JP2001299245A - プロポリス製剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 粘膜付着性を有することにより消化管内に滞
留する時間を延長させることができ、生体内において持
続的に薬効を発揮することができるうえに、有効成分の
吸収効率を向上させることができるプロポリス製剤及び
その製造方法を提供する。 【解決手段】 微小な粒子形状をなすプロポリス製剤
は、プロポリスがキトサンで内包された構成となってい
る。キトサンの平均分子量は１０，０００〜２００，０
００であるのが好ましい。また、プロポリス製剤を構成
するプロポリスは、ポリマー化プロポリスであるのが好
ましい。このプロポリス製剤の製造は、プロポリス溶液
とキトサン溶液とを界面活性剤の存在下で混合して混合
液を調製する工程、その混合液を油相に添加してエマル
ジョンを形成する工程、そのエマルジョンから溶媒を留
去する工程を順に経て行われる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品、健康食
品、化粧品等に利用されるプロポリス製剤及びその製造
方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】プロポリスは古来より民間療法薬として
使用されており、近年においても胃癌や胃潰瘍の原因と
なるピロリ菌に対する効果が発見される等、種々の有用
な生理作用が知られている。このプロポリスを摂取する
場合、従来は、プロポリス原塊から一部の成分を抽出し
た抽出物の他、賦形剤を加えて形成した打錠品、カプセ
ル剤など、各種形態の製品を服用することにより行われ
ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ところが、前記生理作
用を発揮する有効成分は、フラボノイド類、フェノール
性有機酸類及びそのエステル等であり、その多くは水に
対する溶解度が小さく、消化管内を容易に流下してしま
う。このため、それらの有効成分が消化管内に滞留する
時間は短く、薬効が一時的にしか発揮されないという問
題があった。また、その限られた時間の中でしか吸収さ
れないために、多くが生体内に吸収されることなく体外
に排出されてしまうという問題があった。

【０００４】本発明は、上記のような従来技術に存在す
る問題点に着目してなされたものである。その目的とす
るところは、粘膜付着性を有することにより消化管内に
滞留する時間を延長させることができ、生体内において
持続的に薬効を発揮することができるうえに、有効成分
の吸収効率を向上させることができるプロポリス製剤及
びその製造方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、請求項１に記載の発明は、プロポリスをキトサン
の高分子マトリックス中に内包させることにより粘膜付
着性を持たせたことを要旨とする。

【０００６】請求項２に記載の発明は、請求項１に記載
のプロポリス製剤において、前記キトサンの平均分子量
が１０，０００〜２００，０００であることを要旨とす
る。請求項３に記載の発明は、請求項１又は請求項２に
記載のプロポリス製剤において、前記プロポリスがポリ
マー化プロポリスであることを要旨とする。

【０００７】請求項４に記載の発明は、プロポリス溶液
とキトサン溶液とを界面活性剤の存在下で混合して混合
液を調製する工程と、その混合液を油相に添加してエマ
ルジョンを形成する工程と、そのエマルジョンから溶媒
を留去する工程とを備えたことを要旨とする。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体化した一実施
形態を詳細に説明する。本実施形態におけるプロポリス
製剤は、キトサンより形成される被膜でプロポリスを被
覆することにより、プロポリスをキトサンの高分子マト
リックス中に内包した構成となっている。このプロポリ
ス製剤は微小な粒子形状、具体的には粒子径１０μｍ以
下の球状の形態をなしている。そして、プロポリス製剤
は、粒状の形態のままで、又は液中に分散させて液剤に
して、又は賦形剤を加えて錠剤にして、又はカプセルに
内包させて医薬品、健康食品、化粧品等に利用される。

【０００９】まず、プロポリス製剤を構成するプロポリ
スについて説明する。プロポリスとは、プロポリス原塊
に由来するもので、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗酸化
作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用、抗潰瘍作用、局所麻酔
作用、免疫賦活作用、抗アレルギー作用、鎮痛作用等、
種々の有用な生理作用を示す有効成分を少なくとも含む
ものである。この有効成分としては、具体的には、ケル
セチン、クリシン、ケンフェロール等のフラボノイド
類、カフェ酸、桂皮酸、フェルラ酸、クマル酸、クロロ
ゲン酸等のフェノール性有機酸類及びそのエステル等が
挙げられる。

【００１０】また、プロポリス製剤を構成するプロポリ
スは、ポリマー化プロポリスであるのが好ましい。ポリ
マー化プロポリスとは、低分子成分が重合したプロポリ
スをいい、プロポリスを酸化還元酵素で処理することに
よって得られる。前記酸化還元酵素としては、ラッカー
ゼ、チロシナーゼ、フェノラーゼ、ビリルビンオキシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、ア
スコルビン酸オキシダーゼ、ｏ−アミノフェノールオキ
シダーゼ、各種オキシゲナーゼ等が挙げられ、これらの
酵素は単独で又は組み合わせて使用される。

【００１１】なお、前記プロポリス原塊の産地は特に限
定されるものでなく、ブラジル、中国、日本、米国、ヨ
ーロッパ諸国、オセアニア諸国等、いずれであっても良
い。次に、キトサンについて説明する。キトサンは、キ
チンの部分的脱アセチル化物、塩基性多糖の一種であ
り、生体内分解性及び生体適合性に優れている。また、
抗腫瘍作用、降コレステロール作用、血圧調節作用等の
生理作用を示すことが知れられている。プロポリス製剤
に用いるキトサンは、平均分子量が１０，０００〜２０
０，０００のものが好ましく、５０，０００〜１００，
０００のものがより好ましい。

【００１２】続いて、プロポリス製剤の製造方法につい
て説明する。プロポリス製剤の製造は、プロポリス溶液
とキトサン溶液とを界面活性剤の存在下で混合して混合
液を調製する第１の工程、その混合液を油相に添加して
エマルジョンを形成する第２の工程、そのエマルジョン
から溶媒を留去する第３の工程を順に経て行われる。

【００１３】まず、第１の工程では、プロポリス溶液と
キトサン溶液、それぞれの調製が行われる。プロポリス
溶液は、プロポリス原塊そのものを用いて、又はプロポ
リス原塊に含まれる一部の成分を選択的に抽出した抽出
物を用いて、又はそれらを酸化還元酵素で処理したポリ
マー化プロポリスを用いて調製される。ただし、プロポ
リス原塊には夾雑物が含まれているので、抽出物又は抽
出物を酸化還元酵素で処理したものが好ましい。前記抽
出物としては、プロポリス原塊を水で抽出した水抽出
物、メタノール、エタノール、アセトン等の親水性有機
溶媒で抽出した親水性有機溶媒抽出物等が挙げられる。
抽出物又は抽出物を酸化還元酵素で処理したものからプ
ロポリス溶液を調製する場合、それが液状のときは、そ
のままプロポリス溶液としてもよいし、希釈又は濃縮し
たものをプロポリス溶液としてもよい。また、粉末等の
固形状の場合には、それを溶媒に溶解したものがプロポ
リス溶液とされる。プロポリス溶液の固形分濃度は、１
〜５０重量％が好ましく、溶解性の点から１〜２０重量
％がさらに好ましい。プロポリス溶液の溶媒は、プロポ
リスを溶解できるものであればよく、具体的には、抽出
の際にも用いられる親水性有機溶媒や水等が用いられる
が、その中でも食品として許容される水、エタノールが
好ましい。

【００１４】一方、前記キトサン溶液の溶媒には、酸性
の水が用いられる。キトサン溶液のキトサン濃度は、１
〜５０重量％が好ましく、溶解性の点から１〜２０重量
％がさらに好ましい。

【００１５】また、プロポリス溶液とキトサン溶液のう
ち少なくとも一方には界面活性剤が含まれている。この
界面活性剤は、混合液中でプロポリスとキトサンが静電
気的に結合するのを防ぐ目的で用いられる。界面活性剤
の種類は特に限定されないが、水への親和性の点からＨ
ＬＢが１１〜１５のものが好ましい。

【００１６】そして、上記のように構成されるプロポリ
ス溶液とキトサン溶液が混合されて前記混合液とされ
る。この混合は、プロポリス溶液とキトサン溶液のうち
の一方を攪拌下で他方に添加することによって、例え
ば、攪拌した状態のキトサン溶液にプロポリス溶液を滴
下することによって行われる。

【００１７】次に、第２の工程では、上記のようにして
得られた混合液を攪拌下の油相に対して滴下する。この
とき、混合液の溶媒の油相への移行が遅れる結果、添加
された混合液は一時的に相分離を生じ、混合液中に含ま
れていたプロポリスとキトサンがエマルジョン滴となっ
て分散するとともに、キトサンがプロポリスのエマルジ
ョン滴表面に吸着する。

【００１８】この滴下の際の攪拌は、１００〜７００ｒ
ｐｍが好ましい。これが１００ｒｐｍ未満では分散性が
悪くなり、逆に７００ｒｐｍを超えると収率が低下す
る。また、油相の温度は３０〜６０℃が好ましい。３０
℃未満では粘性が高いために攪拌しにくく、逆に６０℃
を超えると取扱いにくい。

【００１９】また、油相には、中鎖脂肪酸トリグリセリ
ドを好適に用いることができるが、前記混合液の溶媒と
混合しないものであれば特に限定されない。ここで、中
鎖脂肪酸トリグリセリドとは、中鎖脂肪酸トリグリセリ
ド分子を形成する各脂肪酸の総炭素数が８〜１２のもの
である。また、油相には、予めポリグリセリン縮合リシ
ノレイン酸エステルを添加したものを用いてもよい。こ
の場合、粘性が下がるために扱いやすくなる。

【００２０】続く第３の工程は、エマルジョンに含まれ
る溶媒を留去して結晶を析出させる工程である。この留
去は、エマルジョンを１００〜７００ｒｐｍで攪拌した
状態で、加熱又は減圧して行われる。すると、溶解度の
低下に伴ってキトサンの結晶が析出成長し、プロポリス
をキトサンで内包した微粒子が油相中に分散した分散液
が得られる。

【００２１】この分散液は、そのままでプロポリス製剤
として医薬品等に利用してもよいが、分散液から微粒子
を単離して用いてもよい。単離する場合には、まず、分
散液にエタノール、アセトン等の親水性有機溶媒を加え
て攪拌を行い、油相の油を親水性有機溶媒に溶解させ
る。次に、１μｍ以下のフィルタで濾過を行い、フィル
タ上に残った微粒子を回収する。ここで得られる微粒子
の表面には溶解しきれなかった油が付着して残っている
ので、親水性有機溶媒によって洗浄を繰り返し行って完
全に油を除去するのが好ましい。そして、回収された微
粒子を減圧下乾燥することにより、目的とするプロポリ
ス製剤が得られる。

【００２２】以上詳述した本実施形態によれば次のよう
な効果が発揮される。 ・ 本実施形態におけるプロポリス製剤は、消化管の粘
膜に対して高い付着性を有しているため、容易に流下し
てしまうことなく、消化管内に長く滞留することが可能
である。従って、プロポリス製剤に含まれる有効成分の
生体内への吸収効率を向上させることができる。よっ
て、プロポリスが備える種々の有用な生理作用による効
果（薬効）をさらに増強することができる。また、その
効果を従来よりも少量の服用で発揮することができるの
で、患者（消費者）の負担を軽減することができる。

【００２３】・ プロポリス製剤の消化管の粘膜に対す
る付着性は、酸性の領域においても変わることがなく高
いため、酸性の高い胃や十二指腸の粘膜にも高い付着性
を発揮することができる。よって、プロポリスによる胃
潰瘍、胃癌、十二指腸潰瘍、胃腸炎の抑制効果をさらに
増強することが可能である。

【００２４】・ プロポリス製剤は、消化管の粘膜に対
して高い付着性を有するうえに、プロポリスを徐々に放
出する徐放性も有している。このため、プロポリスの生
体内への吸収は持続的に行われる。よって、生体内にお
いて薬効を持続的に発揮させることができる。

【００２５】・ プロポリス製剤を構成するキトサンの
平均分子量を１０，０００〜２００，０００とすること
により、収率を向上させることができるとともに、適切
な速度でプロポリスを溶出させることが可能となる。加
えて、プロポリス製剤の形態を滑らかな球状とすること
ができる。キトサンの平均分子量が１０，０００未満で
あると、プロポリスのアニオン成分とキトサンとが静電
気的に結合することにより、凸凹した形態のプロポリス
製剤となり、プロポリスが激しく漏出して凝集するおそ
れがある。逆に２００，０００を超えると、プロポリス
製剤の粒径が大きくなるために消化管の粘膜に対する付
着性が低下する。また、プロポリスの適度な溶出が得ら
れない。

【００２６】・ プロポリス製剤を構成するプロポリス
をポリマー化プロポリスにすることによっても収率を向
上させることができる。 ・ 本実施形態におけるプロポリス製剤は、プロポリス
がキトサンで内包された構成であるため、プロポリスと
キトサンが単にイオン的に結合しただけの構成に比べ
て、優れた粘膜付着性、徐放性を発揮することができ
る。

【００２７】・ キトサンでプロポリスが内包された構
成であるので、従来のプロポリス製品のように経時的固
結を起こすおそれがない。 ・ キトサンは皮膚親和性に優れ、消化管の粘膜だけで
なく皮膚にも高い付着性を示すことが知られている。こ
のため、プロポリス製剤を化粧品に利用することによ
り、プロポリスの日焼け防止作用、抗炎症作用、抗菌作
用等を肌に対して有効に発揮させることができる。

【００２８】

【実施例】実施例、比較例及び試験例を挙げて前記実施
形態をさらに具体的に説明する。 （比較例１）ブラジル産のプロポリス原塊１ｋｇを粉砕
し、これに１．５倍量の９５％エタノールを加えて室温
で３時間攪拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離を行い、上清を分取した。次に、その上清を濾紙（Ｎ
ｏ２）で自然濾過し、その濾液を一晩冷凍庫に入れて脱
ロウした後、再度濾紙（Ｎｏ２）で吸引濾過を行うこと
により、液状のエタノール抽出物（エタノール抽出液）
を得た。また、このエタノール抽出液を飴状になるまで
濃縮し、さらに減圧下乾燥を行うことにより、粉末状の
エタノール抽出物（エタノール抽出粉末）を得た。

【００２９】（比較例２）比較例１で得られるエタノー
ル抽出液を固形分５０％になるまで濃縮してエタノール
抽出エキスとし、そのエタノール抽出エキス２リットル
を、ミキサーで攪拌したデキストリン１ｋｇに徐々に添
加した。全体が均質となるように混合した後、棚式の温
風乾燥機にて５０℃で２４時間乾燥し、その後６０メッ
シュの篩で篩分けすることにより、粉末状のエタノール
抽出物（エタノール抽出粉末）を得た。

【００３０】（実施例１）比較例１で得られるエタノー
ル抽出液を固形分が２０％になるまで濃縮してエタノー
ル抽出エキスとし、そのエタノール抽出エキス１．８ｍ
ｌをエタノール２７ｍｌに溶解することによりプロポリ
ス溶液を得た。また、平均分子量が約１，０００のキト
サン（キトサンオリゴ糖）３６０ｍｇと、界面活性剤
（サンソフトＱ８１Ｆ モノミリスチン酸デカグリセリ
ン（ＨＬＢ＝１４．５））６００ｍｇとを、０．１Ｎ酢
酸バッファー２４ｍｌに溶解することによりキトサン溶
液を得た。そして、プロポリス溶液を攪拌下のキトサン
溶液に添加し、さらに３０分間攪拌を行うことで、プロ
ポリスとキトサンと界面活性剤とを含む混合液を得た。

【００３１】次に、２％のHexaglyn PR-15（ポリリシノ
ール酸ヘキサグリセリル）を含むトリエスターＦ８１０
（トリグリセリル）２１０ｍｌを４０℃に加熱するとと
もに４００ｒｐｍで攪拌し、そこに前記混合液を添加し
た。続いて、４００ｒｐｍで攪拌した状態のまま、４０
℃、真空下で６時間溶媒を留去することにより、微粒子
が油相に分散した分散液を得た。この分散液にエタノー
ル２１０ｍｌを加えて０．８μｍのメンブランフィルタ
で濾過した後、フィルタ上に残った微粒子を回収し、再
度２１０ｍｌのエタノールを添加して濾過を行った。そ
して、フィルタ上に残った微粒子を回収し、それを減圧
下乾燥することにより、プロポリスがキトサンで内包さ
れたプロポリス製剤３８３ｍｇを得た。

【００３２】（実施例２）実施例１において、キトサン
に平均分子量が約３００，０００のものを用いるように
変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、直径８〜
１０μｍの微小球状のプロポリス製剤５９１ｍｇを得
た。

【００３３】（実施例３）実施例１において、キトサン
に平均分子量が約５０，０００のものを用いるように変
更した以外は実施例１と同様の操作を行い、直径２〜３
μｍの微小球状のプロポリス製剤５７７ｍｇを得た。

【００３４】（実施例４）比較例１で得られるエタノー
ル抽出液を固形分が１０％になるまで濃縮してエタノー
ル抽出エキスとし、そのエタノール抽出エキス１．８ｍ
ｌをエタノール２７ｍｌに溶解することによりプロポリ
ス溶液を得た。また、平均分子量が約７０，０００のキ
トサン（キトサンオリゴ糖）３６０ｍｇと、界面活性剤
（ラブラゾール）６００ｍｇとを、蒸留水２４ｍｌに溶
解することによりキトサン溶液を得た。そして、プロポ
リス溶液を攪拌下のキトサン溶液に添加し、さらに３０
分間攪拌を行うことで混合液を得た。

【００３５】次に、２％のHexaglyn PR-15（ポリリシノ
ール酸ヘキサグリセリル）を含むトリエスターＦ８１０
（トリグリセリル）５４ｍｌを４０℃に加熱するととも
に５００ｒｐｍで攪拌し、そこに前記混合液を添加し
た。続いて、５００ｒｐｍで攪拌した状態のまま、４０
℃、真空下で６時間溶媒を留去することにより、微粒子
が油相に分散した分散液を得た。この分散液にエタノー
ル５４ｍｌを加えて１μｍの濾紙で濾過した後、濾紙上
に残った微粒子を回収し、再度５４ｍｌのエタノールを
添加して濾過を行った。そして、濾紙上に残った微粒子
を回収し、それを減圧下乾燥することにより、直径３〜
５μｍの微小球状のプロポリス製剤４５４ｍｇを得た。

【００３６】（実施例５）比較例１で得られるエタノー
ル抽出液を固形分が１０％になるまで濃縮してエタノー
ル抽出エキスとし、そのエタノール抽出エキス５０ｍｌ
に水５０ｍｌを加えて懸濁液とした。この懸濁液にペル
オキシダーゼ（シグマ社製 ＲＺ０．５）５０ｍｇと
０．０１％過酸化水素を添加して、３０℃で５時間反応
させた。その後、溶媒をエバポレータで濃縮し、さらに
凍結乾燥して粉末状のポリマー化プロポリスとし、その
ポリマー化プロポリス３６０ｍｇをエタノール２７ｍｌ
に溶解してプロポリス溶液を得た。また、平均分子量が
約５０，０００のキトサン（キトサンオリゴ糖）３６０
ｍｇと、界面活性剤（サンソフトＱ８１Ｆ モノミリス
チン酸デカグリセリン（ＨＬＢ＝１４．５））６００ｍ
ｇとを、０．１Ｎ酢酸バッファー２４ｍｌに溶解するこ
とによりキトサン溶液を得た。そして、プロポリス溶液
を攪拌下のキトサン溶液に添加し、さらに３０分間攪拌
を行うことで混合液を得た。

【００３７】次に、２％のHexaglyn PR-15（ポリリシノ
ール酸ヘキサグリセリル）を含むトリエスターＦ８１０
（トリグリセリル）２１０ｍｌを４０℃に加熱するとと
もに４００ｒｐｍで攪拌し、そこに前記混合液を添加し
た。続いて、４００ｒｐｍで攪拌した状態のまま、４０
℃、真空下で６時間溶媒を留去することにより、微粒子
が油相に分散した分散液を得た。この分散液にエタノー
ル２１０ｍｌを加えて０．８μｍのメンブランフィルタ
で濾過した後、フィルタ上に残った微粒子を回収し、再
度２１０ｍｌのエタノールを添加して濾過を行った。そ
して、フィルタ上に残った微粒子を回収し、それを減圧
下乾燥することにより、直径２〜３μｍの微小球状のプ
ロポリス製剤６５２ｍｇを得た。

【００３８】（実施例６）比較例１で得られるエタノー
ル抽出液を固形分が１０％になるまで濃縮してエタノー
ル抽出エキスとし、そのエタノール抽出エキス１０ｍｌ
に水９０ｍｌを加えて懸濁液とした。この懸濁液にチロ
シナーゼ（シグマ社製）１ｍｇとフェノラーゼ１ｍｇを
添加して、３０℃で２４時間反応させた。その後、溶媒
をエバポレータで濃縮し、さらに凍結乾燥して粉末状の
ポリマー化プロポリスとし、そのポリマー化プロポリス
１８０ｍｇをエタノール２７ｍｌに溶解してプロポリス
溶液を得た。また、平均分子量が約７０，０００のキト
サン（キトサンオリゴ糖）３６０ｍｇと、界面活性剤
（ラブラゾール）６００ｍｇとを、蒸留水２４ｍｌに溶
解することによりキトサン溶液を得た。そして、プロポ
リス溶液を攪拌下のキトサン溶液に添加し、さらに３０
分間攪拌を行うことで混合液を得た。

【００３９】次に、２％のHexaglyn PR-15（ポリリシノ
ール酸ヘキサグリセリル）を含むトリエスターＦ８１０
（トリグリセリル）５４ｍｌを４０℃に加熱するととも
に５００ｒｐｍで攪拌し、そこに前記混合液を添加し
た。続いて、５００ｒｐｍで攪拌した状態のまま、４０
℃、真空下で６時間溶媒を留去することにより、微粒子
が油相に分散した分散液を得た。この分散液にエタノー
ル５４ｍｌを加えて１μｍの濾紙で濾過した後、濾紙上
に残った微粒子を回収し、再度５４ｍｌのエタノールを
添加して濾過を行った。そして、フィルタ上に残った微
粒子を回収し、それを減圧下乾燥することにより、直径
３〜５μｍの微小球状のプロポリス製剤５１３ｍｇを得
た。

【００４０】（試験例１）実施例１〜６について、使用
したプロポリスのうちキトサンで内包されたプロポリス
の占める割合（内包化率）を下記の式（１）に従って求
めた。その結果を表１に示す。なお、キトサンはプロポ
リス製剤の材料とならなかったものも含めて使用した
分、全てが最後の濾過により回収されるが、キトサンに
内包されなかったプロポリスは最後のエタノール洗浄に
より除去される。このため、下記の式（１）で内包化率
を求めることができる。

【００４１】

【数１】

【００４２】

【表１】 表１の結果より、キトサンの平均分子量が５０，０００
〜３００，０００である実施例２〜４における内包化率
は５０％以上であることが示された。それに対し、キト
サンの平均分子量が１，０００である実施例１では内包
化率がその約１／１０であることが示された。また、ポ
リマー化プロポリスを使用した実施例５，６における内
包化率は、ポリマー化していないプロポリスを使用した
実施例３，４に比べて内包化率が高いことが示された。

【００４３】（試験例２）実施例１，３で得られるプロ
ポリス製剤を電子顕微鏡で撮影した。その写真を図１
（ａ），（ｂ）にそれぞれ示す。同図に示す写真より、
キトサンの平均分子量が１，０００である実施例１が凸
凹した形態であるのに対し、平均分子量が５０，０００
の実施例３は滑らかな球状の形態であることが示され
た。

【００４４】（試験例３）実施例２，３，５で得られる
プロポリス製剤について、プロポリスの溶出挙動を調べ
るために、以下に示す方法で溶出試験を行った。

【００４５】プロポリス製剤１００ｍｇに日本薬局方第
２液２０ｍｌを加えてタッチミキサーで攪拌したものを
サンプル液とし、このサンプル液を３７℃でインキュベ
ートした。インキュベートの開始直前、並びに開始後
１，２，３，７及び９時間を経過したところでサンプル
液を２ｍｌずつ採取した。そして、各液を０．４５μｍ
ＭＦを通し、ＯＤ３１５ｎｍで吸光度を測定してプロポ
リスの溶出量（μｇ／ｍｌ）を求め、さらにその値から
プロポリス製剤に残存するプロポリスの量を百分率で表
す残存率を求めた。時間経過と残存率との関係を表すグ
ラフを図２（ａ）に示すとともに、実施例３，５につい
て、時間の平方根とプロポリスの溶出量との関係を表す
グラフ（Higuchiプロット）を図２（ｂ）に示す。

【００４６】図２（ａ）に示すグラフより、平均分子量
が３００，０００のキトサンを用いた実施例２で得られ
るプロポリス製剤は、２時間を過ぎた以降はほとんどプ
ロポリスの溶出が無く、９時間を過ぎても７０％以上の
プロポリスが残存しており、プロポリスが溶出されにく
いことが示された。それに対し、平均分子量が５０，０
００のキトサンを用いた実施例３，５で得られるプロポ
リス製剤は、時間の経過とともに穏やかにプロポリスを
放出する徐放性を示すことが確認された。また、実施例
３，５で得られるプロポリス製剤は、図２（ｂ）に示す
グラフがほぼ直線状となることから、不溶性高分子であ
るキトサンの中にプロポリスが均一に広がったマトリッ
クス型であることが推察された。

【００４７】（試験例４）比較例２で得られるエタノー
ル抽出粉末及び実施例３，５で得られるプロポリス製剤
について、以下に示す方法で消化管の粘膜に対する付着
性を調べた。

【００４８】Wistar系雄性ラットをエーテルで麻酔して
小腸全体を摘出し、腸管内を生理食塩水で洗浄した後、
小腸上部から長さ約１０ｃｍの断片を切り出した。その
小腸断片を開裂し、再度洗浄した後、下記のように調整
した被検液Ａ〜Ｃのいずれかの中で３７℃、１５分間イ
ンキュベートした。その後、小腸断片を被検液から取り
出し、生理食塩水で洗浄してからホモジネートし、エタ
ノール：酢酸バッファー＝１：１の溶液２．５ｍｌで小
腸断片に付着したプロポリスの抽出を３回行った。続い
て、その抽出液を濃縮乾固し、さらにエタノール：酢酸
バッファー＝１：１の溶液２．５ｍｌで希釈をした後、
その液中に含まれるフラボノイド量（小腸断片に付着し
た総フラボノイド量）をケルセチンを標準品とした比色
法により測定した。また、インキュベート後の小腸断片
を洗浄した洗浄液は回収され、それと小腸断片をインキ
ュベートした後の被検液とを合わせた液（外液）を濃縮
乾固し、エタノール：酢酸バッファー＝１：１の溶液５
ｍｌで希釈した後、その液中に含まれるフラボノイド量
（外液中の総フラボノイド量）を同様に比色法により測
定した。そして、小腸断片に対する付着率を下記の式
（２）に従って求めた。その結果を表２に示す。

【００４９】被検液Ａ：比較例２のエタノール抽出粉末
１５ｍｇ／１０ｍｌ（生理食塩水） 被検液Ｂ：実施例３のプロポリス製剤１５ｍｇ／１０ｍ
ｌ（生理食塩水） 被検液Ｃ：実施例５のプロポリス製剤１５ｍｇ／１０ｍ
ｌ（生理食塩水）

【００５０】

【数２】

【００５１】

【表２】 表２の結果より、実施例３，５で得られるプロポリス製
剤は、比較例２で得られるエタノール抽出粉末に比べて
小腸断片に対する付着性が約２倍高いことが示された。
このことから、前記プロポリス製剤が消化管の粘膜に対
して高い付着性を示すことが示唆された。

【００５２】（試験例５）比較例２で得られるエタノー
ル抽出粉末及び実施例３，５で得られるプロポリス製剤
について、以下に示す方法で酸性領域におけるタンパク
質に対する結合能を調べた。

【００５３】比較例２で得られたエタノール抽出粉末及
び実施例３，５で得られたプロポリス製剤について、そ
れぞれ５％，２５％及び４０％分散液（被検液）を調製
し、各分散液２００μｌに牛血清アルブミンのClark lu
ks buffer（ＣＬＢ，ｐＨ１．６）０．４％溶液１ｍｌ
を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その
後、さらにＣＬＢを３ｍｌ加えて０．２μｍフィルター
で濾過した後、その濾液１００μｌにバイオラッドアッ
セイ試薬を加え、５９５ｎｍにおける吸光度を測定して
濾液中のタンパク質量を求めた。濾液中で検出されるタ
ンパク質は試料（エタノール抽出粉末又はプロポリス製
剤）に結合しなかったものとみなすことができるので、
前記の濾液中のタンパク質量から試料に結合したタンパ
ク質量を求めた。被検液中の試料濃度と、試料に結合し
たタンパク質の割合との関係を表すグラフを図３に示
す。

【００５４】図３に示すグラフより、比較例２で得られ
るエタノール抽出粉末は、ほとんどタンパク質に対する
結合能を有さないことが示された。それに対して実施例
３，５で得られるプロポリス製剤は、酸性領域において
もタンパク質に対する結合能を有し、またそれが濃度依
存的であることが示された。このことから、前記プロポ
リス製剤は胃の粘膜に対しても高い付着性を示すことが
示唆された。

【００５５】（試験例６）比較例１で得られるエタノー
ル抽出粉末及び実施例３，５で得られるプロポリス製剤
について、以下に示す方法で胃の粘膜に対する付着性を
調べた。

【００５６】Wistar系雄性ラットを２４時間絶食させた
後、下記のように調製した被検液Ｄ〜Ｆのいずれかを
０．８ｍｌずつ各ラットに経口投与した。投与後３時間
経過したところでエーテル致死させて胃を摘出し、ＣＬ
Ｂ：９９％エタノール＝１：１の溶液５ｍｌで胃に付着
したプロポリスの抽出を行った。続いて、その抽出液に
２倍量のエタノールを添加して遠心分離を行い、上清を
分取した。そして、その上清をＨＰＬＣにて分析してプ
ロポリス量を測定し、投与したプロポリスに対する前記
プロポリス量の割合（残留率）を求めた。その結果を表
３に示す。なお、表中の値は全てAVE±SD (n=3)を示
す。また、統計学的処理にはStudent t-testを用い、表
中の＊は比較例１に対する有意差が１％以下の危険率で
あることを示す。

【００５７】被検液Ｄ：比較例１のエタノール抽出粉末
（プロポリス換算で３００ｍｇ）／１０ｍｌ（蒸留水） 被検液Ｅ：実施例３のプロポリス製剤（プロポリス換算
で３００ｍｇ）／１０ｍｌ（蒸留水） 被検液Ｆ：実施例５のプロポリス製剤（プロポリス換算
で３００ｍｇ）／１０ｍｌ（蒸留水）

【００５８】

【表３】 表３の結果より、比較例１で得られるエタノール抽出粉
末はほとんど胃に残留していないことが示された。それ
に対して実施例３，５で得られるプロポリス製剤は、投
与後３時間を経過した時点でも比較例１の５０倍量以上
のプロポリスが残留していることが示された。このこと
から、前記プロポリス製剤が胃の粘膜に付着して長時間
にわたって滞留することが示唆された。

【００５９】（試験例７）比較例２で得られるエタノー
ル抽出粉末及び実施例３で得られるプロポリス製剤につ
いて、以下に示す方法で小腸における吸収特性を調べ
た。

【００６０】Wistar系雄性ラットから小腸全体を摘出し
て長さ約１０ｃｍの断片を切り出し、反転させて反転腸
管とした。０．３％グルコースを含むＰＢＳ（−）で洗
浄した後、反転腸管内にリンゲル液約１ｍｌを注入し、
両端を木綿糸で結紮した。次に、下記のように調製した
被検液Ｇ，Ｈ５ｍｌのいずれかが入った三角フラスコ内
に反転腸管を挿入し、酸素を１０分間バブリングした
後、３７℃で３０分間インキュベーションした。インキ
ュベーション開始後１０，３０，６０，９０及び１２０
分を経過したところで反転腸管内の液をサンプリングし
て、各液中に含まれるフラボノイド量をケルセチンを標
準品とした比色法により測定した。反転腸管内で検出さ
れるフラボノイドは小腸で吸収されたものとみなすこと
ができるので、小腸におけるフラボノイドの吸収率を下
記の式（３）に従って求めた。時間経過と吸収率との関
係を表すグラフを図４に示す。

【００６１】被検液Ｇ：比較例２のエタノール抽出粉末
１０ｍｇ／１０ｍｌ（リンゲル液） 被検液Ｈ：実施例３のプロポリス製剤１０ｍｇ／１０ｍ
ｌ（リンゲル液）

【００６２】

【数３】 図４に示すグラフより、比較例２で得られるエタノール
抽出粉末は３０分を経過した後、吸収率が低下すること
が示された。それに対して実施例３で得られるプロポリ
ス製剤は、１２０分を経過した時点でも吸収が持続する
ことが示された。このことから、前記プロポリス製剤の
場合、小腸におけるフラボノイドの吸収が長時間にわた
って持続することが示唆された。

【００６３】（試験例８）比較例１で得られるエタノー
ル抽出粉末及び実施例３で得られるプロポリス製剤につ
いて、以下に示す方法で抗潰瘍作用を調べた。

【００６４】一週間の予備飼育を終えたWistar系雄性ラ
ットを２４時間絶食させた後、下記のように調製した被
検液Ｉ，Ｊのいずれかをプロポリスの投与量が３０ｍｇ
／ｋｇとなるように各ラットに経口投与した。投与１０
分後、ラットを身動きできないように金網ゲージの中に
拘束し、剣状突起部まで水に浸し、約２３℃で６時間、
そのままの状態を保った。すると、水浸拘束によるスト
レスで胃の中に潰瘍の形成が認められた。この潰瘍の面
積を測定し、その値を潰瘍係数（ｍｍ²）とした。ま
た、プロポリスを投与せずに同様に水浸拘束を行ったも
のをコントロールとし、同じく潰瘍の面積を測定し、潰
瘍係数を求めた。それらの結果を表４に示す。また、潰
瘍形成に対する抑制率を下記の式（４）に従って求めた
結果も併せて表４に示す。なお、表中の潰瘍係数の値は
AVE±SD (n=6)を示す。また、表中の＊は、Student t-t
estにより、コントロールに対する有意差が１％以下の
危険率であることを示す。

【００６５】被検液Ｉ：比較例１のエタノール抽出粉末
（プロポリス換算で３０ｍｇ）／５ｍｌ／ｋｇ（蒸留
水） 被検液Ｊ：実施例３のプロポリス製剤（プロポリス換算
で３０ｍｇ）／５ｍｌ／ｋｇ（蒸留水）

【００６６】

【数４】

【００６７】

【表４】 表４の結果より、実施例３で得られるプロポリス製剤
は、比較例１で得られるエタノール抽出粉末に比べて、
潰瘍の形成に対しておよそ２倍の抑制効果があることが
示された。この理由として、試験例６で得られた結果に
あるように、前記プロポリス製剤が胃の粘膜に付着して
長時間にわたって滞留するためと考えられる。

【００６８】次に、前記実施形態から把握できる技術的
思想について以下に記載する。 ・ １０μｍ以下の粒状の形態であることを特徴とする
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプロポリ
ス製剤。このように構成した場合、粘膜に対する付着性
を向上させることができる。

【００６９】

【発明の効果】本発明は、以上のように構成されている
ため、次のような効果を奏する。請求項１に記載の発明
によれば、粘膜に対する付着性が付与されるために消化
管内に滞留する時間が延長される。このため、生体内に
おいて持続的に薬効を発揮することができるうえに、有
効成分の吸収効率を向上させることができる。

【００７０】請求項２に記載の発明によれば、請求項１
に記載の発明の効果に加え、収率の向上を図ることがで
きるうえ、プロポリスを適度な速度で溶出することが可
能である。

【００７１】請求項３に記載の発明によれば、請求項１
又は請求項２に記載の発明の効果に加え、収率の一層の
向上を図ることができる。請求項４に記載の発明によれ
ば、生体内において持続的に薬効を発揮することができ
るうえに、有効成分の吸収効率を向上させることができ
るプロポリス製剤を効率よく得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 （ａ）は実施例１におけるプロポリス製剤を
撮影した電子顕微鏡写真、（ｂ）は実施例３におけるプ
ロポリス製剤を撮影した電子顕微鏡写真。

【図２】 （ａ）はプロポリス製剤の溶出挙動を示すグ
ラフ、（ｂ）は（ａ）のHiguchiプロットを示すグラ
フ。

【図３】 タンパク質に対するプロポリス製剤の結合能
を示すグラフ。

【図４】 小腸におけるフラボノイドの吸収特性を示す
グラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 31/10 31/10 31/12 31/12 35/00 35/00 37/00 37/00 (72)発明者 田中 美穂 岐阜市加納桜田町１丁目１番地 アピ 株 式会社内 Ｆターム(参考） 4B018 LE03 MD41 MD78 ME06 ME07 ME08 ME09 MF02 4B041 LC10 LD06 LE01 LH14 LP14 4C076 AA16 AA29 AA31 AA36 AA53 AA94 BB01 CC03 CC07 CC26 CC29 CC40 DD01 EE37M EE37N FF31 FF34 GG08 4C087 AA01 AA02 BB22 MA05 MA43 NA11 NA12 ZA08 ZA68 ZB09 ZB11 ZB13 ZB26 ZB33 ZB35

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロポリスをキトサンの高分子マトリッ
   クス中に内包させることにより粘膜付着性を持たせたこ
   とを特徴とするプロポリス製剤。
2. 【請求項２】 前記キトサンの平均分子量が１０，００
   ０〜２００，０００であることを特徴とする請求項１に
   記載のプロポリス製剤。
3. 【請求項３】 前記プロポリスがポリマー化プロポリス
   であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の
   プロポリス製剤。
4. 【請求項４】 プロポリス溶液とキトサン溶液とを界面
   活性剤の存在下で混合して混合液を調製する工程と、そ
   の混合液を油相に添加してエマルジョンを形成する工程
   と、そのエマルジョンから溶媒を留去する工程とを備え
   たプロポリス製剤の製造方法。