタス（Harvard Apparatus）、サウ
スナチック、マサチューセッツ州）。窒素乾燥ガス条件
は以下の通りであった；ヒーターの温度、２７５℃；圧
力、１５ｐｓｉ；流速、１５ｓｔｄＬ／分。窒素被覆ガ
スを３３ｐｓｉで供給した。ガス状窒素を沸騰した液体
窒素源から得た。ペプチドを上記オンライン毛管ＲＰ−
ＨＰＬＣにより１.０μｌ／分にてＥＳＩ源中に導入し
た。３秒の速度にてｍ／ｚ４００〜２０００でスキャニ
ングしてスペクトルを得た。データの回収および換算を
フィニガンＢＩＯＭＡＳＳ^TMソフトウエアを用いてＤｅ
ｃ５１００コンピューター上で行った。

【００７８】２．結果ニコチアナ・アラタ柱頭からの個々の６ｋＤ ＰＩ種の
分離および同定 精製した６ｋＤ ＰＩ調製物中に存在すると予測された
約６ｋＤの６つのペプチドのうち５つを逆相ＨＰＬＣク
ロマトグラフィーにより互いに分離した。４つのピーク
が得られ（図９ａ）、各ピーク中のペプチドを電子スプ
レー質量分析により同定した（表２）。ＰＩ前駆体中で
の位置およびキモトリプシンまたはトリプシン活性部位
の存在に従ってペプチドをＣ１、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およ
びＴ４と称した（図９ｂ）。最初のＨＰＬＣピーク（図
９ａ）はキモトリプシンインヒビターＣ１に対応し、第
二のピークはＴ２およびＴ３（互いに同一）およびＴ４
（Ｔ２およびＴ３とは位置３２における一つのアミノ酸
のみが異なる）の混合物からなる。第三のピークにはペ
プチドＴ１が含まれ、第四のピークはＴ１、Ｔ２／Ｔ３
およびＴ４の混合物からなる（表２）。

【００７９】プロセシングの部位は正確には決定しなか
ったが、図１０に示す配列中のアスパラギン酸残基
（Ｎ）とアスパラギン残基（Ｄ）との間に位置している
と思われる。アスパラギン残基に対する特異性を有する
プロテアーゼは、未熟なダイズ種子およびカボチャの子
葉からの液胞から単離されている（スコット（Scott）
ら、１９９２、ハラ−ニシムラ（Hara−Nishimura）
ら、１９９１）。このことは、ニコチアナ・アラタの柱
頭中の乳頭およびその下の分泌細胞の液胞中のＰＩの免
疫金（immunogold）局在と一致する（アトキンソン、１
９９２）。ニコチアナ・アラタＰＩの場合は、ペプチド
ホルモンと類似のプロセシングも可能である。なぜな
ら、可能な各６ｋＤペプチドは二塩基性残基（Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ、図１０中の位置−２＆−３）を側部に有するか
らである。しかしながら、かかるシステムは植物におい
ては記載されておらず、これら二塩基性残基は分子表面
にプロセシング部位を呈示する予測された親水性ループ
の形成に預かっていると考える方がよいようである。

【００８０】質量分析からのデータは、いったん最初の
開裂が起こったら新たなカルボキシ末端はトリミングさ
れていくことを示している（図１０）。ＥＥＫＫＮ配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）は完全に除去されるがトリ
ミングは完全ではなく、ときにはさらにアミノ酸が除去
される。立体障害がトリミングがさらに進むのを防ぐ。
場合によってはアスパラギン酸もＮ末端から除去され
る。

【００８１】実施例３ 組換えバクロウイルスベクターを用いた昆虫細胞（Ｓｆ
９）培養液中でのＰＩ前駆体の製造 ＰＩ前駆体をコードするｃＤＮＡ（図１）をプラスミド
ベクターｐＶＬ１３９２のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
該プラスミドベクターは、ＢａｍＨ１部位にマルチクロ
ーニング部位が挿入されている他はｐＶＬ９４１（ルッ
クナウ（Lucknow）およびサマーズ（Summers）、１９８
９）と同じである。ｐＲＨ１１と称するプラスミドは、
多核体（polyhedrin）プロモーターによって指令される
転写の方向に関して正しい方向にてＰＩｃＤＮＡを含有
する。バクロウイルスＤＮＡおよびｐＲＨ１１をスポド
プテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞
に同時トランスフェクションすることにより組換えバク
ロウイルスを得た。組換えウイルス（相同組換えによっ
て得られた）をプラーク精製し、タンパク質産生のため
に昆虫細胞に感染させる前に増幅させた。組換えバクロ
ウイルスの産生、該ウイルスの滴定およびＳｆ９細胞の
維持および感染に関するすべての手順はキング（King）
およびポッセ（Posse）（１９９２）から得た。ＰＩ前
駆体を産生させるため、大フラスコ（１７５ｃｍ²）中
の単層のＳｆ９細胞が集密に達した時点で高力価の組換
えウイルスで５〜１０ｐｆｕ／細胞の多数の感染により
感染させた。感染の４日後に培養液を回収し、遠心分離
により清澄化し、柱頭からの６ｋＤ ＰＩ種について記
載したのと同様にしてキモトリプシン−セファロースア
フィニティーカラムに適用することによりＰＩ前駆体を
精製した。７Ｍ尿素、ｐＨ３中でカラムから溶出したＰ
Ｉ前駆体を１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）で直ち
に中和し、Milli−Ｑ水に対して充分に透析し、ダイア
フロー（Diaflow）ＹＭ１０フィルターを用いた超遠心
分離により２０〜５０倍に濃縮し、−２０℃にて凍結保
存した。

【００８２】感染した昆虫細胞から前駆体を産生させる
ため、ＰＩ前駆体をコードするｃＤＮＡクローンをバク
ロウイルスベクター中に組み込んだ。昆虫細胞は４２ｋ
Ｄのタンパク質を産生したが、このものは柱頭からの６
ｋＤ ＰＩペプチドに対して産生させた抗体と交差反応
し、キモトリプシンアフィニティーカラムに結合した。
この４２ｋＤタンパク質は、ニコチアナ・アラタの未熟
な柱頭中で産生される４２ｋＤ前駆体とサイズが同じで
あり（図１１）、Ｎ末端配列ＬｙｓＡｌａＣｙｓＴｈｒ
ＬｅｕＡｓｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を有してお
り、シグナル配列が昆虫細胞によって正確にプロセシン
グされたことを示している（図１）。これら結果に基づ
き、バクロウイルス発現系で産生された該４２ｋＤタン
パク質は、いまやＰＩ前駆体と呼ぶことになるであろ
う。この４２ｋＤ ＰＩ前駆体はキモトリプシンに対し
ては抑制活性を有するが、トリプシンに対しては抑制活
性を有していなかった（図１３）。このＰＩ前駆体をエ
ンドプロテイナーゼＡｓｐＮによってプロセシングして
約６ｋＤの安定なペプチドが得られ、これを逆相ＨＰＬ
Ｃにより部分精製した（図１２）。これらペプチドは柱
頭から分離した６ｋＤペプチドに等価なトリプシンおよ
びキモトリプシンに対する抑制活性を有しており、トリ
プシン抑制活性を活性化するには前駆体のプロセシング
が必要であるが、キモトリプシン活性についてはすべて
について必要でないことを示していた。ＡｓｐＮはアス
パラギン酸残基に隣接して（図１０におけるＡｓｎ−１
とＡｓｐ１との間）特異的に開裂しトリミング活性を有
しないので、インビトロで生成したペプチドはＣ末端に
配列ＥＥＫＫＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）が存在する
他は柱頭で産生させたものと同じであろう。このこと
は、活性な６ｋＤ ＰＩペプチドを得るにはＮ末端およ
びＣ末端の正確なプロセシングを必要としないことの新
たな証拠を提供する。Ａｓｐ−Ｎ１はトリプシンに比べ
てキモトリプシンの抑制において一層有効であり、それ
ゆえ主としてＣ１類似体であると思われる（図９ｂ）。
Ａｓｐ−Ｎ２は一層有効なトリプシンインヒビターであ
り、おそらくＴ１〜Ｔ４類似体を含有している。

【００８３】実施例４ 種々の昆虫からの未分画消化管抽出物におけるプロテア
ーゼ活性に対するＰＩの効果 クリステラーら（１９９２）の手順を用いて消化管プロ
テアーゼに対するＰＩの活性を以下のようにして測定し
た。インヒビターの１μＭのアリコート（０〜１０μ
ｌ、消化管中に存在するプロテアーゼに対して少なくと
も５倍過剰）を１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０）
（１５０μｌ）と混合し、各昆虫消化管抽出物（０〜１
５μｌ）と３０℃にて２０分間プレインキュベートし
た。Ｃ¹⁴−標識したカゼイン基質（４００μｇタンパク
質、比活性２５,０００〜７５,０００ｄｐｍ ｍｇ^-1）
（５０μｌ）を加えることにより反応を開始し、反応を
停止させるために冷３０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（５０μ
ｌ）を加えるまで反応を続けた。氷上で３０分間インキ
ュベートした後、未消化のタンパク質を２０℃にて１
０,０００ｇで５分間遠心分離にかけてペレット化し
た。上澄み液を除き、シンチレーション液と混合し、放
射能を測定した。ルシラ・セリカタ（Ｌ.sericata）お
よびクリソムヤ・ルフィファシエス（Ｃ.rufifacies）
の場合に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）を用い
た他はｐＨ１０にてアッセイを行った。

【００８４】表３は、レピドプテラ（Lepidoptera）、
コレオプテラ（Coleoptera）、オルトプテラ（Orthopte
ra）およびジプテラ（Diptera）の種々の成員の消化管
中のプロテアーゼに対するプールした６ｋＤ ＰＩペプ
チド（Ｃ１、Ｔ１、Ｔ２／Ｔ３、Ｔ４）、トリプシンイ
ンヒビターＴ２／Ｔ３およびＴ４の混合物、およびキモ
トリプシンインヒビターＣ１の抑制活性を示す。殆どの
場合、プールしたペプチドおよびトリプシンインヒビタ
ーは、試験した昆虫に依存して３７〜７９％の範囲の抑
制程度にて消化管プロテアーゼに対して等価な効果を有
していた。これらインヒビターは、ジャガイモ塊茎の蛾
であるフトリマエ・オペルクレラ（Ｐ.opercullela）の
消化管プロテアーゼに対しては殆ど効果は認められなか
った。キモトリプシンインヒビターＣ１もまたプロテア
ーゼの活性に影響を与えたが、５つの場合（ウイセアナ
・セルビナタ（Ｗ.cervinata）、ルシラ・セリカタ、コ
ステリトラ・ゼアランディカ（Ｃ.zealandica）、プラ
ノトルトリックス・オクト（Ｐ.octo）、サトウキビ地
虫（sugar cane grub））にはトリプシンインヒビター
よりも有効性が低かった。

【００８５】実験の詳細は図１４の説明に記載してあ
る。ニコチアナ・アラタＰＩは、コオロギの体重を減少
させるうえでダイズバウマン−バークインヒビターより
も一層有効であった。昆虫の中腸の酵素を抑制するプロ
テイナーゼインヒビターの能力と昆虫飼育試験において
昆虫の生育を遅らせるうえでの有効性との間に良好な相
関関係が存在することが示された（クリステラーら、１
９９２）。図１４は、インビトロアッセイで黒色野生コ
オロギ（テレオグリルス・コモデュス（Ｔ.commodu
s））の消化管プロテアーゼを７０％抑制したプールＰ
Ｉが、１０週間の期間にわたって行った飼育試験におい
てコオロギの生育を３０％遅らせたことを示している。
インビトロアッセイと飼育試験との間の相関関係は、最
近になってヘリコベルパ・アルミゲラ（Helicoverpa ar
migera）の生育および発達について研究しているジョン
ストン（Johnston）と彼の同僚（１９９３）によって確
かめられた。

【００８６】

【表１】

【００８７】

【表２】

【００８８】表３の説明 ＮａＰＩ＝プールしたニコチアナ・アラタプロテイナー
ゼインヒビター Ｃ１＝ニコチアナ・アラタキモトリプシンインヒビター
（ＨＰＬＣからのピーク１） Ｔ２／Ｔ３、Ｔ４＝ニコチアナ・アラタトリプシンイン
ヒビター（ＨＰＬＣからのピーク２） ヘリオチス・アルミゲラ（Heliothis armigera）、ヘリ
コベルパ・アルニゲラ（Helicoverpa armigera）、タバ
コの青虫、レピドプテラ ヘリオチス・プンクチゲラ（Heliothis punctigera）、
ヘリコベルパ・プンクチゲラ（Helicoverpa punctiger
a） 自生の青虫、レピドプテラ テレオグリルス・コモデュス 黒色野生コオロギ、オル
トプテラ アグロチス・インフサ（Agrotis infusa） 普通のネキ
リガ、成虫はモンヤガ（Bogong moth）として知られ
る、レピドプテラ

【００８９】ウイセアナ・セルビナタ ポリナ（Porin
a）、ニュージーランドに自生、レピドプテラ ルシラ・セリカタ 緑クロバエ、ジプテラ、ｐＨ８にて
アッセ クリソムヤ・ルフィファシエス 毛深い蛆クロバエ、ジ
プテラ、ｐＨ８にてアッセイ アホジウス・タスマニア（Aphodius tasmaniae） タス
マニアの草地虫＝黒頭牧草コフキコガネ（cockchafe
r）、コレオプテラ コステリトラ・ゼアランディカ ニュージーランドの草
地虫、コレオプテラ スポドプテラ・リトゥラ（Spodoptera litura） 熱帯産
アワヨトウの幼虫（armyworm）、レピドプテラ フトリマエ・オペルクレラ ジャガイモ塊茎の蛾、レピ
ドプテラ エピフィアス・ポストビッタナ（Epiphyas postvittan
a） 薄褐色のリンゴ蛾（ハマキムシ（leafroller））、
レピドプテラ プラノトルトリックス・オクト 緑頭のハマキムシ、レ
ピドプテラ クテノプセウスチス・オブリクアナ（Ctenopseustis ob
liquana） 褐色頭のハマキムシ、レピドプテラ サトウキビ地虫

【００９０】引用文献 アンダーソン（Anderson,Ｍ.Ａ.）、マックファデン（M
cFadden,Ｇ.Ｉ.）、バーナツキー（Bernatzky,Ｒ.）、
アトキンソン（Atkinson,Ａ.）、オーピン（Orpin,
Ｔ.）、デッドマン（Dedman,Ｈ.）、トレギア（Tregea
r,Ｇ.）、ファーンレイ（Fernley,Ｒ.）、クラーク（Cl
erke,Ａ.Ｅ.）（１９８９）The Plant Cell１：４８３
〜４９１ アトキンソン（Atkinson,Ａ.Ｈ.）（１９９２）博士論
文、メルボルン大学、ビクトリア、オーストラリア バーナツキー、タンクレイ（Tanksley,Ｓ.Ｄ.）（１９
８６）Theor. Appl. Genet.７２：３１４〜３２１ ブラッドフォード（Bradford,Ｍ.Ｍ.）（１９７６）Ana
l. Biochem.７２：２４８〜２５４

【００９１】ブラウン（Brown,Ｗ.Ｅ.）、ライアン（Ry
an,Ｃ.Ａ.）（１９８４）Biochemistry ２３：３４１８
〜３４２２ ブライアント（Bryant,Ｊ.）、グリーン（Green,Ｔ.
Ｒ.）、グルサダイア（Gurusaddaiah,Ｔ.）、ライアン
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Ｍ.）、ボニッヒ（Bonig,Ｉ.）、クラーク（１９８７）
Nature ３２６：９９〜１０２ クリステラー（Christeller,Ｊ.Ｔ.）、ショー（Ｓhaw,
Ｂ.Ｄ.）、ガーディナー（Gardiner,Ｓ.Ｅ.）、ダイモ
ック（Dymock,Ｊ.）（１９８９）Insect Biochem.１
９：２２１７〜２３１ クリステラー、レング（Laing,Ｗ.Ａ.）、マークウイッ
ク（Markwick,Ｎ.Ｐ.）およびバーゲス（Burgess,Ｅ.
Ｐ.Ｊ.）（１９９２）Insect Biochem. Molec.Biol.２
２：７３５〜７４６

【００９２】ファインバーグ（Feinberg,Ａ.Ｐ.）、フ
ォーゲルスタイン（Vogelstein,Ｂ.）Anal. Biochem.１
３２：６〜１３ グラハム（Graham,Ｊ.Ｓ.）、ピアス（Pearce,Ｇ.）、
メリーウエザー（Merryweather,Ｊ.）、チタニ（Titan
i,Ｋ.）、エリクソン（Ericsson,Ｌ.Ｈ.）、ライアン
（１９８５）J.Biol.Chem.２６０：６５６１〜６５６４ グラハム、ホール（Hall,Ｇ.）、ピアス、ライアン（１
９８６）Planta １６９：３９９〜４０５ グレゴ（Grego,Ｂ.）、ファン・ドリエル（van Driel,
I.R.）、スターン（Stearne,Ｐ.Ａ.）、ゴーディング
（Goding,Ｊ.Ｗ.）、ナイス（Nice,Ｅ.Ｇ.）、シンプソ
ン（Simpson,Ｒ.Ｊ.）（１９８５）Eur. J. Biochem.１
４８：４８５〜４９１

【００９３】グリーン、ライアン（１９７２）Scienc
e：７７６〜７７７ ハラ−ニシムラ（Hara−Nishimura,Ｉ.）、イノウエ（I
noue,Ｋ.）、ニシムラ（Nishimura,Ｍ.）（１９９１）
ＦＥＢＳ Letters ２９４、８９〜９３ ハーロウ（Harlow,Ｅ.）、レイン（Lane,Ｄ.）（１９８
８）Antibodies. A Laboratory Mannual. コールドスプ
リングハーバーラボラトリー、ニューヨーク ハス（Hass,Ｇ.Ｍ.）、ハーモドソン（Hermodson,M.
A.）、ライアン、ジェントリー（Gentry,Ｌ.）（１９８
２）Biochemistry ２１：７５２〜７５６ ジョンストン（Johnston,Ｋ.Ａ.）、ゲートハウス（Gat
ehouse,Ｊ.Ａ.）、アンステー（Anstee,Ｊ.Ｈ.）（１９
９３）Ｊ.Insect Physiol.３９、６５７〜６６４

【００９４】キング（King,Ｌ.Ａ.）、ポッセー（Posse
e,Ｒ.Ｄ.）（１９９２）The Baculovirus Expression s
ystem. A Laboratory Guide（チャップマン＆ホール（C
hapman＆Hall）：ロンドン、ＵＫ） クオ（Kuo,Ｊ.）、ピアス、ライアン（１９８４）黄化
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Ｆ.）（１９８２）Ｊ. Mol. Biol.１５７：６８０〜６
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s,Ｍ.Ｄ.）（１９８９）Virology １７０：３１〜３９

【００９５】マウ（Mau,Ｓ−Ｌ.）、ウイリアムズ（Wil
liams,Ｅ.Ｇ.）、アトキンソン、アンダーソン、コーニ
ッシュ、グレゴ、シンプソン、ケア−プア（Kheyr−Pou
r,Ａ.）、クラーク（１９８６）Planta １６９：１８４
〜１９１ メルビル（Melville,Ｊ.Ｃ.）、ライアン（１９７０）A
rchives of Biochemistry and Biophysics １３８：７
００〜７０２ ピアス、ライアン、リリエグレン（Liljegren,Ｄ.）
（１９８８）Planta１７５：５２７〜５３１ プランケット（Plunkett,Ｇ.）、セニア（Senear,Ｄ.
Ｆ.）、ズロスク（Zuroske,Ｇ.）、ライアン（１９８
２）Arch. Biochem. Biophys. ２１３：４６３〜４７２

【００９６】リチャードソン（Richardson,Ｍ.）（１９
７７）Phytochemistry １６：１５９〜１６９ リッカウアー（Rickauer,Ｍ.）、フルニエ（Fournier,
Ｊ.）、エスケレ−ツガエ（Esquerre−Tugaye,Ｍ.）
（１９８９）Plant Physiol.９：１０６５〜１０７０ ライアン（１９８３）植物における防御反応：Plant Ge
ne Research、デンズ（Dennes,Ｅ.Ｓ.）、ホーン（Hoh
n,Ｂ.）、ホーン（Hohn,Ｔ.）、キング、シェル（Schel
l,Ｊ.）、バーマ（Verma,Ｄ.Ｐ.Ｓ.）編、ニューヨー
ク、スプリンガー版、３７５〜３８６ サンチェス−セラノ（Sanchez−Serrano,Ｊ.Ｊ.）、シ
ュミット（Schmidt,Ｒ.）、シェル、ウイルミッツァー
（Willmitzer,Ｌ.）（１９８６）Mol. Gen. Genet.２０
３：１５〜２０

【００９７】スコット（Scott,Ｍ.Ｐ.）、ヤング（Youn
g,Ｒ.）、ムンツ（Muntz,Ｋ.）、ニールセン（Nielsen,
Ｎ.Ｃ.）（１９９２）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ
８９、６５８〜６６２ ソーンブルグ（Thornburg,Ｒ.Ｗ.）、アン（An,Ｇ.）、
クリーブランド（Cleveland,Ｔ.Ｅ.）、ジョンソン（Jo
hnson,Ｒ.）、ライアン（１９８７）Ｐroc.Ｎatl.Ａca
d.Ｓci.ＵＳＡ８４：７４４〜７４８

【００９８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF MELBOURNE <120> TRANSGENIC PLANT CONTAINING GENETIC SEQUENCE ENCODING TYPE II SERI NE PROTEAINSE INHIBITOR OR PRECURSOR THEREOF <130> 169486 <160> 14

【００９９】 <210> 1 <211> 1104 <212> DNA <213> Nicotiana alata <400> 1 aaggcttgta ccttaaactg tgatccaaga attgcctatg gagtttgccc gcgttcagaa 60 gaaaagaaga atgatcggat atgcaccaac tgttgcgcag gcacgaaggg ttgtaagtac 120 ttcagtgatg atggaacttt tgtttgtgaa ggagagtctg atcctagaaa tccaaaggct 180 tgtaccttaa actgtgatcc aagaattgcc tatggagttt gcccgcgttc agaagaaaag 240 aagaatgatc ggatatgcac caactgttgc gcaggcacga agggttgtaa gtacttcagt 300 gatgatggaa cttttgtttg tgaaggagag tctgatccta gaaatccaaa ggcttgtcct 360 cggaattgcg atccaagaat tgcctatggg atttgcccac ttgcagaaga aaagaagaat 420 gatcggatat gcaccaactg ttgcgcaggc aaaaagggtt gtaagtactt tagtgatgat 480 ggaacttttg tttgtgaagg agagtctgat cctaaaaatc caaaggcctg tcctcggaat 540 tgtgatggaa gaattgccta tgggatttgc ccactttcag aagaaaagaa gaatgatcgg 600 atatgcacca actgctgcgc aggcaaaaag ggttgtaagt actttagtga tgatggaact 660 tttgtttgtg aaggagagtc tgatcctaaa aatccaaagg cttgtcctcg gaattgtgat 720 ggaagaattg cctatgggat ttgcccactt tcagaagaaa agaagaatga tcggatatgc 780 acaaactgtt gcgcaggcaa aaagggctgt aagtacttta gtgatgatgg aacttttgtt 840 tgtgaaggag agtctgatcc tagaaatcca aaggcctgtc ctcggaattg tgatggaaga 900 attgcctatg gaatttgccc actttcagaa gaaaagaaga atgatcggat atgcaccaat 960 tgttgcgcag gcaagaaggg ctgtaagtac tttagtgatg atggaacttt tatttgtgaa 1020 ggagaatctg aatatgccag caaagtggat gaatatgttg gtgaagtgga gaatgatctc 1080 cagaagtcta aggttgctgt ttcc 1104

【０１００】 <210> 2 <211> 1360 <212> DNA <213> Nicotiana alata <221> CDS <222> (97)...(1200) <400> 2 cgagtaagta tggctgttca cagagttagt ttccttgctc tcctcctctt atttggaatg 60 tctctgcttg taagcaatgt ggaacatgca gatgcc aag gct tgt acc tta aac 114 Lys Ala Cys Thr Leu Asn 1 5 tgt gat cca aga att gcc tat gga gtt tgc ccg cgt tca gaa gaa aag 162 Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys 10 15 20 aag aat gat cgg ata tgc acc aac tgt tgc gca ggc acg aag ggt tgt 210 Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys 25 30 35 aag tac ttc agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat 258 Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp 40 45 50 cct aga aat cca aag gct tgt acc tta aac tgt gat cca aga att gcc 306 Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala 55 60 65 70 tat gga gtt tgc ccg cgt tca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc 354 Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys 75 80 85 acc aac tgt tgc gca ggc acg aag ggt tgt aag tac ttc agt gat gat 402 Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp 90 95 100 gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aga aat cca aag gct 450 Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala 105 110 115 tgt cct cgg aat tgc gat cca aga att gcc tat ggg att tgc cca ctt 498 Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu 120 125 130 gca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc acc aac tgt tgc gca ggc 546 Ala Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly 135 140 145 150 aaa aag ggt tgt aag tac ttt agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa 594 Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu 155 160 165 gga gag tct gat cct aaa aat cca aag gcc tgt cct cgg aat tgt gat 642 Gly Glu Ser Asp Pro Lys Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp 170 175 180 gga aga att gcc tat ggg att tgc cca ctt tca gaa gaa aag aag aat 690 Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn 185 190 195 gat cgg ata tgc acc aac tgc tgc gca ggc aaa aag ggt tgt aag tac 738 Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr 200 205 210 ttt agt gat gat gga act ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aaa 786 Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys 215 220 225 230 aat cca aag gct tgt cct cgg aat tgt gat gga aga att gcc tat ggg 834 Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly 235 240 245 att tgc cca ctt tca gaa gaa aag aag aat gat cgg ata tgc aca aac 882 Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn 250 255 260 tgt tgc gca ggc aaa aag ggc tgt aag tac ttt agt gat gat gga act 930 Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr 265 270 275 ttt gtt tgt gaa gga gag tct gat cct aga aat cca aag gcc tgt cct 978 Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Pro 280 285 290 cgg aat tgt gat gga aga att gcc tat gga att tgc cca ctt tca gaa 1026 Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu 295 300 305 310 gaa aag aag aat gat cgg ata tgc acc aat tgt tgc gca ggc aag aag 1074 Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys 315 320 325 ggc tgt aag tac ttt agt gat gat gga act ttt att tgt gaa gga gaa 1122 Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Ile Cys Glu Gly Glu 330 335 340 tct gaa tat gcc agc aaa gtg gat gaa tat gtt ggt gaa gtg gag aat 1170 Ser Glu Tyr Ala Ser Lys Val Asp Glu Tyr Val Gly Glu Val Glu Asn 345 350 355 gat ctc cag aag tct aag gtt gct gtt tcc taagtcctaa ctaataatat 1220 Asp Leu Gln Lys Ser Lys Val Ala Val Ser 360 365 gtagtctatg tatgaaacaa aggcatgcca atatgctctg tcttgcctgt aatctgtaat 1280 atggtagtgg agcttttcca ctgcctgttt aataagaaat ggagcactag tttgttttag 1340 ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1360

【０１０１】 <210> 3 <211> 368 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 3 Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys 1 5 10 15 Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys 20 25 30 Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Thr Leu Asn 50 55 60 Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys 65 70 75 80 Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys 85 90 95 Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp 100 105 110 Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala 115 120 125 Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ala Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys 130 135 140 Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp 145 150 155 160 Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys Asn Pro Lys Ala 165 170 175 Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu 180 185 190 Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly 195 200 205 Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu 210 215 220 Gly Glu Ser Asp Pro Lys Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp 225 230 235 240 Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn 245 250 255 Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr 260 265 270 Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg 275 280 285 Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly 290 295 300 Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn 305 310 315 320 Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr 325 330 335 Phe Ile Cys Glu Gly Glu Ser Glu Tyr Ala Ser Lys Val Asp Glu Tyr 340 345 350 Val Gly Glu Val Glu Asn Asp Leu Gln Lys Ser Lys Val Ala Val Ser 355 360 365

【０１０２】 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 4 Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys 1 5 10 15 Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn 20

【０１０３】 <210> 5 <211> 58 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 5 Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr 1 5 10 15 Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg 20 25 30 Asn Pro Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly 35 40 45 Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn 50 55

【０１０４】 <210> 6 <211> 58 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 6 Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr 1 5 10 15 Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg 20 25 30 Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly 35 40 45 Ile Cys Pro Leu Ala Glu Glu Lys Lys Asn 50 55

【０１０５】 <210> 7 <211> 58 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 7 Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr 1 5 10 15 Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly 35 40 45 Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn 50 55

【０１０６】 <210> 8 <211> 58 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 8 Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr 1 5 10 15 Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly 35 40 45 Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn 50 55

【０１０７】 <210> 9 <211> 58 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 9 Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr 1 5 10 15 Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg 20 25 30 Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly 35 40 45 Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn 50 55

【０１０８】 <210> 10 <211> 54 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 10 Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr 1 5 10 15 Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Ile Cys Glu Gly Glu Ser Glu Tyr Ala 20 25 30 Ser Lys Val Asp Glu Tyr Val Gly Glu Val Glu Asn Asp Leu Gln Lys 35 40 45 Ser Lys Val Ala Val Ser 50

【０１０９】 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 11 Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly 1 5 10

【０１１０】 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 12 Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly 1 5 10

【０１１１】 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 13 Lys Ala Cys Thr Leu Asn 1 5

【０１１２】 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Nicotiana alata <400> 14 Glu Glu Lys Lys Asn 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１−１】 ｐＮＡ−ＰＩ−２挿入物の核酸配列（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびニコチアナ・アラタＰＩタ
ンパク質の対応アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３）
を示す。該アミノ酸配列は、成熟タンパク質の最初のア
ミノ酸を１としてナンバーを付してある。シグナル配列
はヌクレオチド１〜９７によりコードされており、これ
らアミノ酸残基にはマイナスの番号を付してある。イン
ヒビターの反応部位残基は囲ってある。

【図１−２】 図１−１の続き。

【図１−３】 図１−２の続き。

【図１−４】 図１−３の続き。

【図１−５】 図１−４の続き。

【図２】 ニコチアナ・アラタの種々の器官からのＲＮ
Ａのゲルブロット分析を示す写真表示である。ニコチア
ナ・アラタの器官およびニコチアナ・タバクム（Ｎ.tab
acum）およびニコチアナ・シルベストリス（Ｎ.sylvest
ris）の柱頭および花柱から単離したＲＮＡのゲルブロ
ットは、ｃＤＮＡクローンＮＡ−ＰＩ−２とハイブリダ
イズした。Ｓｔ、柱頭および花柱；Ｏｖ、子房；Ｐｏ、
花粉；Ｐｅ、花弁；Ｓｅ、萼片；Ｌ、傷のない葉；Ｌ
４、傷から４時間後の葉；Ｌ２４、傷から２４時間後の
葉；Ｎｔ、ニコチアナ・タバクムの柱頭および花柱；Ｎ
ｓ、ニコチアナ・シルベストリスの柱頭および花柱；Ｎ
ａ、ラムダ−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片。

【図３】 柱頭および花柱でのＮＡ−ＰＩ−２に相同な
ＲＮＡのインシトゥ局在を示す写真表示である。（ａ）
³²Ｐ標識したＮＡ−ＰＩ−２ ｃＤＮＡプローブとハイ
ブリダイズさせた後の１ｃｍ長の芽の柱頭および花柱の
縦方向の凍結切片の放射能写真；（ｂ）トルイジンブル
ーで染色した（ａ）と同じ切片。ｃ、皮層；ｖ、維管
束；ｔｔ、導管；ｓ、柱頭組織。

【図４】 ニコチアナ・アラタのゲノムＤＮＡのゲルブ
ロット分析を示す写真表示である。制限酵素ＥｃｏＲＩ
またはＨｉｎｄIIIで消化し放射性標識したＮＡ−ＰＩ
−２でプローブしたニコチアナ・アラタゲノムＤＮＡの
ゲルブロット分析。サイズマーカー（ｋｂ）は、ラムダ
−ＤＮＡのＨｉｎｄIII制限断片である。

【図５】 ニコチアナ・アラタの種々の器官におけるＰ
Ｉ活性のグラフ表示である。種々の器官からの緩衝液溶
解性の抽出物について、トリプシンおよびキモトリプシ
ンを抑制する能力を試験した。柱頭および萼片抽出物
が、トリプシン（Ａ）およびキモトリプシン（Ｂ）の両
方に対する最も有効なインヒビターであった。

【図６】 ニコチアナ・アラタの柱頭からのＰＩ精製の
工程を示す。（ａ）柱頭抽出物からの硫酸アンモニウム
沈殿したタンパク質のセファデックスＧ−５０ゲル濾過
クロマトグラフィー。ＰＩ活性はプロフィールの後期に
溶出した。（ｂ）ゲル濾過カラムからのフラクションの
２０％ｗ／ｖ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（レム
リ（Ｌaemmli）、１９７０）。ゲルを銀染色し、分子量
マーカー（ファルマシアペプチドマーカー）はキロダル
トンにて示す。約６ｋＤのタンパク質（矢印）がプロテ
イナーゼインヒビター活性とともに溶出した。（ｃ）精
製手順の種々の段階でのＰＩ含有フラクションのＳＤＳ
−ＰＡＧＥによる分析。レーン１、粗製の柱頭抽出物
（５μｇ）；レーン２、８０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム
により沈殿させた柱頭タンパク質（５μｇ）；レーン
３、キモトリプシンアフィニティーカラムから溶出した
ＰＩタンパク質（１μｇ）。

【図７】 ニコチアナ・アラタ（ａ）およびジャガイモ
（ｂ）およびトマト（ｃ）ＰＩIIｃＤＮＡからのＮＡ−
ＰＩ−２クローンによりコードされるＰＩタンパク質の
ハイドロパシー（hydropathy）プロットを示すグラフ表
示である。線よりも上にある値は疎水性の領域を示し、
線よりも下の値は親水性の領域を示す。推定シグナルペ
プチドには陰影を施してある。疎水性プロフィールは、
カイト（Kyte）およびドゥーリトル（Doolittle）（１
９８２）の予測則および９の連続アミノ酸の連なりを用
いて作成した。

【図８】 生育中の花の柱頭中のＰＩタンパク質のイム
ノブロット分析を示す。 （ａ）ニコチアナ・アラタの生育中の花。 （ｂ）（ａ）に示す生育の各段階における柱頭タンパク
質のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、５μｇの各抽出物を負荷
した。ペプチドゲルを銀染色し、分子量マーカー（ＬＫ
Ｂ・ロー・モレキュラー・ウエイト（ＬＫＢ Low Molec
ular weight）およびファルマシアペプチドマーカー）
はキロダルトンで示してある。 （ｃ）抗ＰＩ抗血清でプローブした（ｂ）と同じゲルの
イムノブロット。

【図９】 ニコチアナ・アラタからの６ｋＤプロテイナ
ーゼインヒビター種の分離および同定を示す。（Ａ）逆
相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる６ｋＤＰＩの分
離。（Ｂ）ＰＩ前駆体タンパク質から得られた５つの相
同なペプチド：Ｃ１、キモトリプシンインヒビター、Ｔ
１〜Ｔ４、トリプシンインヒビター。太線は、これらイ
ンヒビターの反応部位を示す。前駆体タンパク質は、シ
グナル配列を除いて描写してある。図中点線部は、６つ
の繰り返しドメインの領域（アミノ酸１〜３４３、図
１）。図中斜線部は、非繰り返し配列（アミノ酸３４４
〜３６８、図１）。矢印は、前駆体タンパク質における
プロセシング部位を示す。 （Ｃ）ｃＤＮＡクローンから予測され精製タンパク質の
Ｎ末端シークエンシングにより確認されたＣ１およびＴ
１〜Ｔ４のアミノ酸配列。

【図１０】 前駆体ＰＩタンパク質のプロセシング部位
の周辺のアミノ酸配列を示す。太字で示した配列は、精
製ＰＩタンパク質から得たアミノ末端配列である。マイ
ナスの番号を付した配列は、ｃＤＮＡクローンから予測
されるフランキング配列である。予測された前駆体タン
パク質は、この配列の６つの繰り返しを含む。

【図１１】 バクロウイルス発現系で生成されたＰＩ前
駆体（Ａ）、およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎに
よるアフィニティー精製ＰＩ前駆体（Ｂ）の消化後に得
られた生成物を示す。

【図１２】 Ａｓｐ−Ｎ消化により前駆体から得られた
ペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分取クロマトグラフィー
を示す。

【図１３】 柱頭からのＰＩ前駆体、ＰＩペプチド、該
ＰＩ前駆体からインビトロで生成したＰＩペプチドのト
リプシンおよびキモトリプシン抑制活性の比較を示す。

【図１４】 コントロールの人工食餌、ダイズバウマン
−バーク（Bowman−Birk）インヒビターおよびニコチア
ナ・アラタＰＩ上で飼育したテレオグリルス・コモデュ
ス（Ｔ.commodus）若虫の発育曲線を示すグラフ表示で
ある。縦軸は、各処置におけるコオロギの平均体重（＋
／−標準誤差）をｍｇで示す。横軸は週を示す。ニコチ
アナ・アラタＰＩで飼育したコオロギは、実験を通じて
コントロールの食餌およびダイズインヒビターを含有す
る食餌で飼育した両コオロギに比べて低平均体重を示し
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロビン・ルイーズ・ヒース オーストラリア国ビクトリア3016ウイリア ムズタウン、ジョン・ストリート５番 (72)発明者 アドリアン・エリザベス・クラーク オーストラリア国ビクトリア3052パークビ ル、パーク・ドライブ35番

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 II型セリンプロテイナーゼインヒビター
   （ＰＩ）前駆体またはそのモノマーをコードするかまた
   は該コード配列に相補的な配列をコードするヌクレオチ
   ドの配列を含む核酸分子を含む遺伝子構築物を有するト
   ランスジェニック植物であって、該核酸分子は、ＳＥＱ
   ＩＤ ＮＯ：１に示すヌクレオチドの配列を含むかまた
   は該配列中の等価数の繰り返しドメインに対して少なく
   とも６０〜６５％のヌクレオチド類似性を有する配列を
   含むかまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に相補的な配列に高
   厳格条件下でハイブリダイズすることのできる配列を含
   み、該前駆体は少なくとも３つのＰＩモノマーを含み、
   これら３つのモノマーのうち少なくとも一つはキモトリ
   プシン特異的な部位を有し、これら３つのモノマーの残
   りの少なくとも一つはトリプシン特異的な部位を有し、
   該遺伝子構築物はさらに該核酸分子の発現を可能とする
   発現手段、植物細胞中での複製を可能とする複製手段、
   または植物細胞ゲノム中への該核酸分子の安定な組み込
   みを可能とする組み込み手段を含むことを特徴とするト
   ランスジェニック植物。
2. 【請求項２】 図１に示すアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
   ＮＯ：３）のアミノ酸残基２５〜８２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
   Ｏ：５）；アミノ酸残基８３〜１４０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
   Ｏ：６）；アミノ酸残基１４１〜１９８（ＳＥＱ ＩＤ
   ＮＯ：７）；アミノ酸残基１９９〜２５６（ＳＥＱ Ｉ
   Ｄ ＮＯ：８）；アミノ酸残基２５７〜３１４（ＳＥＱ
   ＩＤ ＮＯ：９）；およびアミノ酸残基３１５〜３６８
   （ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１０）よりなる群から選ばれた１
   または２以上のＰＩモノマーを産生する請求項１に記載
   のトランスジェニック植物。
3. 【請求項３】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配
   列のアミノ酸残基１〜２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）か
   らなるＰＩモノマーを産生する請求項１に記載のトラン
   スジェニック植物。
4. 【請求項４】 昆虫または他の病原体の侵入に対する植
   物の抵抗性を増加、促進または他の仕方で容易にする方
   法であって、該植物の細胞または細胞群に核酸分子を導
   入し、該細胞から植物を再生し、該病原体の増殖および
   ／または侵入を抑制することのできるセリンプロテイナ
   ーゼインヒビター（ＰＩ）またはその前駆体への該核酸
   分子の発現を可能とするに充分な時間および条件で該植
   物を生育させることを含み、該核酸分子は、植物からの
   II型セリンＰＩ前駆体をコードするかまたは該コード配
   列に相補的な配列をコードするヌクレオチドの配列を含
   み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すヌクレオチドの配列を
   含むかまたは該配列中の等価数の繰り返しドメインに対
   して少なくとも６０〜６５％のヌクレオチド類似性を有
   する配列を含むかまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に相補的
   な配列に高厳格条件下でハイブリダイズすることのでき
   る配列を含み、該前駆体は少なくとも３つのＰＩモノマ
   ーを含み、該モノマーの少なくとも一つはキモトリプシ
   ン特異的な部位を有し、該モノマーの残りの少なくとも
   一つはトリプシン特異的な部位を有する核酸単離物であ
   ることを特徴とする方法。
5. 【請求項５】 昆虫または他の病原体の侵入に対する植
   物の抵抗性を増加、促進または他の仕方で容易にする方
   法であって、該植物の細胞または細胞群に核酸分子を導
   入し、該細胞から植物を再生し、該病原体の増殖および
   ／または侵入を抑制することのできるセリンプロテイナ
   ーゼインヒビター（ＰＩ）またはその前駆体への該核酸
   分子の発現を可能とするに充分な時間および条件で該植
   物を生育させることを含み、該核酸分子は、キモトリプ
   シン特異的な部位かまたはトリプシン特異的な部位のい
   ずれかを有する単一のII型セリンＰＩをコードするかま
   たは該コード配列に相補的な配列をコードするヌクレオ
   チドの配列を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すヌクレ
   オチドの配列を含むかまたは該配列中の等価数の繰り返
   しドメインに対して少なくとも６０〜６５％のヌクレオ
   チド類似性を有する配列を含むかまたはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
   Ｏ：１に相補的な配列に高厳格条件下でハイブリダイズ
   することのできる配列を含み、該ＰＩは少なくとも３つ
   のモノマーを有する前駆体ＰＩの一つのモノマーであ
   り、これら少なくとも３つのモノマーのうち少なくとも
   一つはキモトリプシン部位を有し、残りがトリプシン部
   位を有する核酸単離物であることを特徴とする方法。
6. 【請求項６】 昆虫または他の病原体の侵入に対する植
   物の抵抗性を増加、促進または他の仕方で容易にする方
   法であって、該植物の細胞または細胞群に核酸分子を導
   入し、該細胞から植物を再生し、該病原体の増殖および
   ／または侵入を抑制することのできるセリンプロテイナ
   ーゼインヒビター（ＰＩ）またはその前駆体への該核酸
   分子の発現を可能とするに充分な時間および条件で該植
   物を生育させることを含み、該核酸分子は、ＳＥＱ Ｉ
   Ｄ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
   Ｏ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
   ８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
   ０から選ばれたペプチドをコードするヌクレオチド配列
   を含むことを特徴とする方法。