CN115381851B - 一种自组装纳米抗凝、溶栓药物、其制备方法及应用 - Google Patents

一种自组装纳米抗凝、溶栓药物、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种自组装纳米抗凝、溶栓药物、其制备方法及应用，该药物通过以下方法制备，将Tempol和低分子肝素溶解在预热甲酰胺中，加入N‑羟基丁二酰亚胺，N‑(3‑二甲氨基丙基)‑N'‑乙基碳二亚胺，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入含羧基的疏水化合物的有机溶剂中反应，之后将上述混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析去除有机溶剂，即可得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物通过静脉注射以改善妊娠期血液高凝状态以及防治相关妊娠期疾病。该纳米抗凝、溶栓药物合成简单，价格低廉，自组装法简单易行，有机溶剂容易去除，稳定性较好、无免疫原性，同时该药物不透过胎盘屏障进入胎儿，保证了妊娠期胎儿发育的安全。

Description

一种自组装纳米抗凝、溶栓药物、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及纳米抗凝、溶栓药物领域，具体是一种自组装纳米抗凝、溶栓药物、该抗凝溶栓药物的制备方法及其通过改善妊娠期血液高凝状态防治妊娠期疾病的应用并验证纳米药物对母体和胎儿的安全性。
背景技术
妊娠期血液高凝状态是妊娠期一种常见生理现象，可引起许多产科疾病和并发症，导致不良妊娠结局。妊娠期血液高凝状态与妊娠期深静脉血栓(DVT)、子痫前期(PE)、胎盘早剥、胎盘梗死、弥漫性血管内凝血(DIC)、胎儿生长受限(FGR)、反复流产、死胎、早产和死产等疾病的病理生理过程有关,给公共卫生健康和社会经济带来严重挑战。因此，改善妊娠期血液高凝状态成为目前妊娠性疾病的研究热点及难点。在确定高危患者或者确诊后必需采取适当的防治措施改善妊娠期血液高凝状态。目前，临床用于改善血液高凝状态的药物和手段包括皮下注射低分子肝素、口服抗凝药物阿司匹林；或者联合使用机械性血栓预防，例如循序加压弹力袜或者间歇充气加压装置；在严重的情况下也必需进行手术干预例如导管溶栓，机械血栓清除或者终止妊娠。
抗凝药物主要针对凝血酶和凝血因子发挥抗凝效果，但很多抗凝药物例如肝素对凝血酶的抑制作用不完全且不稳定，存在肝素诱导的血小板减少症(HIT)等副作用；低分子肝素半衰期短，需要频繁注射，患者依从性差；机械性的血栓预防主要是采用各种辅助装置和器械，促进下肢的静脉回流，以减少静脉血栓的发生，一般与抗凝药物联用，单一使用治疗效果不理想；而手术干预去除血栓的风险大，特别是针对妊娠期，手术干预会影响妊娠结局，不推荐孕妇使用。
为了克服上述问题，近年来开发了一些新型抗凝溶栓药物，包括单靶点抗凝药、嵌段共聚物和纳米材料等。其中，纳米抗凝溶栓药物因其良好的抗凝效果和长效的循环时间，具有较大的临床应用价值，备受研究人员的关注。比如通过独特的DNA自组装技术，有效识别、结合凝血酶，稳定抑制凝血酶的活性而产生抗凝效果；或者通过负载抗凝血剂的凝血酶敏感性纳米颗粒实现自我调节抗血栓系统，在病理环境的触发下，迅速释放抗凝药物和溶栓药物，多功能治疗血栓；亦或将靶向分子引入纳米载体表面，以增加抗凝药物跨越人体屏障到达靶向部分。
尽管上述有关纳米抗凝溶栓药物的研究取得了一定的进展，纳米抗凝溶栓药物还是受到很多限制，例如纳米本身或包载的溶栓药物具有毒性难以用于妊娠期疾病、对母体和胎儿具有不可逆的损伤。另外目前研究的纳米抗凝药物存在储存稳定性差、合成工艺复杂、制备成本高、难以用于临床转化等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种自组装纳米抗凝、溶栓药物的组成、制备方法，同时还验证该纳米抗凝、溶栓药物通过改善妊娠期血液高凝状态防治妊娠期疾病的作用及纳米药物的母体和胎儿安全性。
本发明应用低分子肝素和含羧基的疏水化合物及活性氧清除剂Tempol通过共价键偶联形成具有抗凝、溶栓、ROS清除性材料，该材料具有双亲性的特征，可通过自组装构建新型纳米抗凝、溶栓药物。该纳米药物可以减少凝血因子表达，减弱凝血酶的活性，抑制纤维蛋白原变成纤维蛋白，降低血小板的聚集和激活从而发挥抗凝效果。相关实验证明该纳米药物可以降低tPA的表达，达到溶栓的目的。同时，该纳米药物可发挥抗氧化应激作用抑制大量活性氧(ROS)的产生；并且通过降低中性粒细胞的浸润可发挥抗炎的作用。最后，该纳米药物的主体成分低分子肝素安全性较高，纳米药物不能透过胎盘屏障，对母体和胎儿具有较高的安全性。因此，该多功能纳米药物可以通过抗凝、溶栓、抗炎、清除ROS抑制血栓的发生发展，减少血栓复发的可能。相对于其他抗凝药物，本发明通过自组装制备的纳米抗凝、溶栓药物相对于其他单一功能抗凝药物具有减少血栓复发、安全、同时具备抗凝、溶栓功能等诸多优势，因而有较广阔的应用前景。
鉴于此，本发明采用的技术方案如下：一种自组装纳米抗凝、溶栓药物，由低分子肝素与含羧基的疏水化合物以及活性氧清除剂Tempol通过自组装得到，其中低分子肝素与含羧基的疏水化合物的质量比在0.5:1至8:1之间，低分子肝素与Tempol的质量比在0.5:1至8:1之间，所述纳米抗凝、溶栓剂的粒径在100nm至300nm之间。
所述低分子肝素选自依诺肝素，那屈肝素，达肝素；所述低分子肝素的平均分子量在3000Da至5000Da之间；含羧基的疏水化合物选自各类脂肪酸：1)必需脂肪酸：亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸；2)非必需脂肪酸：共轭亚油酸，硬脂酸，软脂酸，油酸，神经酸。
本发明还提供一种自组装纳米抗凝、溶栓药物的制备方法，包括以下步骤：将Tempol和低分子肝素溶解在预热甲酰胺中，加入N-羟基丁二酰亚胺，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入含羧基的疏水化合物的有机溶剂中反应，之后将上述混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析去除有机溶剂，即可得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。
以上低分子肝素溶液的浓度在10mg/mL至50mg/mL之间，含羧基的疏水化合物的有机溶液的浓度在10mg/mL至50mg/mL之间，Tempol溶液的浓度在2.25mg/mL至22.5mg/mL之间。
本发明进一步提供了自组装纳米抗凝、溶栓药物的应用，包括将所述纳米抗凝、溶栓药物用于静脉注射以改善妊娠期血液高凝状态以及防治相关妊娠期疾病。
所述纳米抗凝、溶栓药物具备抗凝、溶栓、清除ROS、抗炎等多重功能，可以有效防治妊娠期深静脉血栓，减少围产期血栓的复发，是国内外首次应用纳米药物治疗妊娠期深静脉血栓的研究。同时，还可以防治子痫前期、胎儿生长受限和早产相关的妊娠期疾病。
所述纳米抗凝、溶栓药物不能透过胎盘屏障进入胎儿，保证了妊娠期胎儿发育的安全，因此可以用于妊娠期血液高凝状态以及防治相关妊娠期疾病。
本发明具有以下的优点：
1)本发明所使用的肝素均有商品化产品，其合成简单，价格相对低廉，故易于实现相应制剂的产业化。并且，所涉及的肝素均为低分子肝素，具有较高的安全性，临床指南表明其可用于妊娠期相关疾病。
2)本发明采用的自组装法简单易行，且使用的有机溶剂容易去除，保证了最终纳米抗凝、溶栓药物应用的可行性和安全性。
3)本发明所制备的纳米抗凝、溶栓药物为固体，方便储存和携带。
4)本发明所制备的纳米抗凝、溶栓药物的稳定性较好、无免疫原性，保证了体内安全性。
5)本发明所制备的纳米抗凝、溶栓药物具备抗凝、溶栓、清除ROS、抗炎等多重功能，可以有效防治妊娠期深静脉血栓，减少围产期血栓的复发。本发明是国内外首次应用纳米药物治疗妊娠期深静脉血栓的研究。同时，还可以防治子痫前期、胎儿生长受限和早产相关的妊娠期疾病。
6)本发明所制备的纳米抗凝、溶栓药物不透过胎盘屏障进入胎儿，保证了妊娠期胎儿发育的安全，因此可以用于妊娠期血液高凝状态以及防治相关妊娠期疾病。
附图说明
图1为分子量为4500Da的依诺肝素、活性氧清除剂Tempol、必需脂肪酸亚油酸通过自组装制备得到的纳米药物(上图)和分子量为4500Da的那屈肝素、活性氧清除剂Tempol、必需脂肪酸亚油酸通过自组装制备得到的纳米药物(下图)的扫描电镜图和透射电镜图。
图2为Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物清除不同活性氧自由基能力的检测统计图。
图3为空白对照组(0.01M磷酸盐缓冲液)、凝血酶组(0.01M磷酸盐缓冲液)和治疗组(Tempol组，依诺肝素组，Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组)抑制血小板聚集和激活的电镜图，其中标尺为3μm。
图4为空白对照组(0.01M磷酸盐缓冲液)和治疗组(Tempol组，依诺肝素组，Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组)体外抗氯化钙诱导的血液凝聚图片。
图5为空白对照组(0.01M磷酸盐缓冲液)、模型组(0.01M磷酸盐缓冲液)和治疗组(Tempol组，依诺肝素组，Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组)体外抑制过氧化氢诱导细胞产生活性氧的共聚焦显微镜图,其中标尺为20μm。
图6为不同药物治疗妊娠期大鼠髂静脉血栓后的血栓大体形态示意图和血栓重量、长度、tPA表达量、中性粒细胞百分数统计图，其中标尺为1mm。
图7为Cy5/Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物在妊娠期大鼠髂静脉血栓中的荧光分布。
图8为Cy5/Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物在妊娠期大鼠胎盘和胎儿中的荧光分布。
图9为不同药物治疗子痫前期大鼠模型后胎盘的HE染色和子宫动脉阻力指数统计图,其中标尺为50μm。
图10为不同药物治疗胎儿宫内生长受限大鼠模型后胎鼠和胎盘质量统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的发明内容作进一步的详细描述。应理解，本发明的实施例只用于说明本发明而非限制本发明，在不脱离本发明技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
下面结合非限定性的实施例对本发明做详细说明。在自组装过程中，可以控制纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm至300nm之间。
实施例1
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例2
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(40mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有70mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为5mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例3
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(20mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有140mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为10mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例4
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(8mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有350mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为25mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例5
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(4mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有700mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为50mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例6
将100mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和200mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(10mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有140mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为10mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例7
将240mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和30mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(10mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有140mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为10mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例8
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于2.5mL含有25mg亚麻酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为10mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例9
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg花生四烯酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例10
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg共轭亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例11
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg硬脂酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例12
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg软脂酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例13
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例14
将200mg依诺肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg神经酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例15
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例16
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(40mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有70mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为5mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例17
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(20mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有140mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为10mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例18
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量3000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(8mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有350mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为25mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例19
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(4mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有700mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为50mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例20
将100mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和200mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(10mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有140mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为10mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例21
将240mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和30mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(10mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有140mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为10mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例22
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg亚麻酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例23
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg花生四烯酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例24
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg共轭亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例25
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg硬脂酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例26
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg软脂酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例27
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例28
将200mg那屈肝素粉末(平均分子量4500Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg神经酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例29
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例30
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(40mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有70mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为5mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例31
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(20mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有140mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为10mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例32
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(8mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有350mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为25mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例33
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(4mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有700mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为50mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例34
将100mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和200mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(10mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有140mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为10mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例35
将240mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和30mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(10mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有140mg亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为10mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例36
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg亚麻酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例37
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg花生四烯酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例38
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg共轭亚油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例39
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg硬脂酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例40
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg软脂酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例41
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg油酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
实施例42
将200mg达肝素粉末(平均分子量5000Da)和90mg Tempol溶解在预热的甲酰胺中(15mL)，加入N-羟基丁二酰亚胺78mg，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺150mg，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入溶解于14mL含有196mg神经酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，终浓度为14mg/mL,氮气保护下反应12h，之后将上诉混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析72h以去除有机溶剂，真空冻干后得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。该自组装纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100nm-300nm之间。
按照以上实施例1方法和实施例15方法制备的纳米药物的扫描电镜和透射电镜图如图1所示。
图2为Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物清除不同活性氧自由基能力的检测统计图。Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物清除超氧阴离子检测：配置浓度为0.05,0.1,0.15,0.25,0.5,1mg/mL的纳米药物甲醇溶液。根据超氧阴离子检测试剂盒说明书将配置好的试剂与各个浓度的纳米药物混匀，37℃恒温水浴40min，然后加入显色剂，测定其在550nm处的OD值，根据试剂盒说明书计算其清除超氧阴离子的能力；Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物清除自由基DPPH·能力检测：根据DPPH·检测试剂盒说明书，将1.5mL DPPH·(100μg/mL)试剂与3mL不同浓度的纳米药物(0.05，0.1，0.15，0.25，0.5，1，2mg/mL)避光孵育30min，紫外分光光度计测定其在517nm处的吸光度，计算DPPH·清除能力；Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物清除次氯酸根能力检测：根据文献合成自制纳米探针(Lu-bCD NP)，用来检测次氯酸根清除能力，将25μL不同浓度的纳米药物(1，2，3，4，5mg/mL)与475μL含有100mM NaClO溶液混合15min，吸取50μL混合反应物上清液与50μL Lu-bCD NP溶液(10mg/mL)反应，根据标准曲线计算ClO-；纳米药物清除H2O2检测：根据H2O2检测试剂盒，将不同浓度的Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物(0，1，2，4，6mg/mL)与2mL含有50nM H2O2的PBS(0.01M)孵育24h,通过测量405nm处的吸光度来测量残留的H2O2，并计算消除的H2O2。从图2可以看出,Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物可以清除不同的活性氧自由基。
图3为空白对照组(0.01M磷酸盐缓冲液)、凝血酶组(0.01M磷酸盐缓冲液)和治疗组(Tempol组，依诺肝素组，Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组)抑制血小板聚集和激活的电镜图，其中标尺为3μm。SD大鼠麻醉后，静脉取血，将血液储存在肝素抗凝管中，冰上保存。全血4度离心85g 10min得到上层富含血小板的液体(PRP)，PRP用PBS重悬，800g离心10min，保留下层液体，用PBS混匀，使其血小板终浓度为5×108个/mL。扫描电镜观察血小板聚集：8×8mm的玻璃载玻片用盐酸洗净后，滴加100μL混匀的血小板液(5×108/mL)使其附着在盖玻片上，同时加入100μL PBS和含有不同药物的PBS，孵育30min后加入终浓度为1U/mL的凝血酶促血小板聚集，血小板和凝血酶室温孵育10分钟后用电镜固定液固定，梯度的乙醇和叔丁醇脱水，样品脱水后用扫描电镜观察血小板形态，只加入PBS未加入凝血酶诱导血小板聚集作为空白对照组。从图3可以得出结论,相比Tempol组和依诺肝素组,Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组可以更加显著的降低凝血酶诱导下血小板的聚集和激活。
图4为空白对照组(0.01M磷酸盐缓冲液)和治疗组(Tempol组，依诺肝素组，Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组)体外抗氯化钙诱导的血液凝聚图片。SD大鼠麻醉后，静脉取血，将血液储存在枸橼酸钠抗凝管中，冰上保存。将100μL PBS和含有不同药物的PBS加入24孔板中，37℃预热5min，然后每孔中加入300μL全血，再加入50μL 0.2M的氯化钙溶液，置于恒温摇床上37℃振荡孵育5min，依次加入15mL PBS(分5次加入每次3mL)，37℃，30rpm振荡孵育10min后拍照观察。从图4可以得出结论,相比Tempol组和依诺肝素组,Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组可以更加显著的降低氯化钙诱导的血液凝聚。
图5为空白对照组(0.01M磷酸盐缓冲液)、模型组(0.01M磷酸盐缓冲液)和治疗组(Tempol组，依诺肝素组，Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组)体外抑制过氧化氢诱导细胞产生活性氧的共聚焦显微镜图,其中标尺为20μm。细胞以1×105个/孔接种于有载玻片的12孔板中，培养过夜后分别加入空白培养基、含有Tempol、依诺肝素组、Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物的培养基孵育24h，去除培养基后加入含有100μM的H2O2溶液12h诱导ROS产生，移除细胞培养液，加入1mL含有5μM DHE的培养基，细胞培养箱孵育30min，无菌PBS洗涤，4％多聚甲醛固定，细胞核用DAPI染色5min，封片后激光共聚焦观察样本中ROS水平，只加入PBS未加入过氧化氢诱导作为空白对照组。从图5可以得出结论,相比Tempol组和依诺肝素组,Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组可以更加显著的降低过氧化氢诱导下细胞活性氧的产生。
图6为不同药物治疗妊娠期大鼠髂静脉血栓后的血栓大体形态示意图和血栓重量、长度、tPA表达量、中性粒细胞百分数统计图，其中标尺为1mm。将妊娠期第10天的SD雌鼠麻醉后，在下腹部做一中线切口暴露出大鼠左髂动、静脉，分离大鼠左髂静脉，用6-0单丝尼龙线结扎左髂总静脉近端，远端及沿途属支，然后用温的生理盐水清洗并缝合皮肤，缝合伤口处用碘伏棉球消毒，生理盐水组仅开腹后关腹，血栓形成后尾静脉分别注射不同药物(生理盐水，Tempol，依诺肝素，Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物)5天，在妊娠第17天取出血栓进行大体形态学拍照观察，并对其血栓的重量和长度进行统计分析,利用RT-qPCR技术检测血栓中tPA的表达量,利用流式分析技术检测血栓中中性粒细胞的侵润。从图6可以得出结论,相比Tempol组和依诺肝素组,Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组可以更加显著的减少妊娠期大鼠髂静脉血栓的重量和长度，降低血栓中tPA的表达，减少中性粒细胞在血栓组织中的侵润，从而证明了Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物组可以更好的抑制妊娠期大鼠髂静脉血栓的发生发展。
图7为Cy5/Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物在妊娠期大鼠髂静脉血栓中的荧光分布。将妊娠期第10天的SD雌鼠麻醉后，在下腹部做一中线切口暴露出大鼠左髂动、静脉，分离大鼠左髂静脉，用6-0单丝尼龙线结扎左髂总静脉近端，远端及沿途属支，然后用温的生理盐水清洗并缝合皮肤，缝合伤口处用碘伏棉球消毒，在妊娠的第15天尾静脉注射Cy5/Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物4小时后，大鼠安乐死，生理盐水灌注后收集髂静脉用小动物成像系统观察荧光纳米分布。从图7可以得出结论,Cy5/Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物只在血栓处富集而不会在正常的血管聚集。
图8为Cy5/Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物在妊娠期大鼠胎盘和胎儿中的荧光分布。将妊娠期第10天的SD雌鼠麻醉后，在下腹部做一中线切口暴露出大鼠左髂动、静脉，分离大鼠左髂静脉，用6-0单丝尼龙线结扎左髂总静脉近端，远端及沿途属支，然后用温的生理盐水清洗并缝合皮肤，缝合伤口处用碘伏棉球消毒，在妊娠的第15天尾静脉注射Cy5/Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物4小时后，大鼠安乐死，生理盐水灌注后收集大鼠胎儿、胎盘用于小动物成像系统观察荧光纳米分布。从图8可以得出结论,Cy5/Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物只能聚集在胎盘的底蜕膜(即胎盘的母体面)，而在胎儿体内检测不出荧光信号，说明Cy5/Tempol/依诺肝素/亚油酸纳米药物不能透过胎盘屏障影响胎儿。
图9为不同药物治疗子痫前期大鼠模型后胎盘的HE染色和子宫动脉阻力指数统计图,其中标尺为50μm。将孕14天的大鼠异氟烷麻醉后置于恒温手术台，沿下腹正中线开腹,暴露腹主动脉下端、子宫以及卵巢动脉，于腹主动脉下段近髂动脉分叉起始处放置银夹1枚钳夹血管，左右两侧子宫动脉第一分叉前分别置一枚银夹，研究表明该方法可使子宫血流灌注减少到40％，致使胎盘处于缺血缺氧状态，依次缝合肌层和皮肤后常规消毒关腹。生理盐水组仅开腹后关腹，造模后尾静脉分别注射不同药物(生理盐水，Tempol，那屈肝素，Tempol/那屈肝素/亚麻酸纳米药物)7天，在妊娠第20天使用小动物超声进行多普勒测量子宫动脉阻力指数后，取出胎盘多聚甲醛固定进行HE染色进行形态学观察。从图9可以得出结论,子痫前期大鼠模型后胎盘HE染色显示迷路层发育障碍，血流受阻，子宫动脉阻力增加，采用治疗组治疗后，相比Tempol组和那屈肝素组,Tempol/那屈肝素/亚麻酸纳米药物组可以更加显著的减少胎盘损伤，增加胎盘血供，降低子宫动脉血流阻力。
图10为纳米药物治疗胎儿宫内生长受限大鼠模型后胎儿和胎盘质量统计图。SD大鼠妊娠第15天,暴露双侧子宫,记录两侧胎儿数量及发育情况,用微动脉夹阻断左侧子宫动脉20min后恢复血供。生理盐水组仅开腹后关腹，模型建立20分钟后，尾静脉分别注射不同药物(生理盐水，Tempol，达肝素，Tempol/达肝素/油酸纳米药物)5天，在妊娠第20天剖宫产后测量胎儿和胎盘体重，并进行统计分析。从图10可以得出结论,胎儿宫内生长受限大鼠模型降低了胎儿和胎盘重量，采用治疗组治疗后，相比Tempol组和达肝素组,Tempol/达肝素/油酸纳米药物组可以在一定程度上增加胎儿和胎盘重量。
图6-8中所述妊娠期大鼠髂静脉血栓模型的建立方法如下：
雌性Sprague-Dawley大鼠(11-12周，240-250g)和雄性Sprague-Dawley大鼠(12-13周，250-260g)购自重庆医科大学实验动物中心。大鼠饲养在标准的棚内，保持昼夜节律和恒温，饲养一周后，按照雌：雄＝2：1的比例交配，雌鼠阴道涂片检查，有精子记为妊娠第0天(G0)，并用于后续实验。将妊娠期第10天的SD雌鼠(G10)麻醉后，在下腹部做一中线切口暴露出大鼠左髂动、静脉，分离大鼠左髂静脉，用6-0单丝尼龙线结扎左髂总静脉近端，远端及沿途属支，然后用温的生理盐水清洗并缝合皮肤，缝合伤口处用碘伏棉球消毒，术后6h开腹可见左髂静脉血栓形成。
图9中所述子痫前期大鼠模型的建立方法如下：
雌性Sprague-Dawley大鼠(11-12周，240-250g)和雄性Sprague-Dawley大鼠(12-13周，250-260g)购自重庆医科大学实验动物中心。大鼠饲养在标准的棚内，保持昼夜节律和恒温，饲养一周后，按照雌：雄＝2：1的比例交配，雌鼠阴道涂片检查，有精子记为妊娠第0天(G0)，并用于后续实验。将孕14天的大鼠异氟烷麻醉后置于恒温手术台，沿下腹正中线开腹,暴露腹主动脉下端、子宫以及卵巢动脉，于腹主动脉下段近髂动脉分叉起始处放置银夹1枚钳夹血管，左右两侧子宫动脉第一分叉前分别置一枚银夹，研究表明该方法可使子宫血流灌注减少到40％，致使胎盘处于缺血缺氧状态，依次缝合肌层和皮肤后常规消毒关腹。
图10中所述胎儿宫内生长受限大鼠模型的建立方法如下：
雌性Sprague-Dawley大鼠(11-12周，240-250g)和雄性Sprague-Dawley大鼠(12-13周，250-260g)购自重庆医科大学实验动物中心。大鼠饲养在标准的棚内，保持昼夜节律和恒温，饲养一周后，按照雌：雄＝2：1的比例交配，雌鼠阴道涂片检查，有精子记为妊娠第0天(G0)，并用于后续实验。SD大鼠妊娠第15天,暴露双侧子宫,记录两侧胎儿数量及发育情况,用微动脉夹阻断左侧子宫动脉20min后恢复血供。
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Claims (6)

1.一种自组装纳米抗凝、溶栓药物，其特征在于：由低分子肝素与含羧基的疏水化合物以及活性氧清除剂Tempol通过自组装得到，其中低分子肝素与含羧基的疏水化合物的质量比在0.5 : 1至8 : 1之间，低分子肝素与Tempol的质量比在0.5 : 1至8 : 1之间，纳米抗凝、溶栓药物的粒径在100 nm至300 nm之间；所述自组装纳米抗凝、溶栓药物通过以下制备方法制备得到：
将Tempol和低分子肝素溶解在预热甲酰胺中，加入N-羟基丁二酰亚胺，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入含羧基的疏水化合物的有机溶剂中反应得到混合液，之后将上述混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析去除有机溶剂，即可得到自组装纳米抗凝、溶栓药物；
所述低分子肝素选自依诺肝素，那屈肝素或达肝素，所述低分子肝素的平均分子量在3000 Da至5000 Da之间；
所述含羧基的疏水化合物亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸，共轭亚油酸，硬脂酸，软脂酸，油酸或神经酸。
2.权利要求1所述自组装纳米抗凝、溶栓药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将Tempol和低分子肝素溶解在预热甲酰胺中，加入N-羟基丁二酰亚胺，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺，混合物在室温氮气气氛下搅拌24小时后加入含羧基的疏水化合物的有机溶剂中反应得到混合液，之后将上述混合液置于透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中透析去除有机溶剂，即可得到自组装纳米抗凝、溶栓药物。
3.根据权利要求2所述自组装纳米抗凝、溶栓药物的制备方法，其特征在于：所述低分子肝素溶液的浓度在10 mg/mL至50 mg/mL之间，含羧基的疏水化合物的有机溶液的浓度在10 mg/mL至50 mg/mL之间，Tempol溶液的浓度在2.25 mg/mL至22.5 mg/mL之间。
4.权利要求1所述自组装纳米抗凝、溶栓药物在制备防治妊娠期血液高凝状态及妊娠期血液高凝状态相关妊娠期疾病药物中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述妊娠期血液高凝状态相关妊娠期疾病包括妊娠期深静脉血栓、子痫前期、胎儿生长受限和早产。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述纳米抗凝、溶栓药物不能透过胎盘屏障进入胎儿。
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