JP4113952B2 - 機能性植物、その機能性植物を生産するために使用されるプロモーター、ならびにその利用法 - Google Patents

Description

技 術 分 野
本発明は、機能性植物、その機能性植物を生産するために使用されるプロモーター、ならびにその利用法に関する。詳細には、ｃＤＮＡライブラリーのデータベースを利用して特異的プロモーターを得ることにより機能性植物を作製する方法に関する。
背 景 技 術
遺伝子工学が発展する中、トランスジェニック植物を作製するための種々の方法が開発されている。トランスジェニック植物において特定の遺伝子を特異的に発現させるためには、発現を促進するためのプロモーターのような遺伝エレメントをその特定の遺伝子に作動可能に連結させた混合物を形質転換などにより植物に導入することが必要である。
植物における遺伝子発現を調節するプロモーターは、植物遺伝子工学の必須エレメントである。植物における選択された遺伝子の発現に有用なプロモーターがが種々存在する（ＢＥＮＦＥＹ Ｐ Ｎ；ＲＥＮ Ｌ；ＣＨＵＡ Ｎ−Ｈ，ＥＭＢＯ Ｊ，９（６）．１９９０．１６８５−１６９６．，１９９０）。プロモーター領域の特定は、当該分野で周知の方法に基づいて実施され得る。簡単に述べると、プロモーター領域の候補配列およびレポーター遺伝子（例えば、ＧＵＳ遺伝子）を作動可能に連結した発現カセットを構築する。構築した発現カセットを用いて適切な植物細胞を形質転換し、形質転換細胞を植物に再分化する。形質転換植物におけるレポーター遺伝子の発現を、適切な検出系（例えば、色素染色）を利用して検出する。検出結果に基づいて、プロモーター領域およびその発現特性を確認し得る。
細胞（例えば、植物細胞）において遺伝子を発現させるためには、その遺伝子は、通常細胞においてある酵素によって認識されるプロモーターに作動可能に連結されなければならない。プロモーターまたは転写調節領域といわれる、通常遺伝子の５’非コード領域（すなわち、コード領域のすぐ５’の領域）に存在する領域は、ｍＲＮＡ転写物を産生するために遺伝子の転写を開始させる。次いで、ｍＲＮＡは、コードされたポリペプチドを得るために、細胞のリボソームで翻訳される。
プロモーターは、代表的には、約５００〜１５００塩基を含み、そしてその制御下で遺伝子の調節された発現を提供し得る。トランスジェニック植物における異種遺伝子または遺伝子の選択された配列の発現には、代表的には、構成的プロモーター、すなわち、常時かつほとんどの組織に植物全体において産物の発現を誘導するプロモーターが使用されている。
植物において選択された遺伝子を発現するためにウイルス由来のプロモーターが利用されている。そのようなプロモーターを有する既知のウイルス遺伝子の例としては、ウイルスのカリモウイルスファミリー（二本鎖ＤＮＡウイルスの１群）で見いだされるものが挙げられ、そしてカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ（Ｂａｌａｚｓら，１９８２；Ｇｕｉｌｌｅｙら，１９８２；Ｏｄｅｌｌら，１９８５；Ｏｄｅｌｌら，１９８７；Ｏｄｅｌｌら，１９８８；ＴＯｍｍｅｒｕｐら，１９９０；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，１９８７ａ；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，１９８７ｂ）およびＣａＭＶ １９Ｓプロモーター（Ｆｒａｌｅｙら，１９９４）、およびゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）（Ｒｏｇｅｒｓ，１９９５）プロモーターが挙げられる。
植物における遺伝子発現を調節するために有用でありそして細菌供給源から得られるプロモーター、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来プロモーターもまた同定および単離されている。このようなプロモーターには、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔ−ＤＮＡオパインシンターゼ遺伝子に由来するものが挙げられ、そしてノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーター（Ｒｏｇｅｒｓ，１９９１）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）プロモーター（ＬｅｉｓｎｅｒおよびＧｅｌｖｉｎ，１９８８）、およびマンノピンシンターゼ（ｍａｓ）プロモーターが挙げられる。
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは高発現系でも弊害が多い。構成的に高発現つまりあらゆる組織で常に遺伝子産物を多量に生産しつづけていることから植物個体内部の限りある代謝産物を不必要に無用の組織で浪費する結果となり、生育量の低下や収量性の減少が生じる恐れがある。構成的な高発現により利用可能部位において遺伝子産物が蓄積していることに対する消費者の不信感は大きく、また構成的な高発現は植物体内におけるサイレンシング機構の誘導を招く恐れがある。
その上構成的発現を提供するために効果的な植物プロモーター（植物供給源に由来するプロモーター）でさえ、ほとんど知られていない。わずかな例としては、ｈｓｐ８０、カリフラワーに由来する熱ショックタンパク質８０（ＢｒｕｎｋｅおよびＷｉｌｓｏｎ，１９９３）、およびトマトユビキチンプロモーター（Ｐｉｃｔｏｎら，１９９３）が挙げられる。これらのプロモーターは、形質転換された植物組織において異種核酸配列の構成的発現を導くために使用され得るが、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターと同様に、構成的に高発現つまりあらゆる組織で常に遺伝子産物を多量に生産しつづけていることから植物個体内部の限りある代謝産物を不必要に無用の組織で浪費する結果となり、生育量の低下や収量性の減少が生じる恐れがあるという問題がある。構成的な高発現により利用可能部位において遺伝子産物が蓄積していることに対する消費者の不信感は大きく、また構成的な高発現は植物体内におけるサイレンシング機構の誘導を招く恐れがある。
従って、従来のプロモーターでは、所望の機能的発現を実現するトランスジェニック植物を作製することは困難である。
（発明が解決しようとする課題）
従って、本発明は、機能性植物の作製を行うことを課題とし、特に、所望の遺伝子を植物の所望の部位に任意に発現させるための系を構築することを課題とする。
（配列表の説明）
配列番号１は、ＣＧ００６０＿１由来のクローンのプロモーター領域である。
配列番号２は、ＥＢ００８２＿２由来のクローンのプロモーター領域である。
配列番号３は、ＲＡ１５８３＿１由来のクローンのプロモーター領域である。
配列番号４は、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒのアダプタープライマーである。
配列番号５は、実施例４のアダプタープライマー配列の一部および制限酵素認識配列を含むプライマーである。
配列番号６は、実施例４の翻訳開始点直前の配列および制限酵素認識配列を含むプライマーである。
配列番号７は、ＣＧ００６０＿１由来のクローンのプロモーター領域を含む両端に制限酵素認識配列を付加したプロモーターカセットである。
配列番号８は、実施例５で使用した、イネゲノム配列の一部および制限酵素認識配列を含むプライマーである。
配列番号９は、実施例５で使用した、翻訳開始点直前の配列および制限酵素認識配列を含むプライマーである。
配列番号１０は、ＥＢ００８２＿２由来のクローンのプロモーター領域を含む、両端に制限酵素認識配列を付加したプロモーターカセットである。
配列番号１１は、実施例６で使用した、翻訳開始点直前の配列および制限酵素認識配列を含むプライマーである。
配列番号１２は、ＲＡ１５８３＿１由来のクローンのプロモーター領域を含む、両端に制限酵素認識配列を付加したプロモーターカセットである。
発 明 の 要 旨
本発明は、ｃＤＮＡライブラリーデータベースにおける発現頻度に着目し、所望の発現頻度を有する遺伝子に含まれるプロモーターを単離し、所望の遺伝子とともにそのプロモーターを利用することで、所望の部位で所望の遺伝子産物を発現する機能性植物を作出することにより上記課題を解決した。
従って本発明は以下を提供する。
１．特異的発現を行う少なくとも１つのプロモーターおよび該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む、植物であって、該プロモーターの特異性は、該プロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおける該プロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される、植物。
２．前記遺伝子は、構成的に発現される、項目１に記載の植物。
３．前記遺伝子は、葉において特異的に発現される、項目１に記載の植物。
４．前記遺伝子は、カルスにおいて特異的に発現される、項目１に記載の植物。
５．イネである、項目１に記載の植物。
６．前記遺伝子は、病害抵抗性遺伝子または虫害抵抗性遺伝子である、項目１に記載の植物。
７．前記遺伝子は、ビタミン合成遺伝子、糖合成遺伝子、脂質合成遺伝子、ポリケチド合成遺伝子、光合成系遺伝子、機能性成分合成遺伝子および転写因子からなる群より選択される遺伝子である、項目１に記載の植物。
８．特異的発現を行うプロモーターであって、該プロモーターの特異性は、該プロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおける該プロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される、プロモーター。
９．果実における遺伝子の発現を駆動しない、項目８に記載のプロモーター。
１０．葉における遺伝子の発現を特異的に駆動する、項目８に記載のプロモーター。
１１．カルスにおける遺伝子の発現を特異的に駆動する、項目８に記載のプロモーター。
１２．特異的発現を行うプロモーターを含む発現カセットであって、該プロモーターの特異性は、該プロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおける該プロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される、発現カセット。
１３．構成的な遺伝子の発現を駆動する、項目１２に記載の発現カセット。
１４．葉における遺伝子の発現を特異的に駆動する、項目１２に記載の発現カセット。
１５．カルスにおける遺伝子の発現を特異的に駆動する、項目１２に記載の発現カセット。
１６．特異的発現を行う少なくとも１つのプロモーターおよび該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む植物から得られる植物の利用可能部位であって、該プロモーターの特異性は、該プロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおける該プロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される、植物の利用可能部位。
１７．葉、茎または果実である、項目１６に記載の利用可能部位。
１８．所望の遺伝子産物を生産する方法であって、該方法は、以下：
プロモーターの特異性を決定する工程であって、該プロモーターの特異性は、該プロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおける該プロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される、工程；
該プロモーターと該所望の遺伝子産物をコードする核酸分子とを作動可能に連結して連結混合物を作製する工程；
該連結混合物を植物に導入する工程；
該植物を生長させる工程；および
該植物中の該所望の遺伝子産物を収集する工程、
を包含する、方法。
１９．所望の遺伝子産物を特異的に発現する植物を生産する方法であって、該方法は、以下：
プロモーターの特異性を決定する工程であって、該プロモーターの特異性は、該プロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおける該プロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される、工程；
該プロモーターと該所望の遺伝子産物をコードする核酸分子とを作動可能に連結して連結混合物を作製する工程；
該連結混合物を植物に導入する工程；および
該植物を生長させる工程、
を包含する、方法。
２０．前記プロモーターの特異性は、ＤＮＡチップによる解析によって決定される、項目１９に記載の方法。
２１．項目１９に記載の方法によって得られる植物から得られる、遺伝子産物。
発 明 の 実 施 の 形 態
以下に本発明を詳説する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
本明細書において用いられる「機能性植物」とは、ある植物のある機能が、天然における状態の機能よりも、顕著（好ましくは、統計学的に有意に）変化（例えば、追加、増強、減少、消滅など）した植物をいう。ここで、植物の「機能」とは、植物の生理作用をいう。
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。
本明細書において、「プロモーター領域」とは、ある構造遺伝子配列付近の領域であって、プロモーター活性を有する領域をいう。「推定プロモーター領域」とは、ある構造遺伝子配列付近の領域であって、プロモーター活性を有すると考えられる領域をいう。推定プロモーター領域は、遺伝子の転写が開始される際にＲＮＡポリメラーゼが結合する遺伝子上流の塩基配列と推定される領域であり、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
本発明のプロモーターの配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、本発明のプロモーターと同一または類似の活性を有し得る。そのような活性は、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子をレポーター遺伝子として使うアッセイ、生化学的あるいは細胞組織学的な検定により確認することができる。そのようなアッセイは、当該分野における周知慣用技術に属することから（Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ５：３８７（１９８７）；Ｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：８５６（１９８６）；Ｓｈｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．８：７７７−７８４（１９９５））、当業者は何ら困難を伴わずに、本発明の配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含む核酸分子が本発明のプロモーターと同一または類似のあるいは実質的に同等以上の活性を有することを確認することができる。本明細書では、上記アッセイにおいて、検出誤差範囲内で同じプロモーター活性を有することが判定されたときに実質的に同等以上のプロモーター活性を有するという。
本発明のプロモーターの長さは、通常１０ヌクレオチド以上であるが、好ましくは、２０ヌクレオチド以上、３０ヌクレオチド以上、４０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、６０ヌクレオチド以上、７０ヌクレオチド以上、８０ヌクレオチド以上、９０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、１５０ヌクレオチド以上、２００ヌクレオチド以上、３００ヌクレオチド以上の長さであり得る。
本発明のプロモーターは、従来のプロモーター（例えば、ミニマムプロモーター（３５Ｓプロモーター由来の約８０塩基対からなるプロモーター（Ｈａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，７：８５９−８７６（１９９５）；Ｒｏｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１５：４３５−４４０（１９９８）；Ｗａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０：１−１２（１９９９））など）につなげて利用することができる。この場合、従来組織特異性を示さないまたは弱い特異性を示す、あるいは別の特異性を示すプロモーターであっても、本発明のプロモーターまたはその断片を付加することによって、根および／または茎頂に組織特異的に強く機能するプロモーターを作製することができる（Ｈａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，７：８５９−８７６（１９９５）；Ｒｏｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１５：４３５−４４０（１９９８）；Ｗａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０：１−１２（１９９９））。
本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、代表的には、細胞壁の形成・クロロフィルによる同化作用をもつ顕花植物をいうをいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられる。好ましい植物のほかの例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
本明細書において用いられる植物の「利用可能部位」とは、植物の部分であって、生物がその植物を摂取する場合にその生物が摂取することができる部分をいう。生物がヒトであり、植物がイネである場合、「利用可能部位」は「可食部」ともいい、通常利用可能部位は、米粒を含む。なお、白米として食される米粒における胚乳がイネにおける可食部といえる。米粒は、イネ種子の構成要素である穎・胚・胚乳・種皮のうち、胚および胚乳をさす。生物がウシであり植物がイネである場合、通常利用可能部位は根を除く植物体全体をさす。本明細書において、「果実」とは、子房が発達した器官果実内には受精した胚珠が発達して種子を形成する（イネ科の場合は特に穎果をいう）。本明細書において「種子」とは、胚珠が発達して形成される普遍的な散布体をいい、胚、胚乳および種皮からなる。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝の機能的単位をいい、通常染色体上の特定の部位（座）を占める。遺伝子は通常、細胞分裂において正確に自分を複製することができ、酵素などの他のタンパク質の合成を支配する。機能単位としての遺伝子は，ＤＮＡの巨大分子の不連続的な分節からなっており，このＤＮＡ分子は，特定のペプチドのアミノ酸配列をコードする正しい配列の塩基（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）を含む。遺伝子は、通常ＤＮＡによってその情報が記載されるが、ＲＮＡにより記載されることもある。上述のように通常遺伝子は、染色体中に存在し、すべての染色体は、例えば、ヒトの雄の性染色体（ＸとＹ）を除いて対になっていることから、遺伝子は通常、配偶子を除くすべての細胞中に対になって存在し、植物でも同様である。遺伝子は、通常、タンパク質をコードする領域（エキソン）のほか、エキソンの間に存在するイントロン、第１エキソン上流の発現制御領域（プロモーター領域）、タンパク質コード領域の下流領域を含む。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。従って、この場合、「このプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結される」とは、そのプロモーターがその遺伝子の発現を制御し得る限り、どのような相対的位置関係であってもよい。
本明細書において、植物における遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、植物の部位（例えば、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実など）におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、植物の生長段階（例えば、発芽後の芽生えの日数）に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。「ストレス応答性」とは、植物に与えられた少なくとも一種のストレスに対して、その遺伝子の発現が変化することをいう。
本明細書において使用される「ｃＤＮＡデータベース」は、植物の組織から抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、大規模クローニングを行って配列決定したものをデータベース化したものをいう。イネゲノムプロジェクトにおいては、ベンジルアデニン処理カルス、ジベレリン処理カルス、ヒートショック処理カルス、増殖期カルス、幼根、幼緑葉、幼黄化葉、開花期穂よりそれぞれ抽出したｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリを作製し、ランダムに塩基配列を決定したものである。ｃＤＮＡデータベースの発現頻度は、使用したサンプル個数のうち、実際に発現した個数の割合を計算することによって算出される。ｃＤＮＡデータベースとしては、イネゲノムプロジェクトのようなゲノム計画において公表されたデータベースに基づいて作成したものが挙げられる。
発現頻度に基づいて決定されたプロモーターの特異性は、そのプロモーターを含有する遺伝子を含むｃＤＮＡデータベースにおけるそのプロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に依存する。従って、本発明において用いられるプロモーターの特異性は、そのプロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおけるそのプロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定されることになる。
このように、本明細書の記載に基づけば、当業者であれば、所望の遺伝子に所望の発現特性を付与することが可能であり、所望の遺伝子が所望の特異性をもって発現する植物を作出することができる。
本明細書において、導入された遺伝子が「発現されない」とは、その遺伝子がまったく発現されないか、またはその導入された遺伝子の宿主に実質的に影響を与えない程度で発現されることをいう。実質的に影響を与えない程度で発現される代表例としては、例えば、政府機関が定める基準以下で発現されることが挙げられる。
本明細書において、ある因子が遺伝子の発現を「駆動する」（ｄｒｉｖｅ）とは、その遺伝子がその因子の制御下に置かれることによりその遺伝子の発現が促進されることをいう。ある因子が遺伝子の発現を「駆動しない」とは、その遺伝子がその因子の制御下に置かれても、その遺伝子の発現がまったく促進されないか、またはその導入された遺伝子の宿主に実質的に影響を与えない程度で発現が促進されることをいう。ある因子が遺伝子の発現を駆動しない場合、その遺伝子は、例えば、政府機関が定める基準以下で発現される。
本発明のプロモーターは、その配列に類似する配列をも使用することができる。そのような配列は、ＦＡＳＴＡのような配列比較プログラムにより相同性を決定することによって選択することができ、また、ハイブリダイゼーションにより選択することもできる。
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔ_ｍ）より約５℃低く選択される。Ｔ_ｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、 第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。
一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ^＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ^＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
「ストレス」とは、植物に対して、物理的、化学的、生物学的に加えられ得る、植物の正常な生長を妨げる因子のことをいう。ストレスには、例えば、物理的ストレス（光、熱、冷却、凍結、紫外線、Ｘ線、切断、摩擦など）、化学的ストレス（酸素ストレス、化学物質、生理活性物質など）、生物学的なストレス（ウイルス、病原体（例えば、イモチ病菌）感染など）などが挙げられる。従って、本発明のプロモーターとしては、そのようなストレスに晒されたときに特異的に発現するものも含まれる。
本明細書において、本発明のプロモーターの発現が「構成的」であるとは、植物のすべての組織において、その植物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても発現がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある植物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「ストレス応答性」であるとは、少なくとも１つのストレスが植物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を「ストレス誘導性」といい、発現量が減少する性質を「ストレス減少性」という。「ストレス減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、植物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。
本明細書において「病害抵抗性」とは、植物の性質についていい、発病程度を減少させ得る能力をいう。本明細書において「虫害抵抗性」とは、植物の性質についていい、食害程度を減少させ得る能力をいう。本明細書において「病害特異的」とは、あるプロモーターが，病害が発生する場合に特異性を有することをいう。本明細書において、「虫害特異的」とは、あるプロモーターが、虫害が発生する場合に特異性を有することをいう。「薬剤耐性遺伝子」とは、その遺伝子産物が宿主において発現される場合に、宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子をいう。薬剤耐性遺伝子は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましく、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得る。
本発明のプロモーターは、単子葉植物だけでなく双子葉植物および他の生物の改変にも利用し得る。これは、両植物間で転写調節の基本的な機構が類似していることにより説明される。例えばトウモロコシのｚｅｉｎ遺伝子プロモーターがタバコで同じ組織特性で発現すること（Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，７：１２４９−１２５５（１９８８））、イネのグルテリン遺伝子プロモーターがタバコで同じ組織特性で発現すること（Ｌｅｉｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：４１−５０（１９８９））が報告されている。特に好ましい対象植物としては、イネのほか、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ソルガム、カンキツ類、白菜、レタス、タバコ、モモ、ジャガイモ、トマト、およびリンゴなどが挙げられる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。植物細胞に対する「組み換えベクター」としては、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等が例示される。発現カセットは、好ましくは、植物発現ベクターの形態が利用される。「植物発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子および、エンハンサーを含み得る。植物発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターはさらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは複数個用いられ得る。
植物発現ベクターの構築に用いるベクターとしては、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクターあるいはｐＴＲＡ系のベクターが好適に用いられ得る。ｐＢＩ系およびｐＴＲＡ系のベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的の遺伝子を導入し得る。ｐＢＩ系のバイナリーベクターまたは中間ベクター系が好適に用いられ得る。例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３などが挙げられる。これらのベクターは、植物に導入され得る領域（Ｔ−領域）の遺伝子と、マーカー遺伝子として植物プロモーターの支配下で発現されるｎｐｔＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）とを含む。ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入し得る。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９などが挙げられる。植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。
植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウムを介する方法および直接細胞に導入する方法、が用いられ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｎａｇｅｌら（１９９０）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物発現ベクターでエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＧｅｌｖｉｎら（Ｇｅｌｖｉｎら編（１９９４）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２７４−２７６；およびＲｈｏｄｅｓら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：２０４−２０７を参照のこと）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９６２を参照のこと）ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（Ｄａｔｔａら（１９９０）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４０を参照のこと）が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
植物発現ベクターを導入された細胞は、まずカナマイシン耐性などの薬剤耐性で選択される。次いで、当該分野で周知の方法により、植物組織、植物器官および／または植物体に再分化され得る。さらに、植物体から種子が取得され得る。導入した遺伝子の発現は、ノーザン法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、ウェスタンブロット法により確認し得る。
ベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、以下を用いた形質転換などが挙げられる：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等が例示される。
本発明のプロモーターによる発現の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法等が例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法等が例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法等が例示される。
「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、本発明のタンパク質またはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法等の免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンプロット法、ドットプロット法、ＰＣＲ法等の分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。発現量の絶対量または相対量を観察することにより、あるプロモーターが特異的に作用しているかどうかを検出することができる。
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。
本明細書において「再分化する」とは、個体の一部分から個体全体が復元される現象を意味する。例えば、再分化により、細胞および葉または根などの組織片から植物体が形成される。
形質転換体を植物体へと再分化する方法は当該分野において周知である。そのような方法としては、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８：６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；＿Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４（１９８９）；Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などが挙げられる。従って、当業者は、上記周知方法を目的とするトランスジェニック植物に応じて適宜使用して、再分化させることができる。
再分化した形質転換体が、所望の改変された特性を有することは、当該特性の種類に応じて適切なアッセイを行うことにより確認し得る。例えば、レポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子とプロモーターとを融合し、植物体に導入して形質転換体を作出し、ＧＵＳ活性の組織染色で検出することが可能である。ここでは、蛍光タンパク質であるＧＦＰの遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として使うことも可能である。これらはいずれも各種プロモーターのアッセイに使われている。詳細は下記実施例に記載される。また、ストレス耐性として病原性細菌に対する耐性の付与が意図される場合、再分化した植物体にモデル菌、例えばタバコ野火病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔａｂａｃｉ）を接種し、コントロールの植物体と比較して接種による変化の有無を観察することで、特性の変化を評価し得る。
本明細書では、植物の栽培は当該分野において公知の任意の方法により行うことができる。植物の栽培方法は、例えば、モデル植物の実験プロトコール−イネ・シロイヌナズナ編−」：細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４；イネの栽培法（奥野員敏）ｐｐ．２８−３２、およびアラビドプシスの栽培法（丹羽康夫）ｐｐ．３３−４０（監修 島本功、岡田清孝）に例示されており、本明細書では詳述しない。例えば、シロイヌナズナの栽培は土耕、ロックウール耕、水耕いずれでも行うことができる。白色蛍光灯（６０００ルクス程度）の下、恒明条件で栽培すれば播種後４週間程度で最初の花が咲き、開花後１６日程度で種子が完熟する。１さやで４０〜５０粒の種子が得られ、播種後２〜３ケ月で枯死するまでの間に１００００粒程度の種子が得られる。種子の休眠期間は短く、完熟種子は１週間程度乾燥させれば吸水後２〜３日で発芽する。ただし、吸水・播種後２〜４日間４℃で低温処理を行うと発芽が斉一化される。イネの栽培は主に土耕で行い、１００００ルクス以上の光条件下で生育させる。播種後４０日程度以後に短日条件とすることで出穂が誘導され、出穂誘導後３０日程度で開花し、開花後４０日程度で完熟種子が得られる。
本発明のプロモーターの発現解析は、ＤＮＡアレイを用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。また、ＤＮＡアレイを用いた植物の解析についても最近行われるようになっている（Ｓｃｈｅｎｋ ＰＭら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９７：１１６５５−１１６６０）。以下、ＤＮＡアレイおよびそれを使用する遺伝子分析方法を簡単に説明する。
「ＤＮＡアレイ」とは、ＤＮＡを基板上に整列（ａｒｒａｙ）させて、固定させたデバイスをいう。ＤＮＡアレイは、基盤の大きさまたは載せるＤＮＡの密度によって、ＤＮＡマクロアレイおよびＤＮＡマイクロアレイなどに分けられる。
マクロとマイクロとの境界は厳密に決まっているわけではないが、一般に、「ＤＮＡマクロアレイ」とは、メンブレン上にＤＮＡをスポットした高密度フィルター（ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒ）をいい、「ＤＮＡマイクロアレイ」とは、ガラス、シリコンなどの基板表面にＤＮＡを載せたものをいう。載せる種類によって、ｃＤＮＡアレイ、オリゴＤＮＡアレイなどがある。
高密度オリゴＤＮＡアレイのうち、半導体集積回路製造のための光リソグラフィー（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）技術を応用し、基板上で一度に複数種のオリゴＤＮＡを合成することで作製されたものを、半導体チップになぞらえて、特に「ＤＮＡチップ（ｃｈｉｐ）」という。この方法を用いて作製されたものとしては、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、ＣＡ）などが挙げられる（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ａら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２７−３１およびＲａｍｓａｙ Ｇら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６ ４０−４４を参照のこと）。好ましくは、本発明におけるマイクロアレイを用いた遺伝子解析においては、このＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）が用いられ得る。ＤＮＡチップは、狭義には上記のように定義されるが、ＤＮＡアレイまたはＤＮＡマイクロアレイ全体をいうこともある。
ＤＮＡマイクロアレイは、このように、ガラス基板上に数千〜数万またはそれを超える遺伝子ＤＮＡを高密度に配列したデバイスであることから、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって、遺伝子発現のプロファイルまたは遺伝子多型をゲノムスケールで解析することが可能となっている。この手法により、シグナル伝達系および／または転写制御経路の解析（Ｆａｍｂｒｏｕｇｈ Ｄら（１９９９），Ｃｅｌｌ ９７，７２７−７４１）、組織修復の機構の解析（Ｉｙｅｒ ＶＲら、（１９９９），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８３−８７）、医薬品の作用機構（Ｍａｒｔｏｎ ＭＪ、（１９９９），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１２９３−１３０１）、発生・分化の過程における遺伝子発現変動の広汎な解析、病態に伴って発現変動する遺伝子群の同定、またはシグナル伝達系もしくは転写制御に関与する新たな遺伝子の発見などが可能となってきた。また、遺伝子多型についても、多数のＳＮＰを１つのＤＮＡマイクロアレイで解析することが可能となっている（Ｃａｒｇｉｌｌ Ｍら、（１９９９），Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２：２３１−２３８）。
ＤＮＡマイクロアレイを用いたアッセイの原理を説明する。ＤＮＡマイクロアレイは、表面を適切に加工したスライドガラスのような固相基板上に多数の異なるＤＮＡプローブを高密度に固定して作製する。その後、標識した核酸（標的）を、適切なハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズさせ、各々のプローブからのシグナルを自動検出器で検出する。このデータをコンピュータで大量解析する。例えば、遺伝子モニタリングにおいては、オリゴＤＮＡまたはｃＤＮＡをプローブとしたマイクロアレイに、ｍＲＮＡから逆転写反応により蛍光標識を取り込ませた標的ｃＤＮＡをハイブリダイズさせて、蛍光イメージアナライザで検出する。この際、Ｔ７ポリメラーゼを用いてｃＲＮＡ合成反応を行ったり、酵素反応を介させたりと、他の種々のシグナル増幅反応も行い得る。
Ｆｏｄｏｒらは、コンビナトリアルケミストリと半導体製造用光リソグラフィ技術とを合わせて、基板上にポリマーを合成する技術を開発した（Ｆｏｄｏｒ ＳＰら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３）。これを、合成型ＤＮＡチップという。光リソグラフィでは、極めて微細な表面加工が可能なので、１０μｍ^２／ＤＮＡサンプルといった集積度の高いＤＮＡマイクロアレイを作製し得る。この方法では、一般に、ガラス基板上に２５〜３０程度のＤＮＡが合成され得る。
合成型ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現は、Ｌｏｃｋａｒｔらが報告している（Ｌｏｃｋａｒｔ ＤＪら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．：１４：１６７５−１６８０）。この方法では、合成され得る長さが短いため特異性が低いという本タイプのチップの欠点が解消された。ここでは、１つの遺伝子発現をみるために、十数か所に対応するパーフェクトマッチ（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ；ＰＭ）オリゴヌクレオチドプローブと、ＰＭプローブの中央の１塩基に変異を入れたミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ；ＭＭ）オリゴヌクレオチドプローブとを調製することで、この問題が解決された。ＭＭプローブは、ここでは、ハイブリダイゼーションの特異性の指標として用いられ、そしてＰＭプローブとＭＭプローブとのシグナル比から、遺伝子発現レベルが決定され得る。ＰＭプローブとＭＭプローブとのシグナル比が同等な場合は、クロスハイブリダイゼーションと呼び、有意なシグナルとは解釈されない。
いわゆる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイにおいては、スライドグラスにＤＮＡを貼り付けていくタイプのＤＮＡマイクロアレイを作製し、蛍光検出する（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎもまた参照のこと）。この方法では、大掛かりな半導体製造機は必要ではなく、ＤＮＡアレイ機および検出器があれば、研究室内でアッセイすることが可能である。この方法は、貼り付けるＤＮＡを選択することが可能であるという利点を有する。高密度化についても、例えば、直径１００μｍのスポットを１００μｍ間隔でスポットすれば、計算上１ｃｍ^２に２５００のＤＮＡをスポットすることが可能である。したがって、通常スライドグラス（有効面積は、およそ４ｃｍ^２）におよそ１万個のＤＮＡを載せ得る。
合成型ＤＮＡアレイにおける標識方法としては、例えば、二蛍光標識法が挙げられる。この方法では、２つの異なるｍＲＮＡサンプルをそれぞれ異なる蛍光で標識し、同一マイクロアレイ上で競合的ハイブリダイゼーションを行って、療法の蛍光を測定し、それを比較することで遺伝子発現の相違を検出する。蛍光色素としては、例えば、Ｃｙ５およびＣｙ３などが最も用いられているが、それらに限定されない。Ｃｙ３およびＣｙ５の利点は、蛍光波長の重なりが殆どないという点である。二蛍光標識法は、遺伝子発現の相違のみならず、変異または多型性を検出するためにも使用され得る。
ＤＮＡアレイを用いるアッセイにおいては、アレイ機が使用され得る。アレイ機は、基本的に、高性能サーボモーターと組み合わせて、コンピュータの制御下でピン先またはスライドホルダをＸＹＺ軸方向に作動し、マイクロタイタープレートからスライドグラス表面上にＤＮＡサンプルを運ぶ装置である。ピン先の形状には、種々の加工がなされている。例えば、烏口のように割れたペン先にＤＮＡ溶液を溜めて、複数のスライドガラスにスポットする方式である。洗浄・乾燥のサイクルを挟んで、次にＤＮＡサンプルを載せるという工程を繰り返す。ここで、サンプル同士の混入を防ぐためにも、ピン先の洗浄・乾燥を完全に行うことに注意する。このようなアレイ機としては、ＳＰＢＩＯ２０００（日立ソフトウェアエンジニアリング；１回打ち型）、ＧＭＳ４１７Ａｒｒａｙｅｒ（宝酒造；ピンリング型）、Ｇｅｎｅ Ｔｉｐ Ｓｔａｍｐｉｎｇ（日本レーザ電子；万年筆型）などが挙げられる。
ＤＮＡアレイを用いたアッセイに使用されるＤＮＡ固定法には種々の方法が存在する。基板の材質として、ガラスは、メンブレンと比較して有効固定面積が小さく、荷電量も少ないことから、種々のコーティングがなされている。実用的には、ポリＬ−リシンコートまたはシリル化などが行われている（Ｓｃｈｅｎａ Ｍら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０）、Ｓｃｈｅｎａ Ｍら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：１０６１４−１０６１９を参照のこと）。また、市販のＤＮＡマイクロアレイ専用コーティング済スライドガラス（例えば、ポリカルボジイミドガラス（日清紡）など）も使用され得る。オリゴＤＮＡの場合は、ＤＮＡ末端をアミノ化してシラン化ガラスに架橋する方法も利用可能である。
ＤＮＡマイクロアレイには、主に、ＰＣＲで増幅されたｃＤＮＡ断片が載せられ得る。ｃＤＮＡの濃度が充分ではない場合、シグナルを充分に検出し得ない場合が存在する。このように、一度のＰＣＲにおいて充分量のｃＤＮＡ断片が得られなかった場合には、ＰＣＲを何度か繰り返し、得られたＰＣＲ産物をまとめて精製・濃縮し得る。プローブｃＤＮＡは、一般的には、ｃＤＮＡをランダムに数多く載せるが、実験の目的によっては、選択された一群の遺伝子（例えば、本発明の遺伝子群またはプロモーター群）またはＲＤＡ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）で得られた発現変化候補遺伝子を載せ得る。クローンの重複は避けることが好ましい。クローンは、手持ちのｃＤＮＡライブラリーから調製してもよく、ｃＤＮＡクローンをまとめて入手してもよい。
ＤＮＡアレイを用いたアッセイにおいては、ＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズした蛍光シグナルを蛍光検出器等で検出する。このような検出器は、現在までに種々の検出器が利用可能である。例えば、スタンフォード大学のグループは、オリジナルスキャナを開発しており、このスキャナは、蛍光顕微鏡と稼動ステージとを組み合わせたものである（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎを参照のこと）。従来型のゲル用蛍光イメージアナライザであるＦＭＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング）、Ｓｔｏｒｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）などでも、スポットがそれほど高密度でなければ、ＤＮＡマイクロアレイの読み取りを行い得る。その他に利用可能な検出器としては、ＳｃａｎＡｒｒａｙ ４０００、同５０００（ＧｅｎｅｒａｌＳｃａｎｎｉｎｇ；スキャン型（共焦点型））、ＧＭＳ４１８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（宝酒造；スキャン型（共焦点型））、Ｇｅｎｅ Ｔｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ（日本レーザ電子；スキャン型（非共焦点型））、Ｇｅｎｅ Ｔａｃ ２０００（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；ＣＣＤカメラ型））などが挙げられる。
ＤＮＡマイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。
本発明のプロモーターおよび機能性植物はまた、ディファレンシャルディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）技術を用いた遺伝子解析でも解析することができる。
ディファレンシャルディスプレイ技術とは、発現変動する遺伝子を検出または同定するための方法である。この方法では、２つ以上のサンプルからｃＤＮＡをそれぞれ作製し、任意のプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅し、その後、生成された複数のＰＣＲ産物をゲル電気泳動により分離し、パターン化した後、各バンドの相対的なシグナル強度変化をもとに、発現変動遺伝子がクローニングされる。
本発明において利用されるデータベースは、ＤＮＡチップによって解析された結果を含み得る。また、ＤＮＡチップを用いて発現頻度を解析した結果に基づいて本発明のプロモーターの特異性を決定することができる。
好 ま し い 実 施 の 形 態 の 説 明
１つの局面において、本発明は、機能性植物を提供する。この機能性植物は、特異的発現を行う少なくとも１つのプロモーターおよび該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む。本発明の機能性植物におけるプロモーターの特異性は、そのプロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおけるそのプロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される。発現頻度の解析方法は当該分野において周知であり上述したとおりである。
１つの実施形態において、本発明の機能性植物において用いられる遺伝子は、果実において発現されない。別の実施形態において、その遺伝子は、葉において特異的に発現される。他の実施形態において、その遺伝子は、カルスにおいて特異的に発現される。
本発明の機能性植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得る。１つの実施形態において、本発明の機能性植物は、単子葉植物であり得る。１つの好ましい実施形態において、本発明の機能性植物は、穀物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガム）であり得る。より好ましくは、本発明の機能性植物は、イネである。他の好ましい実施形態において、本発明の機能性植物は、食用または嗜好用の作物（例えば、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴ）であり得る。別の実施形態において、本発明の機能性植物は、観賞用の植物（例えば、バラのような花を観賞する植物（ペチュニア、カーネーション、キク、トルコキキョウ、トレニア）、松のような木）であり得る。
他の実施形態において、本発明において利用される遺伝子は、病害抵抗性遺伝子または虫害抵抗性遺伝子（例えば、ディフェンシン、ソマチン、キチナーゼ、Ｂｔ、オリザシスタチン）であり得る。
本発明の好ましい実施形態において、本発明において利用される遺伝子は、ビタミン合成遺伝子、糖合成遺伝子、脂質合成遺伝子、ポリケチド合成遺伝子，光合成遺伝子、機能性成分合成遺伝子および転写因子からなる群より選択される遺伝子であり得る。
別の局面において、本発明は、特異的発現を行うプロモーターに関する。このプロモーターの特異性は、そのプロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおけるそのプロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される。
１つの実施形態において、本発明のプロモーターは、果実における遺伝子の発現を駆動しない。別の実施形態において、本発明のプロモーターは、葉における遺伝子の発現を特異的に駆動する。他の実施形態において、本発明のプロモーターは、カルスにおける遺伝子の発現を特異的に駆動する。さらに別の実施形態において、本発明のプロモーターは、利用可能部位においてのみ特異的に遺伝子の発現を駆動する。さらに別の実施形態において、本発明のプロモーターは、茎に特異的に遺伝子の発現を駆動する。さらに別の実施形態において、本発明のプロモーターは、花において特異的に遺伝子の発現を駆動する。さらに別の実施形態において、本発明のプロモーターは、果実において特異的に遺伝子の発現を駆動する。さらに別の実施形態において、本発明のプロモーターは、種子において特異的に遺伝子の発現を駆動する。
他の局面において、本発明は、特異的発現を行うプロモーターを含む発現カセットを提供する。このプロモーターの特異性は、該プロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおける該プロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される。
１つの実施形態において、本発明の発現カセットは、果実における遺伝子の発現を駆動しない。別の実施形態において、本発明の発現カセットは、葉における遺伝子の発現を特異的に駆動する。他の実施形態において、本発明の発現カセットは、カルスにおける遺伝子の発現を特異的に駆動する。さらに別の実施形態において、本発明の発現カセットは、利用可能部位においてのみ特異的に遺伝子の発現を駆動する。さらに別の実施形態において、本発明の発現カセットは、根に特異的に遺伝子の発現を駆動する。さらに別の実施形態において、本発明の発現カセットは、茎に特異的に遺伝子の発現を駆動する。さらに別の実施形態において、本発明の発現カセットは、花において特異的に遺伝子の発現を駆動する。さらに別の実施形態において、本発明の発現カセットは、果実において特異的に遺伝子の発現を駆動する。さらに別の実施形態において、本発明の発現カセットは、種子において特異的に遺伝子の発現を駆動する。
他の局面において、本発明は、特異的発現を行う少なくとも１つのプロモーターおよびそのプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む植物から得られる植物の利用可能部位を提供する。このプロモーターの特異性は、該プロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおける該プロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される。好ましくは、利用可能部位は葉または果実であり得る。好ましい実施形態において、このプロモーターは、利用可能部位での発現をさせない。この場合、その遺伝子は、病害抵抗性遺伝子または虫害抵抗性遺伝子であり得る（例えば、ディフェンシン、ソマチン、キチナーゼ、Ｂｔ、オリザシスタチン）。１つの実施形態において、このプロモーターは、利用可能部位で特異的に発現を駆動する。この場合、その遺伝子は、ビタミン合成遺伝子、糖合成遺伝子、脂質合成遺伝子、ポリケチド合成遺伝子、光合成系遺伝子、機能性成分合成遺伝子および転写因子からなる群より選択される遺伝子であり得る。
別の局面において、本発明は、所望の遺伝子産物を特異的に発現する植物を生産する方法を提供する。この方法は、以下：
プロモーターの特異性を決定する工程であって、そのプロモーターの特異性は、そのプロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおけるそのプロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される、工程；
そのプロモーターとその所望の遺伝子産物をコードする核酸分子とを作動可能に連結して連結混合物を作製する工程；
その連結混合物を植物に導入する工程；および
その植物を生長させる工程、
を包含する。
本発明はまた、所望の遺伝子産物を生産する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：
プロモーターの特異性を決定する工程であって、該プロモーターの特異性は、該プロモーターを含有する遺伝子が含まれるｃＤＮＡデータベースにおける該プロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定される、工程；
該プロモーターと該所望の遺伝子産物をコードする核酸分子とを作動可能に連結して連結混合物を作製する工程；
該連結混合物を植物に導入する工程；
該植物を生長させる工程；および
該植物中の該所望の遺伝子産物を収集する工程。
１つの実施形態において、このプロモーターの特異性は、ＤＮＡチップによる解析によって決定され得る。
１つの局面において、本発明は、本発明の方法によって得られる、遺伝子産物を提供する。遺伝子産物としては、抗生物質などの医薬品、ポリペプチド、タンパク質などが挙げられる。遺伝子の二次代謝産物もまた、本発明の方法によって得られ得る。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも実施例のみにも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
実 施 例
（実施例１：ｃＤＮＡライブラリーを利用した特異的プロモーターの同定）
（イネ組織からのＲＮＡの抽出）
以下のイネ組織からＲＮＡを抽出した：ベンジルアデニン処理カルス、ジベレリン処理カルス、ヒートショック処理カルス、増殖期カルス、幼根、幼緑葉、幼黄化葉、開花期穂。簡潔には、摩砕した植物組織をグアニジンチオシアネートおよびフェノール存在下でタンパクを変性させ、水層とともに全ＲＮＡを回収する。真核生物のｍＲＮＡは３末端にポリＡ配列を有しているためＯｌｉｇｏ−ｄＴを固定化した担体に吸着させ溶出させることで特異的に単離することができる。
（抽出したＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作製）
抽出したｍＲＮＡは逆転写酵素を用いて相補ＤＮＡ鎖（１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ）を合成し、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼを作用させて２ｎｄＳｔｒａｎｄを合成してｃＤＮＡライブラリーを作製した。
（ｃＤＮＡライブラリーの分析）
作製したｃＤＮＡライブラリーをＤＤＢＪに登録された既知配列と比較し、同一または類似する遺伝子ごとに出現頻度をまとめた。まず第一に、配列全域にわたり９０％を越す非常に高い相同性を有しているクローンを相同性検索の結果から抽出する。第二にそのクローンを相互に比較し、配列中の特定箇所における塩基レベルの相違の有無について検討を行う。特定箇所に明らかに二種以上の塩基の偏りがある場合には同族の異なる遺伝子があるものと判断し、偏りがない場合には、単なる自動塩基配列決定装置による読み間違えと判断する。同一であると判断した一例を図１に示す。その結果を以下の表に表す。
【表１】

ここで、ＣＢはベンジルアデニン処理カルスを示し、ＣＧはジベレリン処理カルスを示し、ＣＨはヒートショック処理カルスを示し、ＣＫは増殖期カルスを示し、ＲＡは幼根を示し、ＳＳは幼緑葉を示し、ＳＴは幼黄化葉を示し、ＥＢは開花期穂を示し、ＥＣは登熟初期穂を示す。
上記表をもとに、所望の発現パターンを示すプロモーターを選択することができた。ここでは、例えば、脱分化状態（カルス）特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、構成的発現プロモーターを選んだ。
脱分化状態（カルス）特異的プロモーターは、ＣＢ、ＣＧ、ＣＨおよびＣＫからなる群より選択される少なくとも１つの部位のみまたはその部位で他より多い発現を示す遺伝子のプロモーター領域から得た。ここでは、ＩＤがＣＧ００６０＿１に属するクローンを以下の実施例において使用した。その配列は、配列番号１に示す。
葉特異的プロモーターは、ＳＳおよびＳＴからなる群より選択される少なくとも１つの部位のみまたはその部位で他より多い発現を示す遺伝子のプロモーター領域から得た。ここでは、ＩＤがＥＢ００８２＿２に属するクローンを以下の実施例において使用した。その配列は、配列番号２に示す。
構成的プロモーターは、全部位にわたってほぼ均一の発現を示す遺伝子のプロモーター領域から得た。ここでは、ＩＤがＲＡ１５８３＿１に属するクローンを選択した。その配列は、配列番号３に示す。
（実施例２：選択したプロモーターの特異性の確認）
実施例１で選択した各クローンが目的とする特異性を有するかどうかをこの実施例で確認した。具体的手順は以下のとおりである。
（選択したクローンの塩基配列決定）
まず、選択したクローンが予想される配列と同一であるかどうかを確認した。配列決定は、当業者に周知のジデオキシダイターミネーション法により行った。概説すると、配列決定を行うＤＮＡ鎖を熱変性により一本鎖状態としたところで、塩基配列を決定する箇所よりも上流にプライマーを付着させた。塩基毎に異なる蛍光色素を付加したジデオキシリボヌクレオチド３リン酸およびデオキシヌクレオチド３リン酸存在下でＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行った。ジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を取り込んだ場合にはＤＮＡ合成の伸長が停止させた。この反応産物をアクリルアミドゲルで電気泳動して分子量的に分離し、蛍光色素を機械的に判読することにより塩基配列が明らかとなった。
次に、決定した配列と、ＤＤＢＪに登録されている配列とを比較して上記各クローンが目的とする配列を有することが確認された。
（実施例３：プロモーター領域の取得）
本実施例では、目的とする配列を有することが確認されたクローンを用いてプロモーター領域を取得した。以下にその手順を簡潔に示す。
まず、ＤＤＢＪに登録されているデータをもとにプライマーを設計し、市販のＰＣＲベースの技術を用いた既知配列の上流を単離するキット（Ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｅｒ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）を用いてクローニングを行い、目的とする遺伝子のプロモーター領域を取得した。そのスキームを図２に示す。
これらの断片は、０．６ｋｂ〜２．５ｋｂほどの長さを持っていた。
（実施例４：カルス特異的プロモーターを用いた機能性植物の作出）
（緑色蛍光タンパク質での発現ベクターの作製）
緑色蛍光タンパク質と、カルス特異的に発現を駆動するプロモーターであると予測されるＣＧ００６０＿１由来のクローンのプロモーター領域（配列番号１）とを用いて発現ベクターを作製した。その具体的手順は以下のとおりである。
イネゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶで完全消化し、生成したＤＮＡ断片の両端すべてにＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒのアダプタープライマー（配列番号４）を付加し、アダプタープライマー内部の配列および既知配列より設計したプライマーペアによるＰＣＲ反応を行うことにより、プロモーター領域を取得した。
取得した断片については、使用上の簡便化のため、両端に制限酵素認識配列を付加した。５’末端側はアダプタープライマー配列の一部および制限酵素認識配列を含むプライマー（配列番号５）を設計し、また３’末端側は翻訳開始点直前の配列および制限酵素認識配列を含むプライマー（配列番号６）を設計してＰＣＲ反応を行い、両端に制限酵素認識配列を付加したプロモーターカセット（配列番号７）を作製した。
バイナリーベクターｐＴＮ１の内部に設計されたマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩの間に、プロモーターカセット化した本発明のプロモーターにより緑色蛍光タンパク質遺伝子を駆動し、アグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子に由来する転写終結シグナル配列により転写終結が行われる構造のＤＮＡ断片を挿入したバイナリーベクターを構築した。
（イネへの発現ベクターの導入）
作製したベクターでイネを形質転換した。その具体的手順は以下のとおりである。
作製したベクターは電気穿孔法によりアグロバクテリウムに導入し、形質転換アグロバクテリウムを得た。前培養を行ったイネ種子を形質転換アグロバクテリウム存在下で３日間共存培養することでアグロバクテリウムを感染させた。エタノールおよび次亜塩素酸ナトリウム溶液で殺菌し、２，４−Ｄを含む培地上で５日間培養を行ったイネの完熟種子をアグロバクテリウムによる形質転換イネ作製に用いた。
（結果）
上記の結果、このプロモーターで形質転換されたイネ細胞が得られた。
（感染細胞の選択）
形質転換イネ細胞はｐＴＮベクター中にコードされるｎｐｔＩＩ遺伝子によりジェネティシンに対する抵抗性を付与されることから、ジェネティシンを含むＮ６培地で培養することにより形質転換イネ細胞のみを選抜した。
（形質転換イネの再分化）
次に、形質転換されたイネから再分化させた。その具体的手順は以下のとおりである。
形質転換イネ細胞はサイトカイニンを含む培地上で再分化を誘導し、さらにホルモンを含まない培地上で土耕可能な個体にまで生育させた後に鉢上げした。
（結果）
上記の結果、植物の各組織が得られた。
（特異的発現の確認）
得られたカルス、植物体を各部位（根・葉・茎・胚乳・胚）に分け、発現特性を確認した。
（結果）
結果を示す（図３〜５）。図に示すように、ＣＧ００６０＿１由来のプロモーターは、根において特異的発現を駆動しないことが実証された。
また、カルスでの特異的発現を駆動することが実証された。また、葉および米粒では検出限界未満であったことが実証された。
（実施例５：葉特異的プロモーターを用いた機能性植物の作出）
（緑色蛍光タンパク質での発現ベクターの作製）
緑色蛍光タンパク質と、葉特異的に発現を駆動するプロモーターであると予測されるＥＢ００８２＿２由来のクローンのプロモーター領域（配列番号２）とを用いて発現ベクターを作製した。
イネゲノムＤＮＡを制限酵素ＤｒａＩで完全消化し、生成したＤＮＡ断片の両端すべてにＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒのアダプタープライマー（配列番号４）を付加し、アダプタープライマー内部の配列および既知配列より設計したプライマーペアによるＰＣＲ反応を行うことにより、プロモーター領域を取得した。
取得した断片については、使用上の簡便化のため、両端に制限酵素認識配列を付加した。５’末端側はイネゲノム配列の一部および制限酵素認識配列を含むプライマー（配列番号８）を設計し、また３’末端側は翻訳開始点直前の配列および制限酵素認識配列を含むプライマー（配列番号９）を設計してＰＣＲ反応を行い、両端に制限酵素認識配列を付加したプロモーターカセット（配列番号１０）を作製した。
（イネへの発現ベクターの導入）
作製したベクターでイネを形質転換した。手短には、バイナリーベクターｐＴＮ１の内部に設計されたマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩの間に、プロモーターカセット化した本発明のプロモーターにより緑色蛍光タンパク質遺伝子を駆動し、アグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子に由来する転写終結シグナル配列により転写終結が行われる構造のＤＮＡ断片を挿入したバイナリーベクターを構築した。
（結果）
上記の結果、このプロモーターで形質転換されたイネ細胞が得られた。
（形質転換イネのカルス作製）
次に、形質転換されたイネからカルスを作製した。その具体的手順は実施例７とおりである。
（結果）
上記の結果、植物組織が得られた。
（形質転換イネの再分化作製）
次に、形質転換されたイネを再分化させた。その具体的手順は実施例７のとおりである。
（結果）
上記の結果、植物体が得られた。
（特異的発現の確認）
得られたカルス、植物体を各部位（根・葉・茎・胚乳・胚）に分け、発現特性を確認した。
（結果）
結果を示す（図３〜５）。図に示すように、ＥＢ００８２＿２由来のプロモーターは、根において特異的発現を駆動しないことが実証された（図３）。
また、葉での特異的発現を駆動することが実証された（図４）。また、このプロモーターは、米粒においては発現が検出限界未満であった（図５）。
（実施例６：胚乳で発現しないプロモーターを用いた機能性植物の作出）
（緑色蛍光タンパク質での発現ベクターの作製）
緑色蛍光タンパク質と胚乳で発現しない特異性を有するプロモーターであると予測されるＲＡ１５８３＿１由来のクローンのプロモーター領域（配列番号３）とを用いて発現ベクターを作製した。
イネゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで完全消化し、生成したＤＮＡ断片の両端すべてにＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒのアダプタープライマー（配列番号４）を付加し、アダプタープライマー内部の配列および既知配列より設計したプライマーペアによるＰＣＲ反応を行うことにより、プロモーター領域を取得した。
取得した断片については、使用上の簡便化のため、両端に制限酵素認識配列を付加した。５’末端側はアダプタープライマー配列の一部および制限酵素認識配列を含むプライマー（配列番号５）を設計し、また３’末端側は翻訳開始点直前の配列および制限酵素認識配列を含むプライマー（配列番号１１）を設計してＰＣＲ反応を行い、両端に制限酵素認識配列を付加したプロモーターカセット（配列番号１２）を作製した。
（イネへの発現ベクターの導入）
作製したベクターでイネを形質転換した。手短には、バイナリーベクターｐＴＮ１の内部に設計されたマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩの間に、プロモーターカセット化した本発明のプロモーターにより緑色蛍光タンパク質遺伝子を駆動し、アグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子に由来する転写終結シグナル配列により転写終結が行われる構造のＤＮＡ断片を挿入したバイナリーベクターを構築した。
（結果）
上記の結果、このプロモーターで形質転換されたイネ細胞が得られた。
（感染細胞の選択）
次に、感染したイネを選択した。その具体的手順は実施例７とおりである。
（形質転換イネの再分化）
次に、形質転換されたイネを再分化させた。その具体的手順は実施例７のとおりである。
（結果）
上記の結果、植物の各組織が得られた。
（特異的発現の確認）
得られたカルス、植物体を各部位（根・葉・茎・胚乳・胚）に分け、発現特性を確認した。
（結果）
結果を示す（図３〜５）。図に示すように、ＲＡ１５８３＿１由来のクローンのプロモーター領域は、葉において特異的発現を駆動することが実証された（図４）。根ではこのプロモーター領域は、特異的発現を駆動しなかった。。
また、利用可能部位として米粒の胚芽での特異的発現は有意に検出されたことが実証された。
（実施例７：カルス特異的発現を駆動するクローンのプロモーター領域の有用性の実証）
次にカルス特異的に発現を駆動するプロモーターであると予測されるＣＧ００６０＿１由来のクローンのプロモーター領域のプロモーターとしての発現強度の実用性を確認した。具体的手順を以下に示す。
（プロモーター領域のレポーター遺伝子との連結）
次に、発現ベクターを用いて抗生物質耐性遺伝子であるハイグロマイシンホスホリルトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）と上記クローンのプロモーター領域とを連結し、発現強度の実用性を確認した。その手順を以下に簡潔に示す。
ＣａＭＶ３５ＳプロモーターによりＨＰＴ遺伝子を駆動する構造をもつバイナリーベクターｐＴＨ１のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター部を取り除き、代わりに本発明のプロモーターによりＨＰＴ遺伝子を駆動する構造をもつバイナリーベクターを構築した。単子葉植物の超迅速形質転換法（特許第３１４１０８４号）に準じた方法でイネ細胞に導入した。
（結果）
結果を図６および７に示す。
図６中の電気泳動図からもあきらかなように、本実施例で作製し生育したイネカルスには、ハイグロマイシンホスホリルトランスフェラーゼが組み込まれていた。また、図７に示すように、本実施例で作製したベクターによる形質転換カルスはハイグロマイシンに対する抵抗性が付与されていた。なお、ｐＴＨは、ポジティブコントロールとして使用したＣａＭＶ３５ＳプロモーターによりＨＰＴ遺伝子を駆動する構造を有するベクターの結果を示す。
本実施例で用いたプロモーターを挿入したものはハイグロマイシン抵抗性を付与するに十分な発現強度を持っていることが実証された。なお、コントロールとして使用した野生型のものは、ハイグロマイシン耐性をが付与されていなかった（図７）。従って、ＣＧ００６０＿１由来のクローンは、カルス特異的プロモーター領域を含んでいたことが実証された。
（実施例８：胚乳で発現しないプロモーター領域の有用性の実証）
次に胚乳で発現しない特異性を有するプロモーターであると予測されるＲＡ１５８３＿１由来のクローンの発現強度の実用性を調べた。具体的手順を以下に示す。
（プロモーター領域のレポーター遺伝子との連結）
発現ベクターを用いて抗生物質耐性遺伝子と上記クローンのプロモーター領域とを連結し、プロモーターとしての発現強度の実用性を確認した。その手順は実施例７に記載のとおりであった。
（結果）
結果を図６および７に示す。
図６中の電気泳動図からもあきらかなように、本実施例で作製し生育したイネカルスには、ハイグロマイシンホスホリルトランスフェラーゼが組み込まれていた。また、図７に示すように、本実施例で作製したベクターによる形質転換カルスはハイグロマイシンに対する抵抗性が付与されていた。
本実施例で用いたプロモーターを挿入したものはハイグロマイシン抵抗性を付与するに十分な発現強度を持っていることが実証された。コントロールとして使用した野生型のものは、ハイグロマイシン耐性をが付与されていなかった。従って、ＲＡ１５８３＿１由来のクローンは、ハイグロマイシン抵抗性を付与するに十分な発現強度を持っていることが実証された。
（比較例）
比較として、ＣａＭＶ ３５Ｓ由来のプロモーターを用いて実施例７および８と同様の実験を行った。同様にこのプロモーターでもハイグロマイシン抵抗性が付与された。
（結論）
以上のように、ｃＤＮＡデータベースにおけるプロモーターを含有する遺伝子の発現頻度に基づいて決定された特異性を有するプロモーターを利用して作出された機能性植物が、実際に目的とする機能を有することが実証された。
このような機能性植物の設計・作出を行うことが可能となったことは、従来技術では達成不可能であった画期的な技術であり、産業上での利用価値ははかりしれない。
（発明の効果）
目的とする部位で特異的発現をするかまたはしないように遺伝子発現パターンを改変した機能性植物が提供された。
産 業 上 の 利 用 可 能 性
本発明の機能性植物を構築する方法により、所望の遺伝子を植物の所望の部位に任意に発現させるための系を構築することが達成された。本発明の方法では、任意の所望の部位に遺伝子産物を発現させ、または発現させないような機能性植物が提供される。このように自由自在に機能植物を提供することができたことは産業上大いに有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、相同性検索の結果同じグループに属するとみなされた配列の一例を示す。ＥＳＴ配列データのほとんどは、ＤＮＡ配列決定機の生データであった。ＤＮＡ配列決定機の誤差を除き、相同性検索結果の多くクローンを比較し、そしてプライマーウォーキングのためにプライマーを設計した。ボックスで囲まれた部分および＊は、すべてのクローンで同じ配列であったことを示す。−は、ギャップを示す。「ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｌｏｎｅ」は、データベースの参照クローンを示す。「ｓｅａｒｃｈ ｒｅｓｕｌｔ」は、相同性検索結果を示す。「ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ」は、コンセンサス配列を示す。「ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｉｍｅｒ」は、設計したプライマーを示す。
図２は、転写調節領域単離方法の概要を示す。
図３は、根におけるＧＦＰ遺伝子の発現を示す図である。上段が可視光による写真、下段が励起光照射によるＧＦＰの蛍光発光を示す。ＷＴは野生型、００８２はＥＢ００８２＿２に属するクローンを示し、１５８３はＲＡ１５８３＿１に属するクローンを示し、５００６０はＣＧ００６０＿１に属するクローンを示す。
図４は、葉におけるＧＦＰ遺伝子の発現を示す。上段が可視光による写真、下段が励起光照射によるＧＦＰの蛍光発光を示す。ＷＴは野生型、００８２はＥＢ００８２＿２に属するクローンを示し、１５８３はＲＡ１５８３＿１に属するクローンを示し、５００６０はＣＧ００６０＿１に属するクローンを示す。
図５は、米粒におけるＧＦＰ遺伝子の発現を示す。上段が可視光による写真、下段が励起光照射によるＧＦＰの蛍光発光を示す。ＷＴは野生型、００８２はＥＢ００８２＿２に属するクローンを示し、１５８３はＲＡ１５８３＿１に属するクローンを示し、５００６０はＣＧ００６０＿１に属するクローンを示す。
図６は、生育したカルスより抽出したＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行って、ＨＰＴ遺伝子（上の矢印の位置）の有無を検出したものを示す。ＨＰＴ遺伝子のイネカルスへの導入を示す図である。左端はサイズマーカーを示し、レーン１から３は非遺伝子導入カルスより抽出したＤＮＡをテンプレートとして用い、レーン４から６はＣａＭＶ３５ＳプロモーターによりＨＰＴ遺伝子が駆動されるベクター、レーン７から９はＲＡ１５８３＿１に属するクローンに由来するＲＡ１５８３＿１由来プロモーターによりＨＰＴ遺伝子が駆動されるベクター、レーン１０から１２はＣＧ００６０＿１に属するクローンに由来するＣＧ００６０＿１由来プロモーターによりＨＰＴ遺伝子が駆動されるベクターをそれぞれ導入したカルスより抽出したＤＮＡをテンプレートとして用い、１．１ｋｂのＨＰＴ遺伝子特異的増幅産物を生成する条件でＰＣＲを行った。１３および１４：ポジティブコントロールとしてＨＰＴ遺伝子断片およびｐＴＨ１プラスミドをテンプレートとした。１５はネガティブコントロールとしてＤＮＡ抽出に用いた抽出バッファーを示し、１６は滅菌水をそれぞれテンプレートとしてＰＣＲを行った。上段の矢印は予想されるＨＰＴ遺伝子の増幅産物のサイズを示す。１５および１６では、増幅産物は出現していない。
図７は、ハイグロマイシン添加の前後での各カルスの生長を示す写真である。ＡおよびＢは、ＲＡ１５８３＿１由来のクローンのプロモーター領域、ＣおよびＤは、ＣＧ００６０＿１由来のクローンのプロモーター領域、ＥおよびＦは、ポジティブコントロールとして使用したＣａＭＶ３５ＳプロモーターによりＨＰＴ遺伝子を駆動する構造を有するベクター、ならびにＧおよびＨは、野生型を使用した結果である。Ａ、Ｃ、ＥおよびＧは、ハイグロマイシン存在下で生育させた後の結果を示し、Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨは、生育前の結果を示す。

Claims (9)

1. 配列番号１に示す配列からなるプロモーターおよび該プロモーターに作動可能に連結された該プロモーターとは異なる由来の遺伝子を含む形質転換植物。
2. イネである、請求項１に記載の形質転換植物。
3. 前記遺伝子は、病害抵抗性遺伝子または虫害抵抗性遺伝子である、請求項１に記載の形質転換植物。
4. 前記遺伝子は、ビタミン合成遺伝子、糖合成遺伝子、脂質合成遺伝子、ポリケチド合成遺伝子、光合成系遺伝子、機能性成分合成遺伝子および転写因子からなる群より選択される遺伝子である、請求項１に記載の形質転換植物。
5. 配列番号１に示す配列からなるプロモーター。
6. 請求項５に記載のプロモーターを含む発現カセット。
7. カルスにおける前記プロモーターとは異なる由来の遺伝子の発現を特異的に誘導する、請求項６に記載の発現カセット。
8. 配列番号１に示す配列からなるプロモーターおよび該プロモーターに作動可能に連結された該プロモーターとは異なる由来の遺伝子を含む植物から得られる形質転換植物の利用可能部位。
9. 葉、茎または果実である、請求項８に記載の利用可能部位。

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