JP4068099B2 - 生体構成要素速度測定装置、及びそのプログラム - Google Patents

生体構成要素速度測定装置、及びそのプログラム Download PDF

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Description

本発明は、医療分野で撮影された画像データの解析処理に関する。
微小循環を考える上で、赤血球の流動挙動、とくにレオロジー的性質は重要である。赤血球の微小循環に関する基礎研究は従来各種の人工微小流路を用いて行われてきた。生体内微小血管では流れの状態が時々刻々と変化するため、平衡状態での観察が困難なためと考えられる。脳循環の研究でも従来はマクロ的測定が主体であり、その微小循環レベルについても定性的な観察のみがなされおり、定量的解析はほとんどなされていない。
Aoki et al. Am J Physiol,273,H2361,1997)
本発明は、赤血球、白血球、血小板等の血液成分やがん細胞等の生体構成要素の移動を定量的に測定し、かつ速度分布を2次元的に表示できる生体構成要素速度測定装置及びそのプログラムを提供する。
本発明にかかる生体用高速レーザー共焦点顕微鏡を用いて検体の生体組織の所定領域の観察を行って得られた生体構成要素の画像から該生体構成要素の速度を測定する処理を、コンピュータに実行させる生体構成要素速度測定プログラムは、前記生体用高速レーザー共焦点顕微鏡から、前記所定領域が撮影された時系列に連続している複数のフレーム画像データを取得する取得処理と、前記各フレーム画像内にある全画素の輝度値の平均を算出し、前記各フレーム画像データから該平均の所定の閾値以下の輝度値を有する画素データを取り除く低画素除去処理と、前記各フレーム画像データ内のうち連続したフレーム画像データから、複数連続する画素データであって所定の形状と認識される該画素データを同一の生体構成要素を示す生体構成要素画素データとして取得するとともに、生体構成要素画素データの中心座標を取得する生体構成要素画素データ取得処理と、前記隣接するフレーム画像データ同士について、一方のフレーム画像データで認識された該生体構成要素の前記中心座標から所定の範囲内にある生体構成要素を他方のフレーム画像データ内で検索することにより、前記同一の生体構成要素画素データの移動量を判定する移動量判定処理と、前記移動量判定処理の判定結果、前記移動量が所定の範囲に含まれる生体構成要素画素データを取得し、前記隣接するフレーム画像データの時間差と該移動量とから、前記生体構成要素画素データの示す生体構成要素の速度を算出する速度算出処理と、前記速度算出処理による算出結果に基づいて、前記生体構成要素の速度分布を生成する速度分布生成処理と、を、コンピュータに実行させることを特徴とする。
このように構成することによって、関心領域における各生体構成要素の挙動を追跡することができる。
また、このように構成することによって、各生体構成要素の所定時間内の平均速度を、例えば色分けなどすることで、個々の細胞の軌道、及び速度分布マップを生成することができる。
また、このように構成することによって、バックグラウンド除去を行うことができ、計算処理を簡素化することができる。
また、このように構成することによって、生体構成要素の速度を算出することができる。
また、このように構成することによって、赤血球、白血球、血小板、又はがん細胞に関して、個々の細胞の軌道、及び速度分布マップを生成することができる。
前記生体構成要素速度測定プログラムは、さらに、前記生体用高速レーザー共焦点顕微鏡を光軸方向にスキャンさせて焦点深度の異なるフレーム画像データ毎に、前記取得処理、前記除去低画素除去処理、前記生体構成要素画素データ取得処理、前記移動量判定処理、前記速度算出処理、及び前記速度分布生成処理を実行して、前記生体構成要素の速度の3次元的分布を生成する3次元分布生成処理と、を、コンピュータに実行させることを特徴とする。
本発明にかかる生体用高速レーザー共焦点顕微鏡を用いて検体の生体組織の所定領域の観察を行って得られた生体構成要素の画像から該生体構成要素の速度を測定する生体構成要素速度測定装置は、前記生体用高速レーザー共焦点顕微鏡から、前記所定領域が撮影された時系列に連続している複数のフレーム画像データを取得する取得手段と、前記各フレーム画像内にある全画素の輝度値の平均を算出し、前記各フレーム画像データから該平均の所定の閾値以下の輝度値を有する画素データを取り除く低画素除去手段と、前記各フレーム画像データ内のうち連続したフレーム画像データから、複数連続する画素データであって所定の形状と認識される該画素データを同一の生体構成要素を示す生体構成要素画素データとして取得するとともに、生体構成要素画素データの中心座標を取得する生体構成要素画素データ取得手段と、前記隣接するフレーム画像データ同士について、一方のフレーム画像データで認識された該生体構成要素の前記中心座標から所定の範囲内にある生体構成要素を他方のフレーム画像データ内で検索することにより、前記同一の生体構成要素画素データの移動量を判定する移動量判定手段と、前記移動量判定手段の判定結果、前記移動量が所定の範囲に含まれる生体構成要素画素データを取得し、前記隣接するフレーム画像データの時間差と該移動量とから、前記生体構成要素画素データの示す生体構成要素の速度を算出する速度算出手段と、前記速度算出手段による算出結果に基づいて、前記生体構成要素の速度分布を生成する速度分布生成手段と、を備えることを特徴とする。
このように構成することによって、関心領域における各生体構成要素の挙動を追跡することができる。
また、このように構成することによって、各生体構成要素の所定時間内の平均速度を、例えば色分けなどすることで、個々の細胞の軌道、及び速度分布マップを生成することができる。
また、このように構成することによって、バックグラウンド除去を行うことができ、計算処理を簡素化することができる。
また、このように構成することによって、生体構成要素の速度を算出することができる。
また、このように構成することによって、赤血球、白血球、血小板、又はがん細胞に関して、個々の細胞の軌道、及び速度分布マップを生成することができる。
前記生体構成要素速度測定装置は、さらに、前記生体用高速レーザー共焦点顕微鏡を光軸方向にスキャンさせて焦点深度の異なるフレーム画像データ毎に、前記取得手段、前記除去低画素除去手段、前記生体構成要素画素データ取得手段、前記移動量判定手段、前記速度算出手段、及び前記速度分布生成手段を駆動させて、前記生体構成要素の速度の3次元的分布を生成する3次元分布生成手段、を備えることを特徴とする。
本発明によれば、生体構成要素の移動を経時的にとらえ、その速度分布を算出し、2次元マップとして表示することが可能となる。
図1は、本実施形態における顕微鏡観察システムを示す。この顕微鏡観察システムは、デジタルビデオカメラ1、レーザー光源4、デジタルイメージングシステム2、共焦点スキャナユニット5、顕微鏡6、ステージ8、フレームグラバーボード3、及び画像解析装置9から構成される。
ステージ8は、顕微鏡6により観察するための標本7を載置するためのものである。顕微鏡6は、生体用高速レーザー共焦点顕微鏡(非特許文献1)である。
共焦点スキャナユニット5には、Nipkow円盤内蔵共焦点スキャナユニット(製品名:CSU−20(登録商標)、横河電機社製)を用いた。一般に、ニポウディスクスキャナー(Nipkow disk scanner)とは、光学的文字認識をする場合に、端に一列、もしくは多数列の孔を螺旋状にあけたディスクから成るデバイスのことである。この孔はディスクを回転することによって、文書の機械的な走査ができるように連続して開けてあり、可視パターンを電気的なパターンに変換するのに用いられる。試料から反射した光は垂直スリットを通って回転ディスクに焦点を結ぶ。ディスク内で孔を通過した光は光電子増倍管に進む。
デジタルイメージングシステム2には、高速度デジタルイメージングシステム(製品名:MotionPro(登録商標)、REDLAKE社製)を用いた。フレームグラバーボード3(Scion社製)は、フレームバッファを内蔵した動画像取り込みボードである。
デジタルビデオカメラ1は、実際のリアルタイムの画像をデジタルビデオで録画して、血管の位置関係を顕微鏡画像と比較同定するために使用する。
図2は、本実施形態における画像解析装置9の内部構成を示す。画像解析装置9は、少なくとも、大容量記憶装置10、メモリ11、出力インターフェース13、入力インターフェース14、CPU(中央処理装置)15、及びこれらを接続するバス12から構成される。そして、出力インターフェース17には表示装置17が接続され、入力インターフェース14にはフレームグラバーボード3が接続されている。なお、画像解析装置9は、通常のパーソナルコンピュータでもよい。
大容量記憶装置10の一例としては、ハードディスク、磁気ディスクなど様々な形式の記憶装置を使用することができ、後述するフローのプログラム等が格納されている。このプログラムは、CPU15によって読み込まれ、フローの各処理が実行される。
メモリ11は、各種の処理で利用するRAM(Random Access Memory)やROM(Read Only Memory)等の記憶装置である。表示装置17は、ディスプレイ等である。
また、入力装置16には、キーボード、マウス、または電子カメラ、マイク、スキャナ、タブレット、記憶媒体(フレキシブルディスク、CD、CD−ROM、CD−R、DVD、DVD−R、DVD−ROM、メモリーカード等)の読み取り装置などを用いることが可能である。さらに、その他の周辺機器も接続することができる。
図3は、本実施形態における全体のフローを示す。まず、雄性Wisterラット7(ラットの体重300gから350gの雄性Wisterラット8匹を使用。以下、ラットと省略する)に麻酔をした後、そのラットの股動脈および静脈にカテーテルを挿入して、それぞれ血圧測定および蛍光色素FITC(Fluorescein isothiocyanate)でラベルした赤血球の注入に用いることとする(S1)。
次に、ラット7の側頭頭頂部に頭窓を作成し硬膜を除去して(S2)、生体用高速レーザー共焦点顕微鏡6のステージ8に固定した。生体用高速レーザー共焦点顕微鏡6では、脳表より約20mmの深さにある関心領域(0.3mm×0.3mm)中の微小血管内赤血球を撮影するために、合焦位置を設定する。FITCラベル赤血球の注入(S3)と同時に、レーザー共焦点顕微鏡6に接続されたNipkow円盤内蔵共焦点スキャナユニット5及び高速度デジタルイメージングシステム2を用いて、高速度撮影(250−500frames/sec)にて記録した(S4)。
フレームグラバーボード3を介してこの動画記録を画像処理装置9に転送し、汎用数値解析プログラムMATLAB(登録商標)に組み込んだ本実施形態に係るプログラムを用いて解析を行う(S5)。
図4は、本実施形態における画像処理装置9の設定画面20を示す。表示装置17には、画像処理装置の設定画面20が表示されている。設定画面20には、ファイル選択ボタン21、選択ファイル名表示部22、ファーストフレーム23、ラストフレーム24、分解能25、フレームレート26、変換ボタン27、赤血球トラッキングボタン28、閾値レベル29、赤血球サイズ閾値30、スケール31、検索半径32、赤血球の移動の最小フレーム33、速度閾値34、速度閾値チェックボックス35の設定項目がある。
ファイル選択ボタン21を押下すると、フレームグラバーボード3を介して転送された動画記録(ファイル)を選択する画面が表示され、複数あるファイルから画像解析の対象となるファイルを選択することができる。選択ファイル名表示部22には、その選択画面で選択したファイル名が表示される。同図では、ファイル名「AAAAA」が選択されている。
ファーストフレーム23には、選択したファイルに含まれるフレームのうち、解析の対象となるフレーム群の最初のフレームを指定することができる。ラストフレーム24には、選択したファイルに含まれるフレームのうち、解析の対象となるフレーム群の最後のフレームを指定することができる。
分解能25には、解析するときの画素の分解能を指定することができる。フレームレート26には、何フレームづつコマ送りにするかを設定することができる。このコマ送りされたフレーム画像に対して画像解析がされる。
閾値レベル29は、バックグラウンドノイズ消去のために設定するものである。閾値レベル29に、たとえば、0.14%と入力すれば、フレーム画像内の全画素の輝度値の平均の14%以下の輝度値を消去することができる。赤血球サイズ閾値30には、赤血球の直径サイズを設定することができる。同図では、FITCラベル赤血球の直径を8μmに設定してある。
スケール31には、1ミクロンにつき何ピクセルかを設定する。同図では、1ピクセル/ミクロンに設定してある。検索半径32には、2フレーム間での赤血球の間隔を設定することができる。
赤血球の移動の最小フレーム33には、同一の赤血球が連続して写っている最小フレーム数を指定することができる。赤血球の移動については、各静止画(フレーム)でその移動の軌跡をとらえて計算するが、時に同じ赤血球が、今まで各フレーム毎に捕らえられていたものが次のフレームで突然消えてしまう(フレームアウトしてしまう)ことがある。これは、フレームがとらえているピント面から赤血球がはずれてしまったときに起こるものであり、あまり消えたり現れたりするものは計算することが難しくなるので、例えば少なくとも3フレーム連続して写っているものを「同一」赤血球として認識し速度計算に用いるようにする。この例えば「少なくとも3フレーム」というのを最小フレームとしている。
速度閾値34には、ノイズと真の赤血球とを区別するための速度の上限の指標です。同図では、例えば30(ミクロン/秒)以下のものを赤血球と判断するように設定されている。速度閾値34の設定を有効/無効にするのが、速度閾値チェックボックス35である。
変換ボタン27を押下すると、21−26で設定された情報に基づいて、個々のフレーム画像が生成される。赤血球トラッキングボタン28を押下すると、変換ボタン27で生成されたフレーム画像に関して、29−34の設定項目に基づいて、図6で説明する画像解析がされる。
図5は、赤血球サイズ閾値30の設定値と検索半径32の設定値との関係を示す。同図において、中央の小円40は、赤血球(赤血球の直径30)を示している。また、その外側の円41は、検索半径32を示している。
図6は、本実施形態における画像解析処理のフローを示す。脳表より約20mmの深さにある関心領域(0.3mm×0.3mm)中の微小血管内赤血球速度マップを表示することのできる本プログラムは、生体用高速レーザー共焦点顕微鏡システムにより記録されたFITCラベル赤血球の挙動を示す高速度撮影画像を、以下のアルゴリズムで処理を行う。本アルゴリズムは、大容量記憶装置10に格納されており、CPU15はこれを読み出して以下のフローを実行する。
まず、バックグラウンド除去を行う(S11)。ここでは、各フレーム画像内にある全画素の輝度値の平均を算出し、その平均から閾値(閾値レベル29で設定された値)以下の輝度値を有する画素データを除去する。
次に、各フレームのFITCラベル赤血球を認識する(S12)。ここでは、赤血球サイズ閾値30で設定された直径を有する領域をパターン認識して、フレーム画像中の赤血球を認識する。赤血球サイズ閾値30で設定された値は8ミクロンであり、スケール31の設定により1ピクセル/ミクロンであるから、所定の輝度値以上の連続する8ピクセルの領域を抽出して、この領域について予め設定されたパターンと比較して、赤血球か否かを決定する。このようにして認識されたものが赤血球であるとみなす(図5の小円40参照)。そして、この赤血球の画像領域を認識したら、その認識した領域の中心の座標を記憶しておく。
次に、隣接するフレーム間でのラベル赤血球の移動を検出する(S13)。すなわち、隣接するフレーム間において、S12で抽出した赤血球の中心座標が検索半径32で設定した半径内にあるか否かを判断する。検索半径32に30μmを設定した場合には、隣接する2つのフレーム画像のうち一方のフレーム画像で認識された赤血球の中心部から半径30μmの範囲内のラベル赤血球を他方のフレーム画像内で検索する。すなわち、図5の大円41で示される半径内に、他方のフレーム画像の赤血球の中心座標があるかを検索する。
なお、S13では赤血球の移動の最小フレーム33及び速度閾値34で設定した値も考慮して計算される。また、このとき、効率よくラベル赤血球の移動を検出するため、ほとんど移動していない赤血球については、停まっているとみなす。すなわち、赤血球の移動の最小フレーム33に設定されたフレーム間で、赤血球の移動距離(変化したピクセル)が所定の閾値以下のものは、停まっているとみなす。これにより、計算をより簡素化し、計算効率を向上させる。
解析対象のフレームについてS11−S13を繰り返すことにより、ラベル赤血球の2次元軌跡を示すマップ(図7参照)を作成することができる(S14)。
次に、隣り合うフレームでのラベル赤血球の移動距離とフレーム時間間隔とから、隣接するフレーム画像間での赤血球の移動速度を計算する。そして、解析対象の全フレームについて計算することにより、速度分布2次元マップ(図8参照)として表示することができる(S15)。
なお、赤血球の運動を一連の動画として、また静止画の連続画像としても表示することも可能である。
図7は、本実施形態におけるラベル赤血球の2次元軌跡マップを示す。各点は、関心領域における各時間での各赤血球の位置を示している。個々のFITCラベル赤血球の挙動を点線上に表し、個別にトラッキングすることが可能である。
図8は、本実施形態における計算された速度分布を2次元マップ上に濃淡で表したものを示す。脳微小血管内での速度プロファイルを画像化できるとともに、トラッキングされた個々の赤血球の速度をすべて数値として表計算または統計ソフトウェア上に展開することも可能である。さらに、マップは赤血球の速度に応じてカラー化することも可能である。
なお、上記実施形態では、赤血球についてトラッキングをしたが、これに限定されず、血球成分たとえば白血球、血小板でもラベル化することにより上記実施形態を適用することができる。またがん細胞でもマーカーをつければ上記実施形態を適用することができる。また、上記実施形態では、脳微小血管内の赤血球の移動をin vivoで経時的にとらえたが、これに限定されず、その他のあらゆる臓器について、またあらゆるex vivoの実験においても応用可能である。
以上より、本発明の実施形態によれば、脳微小血管内の赤血球の運動をin vivoで経時的にとらえ、その速度分布を算出し、2次元マップとして表示することが可能となる。また、赤血球運動を動画および静止画の連続画像としても保存・解析が可能である。また、白血球や血小板においても、蛍光色素でラベルし血球の直径および検索範囲を設定することで速度分布解析が可能である。また、生体用高速レーザー共焦点顕微鏡ではきわめて焦点深度の狭い共焦点イメージの断面が得られるため、光軸方向のスキャンにより3次元的分布も捉えることができる。この方法により、脳虚血をはじめとする各種病態において血流変化や速度分布を解析することが可能である。
本実施形態における顕微鏡観察システムを示す。 本実施形態における画像解析装置の内部構成を示す。 本実施形態における全体のフローを示す。 本実施形態における画像処理装置9の設定画面20を示す。 本実施形態における赤血球サイズ閾値30の設定値と検索半径32の設定値との関係を示す。 本実施形態における画像解析処理のフローを示す。 本実施形態におけるラベル赤血球の2次元軌跡マップを示す。 本実施形態における計算された速度分布を2次元マップ上に濃淡で表したものを示す。
符号の説明
1 デジタルビデオカメラ
2 デジタルイメージングシステム
3 フレームグラバーボード
4 レーザー光源
5 共焦点スキャナユニット
6 顕微鏡
8 ステージ
9 画像解析装置
10 大容量記憶装置
11 メモリ
12 バス
13 出力インターフェース
14 入力インターフェース
15 CPU
16 入力装置
17 表示装置


Claims (6)

  1. 生体用高速レーザー共焦点顕微鏡を用いて検体の生体組織の所定領域の観察を行って得られた生体構成要素の画像から該生体構成要素の速度を測定する処理を、コンピュータに実行させる生体構成要素速度測定プログラムにおいて、
    前記生体用高速レーザー共焦点顕微鏡から、前記所定領域が撮影された時系列に連続している複数のフレーム画像データを取得する取得処理と、
    前記各フレーム画像内にある全画素の輝度値の平均を算出し、前記各フレーム画像データから該平均の所定の閾値以下の輝度値を有する画素データを取り除く低画素除去処理と、
    前記各フレーム画像データ内のうち連続したフレーム画像データから、複数連続する画素データであって所定の形状と認識される該画素データを同一の生体構成要素を示す生体構成要素画素データとして取得するとともに、生体構成要素画素データの中心座標を取得する生体構成要素画素データ取得処理と、
    前記隣接するフレーム画像データ同士について、一方のフレーム画像データで認識された該生体構成要素の前記中心座標から所定の範囲内にある生体構成要素を他方のフレーム画像データ内で検索することにより、前記同一の生体構成要素画素データの移動量を判定する移動量判定処理と、
    前記移動量判定処理の判定結果、前記移動量が所定の範囲に含まれる生体構成要素画素データを取得し、前記隣接するフレーム画像データの時間差と該移動量とから、前記生体構成要素画素データの示す生体構成要素の速度を算出する速度算出処理と、
    前記速度算出処理による算出結果に基づいて、前記生体構成要素の速度分布を生成する速度分布生成処理と、
    を、コンピュータに実行させることを特徴とする生体構成要素速度測定プログラム。
  2. 前記生体構成要素速度測定プログラムは、さらに、
    前記生体用高速レーザー共焦点顕微鏡を光軸方向にスキャンさせて焦点深度の異なるフレーム画像データ毎に、前記取得処理、前記除去低画素除去処理、前記生体構成要素画素データ取得処理、前記移動量判定処理、前記速度算出処理、及び前記速度分布生成処理を実行して、前記生体構成要素の速度の3次元的分布を生成する3次元分布生成処理と、
    を、コンピュータに実行させることを特徴とする請求項1に記載の生体構成要素速度測定プログラム。
  3. 前記生体構成要素は、赤血球、白血球、血小板、又はがん細胞であることを特徴とする請求項1または2に記載の生体構成要素速度測定プログラム。
  4. 生体用高速レーザー共焦点顕微鏡を用いて検体の生体組織の所定領域の観察を行って得られた生体構成要素の画像から該生体構成要素の速度を測定する生体構成要素速度測定装置において、
    前記生体用高速レーザー共焦点顕微鏡から、前記所定領域が撮影された時系列に連続している複数のフレーム画像データを取得する取得手段と、
    前記各フレーム画像内にある全画素の輝度値の平均を算出し、前記各フレーム画像データから該平均の所定の閾値以下の輝度値を有する画素データを取り除く低画素除去手段と、
    前記各フレーム画像データ内のうち連続したフレーム画像データから、複数連続する画素データであって所定の形状と認識される該画素データを同一の生体構成要素を示す生体構成要素画素データとして取得するとともに、生体構成要素画素データの中心座標を取得する生体構成要素画素データ取得手段と、
    前記隣接するフレーム画像データ同士について、一方のフレーム画像データで認識された該生体構成要素の前記中心座標から所定の範囲内にある生体構成要素を他方のフレーム画像データ内で検索することにより、前記同一の生体構成要素画素データの移動量を判定する移動量判定手段と、
    前記移動量判定手段の判定結果、前記移動量が所定の範囲に含まれる生体構成要素画素データを取得し、前記隣接するフレーム画像データの時間差と該移動量とから、前記生体構成要素画素データの示す生体構成要素の速度を算出する速度算出手段と、
    前記速度算出手段による算出結果に基づいて、前記生体構成要素の速度分布を生成する速度分布生成手段と、
    を備えることを特徴とする生体構成要素速度測定装置。
  5. 前記生体構成要素速度測定装置は、さらに、
    前記生体用高速レーザー共焦点顕微鏡を光軸方向にスキャンさせて焦点深度の異なるフレーム画像データ毎に、前記取得手段、前記除去低画素除去手段、前記生体構成要素画素データ取得手段、前記移動量判定手段、前記速度算出手段、及び前記速度分布生成手段を駆動させて、前記生体構成要素の速度の3次元的分布を生成する3次元分布生成手段、
    を備えることを特徴とする請求項4に記載の生体構成要素速度測定装置。
  6. 前記生体構成要素は、赤血球、白血球、血小板、又はがん細胞であることを特徴とする請求項4または5に記載の生体構成要素速度測定装置。
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