JP4084199B2 - 両親媒性ヘパリン誘導体の粘膜吸収を増加させるための製造方法 - Google Patents

両親媒性ヘパリン誘導体の粘膜吸収を増加させるための製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、血液凝固阻止治療を必要とする患者等を治療するためのヘパリンの投与に関するものである。より詳細には、本発明は、粘膜組織(mucosal tissues)を通じたヘパリンの吸収を向上させるためのヘパリン製剤に関するものである。
ヘパリンは、心静脈血栓症(deep vein thrombosis)及び肺動脈塞栓症(pulmonary embolism)の予防と治療の為の強力な血液抗凝固剤(anticoagulants)の一つとして広く使用されている[Damus等, Heparin-A generalized view of its anticoagulant action, Nature,1973年、第246巻、P.355-356; L. Jin等, The anticoagulant activation of antithrombin by heparin, 94 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 1997年、P.14683-14688]。ヘパリン治療は、注射剤にだけ使用されるため、その対象も入院患者に制限されている[R.d. Rosenberg, Biochemistry and Pharmacology of Low Molecular Weight Heparin, 34 Semin. Hematol., 1997年、P.2-8; G.E.Pineo & R.D. Hull, Unfractionated and Low Molecular-weight Heparin, 82 Curr. Concepts Thromb., 1998年、P.587-599]。一般的に患者は退院する時、ヘパリン静脈注射や皮下注射から経口用ワーファリン(warfarin)に転換する。しかし、前記ヘパリンは、効果時間(onset)が遅く薬物間相互作用(drug-drug interaction)を現わす確率が非常に高い。したがって、心静脈血栓症(DVT)や肺動脈塞栓症(PE)にかかった患者達を治療するためのヘパリン経口投与に対する薬学的組成及び投与方法が長い間研究されてきた。
ヘパリンは、自体の大きさ及び高い陰性電荷により胃腸管内(GI tract)では、吸収が難しいと知られている[L.B.Jaques, Heparins: Anionic polyelectrolyte drugs, 31 Pharmacology rev. 1980年、P.100-166]。ヘパリンの親水性による上皮膜の極性グループの反発作用及び低い透過率により上皮細胞の透過が難しい[D.A. Norris等, The effect of physical barriers and properties on the oral absorption of particulates, 34 Advanced Drug Delivery Reviews, 1998年、P.135-154]。ヘパリンをエーロゾル(aerosol)状態で投与または親油性物質または膜透過向上剤(membrane enhancer agents)と共に混合した場合、血中ヘパリンが感知されなかった[A. Dalpozzo等, New heparin complexes active by intestinal absorption. I. Multiple ion pairs with basic organic compounds, 56 Thromb. Res., 1989年、P.119-124]。最近、胃腸管内ヘパリン吸収に対する強力な向上剤として、N-[8-(2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]カプリレート(N-[8-(2-hydroxybenzoyl)amino] caprylate, SNAC)が開発された[R.A. Baughman等, Oral delivery of anticoagulant doses of heparin: A randomized, double-blind, controlled study in humans, 98 Circulation 1998年、P.1610-1615]。
ヘパリンの疎水性を増加させるために、ヘパリンと疎水性物質が結合した新しいヘパリン誘導体を製造した[Y. Lee, S.H. Kim & Y. Byun, Oral delivery of new heparin derivatives in rats, 17 Pharm. Res., 2000年、P.1259-1264; Y. Lee, H.T. Moon & Y. Byun, Preparation of slightly hydrophobic heparin derivatives which can be used for solvent casting in polymeric formulation, 92 Thromb. Res., 1998年、P.149-156; 米国特許第09/300,173号]。前記ヘパリン誘導体中、ヘパリンとデオキシコール酸(DOCA)の結合体が胃腸内で最も高い吸収を示した。このような結果は、(1)疎水性物質との結合によるヘパリンの疎水性増加、及び(2)前記回腸で結合したDOCAと胆汁酸受容体(bile receptors)との相互作用により説明され得る。
前記のように、粘膜細胞を通したヘパリンの吸収向上のための薬学的な製造方法は、重要な技術の向上として評価される。
発明の概要
本発明の目的は、粘膜組織を通じたヘパリンの吸収を向上させるための製造方法を提供することである。
また、本発明のまた他の目的は、経口投与後、胃腸粘膜を通じたヘパリンの吸収を向上させるための製造方法を提供することである。
また、本発明のまた他の目的は、粘膜組織を通じたヘパリンの吸収を向上させるためのヘパリンの投与方法を提供することである。
前記の目的及びその他の目的は、
(a) 胆汁酸、ステロール、アルカン酸(alkanoic acids)、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性物質と共有結合したヘパリンが含まれている両親媒性ヘパリン誘導体を水相に溶解させ、
(b) 前記水相に溶解された両親媒性ヘパリン誘導体を有機溶媒相に分散させエマルジョンを形成させ、及び
(c) 得られたエマルジョンを乾燥して組成物を得る段階を含む、増加されたヘパリンの粘膜吸収を得るための組成物を製造する方法を提供することによって達成される。
好ましくは、前記ヘパリンは、低分子量ヘパリン、高分子量ヘパリン、ヘパリン断片、組換えヘパリン、ヘパリン類似体、ヘパリン活性を示す多糖類及びこれらの混合物からなる群から選択される。
好ましい態様によると、本発明は、胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性物質と共有結合したヘパリン誘導体が含まれた、両親媒性ヘパリン誘導体を有機溶媒相に分散させる段階を含む、粘膜組織を通じた吸収が向上したヘパリンを含む薬学的組成物の製造方法を含む。
また他の好ましい態様によると、本発明は、
(a) 胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性物質と共有結合したヘパリンを含む両親媒性ヘパリン誘導体を水または水/有機溶媒の混合溶媒(co-solvent)に溶解させ、
(b) 前記水または水/有機溶媒の混合溶媒に溶解した両親媒性ヘパリン誘導体を油相に分散させ、及び
(c) 前記水または水/有機溶媒の混合溶媒を蒸発させ、両親媒性ヘパリン誘導体を油相に分散させる段階を含む、増加したヘパリンの粘膜吸収を得るための組成物の製造方法を含む。
また他の好ましい態様によると、本発明は、
(a) 胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性物質と共有結合したヘパリンを含む両親媒性ヘパリン誘導体を薬学的許容可能な水溶性溶媒に溶解させてナノ粒子を形成し、及び
(b) 前記薬学的に許容可能な水溶性溶媒内に含有されたナノ粒子と薬学的に許容可能な界面活性剤を混合すると、前記薬学的に許容可能な界面活性剤はヘパリン及び疎水性物質との相互作用によりナノ粒子が崩壊され、前記疎水性物質が前記ナノ粒子の最も外側の表面に露出されるようにする段階を含む、増加したヘパリンの粘膜吸収を得るための組成物の製造方法を含む。
好ましい薬学的に許容可能な界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン(cationic)界面活性剤、両性界面活性剤、両親媒性界面活性剤、疎水性界面活性剤及びこれらの混合物からなる群から選択される。
また他の好ましい態様によると、本発明は、胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性物質と共有結合したヘパリンを含む多数の両親媒性ヘパリン誘導体を含み、前記多数の両親媒性ヘパリン誘導体は、疎水性物質の一部が最も外側の表面に露出しているナノ粒子形態の組成物を含む。
また他の好ましい 態様によると、本発明は、
(a) 胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性物質と共有結合したヘパリンを含む両親媒性ヘパリン誘導体が有効量で含まれ、前記両親媒性ヘパリン誘導体は、疎水性物質の一部が最も外側の表面に露出されているナノ粒子形態で、及び
(b) 薬学的に許容可能な担体との混合物を含んでなる製剤(dosage)を含む。
また他の好ましい態様によると、本発明は、胆汁酸、ステロール、アルカン酸及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性物質と共有結合したヘパリンを含む両親媒性ヘパリン誘導体が含まれた両親媒性ヘパリン誘導体で、この時、前記両親媒性ヘパリン誘導体は疎水性物質の一部が最も外側の表面に露出しているナノ粒子形態の組成物を有効量で投与して、血液凝固阻止の治療が必要とされる患者の治療方法を含む。
発明の詳細な説明
本発明の両親媒性ヘパリン誘導体の粘膜吸収を向上させるための製剤及び方法を詳細に記述するに先立ち、本発明は、特別な形態、処理過程そして、ヘパリンを含む物質等、例えば、形態、処理過程そして、若干変更する物質を含むことに局限されていないことを理解されねばならない。また、使用した用語は、単に特別に具体的な内容を記述するために使用されたもので、本発明の範囲は、添加した請求事項とそれに相応するものに制限されているため、用語を制限させるために使用されなかったことが理解されねばならない。
以下、本発明の背景技術を説明し、付加的に具体的な詳細説明を提供するために論文及び参考文献等を言及する。以下、言及される参考文献は、本発明の出願日以前に公開されたものである。発明者等は、先行発明により示されたものは、ここに説明しなかった。
本明細書及び添付された請求範囲で使用した単数形「a」「an」及び「the」は、文章で明白に他のものを示さなければ、複数を含む。例えば、「胆汁酸」は、２つまたはそれ以上の胆汁酸混合物を含み、「アルカン酸」は、1つまたはそれ以上のアルカン酸混合物を含み、「ステロール」は、２つまたはそれ以上のステロール混合物を含む。
本発明の明細書及び請求範囲で次に述べる専門用語は、下記に定義にした内容に従って使用する。
ここで使用した、「含む」、「含む」、「含有する」、「特徴づけられる」及びこれらの文法的な同意語は添加され、詳述しない要素または方法段階を除外しない包括的で制限のない用語である。
ここで使用した、「からなる」及びこれと文法的な同意語は、請求項に詳述されていないいかなる要素、段階または成分を除外する。
ここで使用した、「本質的に〜からなる」及びこれと文法的な同意語は、具体的に説明された文節または段階に請求された領域にだけ限定し、実質的に基本的で新しい特徴または請求された発明の特性に影響を及ぼす。
ここで使用した、「疎水性ヘパリン誘導体」、「両親媒性ヘパリン誘導体」、「疎水性ヘパリン」及び「両親媒性ヘパリン」は、相互交換的である。ヘパリンは親水性物質である。疎水性物質とヘパリンを結合することによって、ヘパリンの疎水性を増加させることを本発明では、両親媒性ヘパリン誘導体または疎水性ヘパリン誘導体として現わす。固有のヘパリンに比べて前記ヘパリン誘導体は、疎水性が増加し、それにつれて前記ヘパリン誘導体は、親水性及び疎水性部分を含み両親媒性に言及することが好ましい。
ここで使用する「胆汁酸」は、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸(lithocholic acid)、ウルソコール酸(ursocholic acid)、ウルソデオキシコール酸(ursodeoxycholic acid)、イソウルソデオキシコール酸(isoursodeoxycholic acid)、ラゴデオキシコール酸(lagodeoxycholic acid)、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸(hyodeoxycholic acid)及びこれらの混合物等を含むステロイド、コール酸の天然及び合性誘導体を意味し、これに限定しない。
ここで使用した「ステロール」は、コレスタノール、コプロスタノール、コレステロール、エピコレステロール(epicholesterol)、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びこれらの混合物等を含むステロイドと構造的に関連したアルコールを意味し、これに限定しない。
ここで使用した「アルカン酸」は、4〜20個の炭素原子からなる飽和脂肪酸を意味する。前記アルカン酸は、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸及びこれらの混合物等を含み、これに限定しない。
ここで使用した「HMWH」は、重量平均分子量が約12,000またはそれを超えるヘパリンを意味する。
ここで使用した「LMWH」は、重量平均分子量が約12,000未満で、好ましくは、6,000未満のヘパリン(LMWH(6K))を意味する。
ここで使用した「W/O エマルジョン」は、油中水型エマルジョンを意味する。
ここで使用した「aPTT」は、活性化された部分トロンボプラスチン時間(activated partial thromboplastin time)を意味し、「FXa」は因子Xaを意味する。
ここで使用した「DOCA」は、デオキシコール酸を意味し、「ヘパリン-DOCA」は、ヘパリンとデオキシコール酸が結合した形態を意味する。これと同様に、「HMWH-DOCA」は、高分子量ヘパリンとデオキシコール酸の結合した形態を、「LMWH-DOCA」は、低分子量ヘパリンとデオキシコール酸の結合した形態を意味する。
ここで使用した「薬学的に許容可能な」の意味は、ヒトに投与する時に生理学的に耐えることができ、胃液傷害(gastric upset)、めまい(dizziness)のようなアレルギー反応または類似の反応が典型的に起きない組成及び物質を言う。好ましくは、ここで使用した「薬学的に許容可能な」の意味は連邦、州政府、米国薬典、または動物、特にヒトのために使用される薬典により承認された団体により承認された物を言う。
ここで使用した「有効量」は、毒性がなくすべての医療的な治療時に合理的に要求される利益/リスク比率で、局所的にまたはシステム的な効果を現わす薬物濃度または薬理学的活性剤の含量を意味する。ここで使用した両親媒性ヘパリン誘導体の有効量は、抗凝固活性の選択される量を提供するために選択される量を意味する。
ここで使用した「担体」は、組成物が投与される時に共に使用される希釈剤、補助剤(adjuvant)、賦形剤、または運搬体(vehicle)を意味する。前記薬学的担体は、石油、ピーナツ油、大豆油、ミネラル油、胡麻油等の動物、植物または合成された油及び水等の滅菌された液体を含む。
ここで使用した「錠剤」は、適切な希釈剤を含有するか含有しない薬物を含む固形の薬剤を意味し、この分野で公知された圧縮または成形方法により製造される。錠剤は、19世紀末から現在まで広く使用されてきた。錠剤は、製造者(製造の簡便性及び経済性、安定性、そして包装、運搬及び販売の容易性)と患者等(定量化、稠密性、運搬性、薬物の苦み除去、そして投与の容易性)に利点を提供するため、薬物形態に広く使用される。錠剤の形態は、主に円盤模様(discoid)であるが、丸形、楕円形、長楕円形、円柱形長楕円形、または三角形長楕円形も可能である。前記錠剤の大きさ及び重さは、使用しようとする薬物方法と薬物成分の量により多様である。一般的に前記錠剤は、(1)圧縮された形態、及び(2)成形された形態または粉砕された形態の２つに分けられる。活性的なまたは薬物治療的な成分または組成物だけではなく、錠剤は多数の不活性物質または添加剤を含んでいる。前記した添加剤を含む第１グループには、希釈剤、結合剤及び潤滑剤を含む、製造方法に満足な圧縮的特徴を現わすのに役立つ物質を含む。第2グループには、粉砕剤、染色剤、香料剤、そして甘味料のような添加剤を混ぜて物理的な特性を現わすのに役立つ物質である。
ここで使用した「希釈剤」は、圧縮に適当な大きさの錠剤を作るために製造方法の容積を増加させるために添加した不活性物質である。一般的に使用される稀釈剤は、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン(kaolin)、マンニトール、塩化ナトリウム、乾燥した澱粉、粉砂糖及びシリカ等を含む。
ここで使用した「結合剤」は、パウダー形態の物質で、凝集性質を向上させるために使用される。結合剤または顆粒剤(granulator)として知られている物は、錠剤製造方法に凝集性質を増加させ、圧縮後に不活性を維持するだけではなく、所望の硬度と大きさの顆粒を利用して摩擦力ない流れ性(free-flowing)を向上させる。 通常的に結合剤に使用される物質は、澱粉、ゼラチン、蔗糖、グルコース、デキストロース、糖蜜及びラクトース等の糖類、アカシア、アルギン酸ナトリウム(sodium alginate)、アイリッシュ苔抽出物、パンワール(panwar)ガム、ガティ(ghatti)ガム、イサポルホスク(isapol husk)のゴムのり、カルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose)、メチルセルロース(methylcellulose)、ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidone)、ビーガム(veegum)、微細結晶性セルロース(microcrystalline cellulose)、微細結晶性デキストロース(microcrystalline dextrose)、アミロース(amylose)及び落葉松(larch)アラボガラクタン(arabogalactan)のような天然並びに合成ガム類等を含む。
ここで使用した「潤滑剤」は、錠剤顆粒化の流速を向上させ、飲料や染料の表面に前記錠剤物質の付着を防止し、内部粒子間の摩擦を減少させ、そして染色腔(cavity)からの錠剤の排出を容易にする等、錠剤製造において多くの機能を果たす物質である。一般的に使用される潤滑剤には、滑石、ステアリン酸マグネシウム(magnesium stearate)、ステアリン酸カルシウム(calcium stearate)、ステアリン酸及び水素化された植物性油を含む。前記潤滑剤の含量は、約0.1重量%から約5 重量%が好ましい。
ここで使用した「崩解剤」または「崩壊剤」は、投与後に錠剤の分解または崩壊を容易にする物質である。他の崩壊剤には、化学的に澱粉、クレイ(clays)、セルロース、アルギン(algins)またはガム類(gums)に分類できる。他の崩解剤には、ビーガム(veegum)HV、メチルセルロース、寒天(agar)、ベントナイト(bentonite)、セルロース及び木材(wood)物質、天然海綿(natural sponge)、陽イオン交換樹脂(cation-exchange resins)、アルギン酸、グアガム(guar gum)、シトラスパルプ(citrus pulp)、架橋化したポリビニルピロリドン(cross-linked polyvinylpyrrolidone)及びカルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose)等を含む。
ここで使用した「着色剤」は、錠剤がさらに満足できる外形を見せるようにする物質で、製造者が調剤する間、錠剤を調節したり使用者が前記錠剤を認識することを助ける物質である。承認された製品としては、水溶性 FD&C染料、これらの混合物またはこれと関連したレーキ(lake)等が、カラー錠剤に使用される。染料油は、水溶性染料が重金属の水和性酸素に吸着した混合物で、前記染料を不溶性にする。
ここで使用した「香料」は、化学的構造が簡単なエステル、アルコール及びアルデヒドからカルボナート及び複合揮発性油等まで多様に変化できる。現在、大部分の要求される形態の合成香料が利用されている。
本発明は、鼻、肺動脈、直腸及び他の粘膜層だけではなく、主に胃腸管内粘膜層を通じたヘパリン誘導体の生体利用率が向上した、ヘパリン誘導体を含む製造方法に関するものである。
両親媒性ヘパリン誘導体の細胞内移送において、3種のメカニズムが提案された。その一つは、両親媒性ヘパリン誘導体の疎水性により、粘膜層を通じた両親媒性ヘパリン誘導体の分配によるものである。二つ目は、肝-胆汁循環系(hepato-biliary circulation)、特に胃腸を通じた胆汁酸受容体と結合した両親媒性ヘパリン誘導体の相互作用によるものである。三つ目は、前記ヘパリン高分子にグラフトされた疎水性物質が細胞膜を破壊することによって、粘膜を通じた両親媒性ヘパリン誘導体の透過を向上させるものである。前記提案されたメカニズムが胃腸で支配的であることは、まだ明確ではない。しかし、グラフトされた疎水性物質、特に胆汁酸が胃腸管内で両親媒性ヘパリン誘導体の吸収を向上させることが分かった。
前述したように、ヘパリン誘導体は、結合した疎水性物質及び粘膜間の相互作用により経口吸収が可能である。したがって、前記結合した疎水性物質は、胃腸環境中で露出され容易く粘膜を通じて相互作用をなすことができる。しかし、胃腸が水溶性環境で、前記結合した疎水性物質は凝集しやすいため、自家凝集(self-assembled)したナノ粒子を形成するようになる。このようなナノ粒子の構造は、図1Aに図示した通りである。前記水溶性溶液内で両親媒性ヘパリン誘導体の自家凝集したナノ粒子10は、粒子の内部には結合した疎水性物質12が凝集されていて、粒子の外部には前記疎水性ヘパリン14が位置する。このような構造において、前記ヘパリン誘導体14が粘膜層を通じた拡散が容易くないため、前記結合した疎水性物質は粘膜を通じて透過されにくい。したがって、前記ナノ粒子構造が反転する、即ち、前記結合した疎水性物質が粒子の表面に露出してヘパリンがナノ粒子の内部に含有される(逆相、reverse phase)製造方法は、このような長所を含む。このような構造は、図1Bに図示したように、前記両親媒性ヘパリン誘導体は、油相20内に含まれていて、その結果、ヘパリン高分子22が粒子の内部に凝集されていて、疎水性部分24が粒子の外部に油相で会合されているナノ粒子21を示す。
本発明の具体的な態様によると、両親媒性ヘパリン誘導体は、W/Oエマルジョンから粉末に製造される。このような方法は、水相に前記ヘパリン誘導体を溶解させ、溶解されたヘパリン誘導体を含む水溶液を再び有機溶媒相にエマルジョン状態で分散させるものである。エマルジョンを形成するようになると、ヘパリンと結合した疎水性物質は有機溶媒相に露出され、ヘパリン官能基は水相で凝集される。続いて、前記エマルジョンを乾燥してヘパリン誘導体を疎水性物質が粒子の外部に露出されている、所望の構造を持った粉末に製造する。このようなヘパリン誘導体粉末は、この分野で公知された錠剤、カプセル等商用化された形態に製造できる。前記ヘパリン誘導体の製剤は、肺動脈、鼻、口腔、大腸、直腸及び粘膜組織だけではなく、胃腸膜による吸収により経口投与できる。
本発明のまた他の具体的な態様によると、前記両親媒性ヘパリン誘導体は、油相で分散された形態に製造が可能である。このような方法は、水溶液または水溶液/有機溶媒の混合溶媒相に前記ヘパリン誘導体を溶解させ、続いて油相に 水または混合溶媒を分散させることである。最後に、水または混合溶媒を除去して前記ヘパリン誘導体が油相に分散されるようにする。得られた組成物は、この分野で公知されている方法によりカプセルまたは油のような他の商用化された形態に製造する。
本発明のまた他の具体的な態様によると、両親媒性ヘパリン誘導体が胆汁酸、有機界面活性剤または薬学的に許容可能な界面活性剤のような界面活性剤と混合した後、前記界面活性剤の分子がヘパリン官能基及び疎水性官能基と相互作用をして典型的なナノ粒子が崩壊され、前記粒子の表面に若干の疎水性官能基が露出される。このような構造は、図1Cに図示したように、ヘパリン部分30及び疎水性部分32及び界面活性剤分子34が会合されているナノ粒子28を示す。前記若干の疎水性官能基は、粒子の外部に位置するようになる。
実施例
実施例で使用した両親媒性または疎水性ヘパリン誘導体は、米国特許出願第09/300, 173号に記載されている方法により製造した。その結果を下記に示す。
DOCAとヘパリン-DOCAの経口投与
大韓民国動物実験センター(Korea Animal Center)で育てたマウス(mice)を利用して、薬物投与前に12時間絶食させた。25〜30g程度のマウスをジエチルエーテルで痲酔させた後、ヘパリン-DOCAを経口形チューブを利用して注意深く食道を通過して胃まで単独投与した。前記チューブは、錆びないステンレススチール材質で、端部分は、磨耗させて組織の傷を最小化した。ヘパリン-DOCA溶液は、炭酸水素ナトリウム緩衝溶液(pH 7.4)で製造した。本実験では、(a)HMWH-DOCA、ヘパリンの分子量約12,000、(b)LMWH-DOCA、ヘパリン分子量約6,000の2種類のヘパリン-DOCAを使用した。投与するヘパリン-DOCAの総容積は、0.4ml(0.2ml ヘパリン-DOCA + 0.2 ml DOCA)だった。経口投与するヘパリン-DOCAの含量は、50mg/kg、100mg/kgまたは200mg/kgにした。血液サンプル(450μl)は、心臓から注射器で取りだし、取り出した血液は、すぐに50μlのクエン酸ナトリウム(3.8%溶液)と混合した。前記血液サンプルは、すぐに2500xg、4℃で10分間遠心分離した。血漿でヘパリン-DOCAの凝固時間及び濃度は、各々aPTT分析及びFXa分析方法で測定した。
HMWH、DOCAと混合したHMWHとHMWH-DOCAを各々マウスに経口投与した後、aPTT測定結果時間による凝固時間が変化しなかった(図2A)。しかし、HMWH-DOCAとDOCAを混合して投与した場合、凝固時間は時間により増加し、30分でHMWH-DOCAの最大凝固時間及び最大血漿(peak plasma)濃度が観察された(図2A-B)。LMWH、DOCAと混合したLMWHとLMWH-DOCAをマウスに各々経口投与した時、最大凝固時間は40秒だった(図3A)。しかし、LMWH-DOCA及びDOCAを混合して経口投与した時、LMWH-DOCAの最大凝固時間及びピーク血漿濃度は、各々70秒と4μg/mlに増加した(図3A-B)。
このような結果は、両親媒性ヘパリン誘導体で疎水性グループが凝集した表面上に存在することにより、前記両親媒性ヘパリン誘導体の経口吸収を向上させたことを示している。このような方式で、疎水性グループは容易く粘膜組織に接近することが容易で、両親媒性ヘパリン誘導体の吸収を助ける。
胃腸管内でのヘパリン-DOCAに対するDOCAの投与効果
ヘパリン-DOCA溶液は炭酸水素ナトリウム緩衝溶液を利用して製造した。全体投与されるヘパリン-DOCA溶液の容積は、0.4mlである(0.2mlヘパリン-DOCA溶液 + 0.2ml DOCA)。ヘパリン-DOCAの投与量は、50〜200mg/kgで、自由DOCAの投与量は、各々33、100及び200mg/kgである。各時間毎に血液サンプル(450μl)を採取し、ただちに50μlのクエン酸ナトリウム(3.8%溶液)と混合した。血漿でヘパリン-DOCAの凝固時間及び濃度は、各々aPTTとFXa分析方法で測定した。ヘパリン-DOCA(200mg/kg)をDOCAと混合して経口投与した時、凝固時間がDOCAの含量により増加した(図4A-B)。
胃腸管の組織検査
実施例1に記載された方法により、ヘパリン-DOCAを経口用チューブを利用してマウスに投与した。ヘパリン-DOCAでヘパリンに結合したDOCAのモル比は、10 だった。即ち、ヘパリン1モル当り10モルのDOCAが結合した。前記投与量は、200mg/kgにした(200mg/kg DOCA含む)。ヘパリン-DOCAがDOCAと共に投与された後、0.5、1、2、3時間後にマウスをジエチルエーテルで痲酔して、横隔膜(diaphragm)を切断して致死させた。前記マウスから、胃、十二指腸、空腸、回腸組織を除去して中性ホルマリン溶液に固定させた。対照群として、ヘパリン-DOCAが投与されていない胃腸組織を準備した。前記組織試片は、アルコールを利用して水を除去した。試片は着色されたシリコンを塗布して染色しパラフィン内に包まい(embed)させた。前記包まいした組織はマイクロトーム(microtome)を利用して、-20℃で5μm厚みに切断してスライド上に載せた。そして各々の組織断片をキシレンと無水アルコールを利用してパラフィンを除去した。製造された5μm厚みの組織断片は、この分野で通常的に使用されるヘマトキシリン及びエオシン(H&E)を利用して染色した。
透過電子顕微鏡(TEM)で測定するために、胃、十二指腸、空腸そして回腸組織をPBS(0.1M、pH7.4)内1%四酸化オスミウム(osmium tetroxide)で固定させた後、アルコールの濃度を50〜100%まで徐々に変化しながら水和させた。前記水和された組織に酸化プロピレン(propylene oxide)を浸透させ、エポン(epon)混合物に包まいさせた。前記包まいした組織を、50〜60nm厚みに切断した。このようなスライドは、酢酸ウラニル(uranyl acetate)及びクエン酸鉛(lead citrate)で1分間うすく染色した後、日立(Hitachi)7100透過電子顕微鏡(東京, 日本)で観察した。
H&E染色結果によると、上皮細胞の露出、絨毛の融解、粘膜微細管と血管の充血、または外傷のような胃壁損傷が、胃、十二指腸、空腸及び回腸部分のどこにも発見されなかった(図5A-T及び図6A-T)。このような結果は、増加したヘパリン-誘導体の吸収が胃腸の上皮細胞の破壊により発生しないということを意味する。図7A-T及び図8A-Tは、ヘパリン-誘導体により露出された後に、TEMにより測定された微細絨毛の形態を示したものである。対照群は健康な密着結合(tight junction)、微細絨毛及びミトコンドリアを示している。1、2及び3時間後に、すべての断片において前記細胞外観は、微細絨毛の融解、分解、気孔が含まれた細胞層の不規則性及び毒性効果のようないかなる損傷も示さなかった。
ヘパリン-DOCA粒子の形態と表面成分
ヘパリン-DOCA粒子の表面形態は、走査電子顕微鏡電子X-ray分析器(SEM-EDX, JEOL JSM-5800, 東京, 日本)で測定した。乾燥した状態でヘパリン-DOCAの粒子表面に存在する硫黄元素の濃度は、混合されたDOCAにより減少した(表1)。このような結果は、ヘパリン-DOCA内にヘパリンと結合したDOCAグループがDOCAの混合物により水相で露出できる。
（表 1）ヘパリン誘導体粒子の表面成分
Figure 0004084199
ヘパリン-DOCA粒子の表面電荷
ヘパリン-DOCA粒子のZeta-ポテンシャルを炭酸水素ナトリウム内でこの分野の通常的方法に基づいて測定した。下記の表2に示したように、ヘパリン-DOCAは、陰性ポテンシャルを示している。前記ヘパリン-DOCAの陰性ポテンシャルは、DOCAとの混合により減少した。このような結果は、ヘパリンと結合したDOCAグループが DOCAと混合させることによってヘパリン-DOCAの表面に露出できるからである。
（表２）
Figure 0004084199
炭酸水素ナトリウム緩衝溶液を利用した分散形製造方法
まず、1.5gの炭酸水素ナトリウムを50mlのPBS緩衝溶液(pH7.4, I=0.15)に溶かして、3%炭酸水素ナトリウム緩衝溶液を製造した。動物に投与する緩衝液の容積は、0.5ml/kgにした。ヘパリン-DOCAと炭酸水素ナトリウムを混合させ、超音波処理(80 W, 3分)して分散させた。ヘパリン-DOCAは、緩衝水相にナノ粒子で均一に分散された。
界面活性剤としてDOCAを利用した分散形製造法
ヘパリン-DOCAを3%炭酸水素ナトリウム緩衝溶液に溶解させた。続いて、33、100及び200mg/kgのDOCAを各々蒸溜水に溶解させた後、各々超音波処理した。この時、投与した緩衝液の容積は、0.5mg/kgだった。超音波処理後、DOCA溶液をヘパリン-DOCA溶液と混合して、各々3分間再び超音波(80W)処理した。
いくつかの油(薬物/油)を利用した分散形製造法
ヘパリン-DOCAの含量は、マウスの重さにより測定した(投与量 : 200、100、50、20mg/kg)。続いて、ヘパリン-DOCA粉末を大豆油、ミネラル油、オリーブ油及びスクアレンに各々混合した。次に、15,000 rpmで10分間均等化(homogenized)した。図9に示したように、油に分散されたヘパリン-DOCAが経口投与されると、オリーブ油またはミネラル油内に含有されたヘパリン-DOCAが、スクアレン内に含有されたヘパリン-DOCAより高い凝固時間を示した。また、LMWH(6K)-DOCAは、オリーブ油内に含有されたLMWH(6K)より高い凝固時間を示した。
W/Oエマルジョン化方法1を利用した分散形製造方法
まず、100 mgのヘパリン-DOCAを80Wで3分間超音波処理して、10mlの水に分散させた。続いて、40mlのツイーン(Tween)20、40、60及び80を各々添加した後、10分間8000rpmで均質化させた。80℃で窒素を供給しながら蒸発により最終エマルジョンから水を除去した。水を除去した後、超音波処理(80W、3分)してさらに微細なエマルジョンを製造した。
W/Oエマルジョン化方法2を利用した分散形製造方法
まず、100mgのヘパリン-DOCAを80Wで3分間超音波処理して、10mlの水に分散させた。続いて、20mlのスパン(Span)20、40、60及び80を各々添加した後、同一な条件下で超音波処理した。油相に最終分散されたヘパリン-DOCAは、24時間真空下で乾燥させ水を除去した。
疏水化された乾燥エマルジョン方法を利用した分散形製造方法
ヘパリン-DOCA(5〜20%w/v)を蒸溜水に分散させた。得られた分散液にミグリオール(Miglyol)812(10〜40%)を添加させ、好ましい形態学的性質を持ったエマルジョンを製造するためにシルバーソン混合機(Silverson mixer)(Silverson Machines, waterside, イギリス)を使用して8,000〜12,000rpmで撹拌した。水溶液に分散されたヘパリン-DOCA及びミグリオール812は、乳白相(milky phase)を示した。続いて、ミグリオール812を除去するために50mlの2-プロパノールを-10℃で20分間処理した。前記ヘパリン-DOCAは減圧下で24時間乾燥して水を除去した。最終エマルジョン(0.8mg)を直径15mm、長さ6mmのPVEブリスタ(blisters)に注入した。このPVEブリスタを80Wで3分間超音波処理した。
界面活性剤と疏水化された乾燥エマルジョン方法を利用した分散形製造方法
ヘパリン-DOCA(5〜20%w/v)及びDOCAを蒸溜水に分散させた。得られた分散液に ミグリオール812(10〜40%)を添加した後、好ましい形態学的性質を持ったエマルジョンを製造するためにシルバーソン混合機(Silverson mixer)(Silverson Machines, waterside, イギリス)を使用して15,000rpmで15分間撹拌した。続いて、ミグリオール812を除去するために50mlの2-プロパノールを-10℃で20分間処理した。前記DOCAと混合されたヘパリン-DOCAは、減圧下で24時間乾燥して水を除去した。最終エマルジョン(0.8g)を大豆油、ミネラル油、オリーブ油及びスクアレンと各々混合した後、15,000rpmで10分間均質化させた。
逆相ヘパリン-DOCA粉末製造
まず、50mgのヘパリン-DOCAを2 mlの水に分散させた。得られた分散液に10mlのHCO-60(5%ポリオキシエチレン水素化されたキャスター油誘導体)を添加した後、10分間8,000rpmで均質化させた。エマルジョンを収集して、10mlのイソプロパノールを使用してHCO-60を除去するために10℃で処理した。10分間撹拌後、得られたエマルジョンをろ過し(0.45mmmフィルター膜)、そのろ過液を凍結乾燥器を利用して24時間乾燥した。オリーブ油またはPBS緩衝溶液内の改質されないヘパリンを対照群にしてマウスに経口投与した場合、凝固時間が増加しないことが分かった。反面、オリーブ油またはミネラル油に含有されたヘパリン-DOCAをマウスに経口投与した場合、凝固時間は図11と同様に増加した。
ソルビトールを利用した逆相ヘパリン-DOCAの錠剤製造方法
まず、実施例13により製造した逆相ヘパリン-DOCA粉末及びソルビトール(3vol)を混合した。得られた混合物の重量を測定し、結合剤を徐々に添加した(1μl結合剤溶液/10 mg)。本方法で、結合剤として7.5%ポリビニルピロリドン及び25%エタノールを使用した。得られた粉末及び顆粒剤を前記結合剤及び1%潤滑剤(ステアリン酸マグネシウム)と共に混合した。溶液の濃度を測定した後、圧力計(400ポンド)に装着した後、加圧した。錠剤を製造した後、室温で乾燥した。
ソルビトール及びDOCAを利用した逆相ヘパリン-DOCAの錠剤製造方法
ソルビトール(3vol)、デオキシコール酸及び逆相ヘパリン-DOCA粉末を混合した。前記混合物の重さを測定した後、結合剤を徐々に添加した(1ml結合剤溶液/10mg)。本方法で、結合剤として7.5%ポリビニルピロリドン及び25%エタノールを使用した。得られた粉末及び顆粒剤を前記結合剤及び1%潤滑剤(ステアリン酸マグネシウム)と共に混合した。溶液の濃度を測定した後、圧力計(400ポンド)に装着した後、加圧した。錠剤を製造した後、室温で乾燥した。
二相性溶出錠剤(Biphasic release tablet)方法を利用した逆相ヘパリン-DOCAの錠剤 製造方法
トウモロコシの澱粉のような希釈剤を逆相ヘパリン-DOCAと混合した。1%メチルセルロース溶液を添加した。前記溶液を25-メッシュの篩を利用してろ過した後、40℃で 乾燥した。与えられた含量の崩壊剤を添加して胃腸内での速い溶出を誘導した。前記崩壊剤としては、ポリビニルピロリドン及びナトリウムスターチグリコレートを使用した。得られた混合物にステアリン酸マグネシウム及び二酸化コロイドシリコンを添加した後、15分間撹拌した。得られた溶液に色々な濃度のヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)を混合して拡張された溶出層を形成させた。
二相性溶出錠剤方法を利用し、DOCA(界面活性剤)が含まれた逆相ヘパリン-DOCAの錠剤製造方法
トウモロコシの澱粉のような希釈剤及びデオキシコール酸を逆相ヘパリン-DOCAと混合した、1%メチルセルロース溶液を添加した。得られた溶液を25-メッシュの篩を利用してろ過した後、40℃で乾燥した。与えられた含量の崩壊剤を添加して胃腸内での速い溶出を誘導した。前記崩壊剤としては、ポリビニルピロリドン及びナトリウムスターチグリコレートを使用した。得られた混合物にステアリン酸マグネシウム及び二酸化コロイドシリコンを添加した後、15分間撹拌した。得られた溶液に色々な濃度のヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)を混合して拡張された溶出層を形成させた。
顆粒化方法を利用した逆相ヘパリン-DOCAの錠剤製造方法
逆相ヘパリン(ヘパリン-DOCA)を0.04または0.027インチのふるいを通過させろ過した。得られた溶液に15分間撹拌させたポリビニルピロリドン(Mw : 100万, PVP)及び結合剤を添加させ混合した。前記撹拌した物質及び結合剤は、全体混合物に対して3.4%まで混合させた。得られた混合物を50KNの圧力で圧搾機を用いて加圧して錠剤を製造した。
粉末で充填された逆相ヘパリン-DOCAのゼラチンカプセルの錠剤製造方法
硬質のゼラチンカプセルにDOCA及び逆相ヘパリン-DOCAを充填させた。前記カプセルを5%(w/w)のエタノール溶液を利用して密封した後、スプレー方式で再びコーティングした。ユドラジィ(Eudragit)E100(アクリル酸ポリマー; Rohm Pharm, Darmstadt, ドイツ)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート(HPMC-AS)をコーティング材料に使用した。
溶液で充填された逆相ヘパリン-DOCAのゼラチンカプセル錠剤製造方法
逆相ヘパリン-DOCA(100mg)を3分間80W速度で超音波処理して10mlミネラル油内に分散させた。続いて、得られた溶液はゼラチンカプセル内に注入した後、密封した。
ユドラジィL100を利用した逆相ヘパリン-DOCAの腸コーティング(enteric coating)法
まず、ユドラジィL100(8w/v%溶液)をイソプロパノール-アセトン(1.7:1 容積比)混合液に溶解させた。逆相ヘパリン-DOCA及び胆汁酸を混合した後、錠剤を製造して腸コーティングを行った。ソルビトール及びヘパリン-DOCA(1vol)を混合した。前記混合物の重さを測定し、ここに結合剤(1μl結合剤溶液/10mg)を徐々に添加した。本方法で、結合剤に7.5%ポリビニルピロリドン及び25%エタノールを使用した。前記溶液の濃度を測定した後、圧力装置(400ポンド)に注入後加圧した。錠剤を製造した後、室温で乾燥した。前記錠剤は、単一溶液を使用して三回浸漬(dip)コーティングを行い、20分間室温で乾燥した。
逆相ヘパリン-DOCAの分散形製造方法
逆相ヘパリン-DOCAの粉末は、大豆油、ミネラル油、オリーブ油及びスクアレンと各々混合した。得られた混合物各々を15,000rpmで10分間均質化した。前記した手続きを経て油内にヘパリン-DOCAが分散された。
A〜Cは、両親媒性ヘパリンのナノ粒子または凝集を図式化したもので、水溶液分散相(図1のA)、有機溶媒分散相(図1のB)、及び界面活性剤存在下の分散相(図1のC)を示す。 図2のA及び図2のBは、マウスにヘパリン-DOCAの経口投与後のaPTT 分析により測定された凝固時間(図2のA)及びFXa分析(図2のB)により測定された凝固時間と濃度を示したグラフである。黒色の逆三角: HMWH黒色の三角: HMWH-DOCA 黒色の四角: 遊離のDOCAと混合したHMWH黒色の丸: 遊離のDOCAと混合したHMWH-DOCA 図3のA及び図3のBは、マウスにヘパリン-DOCAの経口投与後、aPTT(図3のA)及びFXa分析(図3のB)により測定された凝固時間と濃度を示したグラフである。黒色の逆三角: LMWH黒色の三角: LMWH-DOCA黒色の四角: 遊離のDOCAと混合したLMWH黒色の丸: 遊離のDOCAと混合したLMWH-DOCA 図4のAは、LMWH-DOCAと混合したDOCAの経口投与後、aPTTにより測定された凝固時間に対する影響を調べるためにaPTTで測定したグラフで、図4のBは、HMWH-DOCAと混合したDOCAの経口投与後、aPTTにより測定された凝固時間に対する影響を調べるためにaPTTで測定したグラフである。白色バー: 0mg/kg DOCA黒色バー: 33mg/kg DOCA影が付いたバー:100 mg/kg DOCA分節されたバー: 200 mg/kg DOCA 図5のA〜図5のTは、200mg/kg HMWH-DOCA及び200mg/kg DOCAを混合して経口投与後、マウスから分離されたヘマトキシリンとエオシン染色方法により測定した胃腸の顕微鏡写真(×100)で、図5のA〜図5のEは、0、10、30、60及び120分後の胃の断面を測定したもので、図5のF〜図5のJは、0、10、30、60及び120分後の十二指腸の断面を測定したもので、図5のK〜図5のOは、0、10、30、60及び120分後の空腸の断面を測定したもので、図5のP〜図5のTは、0、10、30、60及び120分後の回腸の断面を測定したものである。 図6のA〜図6のTは、200mg/kg LMWH-DOCA及び200mg/kg DOCAを混合して経口投与後、マウスから分離されたヘマトキシリンとエオシン染色方法により測定した胃腸の顕微鏡写真(×100)で、図6のA〜図6のEは、0、5、10、30、及び60分後の胃の断面を測定したもので、図6のF〜図6のJは、0、5、10、30、及び60分後の十二指腸の断面を測定したもので、図6のK〜図6のOは、0、5、10、30、及び60分後の空腸の断面を測定したもので、図6のP〜図6のTは、0、5、10、30、及び60分後の回腸の断面を測定したものである。 図7のA〜図7のTは、200mg/kg HMWH-DOCAと200mg/kg DOCAを混合して経口投与後、マウスから分離された胃腸の膜または絨毛を電子顕微鏡(×25,000)で測定した写真で、図7のA〜図7のEは、0、10、30、60及び120分後の胃の断面を測定したもので、図7のF〜図7のJは、0、10、30、60及び120分後の十二指腸の断面を測定したもので、図7のK〜図7のOは、0、10、30、60及び120分後の空腸の断面を測定したもので、図7のP〜図7のTは、0、10、30、60及び120分後の回腸の断面を測定したものである。 図8のA〜図8のTは、200mg/kg LMWH-DOCAと200mg/kg DOCAを混合して経口投与後、胃腸の膜または絨毛を電子顕微鏡(×25,000)で測定した写真で、図8のA〜図8のEは、0、5、10、30、及び60分後の胃の断面を測定したもので、図8のF〜図8のJは、0、5、10、30、及び60分後の十二指腸の断面を測定したもので、図8のK〜図8のOは、0、5、10、30、及び60分後の空腸の断面を測定したもので、図8のP〜図8のTは、0、5、10、30、及び60分後の回腸の断面を測定したものである。 図9は、油相でのヘパリン-DOCAの凝固時間を示したグラフである。黒色の逆三角: スクアレン黒色の三角: 大豆油黒色の四角: ミネラル油黒色の丸: オリーブ油 Aは、油または緩衝溶液相のHMWHまたはHMWH-DOCAの凝固時間を示したグラフである。黒色の逆三角: PBS緩衝溶液相のHMWH黒色の三角: オリーブ油相のHMWH黒色の四角: ミネラル油相のHMWH-DOCA黒色の丸: オリーブ油相のHMWH-DOCA図10のBは、油または緩衝溶液でのLMWHまたはLMWH-DOCAの凝固時間を示したグラフである。黒色の逆三角: オリーブ油相のLMWH(6K)黒色の三角: PBS相のLMWH(6K)黒色の四角: ミネラル油相のLMWH(6K)-DOCA黒色の丸: オリーブ油相のLMWH(6K)-DOCA W/Oエマルジョン中でエマルジョン化させた後、油相でのヘパリン-DOCAの凝固時間を示したグラフである。黒色の逆三角: PBS相のHMWH黒色の三角: オリーブ油相のHMWH黒色の四角: ミネラル油相のHMWH-DOCA黒色の丸: オリーブ油相のHMWH-DOCA

Claims (11)

  1. (a) デオキシコール酸と共有結合したヘパリンを含む両親媒性ヘパリン誘導体を、両親媒性ヘパリン誘導体が前記薬学的に許容可能な水溶性溶媒内でデオキシコール酸を内側に凝集させたナノ粒子が形成されるように、薬学的に許容可能な水溶性溶媒に溶解させる段階、ならびに
    (b) 前記薬学的に許容可能な水溶性溶媒中のナノ粒子と薬学的に許容可能な界面活性剤を混合し、続いて前記薬学的に許容可能な界面活性剤が、ヘパリン及びデオキシコール酸と相互作用するようにナノ粒子を崩壊し、一部のデオキシコール酸が前記ナノ粒子の外側に露出され、界面活性剤とデオキシコール酸とを会合させる段階、
    を含む、ヘパリンの粘膜吸収を増大させるための組成物の製造方法。
  2. ヘパリンが、低分子量ヘパリン、高分子量ヘパリン、ヘパリン断片、組換えヘパリン、ヘパリン類似体、ヘパリン活性を含む多糖類、及びこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の方法。
  3. 薬学的に許容可能な界面活性剤が陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両親媒性界面活性剤、疎水性界面活性剤、及びこれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
  4. 薬学的に許容可能な界面活性剤が、胆汁酸である、請求項１に記載の方法。
  5. 胆汁酸がデオキシコール酸である、請求項４に記載の方法。
  6. 請求項１に記載の方法で調製した組成物。
  7. デオキシコール酸と共有結合したヘパリンを含む両親媒性ヘパリン誘導体と、薬学的に許容可能な界面活性剤とを含み、外側の表面に露出した一部のデオキシコール酸に該界面活性剤が会合し、かつ、残りのデオキシコール酸が内側に凝集した複数の両親媒性ヘパリン誘導体からなるナノ粒子を含む組成物。
  8. 薬学的に許容可能な界面活性剤が陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両親媒性界面活性剤、疎水性界面活性剤、及びこれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項７に記載の組成物。
  9. 薬学的に許容可能な界面活性剤が、胆汁酸である、請求項７に記載の組成物。
  10. 胆汁酸がデオキシコール酸である、請求項９に記載の組成物。
  11. (a) デオキシコール酸と共有結合したヘパリンを含む両親媒性ヘパリン誘導体と、薬学的に許容可能な界面活性剤とを含み、外側の表面に露出した一部のデオキシコール酸に該界面活性剤が会合し、かつ、残りのデオキシコール酸が内側に凝集した複数の両親媒性ヘパリン誘導体からなるナノ粒子の有効量、ならびに
    (b) 薬学的に許容可能な担体
    との混合物を含む剤形。
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