JP4060053B2 - 分析対象の検出装置およびその方法 - Google Patents

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
関連出願
本出願は下記アメリカ特許出願のうちのいずれか一以上の一部継続出願である：GarretModdelらが1992年７月31日に出願したアメリカ出願第07/924,343号、Garret Moddelらが1989年９月18日に出願し現在放棄しているアメリカ出願第07/408,291号の一部継続出願であり現在係属中の、Garret Moddelらの1992年４月24日出願になるアメリカ出願第07/873,097号；Jeffrey Etterらが1991年２月11日に出願し現在係属中の、アメリカ出願第07/653,064号；Jeffrey Etterらが1986年２月25日に出願し現在係属中の、アメリカ出願第07/653,052号；Nygrenらが1986年２月25日に出願し現在放棄しているアメリカ出願第07/832,682号の一部継続出願であって現在継続中の、Nygrenらの1988年10月20日出願になるアメリカ出願第07/260,317号；現在放棄しているアメリカ出願第07/408,296号の一部継続出願であり、1991年３月20日に出願（アメリカ合衆国を指定）のPCT出願US 91/01781号に基づきJeffrey Etterらが1992年７月31日に出願した、アメリカ出願（連続番号）；そして本出願はDiana Maulらが1991年10月１日に出願し現在継続中の、ヨーロッパ出願第EP91308968.6号から外国への優先権主張の権利を有する。上記出願(図面を含めて)はすべて本出願の一部を構成しており、参考までにここに纏めて記載する。
【０００２】
発明の分野
本発明は本装置に衝突する光のスペクトル特性を薄膜現象により検知可能に減衰させる装置に関する。
【０００３】
【従来の技術】
発明の背景
「Applied Optics」24巻の472頁（1985年）でSandstromらは、誘電膜として作られた一酸化ケイ素および二酸化ケイ素をケイ素の光学的基板に使用することが記載してある。彼らは、膜厚を変えると光学的基板の性質が変わり、膜厚により異なる色調が得られると指摘している。すなわち、膜厚はその色調に関連があり、光学的基板の上部に設ける膜は目に見える色調の変化を生じる。彼らは、数理モデルを使用して色調の変化を定量化することが可能であこと、および「コンピューターモデルを使用して実施した計算によれば、多層構造にしても光学的性能には殆んど得るところがない・・・・しかし、表面上の生物層（biolayer）の構造は、光学的性質が主として多層構造内部の界面で決まるので、このような構造での反射は極く僅かしか変化しない・・・・結論をいえば、やや驚くべきことに、生物層を検出するための最も敏感な系は単一層コーチングであり、他方その他の大抵の用途には誘電層を追加すれば性能を改善することが可能である。」と指摘している。
【０００４】
Sandstromらはさらに、金属酸化物で作った金属上のスライドには欠点があること、および金属イオンの存在すると生化学的用途にはまた有害になる可能性が多いと指摘している。彼らは、理想的な表面上部の誘電膜は一酸化ケイ素の膜が周辺雰囲気中で析出する時自然的に形成される２〜３nm厚の二酸化ケイ素であること、および40〜60nm厚の一酸化ケイ素層上の70〜95nm厚の二酸化ケイ素層がガラスまたはプラスチック基板に使用可能であることを指摘している。また彼らは、一酸化ケイ素を選択的にエッチングすること、ジクロロジメチルシランで二酸化ケイ素表面を処理すること、および抗原および抗体の生物層を適用することにより、一酸化ケイ素のウエッヂを形成すると記述している。このウエッヂ構造により彼らは偏光解析計で膜厚を測定することでき、そして"最大のコントラストは干渉色が紫から青色に変わる約65nmの変域で見られた"と記載している。このような系の感度は、抗体によりタンパク質の抗原を検出する場合に適用しても充分高い値であると指摘している。"デザインは広範囲の用途には充分な感度である。材料のガラス、ケイ素および酸化ケイ素は化学的に不活性で、生化学反応には影響を及ぼさない。上記の算定法を使用すれば別の用途に最適なスライドをデザインすることができる。このスライドは製造可能で、その品質は保証でき、そして二つのデザインが現在市販されている。感度が良く、融通性があり、かつ低廉なこれらの道具により、免疫学および生化学において簡単な方法の開発が促進されるだろうことを希望している。"と彼らは結論づけている。
【０００５】
「J. Immunol. Methods」59巻の145頁（1983年）でNygrenらは上記のものと同じ系につき記述している。それには、抗人血清（HSA）の検出に特定の抗人血清抗体を使用している。この出版物中の第２図によれば、10-5mg/mlのHSAは16時間の培養で検出可能であるが、10-6mg/mlのHSAはこの系では検出不可能であったと指摘している。また、彼らは"72時間の培養後、検出限界は低く（１mg/mlに低下）なったが、しかし反応はその後非特定反応には感度がより良好になった"と述べている。アメリカ特許第4,558,012号において、Nygrenらは、525〜600nM範囲の波長の非単色または白色につき層の総合配列を反射を低減させるようにする以外は同じ系について記述している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
発明の要約
本発明は、試料中の分析対象の存在有無または量を検出するための装置の改良、およびこのような装置を使用する方法の改良を特徴とするものである。従来の装置とは対照的に、本発明の装置は試料中の極く少量の分析対象を検出することができる。僅か0.1nM、0.1ng/mlまたは２×103の生物、あるいは数分間だけの迅速測定で僅か50fgの量まで測定できる。測定の総所要時間は測定手続きの開始から（すなわち、分析対象が装置に接触する時点から）一時間から数分間である。事実、本発明の装置によれば、従来の装置と方法とで連鎖球菌Ａ抗原の測定等で可能であったより30％以上もより多くの試料を検出できる。本発明は、Sandstromら（上記参照）の記載のものと比較して、より優秀な構成のものを見つけた結果によるものであり、その詳細を以下に説明する。この装置は機器で構成されている。また、これらは色の変化が目視できる場合、特にその色変化が、例えば金色から暗紫色または青色に変化する等、非常に説明し易い場合は有用である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このように、第一の本発明の特徴は、分析対象の量または存在有無を検知する装置を提供することである。この装置には、これに衝突する光で第一の色調を示す、光学的に活性な表面を有する基板を備えている。この第一の色は光のスペクトル分布によると定義される。また、基板は第一の色とは違った第二の色調を示す（第一の色中に存在する組合わせとは違った光の波長の組合わせであるか、違ったスペクトル分布であるか、または第一の色中に存在するのとは違った一以上の波長の強度を有する）。このような装置により、0.1ng、0.1nM、0.1ng/ml、50fgまたは２×103の生物の量の検出に際し感度良好な方法が得られるのである。事実、好適な具体例による検出量は10倍、100倍または1,000倍とかなり少量まで検出可能である。ある色から他の色への変色は計器または肉眼を使用して測定できる。このような好感度の検出結果は上記SandstromおよびNygrenで記述した装置と比較して可成り進歩しており、かつこの装置を使用しても商売上競争できる。事実、この装置の感度は現行の技術を遥かに凌いでおり、本発明の装置および方法が勝っている。
【０００８】
"光学的に活性な表面"とは、表面に衝突する光が何かで変えられるような、光学的効果の発生に関与する表面のことである。このような光学的に活性な表面は多色光（例えば白色）のみでなく、単色光（例えば、本質的に偏光されるレーザー光）にも反応するようにできる。本発明の装置は好適にも、不反応テスト表面および反応テスト表面の背景の干渉色と明確な対照を示す、色のシグナルを生じる。テスト面には、試料中の分析対照の濃度の半定量的測定に対応する、色の種々のシェードまたは強度が生じ、そして目視または計器で測定できる。このような装置により薄膜測定系の定量的に機器分析できる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
一具体例として、光学的に活性な表面は非鏡面であるか、または光学的に活性な表面を目視できる非鏡面で透明な層を備える。表面があまり重要に見えない角度を形成するので本発明でこの具体例は有用である。用語の"非鏡面"とは表面が鏡のようには作用せず、光に対し散乱することを意味する。一般的に、高さが100nmから100μmの間で変動する不規則表面からなるものである。第一の利点は、乱反射により光に関し広範囲の角度にわたる色変化が目視できることである。
【００１０】
さらに具体例として、基板には窒化ケイ素、酸化ケイ素、二酸化チタン、オキシ窒化ケイ素または硫化カドミウム等から作った干渉膜が含まれている。この膜は光を干渉させるように作用して特定の光を基板表面に生じさせる。この膜は基板上の他の層と相互に作用し、分析対照が装置上にある時は色変化または波長強度の変化が観察できる。より好適な具体例として、分析対照に特有の受容分子を結合させる付着層を設けられる。シグナルが装置上で得られるように、この付着層に可成の受容材料を取付けできるということは本発明では重要である。その他の関連する具体例として、一旦分析対照が付着層に取付けられると、その他の層が対照物に特定の方法で装置上に析出され、色のシグナルまたはより明確な色のシグナルが得られるような方法で本装置が使用できる。
【００１１】
目視で分析できる装置であることが好ましいが、本発明の装置はまた偏光解析計、反射計、プロフィロメータ、改良形偏光解析計等が使用可能である。
【００１２】
他の関連する面から（下記でより詳細に記述する）、本発明の特徴は、上記の装置や本発明で使用する特定の装置を使用する方法、および、各層の最も望ましい厚みが即座に決定できるように、各成分層が種々の厚みで光学的に活性な表面を有する基板を形成することにより本発明の装置を最適使用する方法を提供することにある。
【００１３】
特に、本発明は基板がデンドリマー、スターポリマー、分子状自己集合ポリマー、重合シロキサン、および膜形成ラテックスからなる群から選んだ化学品から作製した付着層を有する装置を特徴とする；基板自体は単結晶性ケイ素、ガラス上に不定形ケイ素、プラスチク上に不定形ケイ素、セラミック、多結晶性ケイ素およびこれら材料の複合物からなる群から選んだ材料で作製する；そして基板には窒化ケイ素、ケイ素／二酸化ケイ素の複合物、オキシ窒化ケイ素、二酸化チタン、チタン酸塩、ダイアモンド、ジルコニウムの酸化物および炭化ケイ素から選んだ材料で作製した反射防止層を有する。
【００１４】
特に好適な具体例として、第二の色は分析対象が装置と接触した後一時間以内に識別できる；分析対象物が0.1nM、0.1ng/ml、50fg、２×103の生物から選んだ量だけ表面に存在する時は、光に対する反応が観察される；表面は鏡面であるか、鏡面でないか、または光学的活性面が見られるようにした鏡面でない表面を有する透明層である；基板は固体の支持体、可撓性支持体、プラスチック、ガラス、金属および非金属からなる群から選ばれる；基板は光反射性か光透過性である；光は単色光、多色光、紫外光、赤外光である；分析対象はリウマチ因子、樺花粉に特有のIgE抗体、癌胚抗原、連鎖球菌群Ａ抗原、ウイルス性抗原、自己免疫性病気に関連する抗原、アレルギー、腫瘍または感染性微生物、連鎖球菌群Ｂ抗原、HIV IまたはHIV IIの抗原、または前記ウイルスに対する抗体、RSVに特有の抗原またはウイルスに対する抗体、抗体、抗原、酵素、ホルモン、多糖類、蛋白質、脂質、炭水化物、麻薬または核酸、髄膜炎の誘因生物、ナイセリア髄膜炎群Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ135、連鎖球菌肺炎、E. coli KI、ハエモヒラス流感型Ｂ、微生物から誘導した抗原、ハプテン、麻薬（許可または免許なしで不法に使用する麻薬を含む）、治療薬、環境用薬剤、および肝炎に特有の抗原からなる群から選ばれる；鏡面でない表面はプロフィロメータで2700から3295の読みである。この値は表面構造の平均ピーク高さでRMS粗さを除したものであり、そしてHeNeレーザ光源により測定した鏡面反射率は約50％以下である；基板はガラス、プラスチックからなる群から選ばれ、その表面に不定形ケイ素の層を設ける。このようにして光学的活性表面が形成される；光学的活性表面は多結晶性ケイ素またには金属が含まれる；さらに基板は不定形ケイ素の層を有する金属である；分析対象を受容する受容層は分析対象に特定の結合相手を備えている；受容層は抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、キレート化剤、酵素、バクテリア、バクテリアの繊毛、バクテリアの鞭毛、核酸、多糖類、脂質、蛋白質、炭水化物、金属、ウイルス、ホルモン、および前記材料の受容体からなる群から選んだ材料で作製される；第一の色は外観が金色で、第二の色は肉眼で外観は紫色または青色である。
【００１５】
他の好適な具体例において、本装置は多色光に対し肉眼で検出できるようなシンボルが得られるよう配列されている；そして光学的膜は装置に480Åから520Åの厚みにコートされている；そして分析対象は受容材料と結合剤との間に挟まれている。
【００１６】
その他、本発明の特徴は分析対象の光学的測定で使用する装置を提供することであり、基本材の層、アルミニウム、クロムまたは透明な伝導性酸化物の伝導性金属層、および不定形ケイ素の層、で作られた多層基質が含まれる。ここで金属層は不定形ケイ素の付近に配置される。その他、本装置は、基本材の層（光学的活性層を設けた固体材料）と基本材付近の不定形ケイ素の層とを有する多層構造の基板を備えている。好適な具体例において本装置には基板上面に非反射層を付着させる。この層は、基板上面に付着可能な光学的材料と、基板上面から最も離して位置させかつテストされる流体中で分析対象を結合させる特定の材料から選ばれた受容材料と、を備えている；基本材はガラス、シリカ、プラスチック、半導体、セラミックおよび金属の群から選ばれ、そして堅いか可撓性かである；そして付着層は光材料と受容材料の間に挿入される。
【００１７】
その他、本発明の特徴はガラス、プラスチック、ケイ素および不定形ケイ素から選んだ基板、窒化ケイ素、ケイ素／酸化ケイ素の複合物、チタン酸塩、炭化ケイ素、ダイアモンド、硫化カドミウムおよび酸化チタンから選んだ非反射層、重合シラン、重合シロキサン、膜形成ラテックスまたはデンドリマーから選んだ付着層、および分析対象に特定の受容材で作製された、分析対象を検出する光学的測定装置を提供することである。
【００１８】
好適な具体例において、不定形ケイ素層は約900から1100nmの厚みを有する；約1800と2200Åの間の厚みのアルミニウム層がガラス上に設けられる；窒化ケイ素、ケイ素／酸化ケイ素の複合物、チタン酸塩または二酸化チタンの膜は約480から515Åの間の厚みを有する；付着層は約90から110Åの間の厚みを有する、アミノアルキルーＴ−構造の有枝シロキサンである；そして受容材料は約30から60Åの間の厚みを有する抗体層である。
【００１９】
より好適な具体例で、基板は第一の色から第二の色への変化がいずれも偏光解析計等の計器の出力で指示されるように配列されている;表面から反射または透過する光の強度が変化する;衝突する光は装置で反射され、この反射光は楕円状または直線的に偏光させられる；単色、多色、非偏光、可視、紫外または赤外またはこれらの組合わせた光である；基板は光学的に活性な表面を支持するか、それ自身光学的に活性である。
【００２０】
その他、本発明の特徴は試料中の分析対象の存在有無またはその量を検出する方法を提供するものであり、その方法には上記装置を用意する行程と、光学的に活性な表面を分析対象を含んだ試料に接触させる行程とが含まれる。分析対象が活性表面と相互に作用して活性面に第二色が表わされる。第二の色の変化の測定に光学的読取り装置が使用される。光学的読取り装置は下記計器群のうちの一からなる；偏光解析計、反射計、比較反射計、プロフィロメータ、薄膜分析器またはその改良品である。
【００２１】
好適な具体例につき、分析対象を受容材料（例えば、抗体または抗原）および第二結合剤（例えば、抗体または抗原）の間に挟ませる；分析対象は結合して直接検出される；分析対象は間接的なシグナルの発生で検出される；試料は尿、血清、血漿、脊髄液、痰、全血、唾液、尿生殖器分泌物、便の抽出物、心膜、胃（gastric）、ぺリトンール、胸膜洗浄物、膣分泌物、および喉の綿棒、からなる群から選ばれる；そしてこの方法では反射計を使用して色または強度の測定を行う。
【００２２】
特に好適な具体例による方法では、基板を分析対象を含むテスト試料と接触させる。基板は第二の色を表わすものとする；そしてこの装置は、第一の色が特定の波長または光の波長範囲の背景の強度を表わし、第二色が第一色に対する一以上の光の波長の強度の変化を表わす反射計のセットである；またこの装置は、第一色が分析器を通り検出器まで透過する光の背景の強度を表わし、第二の色が第一色に関連して分析器を通り検出器に透過する光の強度の変化を表わす薄膜分析計のセットである；またこの装置は、第一色が目視可能な干渉光で、第二色が第一色に対する色の変化を表わすものである。
【００２３】
その他、本発明の特徴は基板、一以上の光学的層、付着層および受容層を有し、これらの層の一以上をスピンコーティングした光学的測定装置を提供することにある。
【００２４】
好適な具体例として、この方法は基板の表面に反射防止層をスピンコーティングする。この膜は；ポリシリザン、酸化アルミニウム、珪酸塩、チタン酸塩、ジルコン酸塩およびＴ−樹脂シロキサン、からなる群に一以上から作製され、そしてこの膜は250から550Åの厚みがある；この方法では装置の光表面に付着層をスピンコーティングし、最も好適には非線形有枝重合シロキサン、膜形成ラテックスおよびデドリマーからなる群の一以上から選んで作製し、厚さが25から250Åであればよい；そして受容材料を付着層にスピンコートまたは溶液コートする。
【００２５】
他の観点から、本発明の特徴は台上に支持されかつ第一コンテナ内に保持された活性受容面を有する光学的測定装置を提供することである；ここで第一コンテナは、台の基礎に設けられ、かつ表面からの液ドレンを吸収するように配列された第一吸収材料を備え、第二コンテナは第一コンテナの一側部にヒンジ連結されていて第二吸収材料を備えている。ここで第二コンテナはヒンジで回して第一コンテナに閉止することができ、このように閉止することにより第二吸収材料をその表面に接触させる。
【００２６】
好適な具体例として、第二コンテナにはさらに第二吸収材料をこれが表面と接触する位置に対し移動させるように配列したハンドルが設けられている；この装置はさらに第二コンテナ内に可動式フラップを備えており、第二吸収材料が第二コンテナから移動しないように配列されている；フラップは第一または第二コンテナにヒンジ連結され、表面または第二吸収材料に接近できるように一以上の隙間が設けられている。
【００２７】
これに関連して、本発明の特徴はベース上に支持されて複数の光学的活性表面を有する光学的測定装置を提供することである。このベースには表面からの液ドレンを吸収するように配列した第一吸収材料が設けられ、そして摺動可能な蓋には装置使用中に光学的活性表面に接触するように配列した一以上の吸収区域が設けられている。
【００２８】
好適な具体例の装置では、ベースに対して蓋を階段的移動させるための手段が設けられている；蓋には一連の開口が設けられ、装置を使用時には表面に選択的に接近できるようにする；蓋には細長い開口がある。ここでベースは一連の印しが設けられ、かつ細長開口は印しと協働して装置の使用法を指示する；分析対象は免疫不全ビールス(HIV)I、IIまたはその組合わせ、連鎖球菌群Ａ、連鎖球菌群Ｂ、RSV、Ｂ型肝炎、クラミデア種、HSV、抗体、抗原、核酸、オリゴヌクレオチド、キレート化剤、酵素、バクテリア、ウイルス、ホルモンまたはこれらの受容体である；そして装置は連鎖球菌群Ａ抗原、連鎖球菌群Ｂ、RSV、クラミデアまたは肝炎の抗原の存在量を測定できるように配列される；そして光学的活性受容表面を有する。
【００２９】
その他、本発明の光学的測定装置は、一分析対象に対し表面の複数の試料の同時測定ができるように配列した光学的活性受容表面と、表面に試料および薬剤の溶液を分配するように配列した自動液取扱い装置（例えばピペット装置）とを有することを特徴とする。
【００３０】
好適な装置にはさらに各測定の結果の光学的読取り装置を備えている；そして装置には表面を乾燥させるように配列したブロー手段を備えている；そしえ装置はかけられた試料の定量的かつ定性的評価を提供する。
【００３１】
他の観点から、本発明の特徴は分析対象を検出する方法を提供することである。この方法の行程は、付着層で一以上の層（特に分析対象と接触する受容材料を添える）を支持して光を反射または透過する基板を有する検出装置を準備し、分析対象が受容材料と結合する条件で分析対象を含んだ試料と装置を反応させ、そしてこの結合分析対象を装置の表面で質量変化させる薬剤と反応させるのである。
【００３２】
好適な具体例において、装置は免疫学的に活性な材料の付着層を支持する平たい反射性材料の基板を有する；この基板は平坦な反射性材料からなる；基板および付着層は反射時に放線を偏光させる；薬剤は装置上の質量を増減させる。例えば、薬剤は酵素であるか、または分析対象に特有の第二受容材料に付着される膜形成スチレンブタジエンコポリマー等の重合ラテックスがある；最も好適には、薬剤は抗バクテリアー抗体ー酵素の錯体を含む共役酵素がよい；薬剤は例えば3,3',5,5'-テトラメチルベンチヂンを含む酵素の基板等の沈殿剤により沈殿させる。
【００３３】
これに関連して、本発明の特徴は、分析対象と反応する光学的活性表面を備えるテスト装置を有する分析対象の光学的測定装置を提供することであり、分析対象と反応するようにした薬剤は表面に結合して表面の質量を変える。好適にはこの薬剤は共役酵素または重合ラテックスにする。
【００３４】
その他の観点から、本発明の特徴は試料中の分析対象を検出する方法を提供することにある。その行程は；基板を有し、上下面を有し、かつ基板に結合した抗体の層、試料の分析対象を含んだ一以上の層、分析対象と錯体を形成した共役酵素を有する層を少なくとも一層支持した分析対象含有層、をその上面で支持する薄膜の光学的免疫測定装置を準備し；共役酵素を沈殿剤と接触させ；沈殿剤と酵素との相互作用から生成物を沈殿させるに充分な時間だけ放置し；テスト試料中の分析対象の量の指標として、共役酵素層および抗体層の質量変化を光学的に測定する。
【００３５】
好適には、共役酵素にはパーオキサイド、または抗バクテリアー抗体セイヨウワサビパーオキサイドの錯体がよい；またはこの共役酵素はアルカリ性ホスファターゼであり、抗バクテリアー抗体アルカリ性ホスファターゼの錯体を構成する；そして沈殿剤は5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル燐酸塩を含む基板である。
【００３６】
他の観点から、本発明の特徴は分析対象の存在有無またはその量を検出するため光学的装置の基板上に配列した計器を提供することにある。この計器には、基板に対しブリュースタの角度以外の角度で配置されて直線的に偏光する単色光源、および基板からの反射偏光を検知するに適する位置と基板に関連する角度とで配置された分析器を有する。この分析器は、質量変化が非反応面に関する基板で生じる時、分析器を通して透過された基板からの反射光の強度をほぼ最大にするように構成されている。
【００３７】
その他、本発明の特徴は分析対象の光学的測定装置を最適化する方法を提供することにある。その方法の行程は；光学的活性層の選ばれた厚みを有する基板を設け；コーティング上に選ばれた厚みの付着層を設け；分析対象に対し選ばれた厚みを有する受容層を設け（ここで、光学的活性層、付着層および受容層の厚さの少なくとも一層を複数の層厚が得られるように変更する。）；受容層の質量増加が得られるような条件で分析対象を受容層と接触させ；そして一以上の層の厚さの光学的厚さを測定する。好適には光学的コーチングの厚さは基板の長さにより変化する。
【００３８】
出願人は、クレームした装置の最適化のために有用な一つの特徴は基板上面に取付けた非反射層を有しかつ屈折率が解っている、基板を使用することであることを知った。この非反射層は基板上面に付着できる材料による一以上の層、上面から最も離して配置しかつテストされる流体中で分析対象と特に結合する材料から選んだ受容材料の一以上の層から構成される。非反射層はそれに近接する基板表面材料の既知の屈折率のほぼ平方根である屈折率を有することおよび装置上の光の波長の1/4の奇数倍以下の厚みを有することが大切である。
【００３９】
すなわち、本発明の装置を最適化するためには以前から開発されている数学的アナゴリズム（"Handbook of Optics"の第３表参照、Water G. DriscollとWilliam Vaughan、出版人MacGraw-Hill Book Co.、8-48から8-49頁）から離れることが必要であることを出願人は知見した（「発明の背景」参照）。このように、数学的公式はむしろ感度のよくない装置に有用であろう一般的な厚みの指標を提供するが、本発明の方法は可成りかつ驚くほど高い感度の装置を提供するものである。
【００４０】
本発明の光学的テスト表面の構成に有用な最適の材料および方法が得られる方法論の指標を下記にて説明する。概して、肉眼で検出できる着色シグナルの発生によるかまたは機器分析によるかに拘わらず、本発明では分析対象を直接検出するための新規な光学的活性テスト面が存在する。これらのテスト面には付着層を介してテスト面に結合される特定の受容材料が設けられる。このように、 本発明では、光学的基板を選定し、分析対象に特有の受容材料を基板上面に取付け、この受容材料を分析対象を含む試料流体と接触させ、それから、 第一の色の変化を観察することによりコートされた表面に生じる反射と透過の変化を試験する。
【００４１】
本発明は広範囲に応用でき、そして種々の特定の測定法に採用できる。例えば、本発明の装置は抗原または抗体を検出する免疫測定法に使用可能である。本装置は直接、間接または比較検出計画に使用して、核酸の検出のみならず、酵素活性度の測定、有機性小分子の検出（例えば麻薬、 環境薬剤）にも利用できる。
【００４２】
本発明の特徴はテスト表面が測定を実施するに適していることである。この表面は種々の基板、非反射性材料、取付け材料および受容材料から開発可能である。このような材料はユーザが広範囲にかつ手短かに採用可能である。単一の測定からでも多くのテスト結果が得られ、しかもテストされる多くの分析対象が単一の試料で簡単に得られる。
【００４３】
本発明の装置はまたこの程度の感度を必要としない測定に対しても貢献する性能を提供する。この改善された性能は測定時間の短縮、説明の容易さ、および測定法や手続きの融通性をもたらすように貢献する。
【００４４】
本発明のその他の特徴および利点は下記の好適な具体例の説明およびクレームから明白になるであろう。
【００４５】
好適な具体例の説明最初にまず図面について簡単に説明する。
【００４６】
図面
第１図は本発明の装置および方法の中枢をなす干渉現象の略図である。第２図は鏡面、および非鏡面または散乱性の基板表面の略図である。第３図は本発明の装置で使用する最適な干渉膜を選定する方法の略図である。第４図は光学的表面への3-アミノプロピルトリエトキシシランの取付け状態を表示したものである。第５図は本発明の装置の作製に有用な多価シロキサンの取付け状態の略図である；ここで、Rは化学的に活性な基の光学的表面に存在するケイ素原子への付着に干渉せず、かつ受容体（生物学的）部分の付着にも干渉しない、多数の基のいずれか一つであり、例えば、このようなＲ基には第一、第二、第三アミン、アルコール類、エトキシ基、フェニル基および芳香族基等がある。第６図は計器読取り結果または目視読取り結果に有用である本発明の装置の略断面図である。第７図は、光学的表面に薬剤を付与することにより光シグナルが得られかつ強化される本発明の方法の略図である；例えば、ラテックスビードを有する抗体を使用するか、または酵素の抗体を使用して基板上に生成物を析出させる。第8A〜8G図は本発明の装置の斜視図および分解組立て図である；特に、第8A、8B、8Cおよび8D図はそれぞれ装置の平面図、底面図、斜視側面図および側面図、第8E図は測定のために開放した装置の斜視図、第8F図は装置のテスト面分解組立て図、そして第8G図は装置内部の各種構成品を示す分解組立て図である。第9A〜9E図は本発明の多重テスト装置の斜視図およびその他であり、特に、第9A、9Bおよび9C図はそれぞれ装置の平面図、斜視図および分解組立て図、第9D図は装置の前面蓋の背部を示し、そして第9E図は前面蓋を外した装置の平面図である。第10図は第8A〜8G図に示した装置を使用する方法の各行程を示す略図である。第11図は第9A〜9E図に示したと同じ装置を使用する方法を示す略図である。第12図は回分サンプリング方式の略図である。第13図は従来の偏光解析計の光路の略図である。第14A図は本発明に有用な薄膜分析計の略図であり、単色光源および感光性半導体素子またはアレイを使用する。第14B図は多色光源および光電子倍増管検出計の略図である。第15図は従来の偏光解析計の光路の改造型の略図であり、シグナル検出の新規の方法を表示する。第16図は光路長の短い偏光解析計の略図である。第17図は従来の蛍光法に対する蛍光測定法における反射性基板の利点の略図である。第18図は第５世代スターポリマーまたはデンドリマー（分子状自己集合ポリマー）の略図である。
【００４７】
テスト装置
偏光解析法、多角反射解析法、干渉分光学器使用術、プロフィロメトリー、表面プラスモン共鳴、消散波、およびその他の方式や偏光分析法、反射解析法、分光学と分光測定法の組合わせ、を含めた多くのタイプの反射防止層測定技術が本発明には有用である。本発明はこれらの技術の応用に関するもので、適宜選定した結合材料表面上の分析対象の濃縮固定化による薄膜の厚み、密度または質量の変化を検出し測定するものである。かかる薄膜測定技術は対象物を直接検出または定量化し、従来の固相測定に取って替わるものである。薄膜の技術的課題は、従来の診断その他の測定用具市場の競合に値するような測定用具の開発を妨害していた。
【００４８】
特定の受容材と光学的材料を組合わせる本発明の装置のテスト表面の構造には種々の重要な特徴がある。より詳細には、特定の受容材を非反射性または干渉性膜と組合わせるには特別の配慮が要求される。これらの特徴を下記で検討するが、概して、最終的な測定装置への要求ばかりでなく、光学的基板、任意の反射防止層や干渉膜や非反射性膜および取付け相と、複合テスト表面に使用される受容材料との間の相互関係をも評価しなければならない。目視／定性的、計器的／定量的、計器的／定性的等のエンドユーザーの所望要素は適当な感度と性能特性の有用なテスト装置の製造時に選択される。
【００４９】
第１図について説明すると、本発明の一具体例の効用の中枢をなす光干渉の一般的現象を示してある。この現象は通常テスト装置の顕微鏡的な表面特性とは無関係である。例えば、この装置により表面から反射する光を変化させるということのみが重要で、表面に回折格子その他の何か特別のパターンを設ける必要がない。このように、概して表面は平坦であり、特別のパターンは何ら備えていない。しかし、表面は人間の目に有効であるような形やデザインにする。非反応テスト面では装置に入射する白色光を金色光で反射させるが、他方、分析対象と結合する付加物にり、反応テスト面は入射白色光を紫または青色で反射させる。金色から紫または青色への変化は反応および非反応テスト表面の干渉の差を表わしている。
【００５０】
第６図は本発明を採用した装置のテスト面の種々の一般的構造を略図で示してある。計器読取り装置の場合は表面に基板、付着層、および受容材料層が設けられ、そして任意に不定形ケイ素および／または金属膜も設けられる。これに対し、目視で読み取りできる装置では、付着層および受容材料層と共に、複合干渉膜を形成した反射防止層（または干渉膜）を設ける必要がある。これら種々の層およびその相互作用を具体例を使用して検討する。
【００５１】
基板
表面上の一以上の薄膜はその表面で入射光を減衰させ、反射または透過で測定される入射光を変化させる。反射は光が付近の媒体でなく異なる屈折率の媒体に遭遇するときに生じる。この付近の媒体は通常屈折率が1.0の空気である。透過なる一般用語は入射光が入射面以外の側の表面または媒体から離れるプロセスのことである。 媒体の透過率は入射光に対する透過光の割合である。反射光と透過光とは共に肉眼で検知でき、また計器で測定できる。本発明では試料中の分析対象の量の尺度として装置内のかかる光の減衰を使用することができる。しかし、装置の実際の構造は反射または透過のモードを所望するかどうか、およびその結果の分析を肉眼でか計器でするかによって決まる。このような特定の組合わせは基板の選定と関係があり、下記で記述する。
【００５２】
反射モード、 肉眼による解明
本発明で使用する現象の一例として、アスファルト面で水の上の油を見る時に観察される干渉色がある。このような干渉効果は至極一般的なことであり、一片の多層構造雲母、一片の氷、引伸ばしたプラスチック鞄またはセッケンの膜で見られる。色の変化は材料の厚さの局所的変化によるものである。水上の油で観察される色は特に濃く、水と油の屈折率の差により肉眼で容易に観察される。水は鏡面反射するので色はさらの濃くなる。アスファルト表面は透過光を吸収し逆反射を抑えて、観察される色調を和らげる傾向がある。肉眼は強度の変化よりコントラストに敏感であり、このため、材料を選定する場合は表面にける質量たは厚みの変化の結果として良好な対照を示すような色が得られるようすべきである。材料の表面に膜を形成して一以上の波長または波長の帯の反射率を変えるのである。このよなタイプの材料はサングラス、カメラのレンズおよび窓ガラスの製造で使用されている。
【００５３】
テスト面が肉眼で見えるようにデザインされている場合は、光学的基板は屈折率が既知のもので、かつその表面は最上面でのみ反射するものでなければならない。研磨した単結晶性のケイ素、金属およびあるセラミックや黒色ガラスの表面はこの用途に直接適用できる。このような材料は目に見えるシグナルを発生させて、光学的に活性であると考えられる。
【００５４】
ガラスまたはプラスチック等の材料は、この方法で有効に利用する前に別に処理しておく必要がある。ガラス等の材料は上面と背面とで反射する。これを回避しかつこのような材料を使用するため、最上面に膜を付加させねばならない。不定形ケイ素、金属の薄膜、またはこれらの材料の組合わせが使用できる。この場合ガラスは固体の支持体として作用し、観察される色の発生には本質的に関与しない。このため光学的には受け身であると考えられる。
【００５５】
単一の基板材料またはより複雑な構造を使用する時、反射防止層または非反射性コーチングを選定するには、最上面の屈折率のみが大切である（下記参照）。予め選定した基板に適合する非反射性材料は" Hanbook of Optics"第３表の8-48から8-49頁の計算を参考にすべきである。単結晶性ケイ素はこれを最上面に、透明ガラスはこの表面を無定形ケイ素その他の材料でコートする。非反射性膜の膜厚の調整は下記のウエッジの実験結果を使用して行なう。肉眼で識別できる色の変化を得るために反射性基板を使用する場合、適当な屈折率および厚みの膜を付加することが絶対に必要である。
【００５６】
光学的基板材料は鏡面反射を形成し、またはシグナルを見る場合に角度に依らない乱反射を生じるように処理できる。
【００５７】
透過モード、肉眼による解明
この方法では、光が表面を透過するので色は反射光中には見られない。このような異なる波長の光の選択的透過はサングラス、 カメラレンズ、窓ガラスおよびnarrowbandpassフィルターの製造に使用されている。材料が異なる波長の光を選択的に反射および透過する。このフィルターは光の波長の大きな束を反射し、特定の一波長を中心した波長の小さな束のみを選択的に透過する。このフィルターは一側面を光の多くの波長を反射する材料でコートした光学的ガラスで構成されている。このガラスにコートした材料の厚みの変化はフィルターの有用な範囲を変更させる。
【００５８】
このため、光学的基板は光の可視波長に対し透過性がなければならない。このため、単結晶性ケイ素、金属、あるプラスチックおよびセラミックは、極度に薄く透明でなければ適用できない。ガラスおよびある種の透明プラスチックはこの用途には最も有用である。この方法では基板は光学的に活性である。目視できる色の変化を生じさせるためであるので、基板の屈折率は非反射性タイプの膜には逆効果を与える。一以上の透過面でのシグナルの散乱を避けるするためこの用途には表面は均一で円滑でなければならない。
【００５９】
不定形ケイ素層が充分薄ければ、この不定形ケイ素層でコートした基板はある角度で可視光線を透過できる。このことはガラス基板上の非常に薄い金属層でも事実である。このタイプのテスト表面は不定形ケイ素がテストピースの背面（すなわち、目視面の反対側）にあるように配置しなければならない。
【００６０】
反射モード、計器による解明
計器による検出を採用する場合は、非反射性または反射防止層を使用することは任意である。反射計ではシグナルを生じせるために色が変化するか、または光度（強度）が変化することが要求される。計器では強度の変化を記録し、コントラストのための最大限の変化を必要としないので、この色の変化は目視可能なように選択する場合の色の変化とは異なることである。非反射性膜厚は、分析対象結合の要因としての強度の最大の変化が得られるように調整することが好ましい。さらに、反射計を採用すればまたこれで鏡面反射または乱反射面での色／強度の変化が測定できる。
【００６１】
偏光解析計タイプの計器を使用する場合は、光学的基板は鏡面反射するものにすべきである。反射は最上表面からのみ生じる。既に検討したように、ガラスはこの場合支持体としてのみ作用し、光学的に受け身であるか、検出されるシグナルの発生には関与しない。計器による検出では薄膜との相互作用による光の強度変化を測定する。光はそれがどのような波長の単色光、多色光でも楕円状または直線的に偏光する。
【００６２】
透過モード、計装解釈
入射光に対し透過的であればどの光学基板でも、その入射光が多色光か単色光か、線形偏光か楕円偏光か、あるいは望ましいどの波長であろうと関係なく、この用途に使用することができる。この用途におけるＡＲ膜の使用は任意であるが、屈折計用に必要な場合は、目による解釈のために提示した規則がここでも適用される。したがって、光学基板の屈折率はＡＲ被膜の選択に影響する。屈折計の設計は、反射測定または透過測定を行なえるように容易に変更することができる。
【００６３】
色に関係なく透過光を変化させるときには、ＡＲ膜は必要ない。この用途における基板の唯一の要件は、入射光の１つまたは複数の成分が透過することであり、試験片の最上部表面の質量または特性が変化すると、透過光が検出可能な方法で変化することである。イーストマン・コダックによって製造されているIrtranシリーズなどの材料は、これらの膜の赤外（ＩＲ）特性の変化を監視するために、この用途に使用することができる。
【００６４】
したがって、「基板」という用語は、以下で述べる層を保持するための固体表面だけでなく、反射防止膜をはじめとする光学活性基板をも含む。明瞭性を期すために、基板のこれらの２つの部分を別個に論じるが、本発明で重要なことは、層（アタッチメント層およびその他の層が接着される層）が光学的に活性であって、上述のようにこれらの層の厚さまたは質量の検出可能な変化を提供することであることを、当業者は認識されよう。
【００６５】
光学基板は固体材料であるか、あるいは光学的に作用する１層の材料を支持するかのいずれかである。これらの材料は、反射防止膜と結合して干渉効果を生起させる場合には、既知の屈折率を持たなければならない。したがって、後で述べるように、これは、反射性または反射性にされるどのような所望の材料からでも形成することができる。計器に使用する場合、透過光が分析されるように、基板を透明（例えばガラスやプラスチック）にすることができる。
【００６６】
本発明は、最終使用者のニーズに適合する様々な光学基板の材料および形態の使用に適している。光学基板は、拡散反射または鏡面反射をする材料から形成するか、あるいはそうした材料を基板上に塗布することができ、剛性または可撓性、反射性または透過性のどちらでもよく、試験表面の光学機能コンポーネントを形成することができ、あるいはまた光学的に受動的な支持体として作用すること（および光学活性層を設けること）ができる。計装分析用に設計されたデバイスは基板上に反射防止被膜（反射防止膜）を必要とせず、目視観察用に設計されたものはそうした被膜が必要である。計装用途、または色信号発生用途の目視観察用の光学基板を選択するのに有用な判断基準を、以下に提示する。
【００６７】
ガラス、溶融シリカ、プラスチック、セラミック、金属、および半導体材料をはじめとする広範囲の剛性材料で、光学基板を形成することができる。可撓性光学基板としては、プラスチック等の薄板がある。大半の基板は、その後の層を基板上に沈積する前に、当業者にとって周知である標準溶剤、プラズマ・エッチング、または酸洗浄が必要なだけである。
【００６８】
目視可能な色信号を発生する場合、反射防止被覆材が必要である。マイラー（ポリエチレン・テレフタレート）および表面エネルギの低いその他の材料のポリマー膜は、そうした材料にはよく接着しないことがあり、この層が沈積できるようにするには、その前に追加処理が必要になることがある。接着力を改善するために、これらの光学基板は、半導体処理における酸素プラズマ洗浄で標準的な条件下で、酸素プラズマでエッチングすることができる。
【００６９】
ガラスや、けい素などの半導体材料、金属等の多くの固体材料の表面は、研磨すると充分に滑らかになり、鏡面反射が得られる。反射による分析に使用する場合、光学基板の選択における重要な要件は、上面だけで反射が発生するか、または発生させられることである。これは、干渉膜を含み、目視観察されるデバイスの場合、特に重要である。これは、当業者に周知の技法で、基板上に薄い金属膜を蒸着し、その後の層を接着を行なうことによって、容易に達成される。例えば、ガラス基板の最上部表面は、下層表面からの望ましくない反射を防止するために、層を被覆することができる。
【００７０】
金属層
基板を反射モードで使用する場合、基板が部分的または完全に透明であるときは、透過光を遮断し、上部表面だけで反射が起きるようにするために、不透明材料を被覆することができる。例えば、ガラス基板は、アルミニウムを充填したタングステン・ボートに向けて真空チャンバ内に取り付けることによって、アルミニウム、クロム、またはその他の透明な導電性酸化物の層を被覆することができる。チャンバは、１×１０-5トルの圧力にまで真空排気される。タングステン・ボートに電流が流れ、ボードの温度が上昇する。アルミニウムが２０Å／秒の率で基板に沈積する温度で１００秒間沈積させ、ガラスに２０００Åの厚さを持つ不透明なアルミニウムの層を被覆する。背面反射を防止するために、これより薄いアルミニウムまたはクロムの層を用いることもできる。金属膜の沈積には非導電沈積技法を使用することもできる。
【００７１】
アモルファス・シリコン上述のアルミ被膜ガラスは、光学的に受動的と考えられる。したがって、水素添加アモルファス・シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を被覆すると、基板の光学特性がａ−Ｓｉ：Ｈのみから誘導される。アルミニウム被覆ガラスが必要なのは、アモルファス・シリコン沈積プロセスに導電性表面が必要な場合だけである。アモルファス・シリコンの沈積に導電性表面の使用を必要としない技術が知られている。この基板を生成するには、プラズマ・エンハンス化学蒸着システム内の２つの対置する電極の一方に、アルミニウム被覆ガラスを取り付ける。システムを真空排気し、基板を２５０℃に加熱する。チャンバ内への一定流量のシラン（ＳｉＨ4）ガスを０．５トルの圧力に上昇する。１０ｍＷ／ｃｍ2のＲＦ電力を電極に印加することによってプラズマが衝突する。ａ−Ｓｉ：Ｈの膜が基板に沈積し、約７５分間で約１０００ｎｍの厚さにまで成長する。こうして形成されたａ−Ｓｉ：Ｈは、試験表面の最初の光学機能層を形成することができる。
【００７２】
ａ−Ｓｉ：Ｈだけを被覆した（アルミニウム層を持たない）ガラス基板も本発明に有用である。ガラス、溶融シリカ、サファイヤ、および多くのプラスチックなどの透明な基板は、追加修正を行なわずに、計器透過測定に使用することができる。目視可能な色信号生成は透過性基板を用いて達成でき、被膜の反射防止特性は透過光から決定される。
【００７３】
薄膜測定に充分な反射表面を持つ基板の多くは、金属から形成される。これらの金属の例として、鉄、ステンレス鋼、ニッケル、コバルト、亜鉛、金、胴、アルミニウム、銀、チタン等、およびこれらの合金がある。金属は、計器検出法を採用するときに、特に有用な基板である。計装測定システムの場合、主な要件は、基板が反射し、平面であることである。対照的に、目視可能な色信号生成の場合、金属の反射率に適切な反射防止被覆を整合させることは、不可能ではないが、非常に難しい。最適な干渉色の生成するために、光学基板の反射率と使用される反射防止膜とを整合させなければならない。したがって、色生成用に設計されるデバイスは一般に、他の基板から、または前に述べたようにアモルファス・シリコン被覆金属基板から形成される。
【００７４】
非鏡面
図２を参照すると、鏡面基板（表面が鏡状またはほぼ鏡状である基板）を提供するのではなく、むしろ図２に図解的に示し、かつ符号Ｂで表わすように、表面が不規則な隆起を形成するような方法で製造される本発明の一般概念の略図を示す。これらの隆起は、図ではかなり誇張されているが、一般には１ｎｍから１００μｍの間の大きさであり、最も望ましくは約１００ｎｍから１００μｍの間である。繰り返すが、これらの隆起は（回折格子の形のように）規則的に設けられたものではなく、表面に入射した光の一般散乱が生じるように設けられたにすぎない。このような隆起を設けることにより、光がどの角度方向から基板に入射するかは重要でなくなり、図１に示す色変化は、基板を入射光または観察する目に対し任意の角度で保持することによって、観察することができる。計器表面および目視可能な色信号生成表面はどちらも、鏡面基板または拡散反射基板により構成することができる。
【００７５】
拡散反射を行なう表面は、物理的研磨、化学的研磨、または材料の塗布など、様々な方法で得ることができる。鏡面基板は、炭化けい素の粒子を含む化合物を用いる物理的研磨によって荒削りして、拡散表面を形成することができる。代替的に、材料を化学的に研磨することもできる。例えば、単結晶シリコン・ウェハは、８０℃の３０％水酸化カリウム（重量）の水溶液でエッチングして、ピラミッド構造から成る粗表面を形成することができる。研磨工程の後で、当業者に周知の等方性エッチングにより、拡散反射を生じる不規則表面を形成することができる。
【００７６】
基板の拡散特性は、被覆によって生起することもできる。例えば、直径２ミクロンのポリスチレン球を、ポリアミド含有溶液などの流体中に浮遊させる。ガラス・スライドをスピン・コータに真空搭載し、スライドの中心部が溶液で覆われるようにする。スピン・コータのスイッチを３０００ｒｐｍで数秒間オンにし、溶液中の球を表面全体に均等に分散させる。流体を乾燥させると、拡散反射を生じる表面が得られる。
【００７７】
本発明の実施例は、拡散光反射を生じる不規則表面を持つ光学基板の使用を含む。また、光拡散材料またはテクスチャード・プラスチック（textured plastic）などの光変更材料を被覆したり、上にかぶせたり、またはそれらを介して観察される滑らかな光学基板の使用も含む。そうしたプラスチックを介して観察すると、上述と同様の効果が得られる。
【００７８】
一例として、光学基板は単結晶から形成され、単結晶を成長させて直径４インチに押し出した後、ダイヤモンド・ソーで切断してウェハにする。このウェハを化学エッチング液で処理して、表面を円滑にし、傷を減少する。このウェハを、タルク・スラリー内のアルミニウム酸化物、チタン酸化物、または炭化けい素の粒子で研磨または研削する。初期粒径は大きく、徐々に小さい粒径を用いて、徐々により円滑な表面にしていく。ウェハの両面にこの処理を施す。最終研磨工程の後、非常に強度の拡散反射表面が得られる。
【００７９】
ウェハの研磨が終了した後、次の工程またはその既知の変形法を用いてウェハを洗浄する。すなわち、ウェハを、陽イオン活性剤で音波洗浄し、その後１８メガオームの水ですすぎ洗浄する。次に、それらを陰イオン活性剤で洗浄した後、１８メガオームの水ですすぎ洗浄する。これらを、３７０ｍｌの３０％Ｈ2Ｏ2、２５０ｍｌのアンモニア水、および９ガロンの水から成るアンモニア水溶液で超音波洗浄し、０．１ミクロンの濾過水を最終すすぎ水とする多段階の水ですすぎ洗浄する。次にこれらをスピン乾燥させ、光学被覆できるようにする。この方法に代わる別の方法として、Polymer Surfaces and Interfaces （edited by W.J. Feast and H. S. Munro, Johon Wiley and Sons, N.Y., N.Y., page 212, 1987）に記述されている「ＲＣＡ洗浄」がある。
【００８０】
ガラスの場合、表面特性の程度つまり不規則性は、光沢で論議される。ここで述べる表面の拡散反射能力とは、反射が純粋鏡面反射に比べて散乱する程度である。拡散性は表面トポグラフィの関数であり、相対トポグラフィは干渉膜またはバイオフィルムよりずっと大きいので、あいまいさ（fuzziness）は、異なる特定の結合剤に対し大きく変化するとは考えられない。目視可能な色信号生成の場合、膜は反射光の明度または色に影響するが、その拡散特性には影響しない。色信号を生成する拡散表面は、反射計に特に便利である。
【００８１】
表面トポグラフィは、デク−タクR（カリフォルニア州サンタモニカ、ソローン・テクノロジー社）などの表面プロフィロメータによって特性化することができ、したがってあいまいさまたは不規則性もしかりである。デク−タクRは、表面特徴間の分離または距離に関する読み、および表面の定義された領域における表面特徴の高さの平均値を提供する。表面の一つの有効な尺度は、二乗平均平方根（ＲＭＳ）または平均表面粗度をを平均ピーク間隔で割った値であり、ピークはＲＭＳ粗度の少なくとも５０％の高さを持つ突起と定義する。粗度は反射率対角度の関数であるので、反射率の角度依存性を測定することによって定量化することができる。法線から３０度で入射する光源の場合、フォトダイオードの反射光の強度は、０度から９０度までの角度の関数として測定しなければならない。選択されたウェハは、観察角度範囲全体にわたり円滑に変化する反射率を示すのが最適である。ＨｅＮｅレーザ光源を使用した場合、本発明で有用な荒い表面からの表面鏡面反射率は、研磨ウェハが１００％反射すると仮定して、５％未満でなければならない。
【００８２】
本発明の一実施例では、非鏡面つまり不規則な表面を持つ品物は、約２７００から３２９５の間のピーク値によって特徴付けられ、好適な測定値は約２９９５である。この値は、ＲＭＳ粗度をテクスチャの平均ピークで割った値を表わす。
【００８３】
研磨処理の他に、広範囲な化学またはプラズマ・エッチング技術が、基板の拡散特性を得るのに適している。例えば、ガラスは、つや消しガラスの製造時に使用されるＨＦエッチングを利用して、拡散光反射表面に変えることができる。
【００８４】
色信号生成の場合、基板選択は、その後の被覆段階に使用される反射防止材の特性を決定する。以下に、初期基板選択に基づく反射防止材の選択について述べる。
【００８５】
基板材料は、切断、ソーイング、スククライビング、レーザ・スクライビング、またはその他の方法で処理して所望の試験片の形状にすることができる。単独使用分析に適した試験片は、０．５ｃｍ2ないし１ｃｍ2であり、好適には０．７５ｃｍ2である。代替形態で実質的に多少反応性試験表面が必要になることがあるので、試験片の大きさは上記に限定されない。
【００８６】
任意選択的反射防止膜材料
図１を参照すると、単層反射防止膜の最も単純な説明として、基板を薄い層の材料で被覆し、膜の外表面からの反射と基板の外表面からの反射が、破壊的干渉によって相互に打ち消すようにする。第１に、反射は１８０度ずれていなければならず、第２に、これらは同一振幅または同一強度でなければならない。
【００８７】
反射モードでは、本発明のデバイスの被覆の反射防止膜特性は、ある波長の光の反射を抑制し、別の波長の光の反射を増強する。これにより、入射光の抑制された波長は、基板または基板上の不透明の被覆に入り、そこで吸収される。反射が抑制されない他の波長の光の多くは被覆された基板には入らず、反射するが、幾つかの成分は吸収される。被覆の光学厚さが変化すると、反射光の波長の範囲が変化する。透過モードでは、被覆の特性は、反射モードの場合と同様に、幾つかの波長の光の反射を抑制し、他の波長の光の反射を増強する。これにより、入射光の抑制された波長は基板に入り、透過する。反射があまり大きく抑制されない他の波長の光は反射し、透過の程度は小さくなる。被覆の光学厚さが変化すると、透過光の波長の範囲が変化する。
【００８８】
目視可能な色信号生成が必要な場合（図６の右側参照）、最終分析結果は計器によって測定することもできる。理想的には、以下で述べる特定の結合剤だけおよび光学基板を使用して完全干渉膜を生成するには、基板は、受容体層（以下参照）の屈折率の二乗の屈折率、つまり（１．５）2つまり２．２５を持たなければならない。この数字が異なっても、以下で述べるように、本発明の有用なデバイスが得られる。選択される材料は、以後の工程に対し機械的に安定しており、反射し、既知の屈折率でなければならない。光学基板を、例えば生物学的膜など特定の膜に整合させることは、常に可能なわけではない。そのような場合、適切な光学基板の欠如を補償するために、中間反射防止膜を使用しなければならない。目視可能な色信号生成の場合、基板材料は次の２つの制約を受ける。第１に、それは反射防止膜材料に接着しなければならない。第２に、最も単純な例では、基板の屈折率がその直接上の材料の屈折率の二乗にほぼ等しくなければならず、より複雑な試験表面では、基板の屈折率が「光学ハンドブック」のpp8-48ないしpp8-49の表３の式の一つにほぼ当てはまるように選択しなければならない。例えば、約４．１の屈折率を持つシリコン・ウェハを使用すると、試験表面は、広範囲の対応する反射防止膜または反射防止材料を用いて設計することができる。この材料は、減衰させる波長の４分の１波長の厚さに、または表３に示す式の変化例の厚さにまで被覆しなければならない。当業者は、様々なその他の材料が、上記基準を満たすならば、試験表面として使用するのに同様に適していることを理解されよう。
【００８９】
反射防止膜被覆は、既知の被覆技術によって基板の表面に沈積する。例えば、真空チャンバ内でのスパッタリングや蒸着などによって実行する。様々なその他の便利な被覆技術が当業者には周知である。反射防止膜被覆として有用な材料は、利用される厚さでかなり透過的な透明材料から形成され、基板を被覆したときに、ある波長の反射光を抑制する。膜は、いったん光学基板に沈積されると、その後の工程にも安定である。
【００９０】
この試験表面は少数の光学層を有することが望ましいが、以下に述べる変化によって、表３に示す式に対応するより多くの層を有するより複雑な試験表面を設けることもできる。すでに述べた通り、材料選択の出発点は、理論計算である。理論的な考慮点を用いて、どの材料が事前に選択された基板と互換性があるかを決定することができる。被覆の厚さは、予め決められた４分の１波長の厚さに、または事前に選択された干渉色に合わせて設定することができる。しかし、本発明の特定の結合剤光学膜複合物を構成するには、初期被覆に多数の調整が必要である。これらの調整を以下で述べる。
【００９１】
例えば、研磨シリコン・ウェハなどの基板は、約４．１の屈折率を持つ。表１の第１方程式に従って、試験表面の効用を最大にするには、選択される反射防止膜材料が２．０２（つまり、４．１の二乗平方根）の屈折率を持たなければならない。最大「みかけの」色変化は、シリコンの場合、窒化けい素（Ｓｉ3Ｎ4）またはけい素／二酸化けい素複合体など、ほぼ２．０の屈折率を持つ材料により達成される。同様の屈折率を持つ他の反射防止膜材料として、酸化すず、酸化亜鉛、酸化クロム、チタン酸バリウム、硫化カドミウム、酸化マンガン、硫化鉛、硫化亜鉛、酸化ジルコニウム、酸化ニッケル、酸化アルミニウム、窒化ほう素、フッ化マグネシウム、酸化鉄、シリコン・オキシニトリド（ＳｉxＯyＮz）、酸化ほう素、フッ化リチウム、および酸化チタンなどがある。
【００９２】
窒化けい素
窒化けい素の沈積の１つの方法として、前にａ−Ｓｉ：Ｈの沈積で述べたのと同様のプラズマ・エンハンス化学蒸着法がある。この技術およびこの技術の変形は、多数の材料の沈積に適することが認識されている。例えば、Ｓｉ3Ｎ4を生成する場合、アンモニア（ＮＨ3）ガスをシラン・ガスに添加する。窒化けい素は、単結晶シリコンや多結晶シリコンの基板上の反射防止膜として、または光学的に受動的な基板上のアモルファス・シリコンや多結晶シリコン上の反射防止膜として、よく機能する。
【００９３】
窒化けい素沈積工程とａ−Ｓｉ：Ｈ沈積工程との互換性は、非常に費用効率のよい組合せを達成する。２つの膜を次のように沈積することができる。ガラス基板を蒸着システムに取り付け、前に述べたように、厚さ２０００Åのアルミニウムの層をガラスに沈積する。次に、基板をプラズマ・エンハンス化学蒸着システムに取り付け、前に述べたように、厚さ１ミクロンのａ−Ｓｉ：Ｈの層を沈積した後、窒化けい素の層を沈積する。この方法により、安価な反射モード試験表面がガラス基板上に形成される。この方法は、１９６２年１２月１２日にコールマンに発行された米国特許第３，０６８，５１０号に記載された誘電体および可撓性基板上の被覆の沈積に延長することができる。
【００９４】
窒化けい素の屈折率、または類推によりけい素／二酸化けい素複合体の屈折率は、蒸着工程で制御することができる。ガスの比率を変化させることができ、あるいは沈積率を変化させることができ、当業界に周知の様々な他の方法を用いて、沈積する反射防止膜の屈折率を制御または選択することができる。
【００９５】
多層膜
多層反射防止膜被覆は、電子ビーム蒸着によって沈積することができる。基板を真空蒸着室に取り付け、蒸着される様々な材料の２つまたはそれ以上のるつぼの上に懸下させる。次に、各るつぼを電子ビーム銃で加熱し、結晶厚さモニタで蒸着率を監視する。各るつぼは、可動シャッタで覆われている。シャッタを交互に開閉することにより、所望の多層の積重ねが沈積されるまで、または多重成分膜が沈積されるまで、基板は各蒸気流に順次露出される。上述の手順は、複数層の様々な反射防止膜材料または特定の屈折率が得られるように特別調整した多重成分膜を沈積するために、３つ以上のるつぼを使用するように普遍化することができる。
【００９６】
窒化けい素膜を特定の厚さに被覆した試験表面は、可視光の青領域の特定の波長を抑制し、したがって黄−金干渉色を反射する。以下の例では黄−金干渉色を用いるが、試験表面の干渉色は、光のスペクトルにおけるどの適切な色にもすることができる。色は、選択された基板材料、選択された光学層の化学成分および屈折率、ならびに被覆層の厚さおよび数に依存する。これらの設計技術を用いて、光のスペクトルの紫外または赤外領域の信号または背景を持つ試験表面を生成することができるが、これらの試験表面は、結合分析（bound analyte）の計装検出でしか使用できない。
【００９７】
例えば、フッ化リチウムは、多層積重ねの１成分を形成することができる。これは可視光に対し１．３９の屈折率を持ち、したがって９２５Åの厚さで緑光に対する４分の１の波長層を形成する。これは、約９００℃のプラチナるつぼから蒸着することができる。
【００９８】
チタン膜
チタン膜は、光学膜の形成に特に有用である。こうした膜は、ＳｉＨ4など、他の光学材料より安全に処理され沈積される材料を使用するので、有利である。この適用方法も、必要な計装が少なくてすみ、費用効果が高く、高速である。
【００９９】
二酸化チタンは可視光に対し約２．２の屈折率を持ち、したがって５８５Åの厚さで緑光に対して４分の１波長層を形成する。二酸化チタンは加熱するとより低級な酸化物に分解するので、蒸着膜は化学量論的（stoichiometric）ではない。化学量論的二酸化チタンを蒸着するには、電子ビームのパルスを発生させなければならない。蒸着は約２０００℃で発生する。
【０１００】
有機チタン酸塩は、早期重合やチタン酸塩の凝縮を防止する条件下で加水分解して、二酸化チタン（ＴｉＯ2）とすることができる。後者の反応（早期重合やチタン酸塩の凝縮）は塩基触媒作用である。有機チタン酸塩は、水溶性溶媒システムや界面活性剤と混合することができる。選択された溶媒／界面活性剤システムは高い固体含有量に耐え、すぐれた平滑化または展着能力を持ち、水と相互溶解しなければならない。アルコールや３Ｍ（ミネソタ州）によって製造されるフルオロサーファクタントは、この方法に特に有用である。有機チタン酸塩の加水分解は、重合や凝縮の前に発生しなければならず、溶媒システムは、望ましくない重合反応を防止するために酸性でなければならない。酸によって供給される対立イオンは、チタン−酢酸の溶解性を改良するために使用することができ、塩化水素酸が望ましい。非水溶性溶媒システムは使用できるが、有機チタン酸塩が早期加水分解しないようにしなければならない。溶媒は、被覆溶液の安定性を改良するために、無水物でなければならない。適切な溶媒として、トルエン、ヘプタン、およびヘキサンがある。界面活性剤は（水溶性溶媒システムの場合のように）使用する必要は無いが、被覆の特性をさらに改善することがある。
【０１０１】
有機チタン酸塩および溶媒システムを混合した後、スピン塗布技術を用いて、この溶液の予め決められた量を光学基板に塗布する。有機チタン酸塩を非水溶性溶媒システムと混合する場合は、溶液を動的送出しによって光学基板に塗布する。動的送出し法で、基板をスピン・コータに取り付け、４０００ないし５０００ｒｐｍで回転させる。溶液は旋回する基板に塗布され、基板は均等な膜が得られるまで旋回し続ける。水溶性溶媒システムの場合、溶液の動的または静的送出しが可能である。静的送出しの場合、溶液が基板に塗布された後、旋回が開始される。必要な旋回速度は、溶液の固体含有率（パーセント）、基板に塗布される量、および基板の大きさによって異なる。生成されるチタン層の厚さは、固体含有率、塗布される量、および旋回速度の関数である。
【０１０２】
二酸化チタン層は、多くの技術によって基板に硬化することができる。二酸化チタン層の屈折率は、硬化時の基板の温度、およびそれより程度は低いが硬化工程の長さによって制御される。硬化工程は炉、赤外加熱ランプ、ホット・プレート、または電子レンジを使用することができる。
【０１０３】
二酸化チタンは、この用途に多数の利点を提供する。
１．広範囲の光学基板に安価にかつ容易に適用でき、また製造における危険性が無い。
２．屈折率を制御することができ、１．６から２．２の範囲を網羅する。したがって、これを用いることにより２．０の屈折率を持つ窒化けい素と同等の材料を得ることができる。
３．表面に形成されるチタノールは、その後の誘導プロセス（derivatization process）におけるシラノールと同様に化学反応する。
【０１０４】
チタン酸塩の他に、けい酸塩、酸化アルキル・アルミニウム、およびジルコニウムの対応する類似物を用いて、この方法によって反射防止膜を生成することができる。
【０１０５】
二酸化チタンのスピン・コーティングの他に、ポリシラザン（polysilazanes）を用いて、スピン・コーティングによる窒化けい素被覆を生成することができる。これらのプロトコルは、この技術に適用することもできる。反射防止膜を生成するために、ポリメチルシルセスキオキサン（polymethylsilsesquioxane）やポリフェニルシルセスキオキサン（polyphenylsilsesquioxane）（一般式ＲＳｉＯ1.5）などのＴ樹脂を光学基板または支持板上にスピン・コーティングし、炭化けい素の表面に適切な屈折率を得ることができる。
【０１０６】
最適化手順
基板、反射防止膜（ＡＲ膜）、付着層及び受容性材料の特別な組合せのため、最適な背景干渉色を選択するためのモデルが開発された。現在までに開発された数学的モデルは本発明の有用な装置を提供するのに効果的ではないので、これらのモデルは装置構築の開始点としてのみ利用される。最適化は本発明の装置を提供するために必要である。説明目的のためだけではあるが、選択される基板はシリコンウェーハとして、選択される最適材料は窒化ケイ素とした。観察された最もコントラストの高い色は、テスト表面上の質量の増加につれてマゼンタに変化するイエローゴールドであった。
【０１０７】
図３において、本発明の装置に対する各層の最適の厚みを選択する方法が、シリコン上の窒化ケイ素膜のために開示されている。ステップ１において、シリコン基板が鏡面もしくは非鏡面のいずれかで設けられる。窒化ケイ素膜はステップ２、３に示すようにこの表面上に設けられ、加熱及び適切な溶液内でかき混ぜることにより段階的に侵食される。各ステップのタイミングは最長期間侵食に賦される部分が青白い金色を呈するように、他方侵食に曝されない部分が濃い青色を呈するように選択される。ステップ５、６では各々検出される検体用の付着層及び受容性材料層が窒化ケイ素上に設けられる。これらの層は経験に基づいて決定されてもよいし、あるいは所望であれば、同様に（例えば、この段階的な方法で）最適化することもできる。ステップ７において、陰性の応答、弱い応答及び強い応答を記録できるように、ストリップの３つの部分が異なる方法で処理される分析評価が実施される。その結果がステップ７に示され、テストにおいて最強の弱い陽性の応答を提供するセクションによって、発明における有用な窒化ケイ素の厚みを決定することができる。
【０１０８】
特に、シリコンウェーハを、ウェーハが濃い青に見えるように、窒化ケイ素の厚いコーティング（８００Å）で調製した。それから干渉色の光学くさびを作るために、反射防止膜材料を熱い燐酸浴の中でウェーハから離してエッチングした。光学材料は、３００Åが光学くさびの一端に残り、７００Åが光学くさびの他端に残るようにエッチングした。（１８０℃で窒化ケイ素はおよそ毎分２０Åで除去された。）
【０１０９】
エッチングされ、くさびで止められたテスト表面を付着材料で被覆し、その後受容性材料で被覆した。反応性表面を陰性の、弱い陽性の、そして強い陽性の試料で分析した。そして光学材料の厚みを、最も際だった色変化もしくは視覚的コントラストを提供するように思われる光学くさびセグメントで測定した。最適膜厚は複合テスト表面分析に基づいて最も簡単に選択される。このプロセスは特別な検体のために得られる視覚的コントラストを最大限活用する。
【０１１０】
この経験的評価に必要な厚みの光学くさびを作るために、窒化ケイ素は容易にエッチングできる。多くの材料は酸エッチングもしくは塩基エッチングプロセスに影響されやすい。材料をエッチングする他の化学的方法も可能である。膜が簡単に破壊されるので、特別な光学基板から所望の光学膜を容易に取り除けない場合、あるいは光学基板が必要なエッチング液に対して安定しない場合、光学くさびを生じさせる別の方法も使用できる。例えば、単結晶性シリコンは塩基性溶液に長時間曝されると安定しない。シリコン上の光学膜が塩基性エッチング液を必要とする場合、光学くさびは化学的アプローチを用いて発生させることができない。
【０１１１】
いくつかの代替案がある：（１）光学膜を光学基板上に溶着させ、時間をかけて段階的に被覆チャンバーに導入する。新たに露出される各セクションは前に露出されたセクションより薄いコーティングを受け入れる。（２）基板にマスキングを施し、時間をかけて段階的にマスクを取り除く。（３）各々異なる厚みの光学材料を作り出す幾つかの異なる被覆作業を行ってもよい。（４）特定の材料をエッチングするためにイオンミリングを使用しても良い。
【０１１２】
所定の光学基板及び元の反射防止膜と同じ屈折率の代替反射防止膜のために、この最適化を繰り返す必要はない。上記の方法を使用して、屈折率２．０を持つ窒化ケイ素（Ｓｉ3Ｎ4）の４８０−５２０Å膜が結合分析評価において使用されるシリコンウェーハ（光学基板）用に必要であると設定した（実施例２を参照）。同じ付着層と受容性材料を用いて、二酸化チタン（ＴｉＯ2）が屈折率２．０で４８０−５２０Åの被覆を必要とすることが示された。屈折率が元の材料のものと正確に同じでない場合、わずかな厚み調節が必要であるかもしれない。
【０１１３】
このように、反射防止膜の被覆のために設定される方式が、特定の結合分析評価にふさわしいテスト表面の製造のためだけのガイドラインとして使用される。予め選択された基板用に、反射防止膜の平方根従属を用いて適切な光学材料を選別する。本発明にとっては、完全な平方根従属からの少しばかりの逸脱は受け入れられる。光学被覆の四分の一波長の使用は被覆の厚みに対する初期ガイドにすぎない。反射防止膜の厚みはこのように特別な結合材料を考慮して経験的に引き出されなければならない。本発明の特異的な複合結合反射防止膜は該かる膜を製造するために理論上必要な条件を満たしていない。厚み及び屈折率の規則にも従わない。驚くべきことに、これらの受け入れられる方式からの該かる逸脱は、質量の変化あるいは厚みの変化に対して非常に敏感なテスト表面を結果的に生じる。
【０１１４】
あまり重要ではないが、特別な付着層及び受容性材料層用の最終テスト装置を最適化するために、反射防止膜層だけでなく各層の相対的厚みを上述したように変更させてもよい。
【０１１５】
付着層
本発明は更に光学基板もしくは反射防止膜に特異的な受容材を付着させる層を作り出すための材料及び方法に関する。特に、発明は官能性密度、安定度、及びその層に固定される受容性材料の実行可能性を最適にする付着層を作り出す方法に関係する。選択される付着材料は生物学的材料もしくは受容性材料と両立しなければならず、（反射防止膜が含まれていようと、なかろうと）上部テスト表面に物理的に粘着もしくは共有的に付着しなければならず、好ましくはテスト表面の所望の薄膜特性を妨げないものでなければならず、また次に続く処理ステップに充分耐え得るものでなければならない。
【０１１６】
固定される受容性材料（もしくは、ある場合には、酵素）の密度及び安定度は、分析評価テスト表面の性能を最適化するように制御されねばならない。
【０１１７】
本発明の有用な装置を得る際の問題点の１つは、他の従来の固相分析評価材料の微視的回旋状の表面特徴と比較して、薄膜分析評価に使用されるテスト膜の非常に制限された巨視的及び／もしくは微視的表面領域であると、出願人は判断した。多くの場合、光学基板は反射的基板の有毒な影響から受容性材料を保護する連続付着層で均一に被覆されなければならない。
【０１１８】
従来の固相分析評価では、マイクロタイター井戸等の一般に使用される大きなテスト表面は、薄膜基板に対してより大きな全体表面領域及び微視的回旋状の表面を持つ。このように、固定される受容性材料の量が、固定化プロセスにより生じる構造上のあるいは化学的変化から生じる視野の希薄、あるいは実行可能性（検体を結合する能力）の損失を補償する。更にそれは乏しい配向ゆえに結合のために利用できないかもしれない受容性材料も補償する。こうして、出願人は、直接的な薄膜分析評価において、表面領域の制限は受容性材料の官能性密度、実行可能性、安定度及び入手のしやすさを最大限活用するために計画される特別な材料及び手順の使用もしくは開発を必要とすることを見い出した。
【０１１９】
特異的な結合分子の保持のためにケイ質材料を応用するための初期作業の多くは、親和クロマトグラフィーの応用及び使用されるシリカ（ＳｉＯ2）ゲル、及びガラス等の固体支持台に起因する。シリカの結合材料に対する初期活性化は、ジクロロジメチルシランを用いた処理によって達成された。シランを適用するために使用されるプロセスの如何に関わらず、シラン化は化学的手段によって分子を共有付着させることができる基を導入することができる。
【０１２０】
以前は、光学的活性表面は、２個のメチル基をその表面に付着させるために、シリカ表面で水酸基と結合するジクロロジメチルシラン（Ｃ2Ｈ6Ｃｌ2）を使用して、疎水性にされていた。こうして、わずかな疎水性が生じる。出願人は該かる反応は最適な表面反応度を生じないと判断した。図４において、基板上に存在するシリカ基に結合するはるかに有用なシラン材料の結合を図式で示している。表面に対する該かるシラン分子の結合だけが、受容性分子との結合用のアミン基等の利用可能な基を提供する。この図から、この方法で結合できる生物学的分子の最大数は、シランとの相互作用に利用できるシリカ基の数に等しいことが明らかである。対象的に、図５に示すように、本発明のはるかに有用な付着分子は基板上に存在する（こうして、より強い結合を提供する）シリカ基に関して多価であるだけでなく、図に示したＲ基の各々が多価であることができるので、受容性分子に結合でき、また更に所望であれば、シロキサンで結合することもできる基に関しても多価である。当業者であれば、特別なシリコン含有基板もしくは他の基板上で結合され得る受容体分子の量を増加させるために、付着層として使用できる等価シロキサンもしくは他の分子を容易に判断することができるであろう。
【０１２１】
出願人は、シリコンが次に行われる付着用の固体支持台もしくは基板としてシリカと置き代わる時、本発明においては従来のシラン化は不適切であることを発見した。シランは表面に付着するためにシラノール残渣の存在が必要である。単結晶性シリコンと共に、シラノール密度は固定反応のために望ましい官能基の密度を生じるためには不十分であり、従って、最適の受容性材料でないものがテスト表面に付着されるであろう（図４参照）。シリカ及び多くのガラスは高いシラノール含有量を持ち、あるいは高いシラノール含有量を提供するように容易に処理できる。しかしながら、シリコンも、シリカもしくはガラスでは見られない、生体分子にとって有害もしくは不利益である表面の影響を持ち込む。該かるシラン化プロセスも処分を必要とし、多くの場合、監視及び制御するのが退屈で困難である危険な材料を生じさせる。このシラン化プロセスはあるレベルの反応度を提供する一方、多くの応用に必要なレベルの感度を提供しない。それに加えて、アミン含有シランは多くの独特の困難を導き出す。その１つはアミン官能化シランが水溶性であり、アミン基が改質表面からシランの加水分解を触媒することである。出願人は、重合体で改質されたシラン、例えば、ＰＥＩ改質シランまたはその当量は、本発明の装置において官能的に優れていることを発見した(図５)。
【０１２２】
好ましい態様において、付着層は均一の方法でスピンコートもしくはエーロゾルスプレーコートされる。様々な中間材料が５Åから５００Åの間の厚み（それより多い量も使用できる）で基板に被覆される。該かる層は以下の機能を果たし、以下の特徴を持つ材料で形成することができる：受容性材料のために好ましい環境を作り、受容性材料が（好ましくは費用効果的な方法によって）活発な官能度で結合されるようにし、光学基板にしっかりと粘着し、均一に被覆され得る。
【０１２３】
直接的な目視による検出方法論のために理想的には、表面活性化技術は基板の表面に非常に緻密な均一もしくは等角の膜を導入する一方で、安定性のために表面の共有改質を提供するべきである。共有付着のない強く吸着された等角膜が適切であるかもしれない、例えば、単結晶性シリコン、巨視的に平面で均一の光学ガラス、金属化ガラス及びプラスチック等の適当な基板は、光学層（つまり、ＳｉＯ、ＳｉＯ2、ＳｉxＮy等）で被覆されていようとなかろうと、共有付着のために利用できる反応基が不足しているが、本発明では有用である。一度塗布されると、付着層は共有もしくは吸着性相互作用により、緻密で機能的である特異的な受容材の粘着を支える環境を提供すべきである。この付着層は初期光学基板の有毒な影響から特異的な受容材を分離するため、充分な厚みを持っていなければならない。
【０１２４】
このテスト表面の製造に使用できるであろう材料の３種類の例について説明する。図５において、非線形分岐重合体シロキサンが基板に対する共有付着の要件を満たすことができ、反応性及び安定性膜において受容性材料を粘着させるであろう。これらの重合体は典型的に、（ペトラルカシステムによって製造される）アミノアルキル、カルボキシプロピル、クロロプロピル、エポキシシクロへキシルエチル、メルカプトプロピル、フェネチル、フェネチルスルホナート、ビニル、メチル、及びメタクリロキシプロピルを含む、多くの異なる官能性（Ｒ）を表面に導入することができる２〜３の分岐点を含む。少しばかりのシラノールでも付着に利用できるので、これらの重合体シロキサンは窒化ケイ素層が上部表面である時に特に有益である。分岐の末端で官能性を有するＴ構造のポリジメチルシロキサンはカルボキシ、プロピル、及びビニル基（ペトラルカシステム）を含む。これら材料の代表的な例が米国特許4,208,506、3,530,159、4,369,268に記載されており、参照のためここに挿入した。
【０１２５】
これらのテスト表面の製造において有用性を示す材料の第２群は、一般にスチレン／ポリブタジエンの混合物で構成される共重合体で、等角の表面活性剤もしくは膜形成ラテックスである。これらの調製品は溶液中では粒子として作用するが、表面で、あるいは乾燥された時に、粒子状の性質を保持してはいない。これらの材料は表面の微視構造に強く粘着するように作られる。Seradynが販売するＴＣ７及びＴＣ３粒子、及びBangs LaboratoriesもしくはRhone-Poulencが販売する表面活性剤（アミドもしくはカルボン酸）は、本出願に特に良く適合する。類似する膜形成ラテックスもしくはスチレン／ブタジエン／他の共重合体も使用できる。
【０１２６】
この種のテスト表面の製造に有用である別の綱の化合物は、デンドリマー、スターポリマー、もしくは分子自己組立ポリマーである。これらの重合体は一度乾燥させた表面に強く粘着する。これらの材料は周期的な方法で作り出され、各周期が材料の新しい世代を作り出す。どの材料世代も本出願において使用することができるが、（図１８に図式的に示す）世代５は最良の反応性を提供することを示している。これらの材料は米国特許4,507,466; 4,588,120; 4,568,737; 4,587,329に記載された材料で作られ、これらの材料で構成される。三元デンドリマーの代表は図１８に示したポリアミドアミンである。この図において、Ｙは二価アミド部分を表す。-CH２CH２CONHCH２CH２-及びYNが反復単位である。末端基は図１８に示すようにアミンであってもよいが、次の世代のために樹脂状結晶分岐として作用する活性基であれば何であってもよい。他の適当な二価部分はアルキレン、酸化アルキレン、アルキレンアミン等を含み、末端はアミン、カルボキシ、アジリジニル、オキサゾリニル、ハロアルキル、オキシラン、ヒドロキシ、カルボン酸エステル、もしくはイソシアナト基である。
【０１２７】
これらの材料の全ては、固体支持台上の展伸能力を改善する有機溶剤に対して安定している。これにより、付着層が制御しやすく、大量に製造できるスピンコート技術により作られるようになる。別の塗布方法はディップコート、スプレーコート、もしくは他のエーロゾル技術を含む。硬化プロセス（一般的に熱処理）の後、受容性材料と接触する有機溶剤が残らないので、有機溶剤の使用も可能である。硬化プロセスは光学テスト表面に対する付着層の粘着を向上させ、重合及び凝結プロセスの操作を助ける。これらの材料及びこれらの付着層の正確な製造方法の各々の評価を下記の実施例５、６、７に示す。
【０１２８】
シロキサンは本出願において有益である材料の一般的な綱を指している。シロキサンは水溶性ではなく、水性コーティング溶液もしくは試料と接触しても加水分解しない。分岐構造及び重合体という特徴の故に、重合体構造はシランとして単一の孤立した島を形成する（図４）のではなく、テスト表面上に連続膜（図５）を形成する。シロキサンの高度に交差結合した構造は全体の表面視野を増加させる。シロキサン膜の屈折率は制御することができ、あるいはシロキサンの側鎖の中に組み込まれる官能基と共に変化することができ、それによって他の層と相互作用させて適切な干渉膜を作り上げる。
【０１２９】
シロキサンは基板を共有改質するが、その後の層間剥離なしに表面に粘着し、機械的操作に対して安定であるその他の材料も有用であるので、これは本質的な特徴ではない。重合体を基板に被覆する方法は半導体製造業者の間で公知である。
【０１３０】
必要ではないが、所望の特性を伝える付加的な材料を付着層に付着させてもよい。この層は受容性材料の配向、例えば抗体を配向するためにタンパク質Ａ及びタンパク質Ｇの使用を改善することができるであろう。他に使用できる材料としては、アビジン・ビオチン、合成タンパク質もしくは組換えタンパク質Ａ／タンパク質Ｇ断片、あるいはペプチドまたは結合Ａ／Ｇペプチド等がある。
【０１３１】
受容性材料を付着層に付着させるための固定化化学は付着層及び受容性材料両方の特性に基づいて選択される。受容性材料はこの材料に共有的あるいは受動的に付着することができる。付着層が共有付着のために特に適合される場合、付着層を活性化させるための付加的なステップが必要となろう。様々な活性化及び結合手順を使用することができ、例えば、受容性材料を粘着させるために光活性ビオチンを使用できる。通常、それは受容性材料を付着層に受動的に吸着させるのに充分であり、従って、固定化化学手順の時間と費用を節約する。
【０１３２】
受容性材料
受容性材料は特異的な結合対の一部分として限定され、次のものを含むが、それらに限定されることはない：抗原／抗体、酵素／基板、オリゴヌクレオチド／ＤＮＡ、キレーター／金属、酵素／抑制剤、細菌／受容体、ウイルス／受容体、ホルモン／受容体、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド／ＲＮＡ、及び他の化学種に対するこれらの化学種の結合と共に、無機化学種とこれらの化学種の相互作用。
【０１３３】
付着層に結合される受容性材料は特に関係のある検体を結び付ける能力によって特徴付けられる。受容性材料として使用できる種々の材料は、二次特異的パートナーと（選ばれる試料に関して）選択的に結合するであろう材料の種類によってのみ制限される。受容性材料の全体的な綱に含まれる材料の亜綱には、毒素、抗体、抗原、ホルモン受容体、寄生虫、細胞、ハプテン、代謝産物、アレルゲン、核酸、核材料、自己抗体、血液タンパク質、細胞の残骸、酵素、組織タンパク質、酵素基板、補酵素、ニューロン伝達子、ウイルス、ウイルス粒子、微生物、タンパク質、多糖類、キレーター、薬剤、及び特異的な結合対の他のメンバーがある。このリストは薄膜分析評価システムを作るために、付着層に被覆することができる多くの異なる材料の幾つかを含むだけである。関係のある選択された検体がどのようなものであれ、受容性材料は特に関係のある検体と結合するように計画される。関係のある検体を含むマトリックスは、流体、固体、気体、もしくは粘液、唾液、尿、排せつ物、組織、骨髄、脳螺旋流体、リンパ液、血しょう、全血、たん、緩衝液、抽出液、精液、膣の分泌液、及び心膜の、胃の、腹膜の、胸膜の、あるいは他の洗浄剤等であってよい。関係のある検体は抗原、抗体、酵素、ＤＮＡの断片、損なわれていない遺伝子、ＲＮＡの断片、小分子、金属、毒素、環境動因、核酸、細胞質成分、毛または鞭毛の成分、タンパク質、多糖類、薬剤、あるいは表Ａに記したような他の材料であってよい。例えば、表Ａに記した細菌のための受容性材料は、特に表面薄膜成分 - タンパク質もしくは脂質、多糖類、核酸あるいは酵素を結合することができる。細菌に対する特異的な検体は多糖類、酵素、核酸、薄膜成分、あるいは細菌に応じて宿主により作られる抗体であってよい。検体の存在は（細菌性もしくはウイルス性の）伝染病、癌もしくは他の代謝障害または状態を指示するかもしれない。検体の存在は食品中毒もしくは他の有毒曝露を示すものであるかもしれない。検体は薬剤の濫用を指示し、あるいは治療剤のレベルを監視することができる。
【０１３４】
この技術を利用できる最も一般的に遭遇する分析評価プロトコールは免疫分析評価である。下記の受容性材料層の構築のために為された議論は特に免疫分析評価を重点的に取り上げている。しかしながら、一般的な研究は核酸消息子、酵素／基板、及び他の配位子／受容体分析評価フォーマットに適用される。免疫分析評価のために、抗体は受容性材料として作用してもよいし、あるいは関係のある検体であってもよい。受容性材料、例えば抗体は安定した、緻密な反応層をテスト装置の付着層に形成しなければならない。抗原が検出されることになっており、抗体が受容性材料である場合、抗体は関係のある抗原にとって特異的なものでなければならないし；抗体（受容性材料）はテスト表面に抗原を保持する充分な結合性で抗原（検体）を結合しなければならない。ある場合には、検体は受容性材料を単に結合するだけではなく、受容性材料の検出可能な改質を発生させるかもしれない。この相互作用はテスト表面で質量の増加を引き起こすか、あるいはテスト表面上で受容性材料の量の減少を引き起こすことができるであろう。後者の例は、分解性酵素または材料の特異的な固定化基板との相互作用であり、実施例１３を参照のこと。結合、異種交配、あるいは検体の受容性材料との相互作用が発生する特異なメカニズムは、本発明にとって重要ではないが、最終的な分析評価プロトコールにおいて使用される反応条件に衝撃を与えるかもしれない。
【０１３５】
一般に、受容性材料は付着層に受動的に粘着され得る。必要であれば、付着層によりテスト表面上に導入される遊離官能基を、受容性材料のテスト表面への共有付着のために使用することができる。受容性材料の付着のために利用できる化学は、当業者に公知である。
【０１３６】
受容性材料を付着層に粘着させるために広範囲の技術を使用することができる。テスト表面は、所定期間の間溶液に全体的に浸漬することにより；不連続な配列またはパターンで溶液の塗布により；スプレー、インクジェットまたは他の刻印づけ方法により；あるいは適切な溶剤系からのスピンコートにより、受容性材料で被覆することができる。選択される技術は、多数のテスト表面を被覆するために必要な受容性材料の量を最小にし、塗布中に受容性材料の安定性／官能性を維持すべきである。更に技術は非常に均一かつ再生可能な方法で、付着層に受容性材料を塗布または粘着しなければならない。
【０１３７】
コーティング溶液の組成は塗布方法及び利用される受容性材料の種類に依存する。スピンコート技術を使用する場合、界面活性剤は光学基板または支持台全体に亙って受容性材料の均一性を向上させることができる。一般に、コーティング溶液は受容性材料の付着層に対する受動的粘着を増進するようなｐＨ、組成、及びイオン強度での緩衝水溶液であろう。選択される正確な条件は開発中の分析評価のために使用される受容性材料の種類に依存するであろう。一旦特別な種類の受容性材料、例えば、多クローン性抗体のためにコーティング条件が設定されると、これらの条件は該かる受容性材料に基づく全ての分析評価にとって適切なものとなる。しかしながら、化学的に独特な受容性材料、例えば、多クローン性抗体及び核酸は、同じ緩衝及び塗布条件の下では付着層に均等にうまく被覆しないかもしれない。
【０１３８】
受容性材料が抗体である時、付着層がＴ構造のシロキサンである場合、適切な粘着が得られることが示されてきた。Ｔ構造のシロキサンは抗体の相互作用のために非常に均一な疎水性表面を提供する。実施例６を参照のこと。
【０１３９】
驚くべきことに、膜形成ラテックスは一般にシロキサンよりも、抗原に対するはるかに良好な付着を提供する。固体化抗原との抗体の相互作用はシロキサン改質表面上で改善される一方、基板との酵素反応はシロキサン改質表面に対して、ラテックス改質表面上で改善される。
【０１４０】
上記の材料及び方法は特異的な結合テスト表面の構築を可能にする。テスト表面は光学基板または支持台、任意の反射防止膜、付着層、及び最後に受容性材料層で構成される。特異的な結合発生または相互作用の視覚的測定のため、複合干渉膜が反射防止膜、付着層及び受容性材料を含むように実際上設計される。付着層及び受容性材料が反射防止膜に被覆される時、選択される初期干渉色が維持されなければならない。図３を参照のこと。一度表面が受容性材料で被覆されると、関係のある検体を含む調製品の小さなスポットが表面に塗布される。これは数分間培養され、すすいだ後、窒素流の下で乾燥される。これは分析評価される試料が陽性であろうと陰性であろうと、展開される手順管理を発生させる。この管理によりエンドユーザーに対して、正確に分析評価プロトコールに従い、キット内の全ての試薬が正しく作用していることが保証される。手順管理はあらゆる所望のパターンにおいて適用できる。
【０１４１】
手順管理と同様に、受容性材料をパターンに適用することができる。このように、装置は反射防止膜が光学基板に塗布された時に、多色光に応じて目視により検出可能な記号を提供する。受容性材料を含むコーティング溶液はマスクで覆われた表面に塗布されてよい。マスクはコーティング溶液に曝されている部分においてのみ、受容性材料が付着層に固定化されるようにする。受容性材料で均一に被覆される表面をマスクで覆い、受容性材料を選択的に不活性化することができる。受容性材料の不活性化にとって適切な多くの技術がある。生物学的材料にとって最も簡単な技術の１つは、その材料を不活性化するために充分な時間の間、受容性材料の部分を紫外線放射に曝すことである。マスクは結果の解釈においてエンドユーザーを助けるであろうパターンならどのようなパターンにも設計できる。
【０１４２】
受容性材料のパターンを発生させるために、押印、インクジェット印刷、超音波ディスペンサー、及び他の液体調剤装置等の技術が適切である。受容性材料はこれらの技術によってパターンに塗布され、所定期間培養され、その後表面からすすがれる。付着材料の露出部分は受容性材料に類似する不活性材料で被覆することができる。
【０１４３】
干渉色の特に有益な組合せは、テスト表面背景もしくは開始点のための黄色／金色の干渉色を頼りとする。一度質量の増加が表面で発生すると、質量は厚み及び濃度の直接的な関数であるが、反応領域は干渉色を紫／青色に変化させる。上述したように、生物学的テスト表面の構築において必要な層を補い、所望の開始干渉色を維持するために、反射防止膜を調節・最適化することができる。
【０１４４】
質量の増大
特異的な結合対の直接的判定を行う薄膜検出方法は、蛍光、発光、及び熱量の測定等による検出計画、もしくは他のタグ依存検出計画を含む、放射性もしくは酵素的手段に関して重大な利点を提供する。薄膜システムは小分子の検出に応用できる。しかしながら、該かる検体は直接目視による、あるいは器具による検出に対して充分な厚みもしくは光学的密度を作り出せない。出願人は、質量増大のための手段が必要であることを発見した。しかしながら、薄膜検出システムは膜の完全性が維持される時、最適に作用する。このように、該かるシステムにおける拡大のための方法は、検出システムにより課される制限条件を満たす、最も簡単な可能性のある構造であるべきであると共に、厚みもしくは質量の増加を提供し、膜の完全性を維持するべきである。
【０１４５】
C. Fredrik Mandenires及びK. Mosbach、170 Anal. Biochem. 68、1988は楕円偏光法的分析評価において、コンカナバリンＡもしくは耐−ＩｇＧ抗体で被覆された微小シリカ粒子を用いる方法を説明している。シリカ粒子は濃度依存方法で生物層の見掛け厚みを増すような、生物層に充分近い屈折率を提供する。これらの粒子は性質上硬質であるが、膜の完全性を維持しない。従って、光散乱が発生する。
【０１４６】
拡大技術は関係のある検体の濃度に直接関係してもよいし、あるいは拮抗的もしくは阻害分析評価フォーマットにおけるように、関係のある検体の濃度に反比例してもよい。質量増大もしくは拡大試薬の結合は、テスト表面に対する検体結合の特異的な関数であり、信号発生試薬の一部として考慮してもよい。
【０１４７】
図７において、本発明の装置上の検体の存在を信号増幅により検出できる２つの方法を図式的に示している。例えば、受容性材料をラテックス粒子で分類された検体に接触させることにより、あるいはその２つを結合させると、受容体検体層の厚みを増大させる他の手段により、信号を増幅することができよう。あるいはその代わりに、検体は二次的結合剤を通して酵素で分類されてもよく、その場合、その酵素に対する基板の準備によって受容体-検体-酵素の組合せが検出されないかもしれないが、テスト装置の上に製品を置き、目視で検出できる。出願人は、基板からの製品の配置を促進するように装置表面が帯電されることを保証することが有利であることを発見した。
【０１４８】
質量増大試薬は二次的受容性材料に受動的もしくは共有付着ができなければならない。質量増大試薬に対する受動的付着の例は、表面活性剤粒子上への抗体の吸着である。質量増大試薬の二次的受容性材料に対する共有付着の例は、抗体に対するセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、または別の酵素）の接合である。使用するメカニズムに関わりなく、質量増大試薬は二次的受容性材料と共に安定した製品または付加物を形成すべきである。選択される結合プロトコールは非特異的な結合効果をテスト表面に残すべきではないし、導入すべきでもない。質量増大試薬は更に検体との直接的かつ特異的な相互作用が可能である。
【０１４９】
このように、発明は薄膜検出方法に依存する分析評価システムにおいて、信号増幅のための方法を特徴とする。該かる方法には、楕円偏光法、干渉効果、プロフフェロメトリー、走査トンネル顕微鏡法、原子力顕微鏡法、インターフェロメトリー、光散乱、全反射、もしくは反射率計技術等があるが、それらに制限されない。これらのタイプのシステムにおける使用のために選択される材料は、好ましくは溶液中である程度の粒子状特性を維持し、表面もしくは支持台と接触すると同時に安定した薄膜を形成する。膜は基板の所望の滑らかさまたは組織を維持するために、好ましくはテスト表面に対して等角である。表面組織の特徴は使用する検出方法に依存する。選択される材料も共有または受動的相互作用を通して、受容性材料または特異的な結合対の一部を粘着することができなければならない。二次的受容性材料もしくは結合試薬は、その二次的受容性材料の反応性及び安定性を保持する方法で、信号増幅材料または粒子に粘着させることが好ましい。粒子に塗布させる二次的受容性材料は、テスト表面に固定化される受容性材料と同じであってもよいし、あるいは適合するものであってよい。二次的受容性材料または結合試薬と付加的材料との組合せは、粒子、酵素等であれ、質量増大または信号発生試薬を形成する。
【０１５０】
一般に、増幅を必要とする光学分析評価は、その特性及び特徴が使用される検出方法のタイプにより決定される基板、光学的二次光学材料、付着層、受容性材料層、及び質量増大試薬で構成される。一般的な分析評価プロトコールは、関係のある検体を含むと考えられる試料が、細胞質抗原の抽出等の必要な処理を通して処理され、その後二次的試薬または増幅試薬と混合されることを求める。この混合物のアリコートは受容性材料被覆基板に塗布される。適当な培養期間の後、物理的すすぎ／乾燥プロトコールにより、あるいはすすぎ／乾燥ステップを含む装置で、未結合の材料が反応膜から分離される。その後目視または器具により信号を判断する。二次的試薬もしくは増幅試薬の導入は、試料採集もしくは塗布装置において凍結乾燥された材料、または分析評価装置に埋め込まれた材料として、試料に対する試薬の添加により達成される。
【０１５１】
重合体固体
本発明において有用な重合体は等角（膜形成）であり、特別な特徴を表面に持ち込まない。広範囲のスチレン-ブタジエン共重合体は凝集分析評価、免疫分析評価、及びクロマトグラフィーの応用において利用できる。一般に使用されるラテックスは高度に交差結合された、硬質の共重合体である。これらの応用におけるラテックス粒子の最も一般的な使用法は、所望の検体の捕獲及び分離のための固体支持台としてである。低い交差結合によるスチレン-ブタジエン共重合体は表面活性剤または膜形成ラテックス粒子と指定されている。これらの調製品は溶液の中では粒子としてふるまうが、表面と接触すると等角膜に対して乾燥状態になる。これらの膜形成スチレン-ブタジエン共重合体は広範囲に亙る官能性結合基を含むことができる。
【０１５２】
更に、硬質のポリスチレン粒子も染料の添加による信号発生のために使用されてきた。これらの粒子は信号発生のためのタグまたはラベルの導入のための代替方法にすぎない。凝集分析評価及びメンブレンを基礎とする分析評価用の着色または染色されたラテックスの使用は、広く利用されてきた（再検討のために、L.B. Bangs, American Clinical Laboratory News、May 1990を参照）。前者の場合、これらの粒子のための主要な要件は、凝集分析評価において視認性のためにそれらの構造を維持し、メンブレンを基礎とするテストの細孔を遮断するようにゆがまないことである。共有付着が特定の相互作用する化学種に特別な利点を提供する一方、ラテックスに対する受容性材料の受動的吸着が適切であることがしばしばある。
【０１５３】
適当な拡大膜形成ラテックス粒子の製造においては、捕獲される検体の見掛け厚みまたは密度を増すために、膜形成粒子、もしくは二次的反応種と両立し充分な大きさを持つ表面活性剤の選択が必要である。
【０１５４】
二次的反応種は所定時間、適切な温度での培養により、表面活性剤粒子上に固定化できる。選択される温度は二次的反応種を粒子に付着させるために利用される化学、反応種の性質、及び粒子の組成により影響される。温度に加えて、培養期間の長さ、固定化化学、緩衝液組成（ｐＨ及びイオン強度）、及び二次的反応材料の量が特定の応用のために最適化されなければならない。
【０１５５】
下記に示す特殊な例（１４、１５）は膜形成拡大試薬の製造に使用される方法のタイプを示すためのものである。記載された条件は該かる拡大試薬の製造に制限を加えるためのものではない。スチレン／ブタジエン／ビニル共重合体は好ましい膜形成ラテックスの組成である。しかしながら、膜形成特性を維持する如何なるスチレン／ブタジエン共重合体も使用できる。官能基は二次的結合試薬の粘着または相互作用を支持するであろう化学組成のものであればよく、二次的結合試薬は関係のある検体と本質的に結合するであろう。Seradynが販売するＴＣ７及びＴＣ３の調合物、及びBangs LaboratoriesまたはRhone-Poulencが販売する表面活性剤調合物が好ましい（そのカタログを参照のため挿入する）。従来からのラテックス粒子（S/B/V-CONH2、S/B/V-COOH、S/V-CONH2、S/R-NH2、S/HYDRAZINE、S/V-COOH、S/B-COOH、S/B-CONH2、PS、S/VBC、S/A/B-COOH、PMMA-COOH、S/A-OH、S/R-OH、及びS/R-SHOと称する）は本発明においてある種の有用性を表示したが、膜形成ラテックスより散漫な信号を作り出す傾向がある。
【０１５６】
固体の触媒製造
出願人は、薄膜表面に不溶解性の析出生成物を作る酵素／基板の対によって、より感度の高い反射防止膜分析評価を得ることができることを発見した。この拡大技術の触媒性は該方法の感度を改善する。本発明において有用な酵素は、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ等である。しかしながら、受容性材料に付着され得る特殊な成分を提供し、析出膜生成物への基板の転化を触媒することができるプロセスであれば、何でもこの技術にとって適当である。テスト表面に固定化された抗体-抗原-抗体-ＨＲＰの錯体が存在する時、不溶解性の反応生成物が生じる。生成物はアルギン酸、硫酸デキストラン、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸共重合体、もしくはカラゲーニン等と、ＴＭＢ（３、３'、５、５'−テトラメチルベンジジン）と酸素遊離基との相互作用により形成される生成物との組合せ等の析出剤の作用によって析出される。この特別な基板は遊離基がＴＭＢと接触する時はいつでも不溶解性の生成物を形成する。他にクロロナフトール、ジアミノベンジジン、テトラ塩酸塩、アミノエチルカルバゾール、オルトフェニレンジアミン等の物質も使用できる。これらは約１０〜１００ｍＭの濃度で使用される。質量の測定可能な増加は酵素共役層と共に発生する。色信号は基板溶液中に存在する発色団の基本色による影響を受けない。表面に析出される質量を増加させる種々の酵素基板系または触媒系が使用できる。
【０１５７】
髄膜症や連鎖球菌等、人における細菌感染に対して一般的に責任のある細菌群から引き出された多糖類抗原の低レベルの検出のために、薄膜分析評価における酵素により分類されたこのような抗体方法の例を実施例１６、１７、１８に示す。
【０１５８】
図６において、その上部表面に様々な層が被覆された基板を持つ多層装置の横断面を表すグラフが示されている。１例では、これらの層は上部光学基板層に直接隣接する窒化ケイ素の層、重合体シロキサン等の付着層、及び細菌抗原分析評価に対する抗体である受容性材料を含む。図７において、検体が存在する場合、酵素により分類された抗体及び検体を持つ錯体がテスト表面に同時に形成される。前述の生成物析出物を形成させるために基板が加えられるのはこの塊の上である。
【０１５９】
所望であれば、関係のある検体は同時または連続添加プロセスのいずれかにおいて、質量増大試薬及び固定化された受容性材料と組み合わされてもよい。いずれのメカニズムもテスト表面に固定化される検体／質量増大試薬錯体の形成を生じる。このように、質量増大試薬は試料と直接混合されてもよい。この混合物は次に反応性テスト表面に塗布され、必要な期間培養される。これは同時分析評価フォーマットである。
【０１６０】
ある場合には、付加的な感度は試料の連続添加を行い、続いて質量増大試薬を添加することにより得られる。如何なるメカニズムあるいは特異的な相互作用も、質量増大試薬の発生のため利用できる。例えば、核酸は金属等の多数の材料及びある種の染料をしっかりと結合する、あるいは挿入することが知られている。これらの材料は特別に固定化される核酸に質量を導入する働きをするであろう。
【０１６１】
生成物層の増加は視覚的手段、もしくは楕円偏光法等の器具の使用や光強度差が増加した厚みにより生じている場所等により判定することができる。受容性材料酵素錯体はこのように、関係のある検体との直接的相互作用が可能であり、より詳細には、抗原等の検体の証拠である。この変化は光学厚みを測定することにより検出でき、必ずしも基板材料の光反射力に依存しない。該かる器具の１つは、米国特許4,332,476、4,655,595、4,647,207、4,558,012に記載されているSagax Ellipsometerであり、その開示を完全に挿入し、この明細書の一部とする。
【０１６２】
装置
装置フォーマットにおいて上記の多層テスト表面の幾つかの配列が可能である。最も簡単な分析評価フォーマットは単一使用、単一試料装置である。より複雑な装置は１つの試料が多数の検体の存在のために審査されるようにする。付加的な装置は多数の試料を１つの検体またはバッチテストのために審査できるようにする。
【０１６３】
単一使用装置は、感染症テスト、妊娠または多産反応等の広範囲の分析評価に適合可能なフォーマットを使用しやすくする。これらの単一テスト装置を使用するためのプロトコールは非常に簡単である。密閉された装置が開けられ、反応性テスト表面を露出させる。試料がテスト表面に塗布され、短時間の間、例えば２分間培養される。試料は例えば細菌からの抗原抽出等の前処理を必要としても、しなくてもよい。テスト表面への塗布の前に試料に二次的試薬を添加することが必要であってもよい。培養期間が完了すると、無反応の試料が水ですすぐことにより除去される。装置はテスト表面を乾燥させるために吸い取られる。使用されるテスト及び質量増大／拡大方法に応じて、分析評価が完了し、あるいは分析評価は付加的な培養／洗浄／乾燥サイクルを必要とするかもしれない。テスト装置及びプロトコールは医師の事務所、臨床研究室、家庭またはフィールドテスト用環境にうまく適合する。装置のまわりに、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン等、成形装置または射出成形装置に容易に形成される材料で構成される保護シェルが設けられることが好ましい。多検体もしくは多試料装置は同様のプロセスを用いて、同様の材料で作ることができる。
【０１６４】
単一使用装置
該かる装置の特定の例を図に示す。例えば、一般的に図８Ａ−８Ｇにおいて、単一使用装置は如何なる大きさの成形装置にも納められるが、この例では、装置を閉じた時の大きさは長さ1.74インチ、幅2.22インチ、深さ0.375インチである。装置はテスト表面を保持する基部と、洗浄液と余分な試料を保持するための吸収性パッドで構成される。装置の蓋はテスト表面から過度の湿気を取り除くブロッターパッドを保持するように設計される。装置の基部にある吸収性パッドあるいは蓋の中のブロッターを固定するため、プラスチックの薄片がリビングヒンジによって装置の各部に付けられる。装置の基部と蓋はリビングヒンジによってつながれる。しかしながら、多数の開閉サイクルを可能にする如何なる留め金または蝶番の組合せも使用できる。吸収性パッド及びブロッターを装置の中に置き、これらのカバーを閉じて材料をしっかりと締める。これらのプラスチックカバーは、吸収性材料の中に含まれる洗浄液及び余分な試料の露出を防止することにより、エンドユーザーに対する保護を提供する。装置の蓋は留め金が付いていても付いていなくてもよいが、密閉シールがあることが好ましい。装置は容易に配置され、あるいは貯蔵のために便利な大きさであるべきである。装置の全ての構成要素は、反応性テスト表面を除き、必要であれば殺菌できる。
【０１６５】
上部ブロッターパッドには幾つかの独得の要件がある。複合ブロッター材料はテスト表面の真上に装置の蓋の中に設置されなければならない。蓋が閉じられ、すすがれたテスト表面がブロッターパッドと接触すると、テスト表面はブロッターパッドに充分圧縮され、テスト表面から溶液を垂直に選択的に吸い取らなければならない。ブロッターパッドは、付加的な洗浄／乾燥ステップのために、新鮮な乾燥材料がテスト表面に補給されるように、小さなプラスチックスライドの上に取り付けることができる。ブロッターの初期材料は表面から水を垂直に急速に吸い取るように、つまり紙が高い吸収率を持つように選択される一方、次の材料は高い吸収能力を持ち、テスト表面から水平に溶液を取り除く。表面の隣のブロッター材料は光学テスト表面を流してはならないし、こすってもいけない。Whatmanのグレード１Ｃｈｒペーパーはこの機能を非常にうまく果たすが、代わりの材料でもよい。高度に吸収性のある材料がブロッターパッドの付加層として使用され得る。２つの付加パッドがグレード１Ｃｈｒ層との組合せで、２段階乾燥プロセスにとって最適であることが見い出された。層は遊離していても、共に積層されていてもよい。多段すすぎ／乾燥が必要な場合、ブロッティング材料を支持するスライドがテスト表面の上に新しいブロッターを置くためのハンドルを持つ。このハンドルは、ブロッターがテスト表面と接触する時に、移動するのを防止するため、装置の基部の上の保護シールドの中の開口部に収められる。
【０１６６】
反応性テスト表面は装置の基部の上に伸びるピラミッド型の支持台の上に取り付けられる。すすぎ溶液はテスト表面上を流れ、支持台の表面を下り、吸収性パッドに捕らえられる。更に、支持台は蓋が閉じられた時に、テスト表面がブロッティング材料の中に圧縮されるように、テスト表面を配置する。支持台の上に取り付けられるテスト表面は０．５ｃｍ2〜１．０ｃｍ2の大きさであり、好ましくは０．７５ｃｍ2である。目視分析評価のためのテスト表面の大きさに関する唯一の制限は、無反応のテスト表面が反応領域と対照して目に見えることである。干渉色変化もしくは陽性の応答に対して生み出される他の信号は永久的であるので、テスト装置を密閉し、永久記録として保存することができる。
【０１６７】
図８Ａ−８Ｇにおいて、本発明の単一使用装置を示す。特に、装置２０は容易に成形可能な硬質プラスチック材（クリップ２２付き）で形成され、装置内にあるテスト表面に対する損傷を防止し、装置の構成要素の適切な配置を確実にする。テスト表面が（図８Ｆに示すように）他の内部構成要素に対して浮揚するように、装置の下部表面がくぼみ２４にくぼませられ、そこでテスト表面２６がピラミッド状構造物２８の上に乗せられる。縁の向かい合ったクリップ２２の上に蝶番３０が設けられ、装置の上半分３２を下半分３４に対して上下できるようにする。
【０１６８】
特に図８Ｅにおいて、テスト表面２６は前述のようにピラミッド２８の上に乗せられて、装置の下半分３４に設けられ、表面２６の上に置かれた液体が表面からピラミッド２８の下へと流れ、回りの壁３８と同じ高さで配置される上表面を持つプレート３６の下の囲まれた領域に流れ込む。プレート３６は下半分３４の１方の側４２に蝶番４０によって取り付けられる。
【０１６９】
装置の上半分３２には、１方の縁５０に沿った上半分３２に蝶番４８によって取り付けられる第２のプレート４６が設けられる。２つのアパーチャ４７と４８がプレート４６の中に設けられる。プレート４６の下には、矢印５８で示すように、アパーチャ４８（Ｉ）の右手側の位置からそのアパーチャ内の左手位置（ＩＩ）へと移動させることができるハンドル５６を備えた可動プレートに沿って濾過紙５２がある。このような動きは濾過紙５２の移動を引き起こす。
【０１７０】
次に図８Ｇにおいて、プレート３６及び４６はそれぞれ蝶番４０と４４のまわりの回転により、図８Ｅに示した位置から取り除くことができる。プレート３６の下には、ピラミッド２８から流れる液体を吸収するための厚いフィルターパッド（吸収材）６０がある。アパーチャ６２はプレート３６の中に設けられ、プレート３６がピラミッド２８の上に当てはめられるようにする。プレート４６の下には、濾過紙５２、５４及び６４が設けられる。濾過紙５２、５４、６４は前述のように図８Ｅにおける位置ＩからＩＩへと、ハンドル５６の動きにより蝶番４８に対して左から右へと動かされる。アパーチャ４２、４４はプレート３６の中に設けられ、位置Ｉと位置ＩＩにある時、ハンドル５６と協動し、装置１０が装置の使用中閉じられるようにする。特に、濾過紙５２の露出度は、装置が閉じられている時、濾過紙５２の表面がテスト装置２６の表面と接触し、その表面上の液体を吸収するような程度である。ハンドル５６（及び装着されたプレート６６）の動きは、装置を再度閉じた時に、濾過紙５２の新しい部分がテスト表面２６と接触できるようにする。
【０１７１】
この装置は標準の手順を用いて製造できる。特に、一度プラスチック鋳型が形成されると、濾過紙５２、５４、６４は装置の上部部分内に置かれ、プレート４６がこれらの紙の上に固定されて、上部部分３２内にこれらの紙を保持する。同様に、プレート３６を固定することにより、濾過紙６０を下部部分３４内に固定することができる。両プレート３６、４６には、これらのプレートを適所に保持するために、各々リップ部分６８、７０と係合するように適合される（図示しない）縁に沿って、複数の小さな突き出しが設けられる。更に、上部部分３２内に棚７２が設けられ、プレート４６がその棚の上に乗せられ、内部空間７４の中で濾過紙５２、５４、６４が動けるようにする。テスト表面２６は接着剤または他の手段により、ピラミッド２８に容易に取り付けられる。
【０１７２】
使用法
図１０において、本発明の方法において装置２０を使用できる方法が示されている。特に、ステップ１において、試料が適切な方法で得られ、処理されて、テスト表面への塗布のために準備される。このような塗布は装置を開いて行われる。ステップ２において、試料は、試料に存在する検体が受容体層と反応できるように培養される。ステップ３において、試料はテスト表面が洗浄され、余分な液体はテスト装置を保持するピラミッドの下のフィルターの中へ流される。この段階で、上部フィルター材料の位置はＩである。ステップ４において装置は閉じられが、フィルターがテスト表面を吸い取るように締められる。ステップ５において、適切な基板が加えられ、培養されて、再び上述のようにすすがれる。この時点で、上部フィルター材は位置Ｉから位置ＩＩへと動かされ、装置は再び閉じられて、テスト表面が乾燥される。この時点で、装置は再び開かれ、結果が読み取られる。
【０１７３】
多重テスト装置
一般的に図９Ａ−９Ｅ及び１１において、多検体用に１つの試料を調べる装置は単一使用装置の特徴の多くを具備している。装置の最初の位置は多くのテスト表面を露出させ、各々が異なる受容性材料で均一に被覆される。装置はエンドユーザーを助けるために、上部表面上に刻印されるテストプロトコールを有する。装置にはテスト表面が幾つでも取り付けられるが、５つの独立した分析評価が非常に簡単に行われる。試料はテスト表面の各々に塗布され、培養される。培養期間の後、テスト表面は水ですすがれる。テスト表面はすすぎ液と余分な試料を装置の下部にある吸収性パッドに排水する傾斜した凹地の上に取り付けられる。蓋が持ち上げられて、第２の位置に進められる。これはブロッターパッドを各テスト表面と接触させ、単一使用装置において説明したように、それらを乾燥させる。蓋が持ち上げられ、テスト表面が再び露出される。単一使用装置の場合と同様に、テストはこの時点で結果が読まれてもよく、あるいは付加的な培養／すすぎ／乾燥サイクルを必要としてもよい。装置は必要な多数のステップを収容するために容易に延長することができる。このタイプの装置は薬品の濫用、アレルギー審査、脳膜炎審査、性的伝染病、ＴＯＲＣＨパネル等のために患者を調べる際に特に有用であろう。テストプロトコールはかなり簡単であり、医師の事務所、医療研究所及び関連研究所のテストに適しているであろう。フィールド使用は、尿もしくは全血が被審査試料である場合なら可能であろう。この例のために、各反応性テスト表面が受容性材料で均一に被覆された別個の0.75 cm2のテスト片として装置内に表示される。各受容性材料をテスト片の表面を横切る不連続な線またはスポットで塗布することが可能である。そうすればテスト装置は単一使用装置のサイズに近付くであろう。
【０１７４】
更に、単一使用装置に非常に近い多数の架台を持つ装置を設計することも可能である。この場合、リビングヒンジで留められた蓋は架台の上に取り付けられた各テスト表面の上に正確に位置付けられる特定の入口を含むであろう。洗浄液と余分な試料は各架台を囲む吸収性パッドの中に集められるか、あるいは多孔質の固体架台を通り下に置かれた貯水槽に流れることができよう。
【０１７５】
光学基板もしくは支持台は所望の如何なるサイズにも切断することができ、こうして反応性テスト片は必要な如何なるサイズであってもよい。均一に被覆されたテスト表面は標準のマイクロタイター井戸フォーマットが設計され得る充分な大きさであることができる。井戸は相互汚染の無い試料塗布のために貯水槽を提供し、現在のＥＩＡ分析評価自動化技術を開拓する。テスト装置は、予め設定されたｘ、ｙ座標に受容性材料が配置される、如何なる大きさでもよい、簡単なプレートであってよく、試料の塗布がこれらの座標から離れて行われる。試料間の相互汚染は、反応領域を囲む疎水性井戸、他のタイプの物理的障壁、あるいはマイクロスポットサンプリング技術によって制御できるであろう。これらのタイプの多試料・単検体テスト装置は、半自動化もしくは完全に自動化された器具使用に適合されるであろう。図１２を参照。バッチテスト用には、目視による判断より器具を使用しての判断が勧められる。バッチテスト表面はブロッターデザイン、ヒートランプまたは他のこのような装置を用いて乾燥させてもよいし、あるいは強制空気または窒素乾燥方法を具備してもよい。試料の残渣及び汚染されたすすぎ液は貯水槽に排水し、そこで処分される前に処理することができるであろう。あるいは、余分な試料とすすぎ液をテスト装置の密閉されたセクションに引っ張ることもできるであろう。
【０１７６】
バッチもしくは多試料装置は定性、半定量、もしくは定量テストフォーマットで設計することができる。バッチテスト用表面は如何なるサイズであってもよい。サイズは単一分析評価で行われるべきコントロール及び試料の数によって決定される。自動化試料処理装置及び試料塗布装置がテスト表面のサイズに強い影響を与える。自動化試料処理及びバッチテストの応用には、血液銀行用の血液審査と共に医療及び関連研究所用のものが含まれる。これらの研究所は大量かつ限度のあるテストメニュー；大量かつ大きなテストメニュー；あるいは少量かつ大きなテストメニューを必要とするかもしれない。テスト表面デザイン上の柔軟性はこれらの要件全てが単一光学検出方法で満たされることを可能にする。試料の量もしくは実施されるテスト数を増加させるために、付加的な試料処理及びテスト装置操作が必要とされるかもしれない。
【０１７７】
特に、図９Ａ−９Ｅにおいて、本発明の多テスト装置が図式で表示されている。この特殊な例は、大腸菌、連鎖球菌Ｂ、連鎖球菌肺炎、Ｈ．インフルエンザ、Ｎ．髄膜症の存在を突き止めるためのテスト用に設計された。一般に、この装置は複数のテスト装置、つまり５個のテスト装置、１００、１０２、１０４、１０６、及び１０８で構成される。装置は上部の摺動可能なカバー１１０、及びワイヤーループ１１６を使用してセクション１１２から取り外し可能な、大きな分厚いフィルター材料１１４を含む下部の棚部分１１２を有する。上部カバーには５個のアパーチャが連続したものが３個、１２０、１２２、１２４と、大きな方形のアパーチャ１２６が設けられる。その下面には、フィルター材料で作られる２つの吸収性スポンジ１２８と１３０が設けられ、カバー１１０の下部表面に接着剤で固着される。１４６、１４８、１５０で示すような一般的な標識をカバー表面に設けてもよい。
【０１７８】
更に、カバー１１０の内部表面からおよそ４ｍｍ伸びる、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２で分類される、３個づつ連続した円筒形伸張部分が設けられる。上部カバーの各列のアパーチャがテスト装置の上に、あるいは必要に応じて、下部部分１１２にある他の標識の上に特別に配置できるように、円筒形伸張部分は部分１１２の下部部分に設けられた空間１５２と係合するように適合される。この動きは図９Ｂにおいて一般的に矢印１５４と１５６で示される。
【０１７９】
下部部分１１２には更に、テスト表面１００、１０２、１０４、１０６及び１０８上の余分な液体が部分１１２内に排水され、フィルター１１４によって吸収されるように配置されるアパーチャ１５８が設けられる。下部部分１１２には更に、１６０で示される一連の指令が設けられ、それらは摺動可能な部分１６４に沿った空間１５２に対する、円筒形の伸張部分１３２、１３４、１３６、１３８、１４０及び１４２の係合により指図されるような段階的な方法でカバー１１０が移動するにつれて順に現れ、装置のユーザーが発明の分析評価を実施するためにどのようなステップが必要であるかの指示を得られるようにする。上部及び下部部分は、濾過紙１２８、１３０を分析評価手順において適切な時に、各テスト装置の表面と接触させるように構成される。
【０１８０】
図１１において、図９に示した多分析装置の使用法を図式で示している（上部部分対下部部分の伸張部分は特に示していない）。ステップ１では、試料が集められ、適切な試薬がそれに混合される。試料は各テスト装置に塗布され、装置はテスト表面が該かる塗布に賦されるように１刻み動かされる（つまり、１つの円筒形伸張部分が矢印１５６に沿って次の空間１５２に動かされる）。ステップ２において、第１のフィルター材料１３０がテスト表面と接触するように、表面が再び動かされる。このステップの前に、テスト表面が洗浄され、洗浄液はアパーチャ１５８を通りフィルター１１４に排水されるようになる。ブロッティングの後、装置は再び１刻み動かされ、テスト表面へのアクセスを可能にし、基板が塗布される。もう一度、適切な培養期間の後、これらの表面は洗い流され、洗浄液はフィルター１１４に排水される。次に、上部表面が１刻み動かされ、フィルター１２８がテスト表面と接触する。２つの表面がお互いに対してもう一度移動すると、結果の判別が可能になる。プロセスの各ステップにおいて、アパーチャ１２６はユーザーが取るべきステップを指示し、こうして装置の誤った使用を防止する。
【０１８１】
図１２は本発明において有用な３つのバッチサンプリングコンセプトを図式で示している。第１の装置（図１２の上部）は前述したように準備された、光学的に活性な検体反応性テスト表面＃１を含む。テスト表面＃１は個々の試料井戸＃３を作り出すプラスチック装置＃２に溶融接合されるか、糊付けされる。最終的な装置は９６の井戸マイクロタイタープレートと全く同じ方法で形成され処理される。このテスト表面＃１の配置は如何なる市販のマイクロタイターに基づく処理システムにも容易に適合され得る。
【０１８２】
バッチテスト用の第２の配置は単一使用装置に非常に類似した装置であり、クィックパネル審査分析評価（図１２の中間を参照）において特に有用であろう。装置は蝶番＃７によって底部容器＃５に蝶番式に取り付けられる蓋＃１を含むように形成される。底部容器＃５は余分な試料と洗浄液を吸収するための吸収材＃６を保持する。蓋＃１は分析評価プロトコールにおいてテスト表面＃４を乾燥させるために使用されるブロッター＃２を含む。テスト表面は架台＃３の上に装着され、洗浄工程を容易にする。保護カバー＃８と＃９がブロッター＃２と吸収材＃６を装置内の適所に保持する。
【０１８３】
第３のコンセプトは＃２で表される反応性領域を含む、光学的に活性な検体反応性テスト表面＃１を含む（図１２の下部参照）。反応性領域＃２はスポットコーティングにより、受容性層の選択的不活性化、もしくは反応領域間の物理的障壁により作ることができる。試料は反応領域（＃２）に塗布され、次にすすぎ液と余分な試料が排水口＃３を通して流し出される。
【０１８４】
別の配置では、テスト表面は縦の縁の片方もしくは両方にあるフィルター材で一連の縦のストリップとして作ることができ、９６井戸の配置の中に適合するように配置される。
【０１８５】
器具使用
試料がテスト装置の表面と接触した後、器具を用いて検体結合を検出することができる。該かる器具の１つはSagax Ellipsometerである（米国特許4,332,476、4,655,595、4,647,207、及び4,558,012を参照、その開示をここに完全に挿入し、本明細書の一部とする）。この技術にふさわしい別の器具は伝統的なナル楕円偏光計、薄膜アナライザー（図１４参照）、プロフィルメーター、偏光計等を含む。干渉膜がテスト表面構造に含まれる場合、定量分析には単純な反射率計（図１４参照）が適切である。
【０１８６】
図１３において、光とテスト表面の相互作用を検出する先行技術の方法が示されている。先行技術においては、該かる検出を可能にするために２つの偏光子が設けられる。特に、＃１はこの先行技術の器具において使用される白い光源に相当する。多色光を発生させるために標準的なハロゲンランプが使用される。光は位置＃２において偏光子に入射し、次に直線的に偏光される。直線偏光された光は、テスト表面＃４に対して７０゜である基準表面＃３に衝突する。直線偏光された光は楕円形に偏光された光として、基準表面＃３から反射される。次に光はテスト表面（＃４）に衝突し、位置＃５にある第２の偏光子に反射される。テスト表面（＃４）と光の相互作用は楕円形に偏光された光のｓ−及びｐ−成分を逆転させる。位置＃２と＃５における偏光子は調和し、＃５は＃２に対して９０゜回転される。基準表面＃３から反射されたものと調和するテスト表面＃４から反射された光は、偏光子＃５を通過し、検出器（＃６）において完全に消される。表面＃４と＃３の表面特性に何等かの差があれば、残りの楕円率が強度の増加を生じさせ、検出器＃６で測定されるであろう。
【０１８７】
薄膜及び膜特性の変化の分析に有用である該かる器具は、米国特許4,332,476、4,655,595、及び4,647,207に記載されたComparison Ellipsometer（比較楕円偏光計）である。該かる器具の光路は前述のように、図１３に示されている。この器具は表面を横切る厚みの光学くさびを含む基準表面を使用することができる。厚みの値が光学くさび上に刻みつけられると、テスト表面の厚みは光学くさびに対して決定される。テスト表面の厚みは光が検出器において消される点における光学くさびの厚みに等しい。
【０１８８】
器具は直線偏光多色光の反射により生じる楕円形の偏光度を２つの表面間で比較することに基づいて操作される。入射多色光はコリメートされ、直線偏光される。偏光された光は、テスト片のものと同様の、または全く同じ光学特性を持つ反射基板である、基準表面から斜角で反射される。反射光は次に反射の結果、楕円形に偏光される。楕円形に偏光された光はその後テスト表面から反射される。テスト表面及び基準表面はお互いに対して垂直に配置され、テスト表面からの反射の後、光が再び直線偏光され、そこでテスト表面と基準表面が光学的に同一になる。それらの厚み、及び／もしくは屈折率が同一でなければ、その光はある種の楕円形の性質を保持している。楕円率は屈折率及び厚みの差の関数である。次に第２の偏光子を使用して光を濾過し、同一膜に対応する直線偏光された光を取り除く。楕円率の増加は第２の偏光子を通過する光透過の増大を招く。こうして、厚みもしくは屈折率の変化は光度の変化に変換され、それは次に従来の技術を用いて測定できる。この方法で比較楕円偏光計を使用して、＋／−５Ａまでの解像度が達成できる。従来からの楕円偏光計と異なり、比較楕円偏光計は幅広い視野測定を可能にするように設計されている。この特徴は反応領域全体の同時測定を可能にする。従って、異質結合もしくは反応パターンによる測定誤差は生じない。
【０１８９】
本発明の応用にとって、より有用な基準表面は均一なものである。分析されるテスト表面が視覚的解釈のために着色信号発生用の全ての要素を持っている場合、基準表面も反射防止膜コーティングを包含しなければならない。この付加的なコーティングは器具を使用する分析には不必要である。テスト表面上の厚みもしくは質量の変化により生じる信号を最大限活用するために、基準規格はテスト表面、基板、付着層、及び受容性材料よりおよそ５０〜１００Å薄くするべきである。これら２つの表面があまりに近接して調和すると、厚みもしくは質量の小さな変化が強度に生じさせるのは、元の背景強度に対してわずかな増加だけである。背景強度がある最低より上であるか、あるいは充分に明るい時、わずかな厚み変化に対して強度の変化は劇的に増加する。この基準表面で、厚みもしくは質量の全ての変化は、テスト表面の初期の読みに対して検出器で測定される光の強度において劇的な変化を生じさせる。強度の変化は塗布次第で厚みの増加あるいは減少を反映することができる。実施例８、１２、１３、１６、及び１７を参照。器具を使用した読みプロトコールは実施例２１に示している。
【０１９０】
テスト表面上での特異的な結合反応の分析のために、多数の修正により比較楕円偏光計の性能が大いに改善される。元のデザインは表面検査のために観察者の目に頼っている。
【０１９１】
図１４において、偏光子が全く設けられない２つの装置が示され、その場合薄膜は１つのフォトダイオード、フォトダイオードアレイ、もしくはＣＣＤ検出器配列か、あるいは反射率計、光電子増倍検出器のいずれかにより分析できる。
【０１９２】
検出器は接眼レンズが元の器具に配置される場所に取り付けられる。更にそれは光の一部を検出器に反射させ、残りを試料の視覚的配列のために接眼レンズに反射させるため、部分的に銀めっきされた鏡またはビームスプリッターセットを４５゜に組み込むことにより、光路側に対して９０゜に取り付けられる。鏡が光路に挿入された場合、検出器に達するスポット強度は利用できる光の断片にすぎなくなる。検出器が鏡なしに光路の中に直接置かれる場合、試料強度の１００％が検出器に達する。ビームスプリッター及び接眼レンズが装置の中に含まれる場合、注意しないと、検出器上の光学信号入射を低下させる漂遊光が導入されることがある。
【０１９３】
フォトダイオードアレイは個々のフォトダイオードを反応領域もしくはスポットの強度を測定するために供するようにプログラムすることができる一方、他のフォトダイオードアレイが背景を測定したり、あるいは領域を制御する。スポット強度及び背景強度の同時測定により、テスト表面背景のために各々の読みが正確に訂正される。
【０１９４】
線形アレイもしくはマトリックスアレイのいずれも使用することができる。線形アレイはアレイにおいて利用できるサイズ及び解像度に依存する、１つの予め設定された試料スポットの軸に沿った測定だけを行うことができる。マトリックスアレイは全反応スポットと背景の測定を行うことができよう。
【０１９５】
器具は更に、如何なる背景信号も捕らえることなく、異なるスポットがフォトダイオードを満たすことができるように、可変拡大機能もしくはズームレンズを含むように修正することができる。
【０１９６】
特に、２つの該かる器具が図１４ａ及び１４ｂに図式的に示されている。薄膜アナライザー（図１４ａ）は単色光源＃１を使用する。光が充分直線偏光されない場合、位置＃２にある偏光子が光を偏光するために使用される。偏光子＃２は光の最大強度がテスト表面＃３へと通過できるようにするために配置されなければならない。初期偏光子を相殺することにより、入射面に対して垂直に偏光された光成分が、入射面に対して平行に偏光された光に加えて、表面と相互作用できるようになる。光は法線から５０〜７５゜外れ、ブルースター角から充分に外された角度でテスト表面＃３に衝突する。偏光子／検出器はテスト表面に対する入射光源と同じ法線からの角度で設定される。偏光子は全体の光の吸光度のために偏光子を配列するセッティングを越える２゜〜１５゜に設定される。法線から３０゜〜４０゜外れた入射角は非常に希釈した試料の適切な解像度を提供するが、全ての応用に対して充分な範囲を提供することはできないかもしれない。第２の偏光子、もしくはアナライザー偏光子は、光が６５゜以上の角度で表面に入射する場合、背景信号を適切に最小限にすることはできない。しかしながら、動的範囲は背景信号に於ける電子的減少のために準備するのに充分である。光は検出器＃５で測定される前に、テスト表面＃３から位置＃４において偏光子／アナライザーを通って反射される。検出器は１つのフォトダイオードであっても、あるいはフォトダイオードアレイであってもよい。ブランクのテスト表面が試料位置に置かれ、第２の偏光子を配列するために使用される。第２の偏光子は、最低限（検出器への光の最大吸光度）から少しだけ外れるように、第１の偏光子に対する角度で配置されるべきである。このように、テスト表面の背景は低い検出可能な信号を生み出すが、光強度の変化は今や厚みの変化の関数である。実施例２６を参照。
【０１９７】
反射率計（図１４ｂ）は色の変化または強度の変化の測定を可能にする非常に簡単な器具である。位置＃１において、標準的なハロゲン光源が使用される。これは多色光を提供する。光源＃１は最大強度の入射光がテスト表面＃２に衝突するように、テスト表面＃２に対して配置される。検出器＃３は増倍型光電管等であってよい。光がテスト表面＃２に衝突する角度は、検出器＃３がテスト表面＃２に対して配置される角度を決定する。
【０１９８】
図１５において、１つの特殊な例では、半反射鏡がズームレンズと接眼レンズの間に４５゜で導入された。視野の中間に、焦点を合わせて適切に配置された接眼レンズ内に、楕円の十字線が設定された。十字線は平均試料スポットサイズに合うように選択された。光路の中心線上に、光学軸から９０゜反射されて、十字線のサイズに合うマスクが設定された。十字線に対する鏡の中心からの距離は、マスクに対する鏡の中心からの距離に等しい。鏡は、十字線内に見られる画像がマスク内に現れる画像と同一であるように、ねじを調節して取り付けられた。数ミリメートルの距離で、マスクの背後に、マスクを通過する光、及び従って選択された画像からの光を読み取るためにだけ配置される光電性セルが装着された。半反射鏡は二次画像が第２の表面から現れるような厚みのものである。これはビームスプリッターとして適切に被覆された薄いマイラーメンブレンを用いて除去される。
【０１９９】
白光または単色の一定の光源が、フィードバック能力を持つ電源を用いて提供される。ランプの光出力を監視するフォトレジスターが、元の器具のランプハウス／ヒートシンクの内部に装着される。光出力が変化すると、対応する抵抗変化が発生し、それによりランプに送られる電流／電圧に影響を与える。
【０２００】
電源はフォトレジスターが遮断される間に、ランプに＋１５ＶDCを送るように設定される。フォトレジスターが接続されると、電源は＋１５Ｖの電源で作られるレベルで光出力を維持する。器具が定量分析に使用される場合、一定の光源が必要である。更に、器具はフォトダイオード検出器増幅器の出力が、コンピューターまたは他の専用装置におけるアナログ・デジタル変換機ボードに出力できるようにする、ＢＮＣポートで修正されてもよい。専用装置もしくはコンピューターは入力信号を読み、指名し、入力を記憶し、指名された入力を操作し、つまり、統計的分析等を行い、そして入力データ及び入力から引き出されたその他の必要な計算を印刷する。
【０２０１】
特に、図１５は図１３に示した先行技術の器具の修正を図式的に示している。一定の電源が位置＃１で使用される。電源は白い光源＃２と検出器＃１２の両方に供給する。白い光源は標準的なハロゲンランプであり、多色光を提供する。前述したように、光は位置＃３で偏光子を通過し、直線偏光される。偏光子＃６は位置＃３にある偏光子に対して適合し、交差するように置かれる。基準表面＃４とテスト表面＃５は前述した通りである。この器具では、光が偏光子＃６を通過する時、光は位置＃７にあるビームスプリッターに衝突する。このビームスプリッターは、光の一部が検出器＃１２で受け取られ、一部が位置＃１１にあるＣＣＤカメラで受け取られるように、光を分離させる。ＣＣＤ＃１１はユーザーがテスト表面＃５を器具の視野の中心に配置できるようにする。検出器に分離される光は位置＃９でマスクに衝突する。マスクはテスト表面＃５上の試料スポットが十字線＃１０の中心に正しく置かれる時、マスク＃９を通り検出器＃１２へと通過する光が試料スポットからのみ反射されるように、位置＃１０で十字線に合わされる。位置＃８のズームレンズは十字線に対する試料スポットの位置付けを助ける。
【０２０２】
上述の比較器具のために使用される光路は多数の応用のために望まれるものより大きい。以下の修正案では光路を減少させることが可能である。レーザー光源（ガスレーザーまたはレーザーダイオード）から放出される光は既にコリメートされ、偏光されているので、コリメーティングレンズシステムは簡略化もしくは省略できる。直線偏光子が光源に近接して配置される。この偏光子はレーザーがしばしば偏光されるので必要でないかもしれない。基準表面は試料表面に対して６０゜〜７０゜に配置される。基準表面及び試料表面の入射面はお互いに直交する。アナライザー偏光子は最大吸光度が基準位置と試料位置に置かれる２つの同じ表面のために発生するように配向される。両偏光子はそれらの表面が光ビームに対して垂直に配置されることが重要である。信号を集め、処理し、記憶するために、適切に小さな検出器とエレクトロニクスを使用することができる。高精度を得るために、偏光子は１０5の吸光度以上を供給するべきである。図１６を参照。偏光子は光源と検出器の表側に建てられているが、図ではラベルによる分類はされていない。
【０２０３】
薄いアナライザーは前述の器具の基準表面の要件を取り除き、サイズの縮小を容易にする。比較に基づく器具は特別な基準表面が使用される各タイプのテスト表面のために設計されることを求める。基準表面を変化させるる手段が提供されない限り、これは光学基板の範囲、及び所定の器具と互換性のある反射防止膜の範囲を制限する。この新しい器具はアナライザーの簡単な調節により、薄膜と光学基板の如何なる組合せをも容易に収容する。器具は厚みの優れた解像度を提供するかもしれない。この器具と修正された比較楕円偏光計では、９Ｖの電池もしくは他の再充電可能な電源により電力を供給することができる。このプロトタイプは開口数、画像の明るさ及び焦点における増加を可能にする。そのため、使用される倍率のレベルをより高くすることができ、それはより小さなスポットサイズでの作業にとって重要である。更に、試料は比較楕円偏光計で可能であるよりもっとお互いに近接して塗布されてもよい。
【０２０４】
特に、図１６は図１３の先行技術による器具の改良を図式的に示している。この場合、多色光源＃１が使用される。小型レーザーが使用される。偏光子は位置＃１において光源の真横に置かれる。図１３においてテスト表面＃４の視覚検査を提供するために、先行技術の器具において使用されるレンズ系は取り除かれ、全光路において減少を達成できるようにする。テスト表面は位置２において試料台に休止するように配置される。光は基準表面＃３に衝突し、図１３の先行技術の器具に関して前述したように、楕円状に偏光される。光は基準表面＃３から、試料台＃２の上に置かれたテスト表面に反射する。一定の電源を供給し、検出器＃５を制御するために、小さなエレクトロニクス制御ユニット（＃４）が組み込まれる。１つのフォトダイオードが検出器＃５として使用される。位置＃６にあるダイヤルは試料台＃２を動かし、テスト表面の位置を制御するために使用される。試料台＃２は試料スポットを検出器＃５に整列させる予め決められた停止位置を持っている。試料スポットからの信号だけが検出器により測定されるように、試料スポットが配置され、検出器＃５がマスクで覆われる。第２の偏光子が検出器＃５の直前に置かれる。
【０２０５】
蛍光方法
更に、これらの光学的に活性な基板、もしくは固体支持台が重点的に取り上げられる、器具を使用する態様は反射蛍光方法である。ブルームは均質フォーマット、異質フォーマット、拮抗的フォーマット、もしくは直接的フォーマットにおける免疫分析評価、酵素分析評価、核酸分析評価において生み出される。信号発生はこの方法において膜厚に依存しないが、該方法は現在の入射光の経路長を二倍にすると共に、検出器における収集効率を高める。光学的に活性の基板、もしくは固体支持台はシリコンウェーハ等の磨かれた反射材料であってよい。
【０２０６】
標準的な蛍光分光学において、励起光は一度試料を通過する。図１７を参照。反射基板が使用される場合、蛍光種の励起は入射点及び反射点で発生する。一般に、主として検出器のデザインを簡略化するため、蛍光放射があらゆる方向に放射されても、放射（ブルーム）は励起軸から９０゜外れて検出される。例えば、ポイント検出器では、励起エネルギーは検出器に突き当たらないようにされるべきである。回折格子が励起源と共にしばしば使用され、最大ブルームは励起波長から区別される程度に動かすことはできない。これは高強度の励起源からの影響、及び溶液と細胞壁からの散乱を減少させるために要求される。反射基板では、検出器及び入射光は法線から等しい角度である。
【０２０７】
試料を通る励起光の通過数を増加させることにより、蛍光分析評価の感度を高めるための試みが為されてきた。このアプローチは焦点調節のためにより複雑な光学、高い出力光源、及び大きな収集光学を必要とする。この方法は更に細胞からの背景ブルーム、及び干渉生分子または固有の生分子を増加させる傾向がある。試料の容量及び／もしくは光路長を増加させることにより、感度の向上も達成できる。本発明の方法はこれらの方法に見られる複雑さなしに、感度の向上を提供する。
【０２０８】
英国特許GB 2 065 298 Aは、蒸発工程により生じる反射性金属基板を使用する、蛍光分析評価について記載している。検体の結合及び蛍光ラベルに結合される第３の生物種のために、捕獲層には特に反応性生物粒子を使用している。金属基板は励起粒子をトラップ（多重反射）に向けさせ、検出器から遠ざけるように向け直すために配置される。
【０２０９】
この特許は、励起粒子が金属基板により暗い囲いに向けて反射されるようにするため、光子計数システムを基板から離して配置する。囲いは囲いを打つ全ての光子を吸収し、それは検出器におけるノイズを減少させる一方、基板から誘導される多くの信号が反射のために光子計数システムに移動する。検体は湿気のある培養において反応させられる。
【０２１０】
このアプローチのため、光源から始まり、暗い囲いの壁で終わる励起格子の通路には、高い反射性の金属表面と生物粒子以外は何も存在してはならない。入射角が反射角に等しく、信号検出システムが基板に対して垂直で、基板からある距離を置いて配置されることにより、励起粒子は検出システムに向かって散乱しないであろう。
【０２１１】
本発明は反射基板と受容性の生物層の間の付着層に依存する。この基板と生物層の間の重合体層は蛍光信号の発生に影響を与えない。付着層は次の化学薬品から選択することができる：デンドリマー、スターポリマー、分子自己組立ポリマー、重合体シロキサン、及び膜形成ラテックス。これらの表面の製造方法は実施例５に記載されている。反射基板もしくは支持台（光学的に活性な表面）は、単結晶性シリコン、ガラス／アモルファスシリコン複合材、金属、セラミック、多結晶性シリコン、プラスチック／アモルファスシリコン複合材、及びこれらの材料の複合材から選択できる。これらの材料の製造方法は上述した通りである。この方法は試料の量を二倍にすることなく、励起通路長を二倍にする。それに加えて、反射基板を励起光に対して耐反射性材料で被覆することで、蛍光方法に関連してしばしば発生するノイズを除去するが、吸光度が空気と膜の界面のみで発生するので、励起を可能にする。適切な材料としては、窒化ケイ素、ケイ素／二酸化ケイ素複合材、オキシ窒化ケイ素、二酸化チタン、チタン酸塩、ダイヤモンド、ジルコニウムの酸化物、及び炭化ケイ素がある。材料及び材料の厚みは励起波長の光を抑制するように選択される。選択される励起波長は特殊な染料（発蛍光団）もしくは使用されるラベルに依存する。これらの材料は上述したように製造される。入射励起の角度が険しくなると、検出器に達する励起光の量を減少させる助けをする。
【０２１２】
本態様では如何なる数の蛍光分子も使用できる。フルオレセイン、ローダミン、及びローザミンを含むキサンテン染料等の蛍光分子は本出願に適している。それに加えて、これらの染料のアミノ及びカルボン酸、もしくはイソチオシアネート代理品も適している。１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホナート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホナート、及び２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホナート等のナフチルアミンも有用である。生物分子に対するこれらの化合物用の接合プロトコールは、当業者に公知である。二次抗体、酵素基板、核酸プローブに対して、あるいは関係のある検体用の適切に選択される、特異的な受容性材料に対してラベルを添付してもよい。
【０２１３】
本発明において、光学的に活性な、もしくは反射性支持台は、光学コーティングまたはＡＲ膜があろうとなかろうと、適切な重合体で被覆されるであろう。次に重合体層は関係のある検体、つまり抗体に対して特異的な受容性材料で被覆されるであろう。生物学的に反応性かつ反射性基板は関係のある検体を含むと思われる試料と接触させられ、検体を表面に結合するのに充分な時間の間培養されるであろう。検体は表面に接触すると同時に、あるいは逐次、蛍光材料のラベルが付けられた二次的受容性材料と混合されてもよい。いずれの場合にも、ラベルは検体ブリッジを通り表面に固定化される。固定化されたラベルは励起光源に露出され、検出器が蛍光度を測定するであろう。ブルームの量は関係のある検体の濃度に対して直接的に、逆に、あるいは間接的に測定できる。酵素の活動もしくは核酸の検出のための同様の計画が当業者によって容易に考えられるであろう。光源及び検出器は標準的な蛍光光学要素の組合せから選択できる。
【０２１４】
検体
連鎖球菌属グループＢ連鎖球菌（ＧＢＳ）、無乳症連鎖球菌は新生児及び母親の症病率、死亡率の主要な原因である。新生児の感染は敗血症及び髄膜炎を含む一方、分娩後の生体は子宮内膜炎、しゅう毛羊膜炎、及び敗血症を含む。新生児にとって、初期発病疾患が誕生から１週間の間に発生する。疾患は呼吸困難、敗血症、及びショックにより特徴付けられる。米国だけで１０００人の出生当り１．９〜３．７例があり、死亡率は２６％〜５０％であり、感染した幼児の３０％が髄膜炎を起こしている。後者のグループでは、５０％が持続的な神経的損傷に苦しんでいる。年間約２０００人の新生児の死亡の原因がＧＢＳの感染であり、米国だけで年間ヘルスケアにかかる費用は５億ドルを越えると概算されている。母親の頸部／膣のＧＢＳ運搬と幼児の感染との直接的な相互関係が論証されている。
【０２１５】
ＧＢＳは更に、誕生後３カ月以内に発生する末期発病疾患を発生させる。これらの場合の病気は中枢神経系の障害、髄膜炎、及び菌血症によって特徴付けられる。これらの疾患による死亡が幼児死亡率の約２０％を占めている。
【０２１６】
母親の感染は主として頸部／膣及び肛門である。妊娠中の婦人の５％〜３０％がＧＢＳで感染されている。母親の感染は早産、難産、早期羊膜破裂、分娩時の熱、未熟児出産と共に初期発病疾患の原因となることがある。母親の出産前の処置が新生児の結果を大きく改善し、ＧＢＳの垂直伝染を除去することができる。しかしながら、母親の頻繁な再感染のため、診断／治療プログラムが妊娠初期であれば、母親のＧＢＳ感染の診断、及びその後の処置は垂直伝染を除去することができないかもしれない。初期診断はＧＢＳ感染のため危険に曝されている新生児を特定することができる。しかし、分娩時にＧＢＳの素早い、敏感かつ正確な診断のために文書化する必要がある。該かる診断上の道具が利用できれば、母親の予防処置が分娩発生時に開始でき、幼児に対する処置は誕生時に始めることができるであおう。これは新生児に対する危険をかなり減少させることが論証されている。
【０２１７】
ＧＢＳは５つの血清型から成る。これらはＩａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩ、ＩＩＩと称される。５つ全ての血清型は臨床感染に包含されている。５つ全ての血清型は独得である特異的な多糖類属を含み、加えて血清型を唯一特定する抗原をも含む。特異的な多糖類属が全ての血清型を特定するにつれて、この抗原はＧＢＳの特定のための免疫学的方法の焦点となってきた。ＧＢＳ診断のための「ゴールドスタンダード」はいまだに培養特定である。このプロセスはＧＢＳの正確な特定のために２４〜７２時間かかる。危険の大きい妊娠はしばしば培養結果が利用できるずっと前に分娩を完了するであろう。
【０２１８】
ＧＢＳの検出のために多くの市販されている様々な免疫学的テストがある。これらの方法の臨床評価は１２％〜９２．３％の範囲の臨床感度を実証し、平均臨床感度は５０％〜６０％である。分析的感度は７．６×１０5〜２．１×１０7セルの範囲であると報告されている。これらの方法は素早い診断を提供する一方、時機を得たＧＢＳの特定のために臨床上の必要性を重点的に取り上げるために必要な感度を備えてはいない。
【０２１９】
例えば、WO 9219969はＧＢＳ用の分析評価を記載しており、そこでは固体支持台がグループＢの特異的な多糖類の１エピトープである、トリラムノースエピトープと特に相互作用する単クローン性抗体で被覆される。モノラムノースエピトープに対して特異的である多クローン性抗体が１つの発生ラベルに接合される。この方法の分析的感度は３×１０4セルに設定される。感度は捕獲剤の厳重な選択性を通してのみ得られる。該方法はＧＢＳの優勢なエピトープにのみ専念する。「抗原捕獲剤はＧＢＳ多糖類抗原のトリラムノースエピトープに特に結合するための親和力を持つ」、そしてこの抗原捕獲剤は更に「独占的もしくは少なくとも優勢的にトリラムノースエピトープと相互作用することができ、この捕獲剤とグループＢ連鎖球菌多糖類抗原の他の成分との間の相互作用は、非常に低率であるか、もしくは無視できる程度である（つまり、トリラムノースエピトープとの相互作用はＧＢＳ多糖類抗原またはＧＢＳ感染の検出及び／診断目的のために充分特異的である」。分析評価は綿棒を抗原捕獲剤で被覆された容器の中に置くことを必要とする。容器は非常に高い領域／容量率を持つ。抗原は酸抽出プロトコールを用いて、５〜２０分かけて綿棒から抽出される。トリス及びトゥイーンを含む緩衝液がそれに添加され、綿棒が取り除かれる。抗原マーカー剤が添加され、混合物は更に１０〜１５分間培養される。次に容器は完全に洗浄され、基板が１０〜２０分間添加される。それから反応が停止され、その結果が分光測光法により読み取られる。
【０２２０】
本発明において記載されるＧＢＳ検出法は、３０分以内で得られる感度を達成する。テスト結果は解釈しやすく、病床あるいは分娩室での使用に適している。本発明の光学テスト表面は独特な付着層の故に改良された感度を提供し、如何なる属の特異的な多クローン性抗体あるいは単クローン性抗体ともうまく作用する。抗体は必要な臨床感度を達成するために異なるエピトープ特異性を呈する必要がない。ＧＢＳ抗原に対する様々な特異性及び親和性の組合せである抗体調製品は、サンドイッチフォーマットの両サイドとうまく作用する。しかしながら、異なるエピトープ特異性を持つ抗原が本発明においては有用である。
【０２２１】
クラミジア
クラミジアトラコーマティスは生きている細胞で培養されなければならない、つまり組織培養が必要な真正細胞内生物である。クラミジアは１５のserovarを持ち、主としてトラコーマ、結膜炎、リンパ肉芽腫、性病、非淋菌の尿道炎及び肛門炎等の、人の眼の疾患及び性殖器の疾患を起こさせる。米国で年間およそ３〜４００万のクラミジアの症例がある。非常に専門的な研究所のみがクラミジアを培養するのに成功しているが、収率は低く、汚染問題が深刻である。貯蔵状態が培養のための生物の生存能力に影響を及ぼす。推薦される培養プロトコールはMcCoy細胞で処理されたシクロヒキシミドの接種、盲通路、及び封入体の蛍光着色を含む。接種前に試料の渦化及びソニケーションは陽性の培養収率を増加させる。サンプリングはサンプリング場所を囲む細胞及び粘液を含む。
【０２２２】
培養技術に加えて、多くの直接的な免疫蛍光法及びＥＬＩＳＡ法が開発されている。これらの技術は低レベルのクラミジア感染をしている患者を検出するため、もしくは無症候性である個人にとっては不適切な感度を提供する。１００ＩＦＵ（包接形成単位）以下を含む試料に対して、培養に対する４４％の全体的な感度が報告されている。利用可能な方法は１００ＩＦＵ以上を含む試料に対して８２％の感度を実証している。
【０２２３】
更に、多くのグラム陰性細菌も、クラミジアによって作られるものに類似する生物特異的リポ多糖類（ＬＰＳ）を作り出す。生物の検出及び特定はこの抗原の免疫学的反応に基づいて為される。生物特異的多糖類も有用であるかもしれない。グラム陰性細菌はクラミジアプシタチ、大腸菌、プソイドモナス蛍光、アゾトバクターヴィネランディ、アイロゲネス菌、淋菌、トレポネーマパリードス、葡萄状球菌、シゲラ、ヒドロゲノモナス種、サルモネラ、ヘモフィルスインフルエンザ、カンピロバクター、ヘリオバクター、及びレジオネラを含むが、それらに限定されない。
【０２２４】
米国特許4,497,899は、シリカ、シリコーン、ガラス、金属、もしくはプラスチックビーズ等の露出した固体支持台に対する抗原の非特異的吸着に基づく分析評価を記載している。固体支持台に対する抗原の化学的もしくは免疫学的結合はない。分析評価プロトコールは抗原を遊離させるために溶解された試料とビーズの混合を含む。抗原のビーズに対する吸着の後、ビーズはすすがれ、新しい担体に送られる。クラミジア抗原に特異的な抗体が添加され、所定の時間培養され、ビーズがすすぎ落とされる。信号発生ラベルに接合される、耐クラミジア抗体に対して特異的な別の抗体がビーズと混合され、培養され、すすぎステップが続き、その後基板で培養される。
【０２２５】
米国特許4,497,900は非特異的抗原吸着のために露出した固体支持台を用いた、淋菌のための分析評価を記載している。固体支持台は好ましくは炭化水素重合体、ポリスチレン、シリカ、シリコーン、ガラスまたは金属の、露出された、未処理の、被覆されていない支持台である。
【０２２６】
米国特許4,959,303はグラム陰性細菌の検出方法を記載している。使用される固体支持台は特異的な結合タンパク質がなく、本質的にタンパク質がない。固体支持台は正の電荷を所有することができる、露出した疎水性支持台である。分析評価プロトコールは、抗原が非特異的に表面上に捕獲された耐クラミジア抗体と混合されることを求める。耐クラミジア抗体に対して特異的であり、信号発生器に接合される抗体が添加され、次に基板が添加され、その後検出が行われる。支持台は水分を吸収しやすい、無孔質の水に不溶な材料であれば何であってもよい。
【０２２７】
米国特許5,030,561はアミジン改質ラテックス粒子もしくはポリスチレンを固体支持台として使用することによる上記アプローチの修正を記載している。抗原は非特異的に支持台に粘着し、粒子が濾過を通して液体相から固体相を分離するために使用される。濾過工程において使用されるメンブレンは、分析評価において使用される前に、界面活性剤及びカゼインで洗浄されなければならない。基板の視認性はメンブレンに発生する。
【０２２８】
米国特許第５、０４７、３２５号には、プラス電荷が印加される露出式あるいは被膜式固支持体を使ってクラミジアや淋菌の抗原菌を検出する方法が詳細に記述されている。その固支持体は、ガラス、セルロース、ポリマーなどから成る。プラス電荷体は、幅広いＰＨ値において電荷を維持できるような原子塩が好ましい。前記固支持体上には、非特定抗体捕捉源が載置されており、陽イオン界面活性剤にてその表面を洗浄して除去する必要がある。なおサンプルは、細胞片を取り除くための予備フィルター処理しておく必要がある。
【０２２９】
また、米国特許第５、０７５、２２０号では、固支持体のＬＰＳ抗原のイオン相互活動作用を支援できるよう陽イオン面基をもつポリマー支持体が利用されている。支持体は、抗原菌の反応測定動作前には、抗体や生物化合物などで汚れていないよう注意する必要がある。
【０２３０】
本発明のクラミジア試験では、ＬＰＳや抗原菌を非特定に捕捉することができるような疎水性面を作成するため、重合シロキサン被膜をもつ固支持体が使われる。この構成により、ＬＰＳ源の確認もできる。しかも、実験から、抗原菌の捕捉動作前に少量の抗体またはタンパク質のような非特定の生物質で疎水性面を被膜した場合、均一で最良の反応が行なえることが判明した。この追加の被膜処理は、ＥＩＡ、ＦＩＡ、ＲＩＡなどの検知方法にも利用できる。本発明の方法においては、この非特定の生物質層により、沈着基体系との均一接着が可能となる。特に、疎水性支持体などの固支持体と沈着基体系の組合せに依存するようないかなるシステム装備にも、本測定試験構成の利点が適用できる。
【０２３１】
ＲＳＶ
呼吸系合胞ウィルス（ＲＳＶ）つまりミクソウィルスは、幼児や児童などの下部呼吸気道の疾病に関与している。成人の場合、ＲＳＶは通常、良性で無熱性の上部呼吸気道感染である。幼児期の最初の６ヵ月間において、細気管支炎全体の３２〜７５％、そして肺炎の３〜３９％はＲＳＶが原因で起こっている。これらのウィルスは、しばしば生命を脅かすものである。その有機物はまた、気管支炎や咽頭炎のような急性発熱性の呼吸系疾病に関与している。そのような有機物は冷凍保存あるいは高温射熱される前の所定のサンプルを培養して生成され、鼻中または咽頭内の分泌液から検出されるものである。そのサンプルはＨｅＬａ、あるいはＨｅｐ２細胞の接種に使用され、結果がでるまで３〜１４日を必要とする。なお、ＲＳＶは晩秋から初冬、そして晩冬から初春にかけて発生し、各発生ごとに３〜５ヵ月間生存する。
【０２３２】
初期のウィルスの診断で、医師たちは患者の症状を推察し、呼吸系疾病の病因を確認することができる。ウィルス性疾病の確認には３種類の診断法を用いることが可能である。まず第一は、プロトコル確認に従った培養隔離法である。第二に、ウィルス感染に対する宿主反応を検知する血清学的測定法、そして第三には直接ウィルス抗原検知法がある。
【０２３３】
ＲＳＶの培養方法は、サンプルの収集およびガラスビーズとの混合からなる。それには、通常には気管の分泌物と気管支肺胞の洗浄サンプルが利用される。ビーズは、搬送媒体へのにウィルスの分散のため、音波破壊や渦巻効果によるサンプル細胞の破壊に利用される。このサンプルの一部分は、細胞培養の育成に使われる。利用する試験法には、補体結合反応作用と中和反応作用とが含まれる。
【０２３４】
血清学的測定法は、ウィルスに対する宿主反応、つまりＩｐＧの生成に基づくものである。しかし、ＩｐＧは数週間では生成できず、さらに感染が数か月から数年は持続するため、診断確認が困難になる。直接抗原検知法は、進行性感染に対してはより効果的であるが、ＲＳＶに対しては前記の培養法や確認測定法と比較して反応が悪い。直接検知法には、免疫蛍光検査法、電子顕微鏡検査法、酵素連結免疫吸着剤法（ＥＬＩＳＡ）、および培養処理が含まれる。
【０２３５】
ＨＩＶ
免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）には、ｇｐ４１、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｐ６６、ｐ２４、およびｐ１８で示されるいくつかの特徴がある。ｐ２４ペプチドはＨＩＶ−１の核を備える４つのヌクレオカプシドのうちのひとつであり、２４、０００ダルトンの分子量を有する。ＨＩＶウィルスの特定感染性は、ｇｐ１２０抗原に関係あるが、ｇｐ４１は、宿主細胞内へのウィルスの直接侵入を必要とする特徴をもつ。現在のスクリーニング測定法は、これらマーカのうち一つ以上に対する宿主反応、つまり抗体生成検知法に依存している。現存する免疫学的検定法は、直接抗原検知法に十分な過敏性を与えるものではない。
【０２３６】
現在では、ＨＩＶ感染の最終的な確定は、ウエスタン（免疫性）ブロット分析法が基本となっているが、これらの試験は、判断の難しさはもちろんのこと、多くの費用、および技術力が必要とされる。また、これらの方法が、現場条件にて実施される場合、関連実験施設での実施条件と比べて、通常その作用は劣っている。ウエスタンブロット分析法は、ウィルス殻開口タンパク質ｐ１７、ｐ２４、あるいはｐ５５、ポリメラーゼタンパク質ｐ３１、ｐ５１、あるいはｐ６６、そしてエンベロープタンパク質ｇｐ４１、ｇｐ１２０、あるいはｇｐ１６０からそれぞれ一つ以上を検知できるように構成されている。赤十字検査では、各グループにつき１つ、３つの陽性群が必要とされる。陽性結果を報告するためには、ＣＤＣ検査ではｐ２４，ｐ３１，ｇｐ４１および／あるいはｇｐ１２０／１６０を含む少なくとも２つの陽性群が必要とされるが、一方、ＦＤＡ検査はｐ２４、ｐ３１、ｐｇ４１、および／あるいはｇｐ１２０／１６０が陽性となることが必要である。本発明は、１つ以上のＨＩＶの特定抗原に対する宿主反応の検知のための、適切な光学プラットホームを提供するものである。なお、抗原は、組合せあるいは個別に試験表面上に付与される。
【０２３７】
肝炎ウィルス
臨床的には、多種のウィルス性肝炎を区別することは困難である。それゆえ、原因となる因子の診断には、血清学的測定法が必須である。肝炎には５種類の分離型ウィルスが関与しており、それぞれＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、そしてＥ型と称されている。本来は、Ｃ型肝炎が非Ａ型、非Ｂ型として見なされていたが、最近では非Ａ、非Ｂ型の肝炎として認知されている。Ａ型、および、Ｅ型肝炎は排泄物や経口から感染し、急性感染を起こす。Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型の肝炎は経口以外から感染し、急性や慢性の感染を起こす。ＨＣＶは、多くの場合には輸血による肝炎の原因となっている。個体に感染した多くのＨＢＶは、無症候性で感染しやすく、またＨＢＶ感染は肝硬変や肝臓癌とも関連がある。肝炎における血清学的測定法の一例が、「学外薬学」誌、９２巻、５５〜６８ページ、１９９２年に掲載されている。肝炎所有（Ａｇｓ）抗原の各形態はウィルスの各形態と比べると独特で、ＨＡＶはＨＡＶＡｇを、ＨＢＶは表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、殻抗原（ＨＢｃＡｇ）、そしてヌクレオカプシドの内的構成要素（ＨＥｂＡｇ）を有し、ＨＣＶは殻抗原の主要抗原性領域である殻ペプチドのＮ終端とともに、Ｃ１００、５−１−１、Ｃ２２−３（殻）、Ｃ３３ｃ（殻）を有する。さらに、ＨＤＶはデルタ抗原を備えているので、ＨＢｓＡｇの陽性反応から検知できる。ＨＥＶに関しては、その特性はあまり明らかになっていない。肝炎の形態は抗原検知、あるいは宿主抗体反応に基づいて決定判断されるものである。直接抗原検知法では過敏性が必要とされるため、現在の診断測定法では、特定抗原に対する抗体反応性により検知される。宿主反応はＩｇＭまたは／あるいはＩｇＧを生成し、感染の活性状態を作るため、抗体反応からの分離を必要とする。例えば、ＩｇＭ抗ＨＡＶは急性感染を示すが、ＩｐＧ抗ＨＡＶは既往感染を示す。
【０２３８】
本発明は、肝炎の診断のための有益なプラットホーム検知法を提供するものである。まず、抗原の一つの組合せを、それら抗原に対する宿主反応を検知するため、試験表面上で不動化処理する。表面抗原、殻抗原、あるいは、ｅ抗原などの一つ、あるいはそれ以上を被膜処理した試験表面により、ＨＢＶなどの肝炎ウィルスを特定する抗原群を検知する。または、単一サンプルを使用しているＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、およびＨＥＶ間を識別できる１種類以上の抗原で、試験パネルを被膜処理してもよい。そのようなスクリーニング試験は、可視法、定性分析法、あるいは全自動装置のいずれの方法ででも実施することができる。抗体検知は、特にＩｇＧ、ＩｇＭ、または両方に対処できる。
【０２３９】
以下の実施例は、本発明の試験装置を最善に作動させるための方法であって、機器や目視読取記録に利用できる前記のそれぞれの被膜の効果的な組合せ作用例が記述されている。それら方法が、本発明と同様の結果をもたらすような試験装置を最適に動作させるのに適用できるのは、当業者にとっては明白であろう。
【０２４０】
【実施例】
実施例１：拡散面
多様なレベルの拡散反射を生成するための異なったサイズの粒子で覆われたシリコンウェファを、窒化シリコンで被膜して、厚さが５００オングストロームで屈折率が２．０のＡＲウェファを作成した。この結果、金色の干渉色層が生成できる。最初に、ウェファの反射量と残留鏡面特性とを調べた。次に、これらウェファに下記のようにアミノシレンを塗布してから、抗Ａ型連鎖球菌ポリクローン性抗体で抗体被膜を作成する。
【０２４１】
試験面を、下記のような方法で、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメソキシレンを添加することにより化学的活性化した。
１．前記のＡＲウェファを、ＤＣ１７５ミリアンペアで２５０ＲＦワットの陽極電流にて、０．７ｔｏｒｒの酸素圧力で真空中で５分間酸素エッチング処理した。
２．ウェファを水晶ラックに載置して、５マイクロリッタのＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメソキシレンの入った容器で真空乾燥器に挿入した。真空を３０分０．０６ｔｏｒｒにして、１時間のあいだ乾燥器の温度を１００度に上げて、アミノシレンの蒸着層を作成した。
３．２０ｍｌのＰＢＳ（燐酸塩緩衝サリン）溶液内の２０マイクログラム／ｍｌのポリクローン性抗Ａ型連鎖球菌と、１０ｍＭの燐酸カリウムと、０．８％のＮａＣｌ（ｐＨ７．２）と、１容量％のグルタルアルデヒドとを混合して、受容剤溶液を作成した。ウェファをペトリ皿上に置いて、前記の受容液を加えた。
４．そして、室温（約２０℃）で撹拌浴内で１５時間ウェファを培養した。
５．培養の後、ウェファを脱イオン水で洗浄して、不要な抗体を除去した。
６．安定化溶液で培養してから、試験面を１時間撹拌浴内で培養した。安定溶液は、ＰＢＳ内の２％（ｗ／ｖ）のスクロースと、２ｕｇ／ｍｌの酸性加水分解カセインと、１％の（ｖ／ｖ）のグリセロールとから作成されている。
７．安定化処理の後、試験面を脱イオン水で洗浄して窒素噴流で乾燥させた。
【０２４２】
ウェファを、室温で２分間培養して、実施例１４および１５に記述されているラテックス２次試薬と、多様なレベルのＡ型連鎖球菌群抗原を備えるサンプルとを反応させた。スライド部は、脱イオン水で洗浄して、窒素噴流で乾燥させた。混合したシラン、あるいは加えられた抗体の容量には、何の変化も見られなかった。
【０２４３】
その結果は、表１および表２に示されており、それによる非鏡面は、どの角度からでも鏡面以上の高い感度で観察することが可能であることが分かる。
【０２４４】
【表１】
Figure 0004060053
【０２４５】
【表２】
Figure 0004060053
【０２４６】
実施例２：ガラス基板
直径４インチのホウケイ酸塩ナトリウムのガラスに、そのガラスの反射量を効果的に増加させて、後面反射を遮断できるよう、厚さが１０〜５０オングストロームのアルミニウム（クロムでも可）の薄膜層を塗布した。その上に前記のような熱蒸着法によって無定形シリコンを被膜して、厚さが５００±３％オングストロームの窒化シリコンの層を作成した。
【０２４７】
前記の試験表面上に、実施例１１にて記述されているような抗体被膜層を作った。本実施例では、その試験表面の抗体被膜層には、Ａ型連鎖球菌群（ＧＡＳ）に対するポリクローン性抗体を使用した。１００μｌのＧＡＳ抗原希釈液あるいは非希釈液と、５０μｌの非ＧＡＳ表面活性剤粒子とを混合して、実施例１１にて記述されるような方法で検査した。それからＧＡＳ測定法により、シリコンウェファ上の窒化シリコン被膜に対する試験面との比較を行なった。その結果は、表３に示されており、ガラスはシリコンと同様に基板として利用できることが分かる。
【０２４８】
【表３】
Figure 0004060053
【０２４９】
実施例３：ＡＲ試験面の作成
本実施例では単結晶シリコンの光学的基板を、ＡＲフィルムに必要な平方根依存性値に近似した窒化シリコンなどの厚膜層（７５０〜８００オングストローム）で被膜した。その厚膜層を、前記のように基質に対して約５０オングストロームの厚さの化学エッチング処理を数回行なって選択的に除去した。つまり、基板表面全体に干渉色段階のくさび形状を生成した（図３参照）。それから基板を装着層と受容剤で被膜し、陰性、低陽性、および中間陽性のサンプルを使用して測定を行なった。
【０２５０】
装着層、受容剤、測定プロトコルのどのような組合わせでも、この分析方法を行なうことができる。本発明の実施例において、実施例５で記述されるように、Ｔ構造をもつシロクサンで被膜したシリコン上にある窒化シリコンのくさび形状を使用した。そしてＡＲフィルムを覆うシロクサンを、実施例１１で記述されるように、ポリクローン性Ａ型非連鎖球菌抗体で被膜処理した。その測定プロトコルについては、実施例１９にて記述されている。測定サンプルは、各くさび形状（異なる厚膜層）の中心部に配置した。本測定の終了後、単数あるいは複数のくさび形状の選定のため基板全体を検査した。それらくさび形状の特性は、１）最明瞭陰性反応性、つまり最も検知しにくい非特定結合性、２）最高感度性、そして、３）最強視覚コントラスト性である。５０オングストロームの厚膜を選択した場合、基板を均一に被膜することにより、最初の実験で選択した最も厚い厚膜（５５０オングストローム）では、１０オングストロームの厚さでエッチング処理が行なわれたものに比べて、より高い解像度が得られた。この方法では、生物質の組合せに因る最も「明確」な色変化が得られる必要光学厚膜の選択が速やかにできる。
【０２５１】
実施例４：ＴｉＯ 光学被膜の作成
すべての測定法は、使用物質の容量が基本となっている。有機チタン酸塩はデュポン社から入手でき、その製品名はタイザー（Ｔｙｚｏｒ）ＴＰＥ（テトライソプロピルチタネート）であるが、その代わりにテトラｎブチルチタネートを使うこともできる。１ｍｌのＴＰＴと、３ｍｌの氷酢酸と、３ｍｌのアルコールと３ｍｌの脱イオン水と、１０μｌの３ＭのＦＣ１７１フルオロサーファクタントとを混合した。本出願例では、イソプロパノール、ｔ−アミル、アルコール、エタノール、あるいはアセトンを水と共に使用してもかまわない。エタノールはチタンの沈澱の原因となるため、避けたほうがよい。
【０２５２】
３００〜５００マイクロリッタの混合液を、静電スピン被膜作成法により形成した均一フィルムと光学基板に加えた。フィルムの厚さは、４９５±１５オングストロームとする。そして基板を２５０℃で２時間のあいだ加熱するか、あるいは４００ワットで２分間マイクロウェーブ熱処理することで、そのフィルムを硬化させた。本実施例では、光学基板として、単結晶体シリコンウェファを使用した。そのため、許容温度限度値も使用される光学基板の種類によって異なる。プラスチックの場合、２５０℃硬化処理に耐えられないが、ガラスでは耐えられる。ここで選択された硬化条件においては、本出願例にて適切とされる屈折率が２．０（±３％）のフィルムが作成される。
【０２５３】
光学基板は清浄な状態、つまり不要な微粒子の無い状態でなければならず、被膜溶液内に微粒子が存在しないよう注意する必要がある。スピン被膜作成法を実施する場合、微粒子がフィルムの被膜不良を起こすためである。
【０２５４】
実施例５：装着層の生成
ここで説明する装着層材料の名称の定義は、以下のとおりである。
１．ＰＥＩ−（トリメトオキシリプロピル）ポリエチレンイミン。
２．ＰＥＩ／ＤＭＤＣＳ−ＰＥＩ＋ジメチルジクロシラン。
３．ポリスチレン４．ＭＳＡ−スターバースト、第５世代。
５．Ｔポリマー・アミノアルキルＴ構造ブランチ点ポリジメチルシロキサン。
６．ＴＣ７Ａ−フィルム形成ラテックス。
７．ＤＭＤＰＳ−ジメチルジフェニルシロキサン共重合体。
８．Ｍｅｒｃａｐｔｏ−メルカプトプロピルメチルジメチルシロキサン。
９．ＢＡＳ−Ｎ−（２−アミノエチル−３−アミノプロピル）−トリメトオキシシラン。
１０．ＰＢＤ−トリメトオキシシリル調製ポリブタジエン。
１１．ＰＡＰＤＳ−（メチルフェニル）メチルドデシル−メチルアミノプロピル−メチルシロキサン。
【０２５５】
これら化学物質を、以下の装着層を形成するため使用した。
１．ＰＥＩ（ペトラルカ、ペンシルバニア州ブリストル）
備蓄シランの１：５００の希釈液をメタノールで生成した。３００マイクロリッタのこの溶液を、１００ｍｍの処女使用シリコンウェファ上にマイクロパペットで点滴した。この場合、自動のエアロゾル装置やスプレー装置を使ってもよいけれども、ウェファがフォトレジストスピン被膜装置上を７、０００ｒｐｍで回転しているので、マイクロパペットを使用すべきである。スピン被膜装置は、多数の基板を迅速かつ簡単に自動加工処理することが可能である。ここでは、前記の装着層を作成するためにスピン被膜装置を使っているが、本発明においては、それに限定されるものではない。その他の溶解沈着や真空沈着などの方法が利用できるのも、当業者にとっては明白であろう。ＰＥＩ被膜基板は、１００℃で０．１ｍｍＨｇ条件にて６０分で硬化した。周知の楕円偏光測定法で測定する最終装着層は、８０オングストロームが好ましいが、その他の厚さでも構わない。
【０２５６】
２．ＰＥＩ／ＤＭＤＣＳ；（シグマ化学、ミズリー州セントルイス）
ＰＥＩ被膜基板は、さらにＤＭＤＣＳで加工処理される。これにより、線状ＰＥＩ鎖にそったブランチ点が生成され、Ｔポリマー被膜面の働きをもつ試験表面が形成できる。２％のＤＭＤＣＳの１００ミリリッタ溶液を、１、１、１−トリクロロエタン（ｖ／ｖ）に作成した。ＰＥＩ被膜基板を、２５℃のＤＭＤＣＳ被膜溶液に６０分のあいだ浸漬した。浸漬後、前記基板をＤＭＤＣＳ被膜溶液から取出し、９５％のエタノールで洗浄して、窒素噴流で乾燥させた。周知の楕円偏光測定法で測定する最終装着層は、２００オングストロームの厚さが望ましいが他の厚さでもかまわない。
【０２５７】
３．ポリスチレン（ベクトン ディッキンソン、カリフォルニア州オックスフォード）
約０．０５グラムのポリスチレンを、２ミリリッタのトルエンで溶解した。その溶液を、前記スピン被膜技術にて処理した。基板は、その使用前に２５℃で６０分のあいだ硬化処理を行なった。最終装着層は、２００オングストロームの厚さになることが望ましいが、他の厚さでもかまわない。
【０２５８】
４．ＭＳＡ−スターバーストポリマー（ポリサイエンス、ペンシルバニア州ワーリントン）
第５世代スターバースト（０．５％固体）の１：４希釈液をメタノールで生成した。２００ミリリッタのその希釈液を、回転速度３５００ｒｐｍのスピン被膜作成法にて基板に付着させた。この装着層を、２５℃で１２０分間のあいだ硬化処理を行なった。最終装着層は、４０オングストロームの厚さになることが望ましいが他の厚さでもかまわない。
【０２５９】
５．Ｔポリマー（ペトラーチ、ペンシルバニア州ブリストル）
Ｔポリマーの１：３００（ｖ／ｖ）希釈液を２−メチル−２−ブタノールで生成した。装着層は、スピン被膜作成法にて基板に被膜され、さらに使用前に、１４０℃で２４時間のあいだ硬化処理を行なった。最終装着層は、１００〜１６０オングストロームの厚さになることが望ましい。
【０２６０】
６．ＴＣ７Ａ（セラディン、インディアナ州インディアナポリス）
３０％の保存溶液をメタノールの固体０．５％に希釈した。３００マイクロリッタのその溶液を、スピン被膜作成法にて基板に付着させ、さらに使用前に、３７℃で１２０分間のあいだ硬化処理を行なった。この物質の最終的な厚さは２４０オングストロームになることが望ましい。
【０２６１】
７．ＤＭＤＰＳ（ペトラーチ）
シロキサンの１：１００（ｖ／ｖ）保存溶液をトルエンで生成し、スピン被膜作成法にて基板に付着させ、さらに使用前に３７℃で１２０分間のあいだ硬化処理を行なった。最終装着層の厚さは、２００オングストロームになることが望ましい。
【０２６２】
８．メルカプト（ペトラーチ）
シロキサンの１：３００（ｖ／ｖ）保存溶液をトルエンで生成した。被膜、および硬化処理プロトコルは、ＰＥＩで記述したのと同じように実行した。最終装着層の厚さは、２００オングストロームになることが望ましい。
【０２６３】
９．ＢＡＳ（ペトラーチ）
シランの１：１００（ｖ／ｖ）溶液をトルエンで生成した。２００マイクロリッタのこの溶液を、前記のスピン被膜プロトコルにて処理した。さらにウェファを１４０℃の０．１ｍｍＨｇ状況下で２時間のあいだ硬化処理した。最終装着層の厚さは、３０オングストロームになることが望ましい。
【０２６４】
１０．ＰＢＤ（ペトラーチ）
２７．５マイクロリッタの保存シランを、３２７５マイクロリッタのトルエンと混合した。３００マイクロリッタのこの溶液をスピン被膜処理し、さらにウェファを１２０℃で６０分のあいだ硬化処理した。最終装着層の厚さは、１００オングストロームになることが望ましい。
【０２６５】
１１．ＰＡＰＤＳ（ペトラーチ）
シロキサンの１：１００（ｖ／ｖ）の希釈液をトルエンで生成し、２００マイクロリッタのこの溶液をスピン被膜処理し、さらに使用前にウェファを１００℃で１２０分間のあいだ硬化処理した。最終装着層の厚さは、２００オングストロームになることが望ましい。
【０２６６】
前記の濃度、容量、重量、スピン被膜速度、緩衝剤、培養時間、および培養状態、その他すべての試薬や処理方法は、本発明の好適実施例として記述されており、本発明を限定するものではない。
【０２６７】
実施例６：抗原の装着層材の比較
受容材としての抗体の単結晶シリコン基板への装着における装着層材の効率性の分析測定を行った。この方法を使えば、本発明のその他の装置を最適に利用することができる。高濃度な抗体の反応層を作成するのは、厳格な配向条件が必要なせいで受容材の層を作成するより難しいことが判明している。装着層の評価を行えるのが、ＥＬＩＳＡ法である。単クローン性抗西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）を試験受容材として装着層に添付して、その試験表面に異なったレベル値の西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）を載置して標準曲線を作成した。同様条件にて微細滴定孔に制御剤としての抗体被膜処理を施した。
【０２６８】
全試験表面を、２０μｇ／ｍｌの単クローン性抗ＨＲＰ（シグマ化学、ミズリー州セントルイス）を含む７．４ｐＨの０．０５ＭのＰＢＳ溶液で２５℃で１６時間のあいだ抗体被膜処理した。前記の被膜処理基板は、その被膜溶液に浸漬させた。その過酸化酵素（シグマ化学、ミズリー州セントルイス）の濃縮分を、３７℃で３０分のあいだ試験表面つまり微細滴定孔と反応させてから、脱イオン水で洗浄して不要な過酸化酵素を除去した。そして試験表面上の各点からの流体物を、停止試薬を有する被膜されてない微細滴定孔に移して、４５０ｎｍにおける光学濃度値を記録した。停止試薬を、比較基板の微細滴定孔に直接添加して、同様に測定値を読み取った。
【０２６９】
本実験例の結果は、表４に示されているとおりである。それには、試験表面のダイナミックレンジと感度（負制御値に対する低濃度の分解能）が評価されている。制御処理を行うため、各装着層をウサギのＩｇＧで被膜して、過酸化酵素法にて検査した。その結果、ウサギのＩｇＧで被膜した装着層では、過酸化酵素の著しい相互作用は観察されなかった。同じ条件で未処理シリコン基板も試験したが、試験表面に付着した活性受容剤はわずかなものであった。（前記データは、４５０ｎｍでの光学濃度測定に基づくものである。）
【０２７０】
【表４】
Figure 0004060053
【０２７１】
本実験例では、基板をＰＥＩまたはＢＡＳで処理する作用における、薄膜基板上の装着層のシロキサンの有効性が示されている。同様に、各シロキサンの利用においての多様性があるため、シロキサンの作用基は受容材の反応特性に影響することが判る。また、分子自己結合ポリマーも、ＢＡＳに対する装着層としての作用機能の増加を示しているが、シロキサン材ほど有効ではない。ＴＣ７Ａ表面活性剤はこの測定方法ではあまり作用してないが、以下の実験例では有効性が見られる。
【０２７２】
実施例７：抗体の装着層材の比較本分析実験では、異なった装着層を、７．４ｐＨの０．０５ＭのＰＢＳのウサギのＩｇＧ（シグマ化学、ミズリー州セントルイス）の２０μｇ／ｍｌ溶液に２５℃で１６時間のあいだ浸漬して被膜処理した。また、ヤギ用抗（全分子）ウサギＩｇＧ抗体というラベルの付いた異なったレベル値のＨＲＰ（シグマ化学、ミズリー州セントルイス）にて、３７℃で１５分のあいだ試験表面を培養した。それから、脱イオン水で洗浄して不要物を除去した。試験表面にＴＭＢ基板溶液を塗布して、２５℃で２分のあいだ反応させてから、溶液を停止剤を有する被膜のない微細滴定孔に移した。（この実験での光学濃度値は、４５０ｍｍで測定されている。）その結果は、表５に示したとおりである。
【０２７３】
【表５】
Figure 0004060053
【０２７４】
この実験例では、抗体補足の検知における装置の有効性が、様々な試験表面を使って確認されている。ここでは、シロキサン装着層と分子自己結合装着層のどちらもが同様に作用結果が良かった。装着層の被膜のない基板では、受容剤の有効作用つまり反応がわずかしかなく、装着層の必要性が判明した。
【０２７５】
実施例８：比較方法の形式ＤＮＰは、小さな分子体であって、治療用薬品、有害薬品、殺虫薬残留物、有機残留物などのような分子範囲における特異なものではない。そのような小さな分子体を測定するために、比較形式測定法が使われている。
【０２７６】
本実験例では、ＤＮＰの濃度の定量測定とその結果を説明している。まず試験表面を、ハプテン、または、ハプテンと結合した担体にて被膜処理した。ハプテンは、適当な化学薬品が入手可能なら直接に試験表面に固定するか、あるいは、受動的に表面に添付するか、いずれでもかまわない。同じことが、ハプテン／担体を利用した場合もいえる。
【０２７７】
試験サンプルを、その中の自由ハプテンとだけでなく固定ハプテンとも反応するような物質と混合した。最も普通に使われる物質のひとつに、ハプテン特有抗体がある。抗体の代わりに、高比結合試薬を使ってもよい。そのような試薬の補足作用は、元の試験サンプル内の自由ハプテンの濃度に反比例する。本実験例は定量または定性の分析結果を作成することを目的としている。
【０２７８】
下記のような材料と試薬とを準備した。
１．直径が４インチで、ｎ＝４．０２、処女試験品質、片側研磨、１−０−０結晶配向の単結晶シリコンウェファを、屈折率が２．０（±０．０５）で最終厚さが５５０オングストローム（±１０）の一酸化シリコンにて被膜処理した。この材料から作成された薄膜の干渉色層は金色であった。ウェファへの一酸化シリコンの被膜は、従来の化学蒸着法にて行った。
２．ウェファを、実施例１に記述してあるビスアミノシレン蒸着処理にて活性化させた。
３．そのアミン誘導処理試験表面を、ファルコン製１００ｍｍ組織培養皿内の、人体血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合した５ｍｇ／ｍｌのＤＮＰ（ＤＮＰ−ＨＳＡ）と７．２ｐＨの燐酸塩緩衝サリン（ＰＢＳ）とを含む３０ｍｌ溶液内に置いた。そして、試験表面上に４０オングストロームのＤＮＰ−ＨＳＡが装着するまで、湿度９８％で３７℃（±２）の温度でウェファを被膜処理した。作成層の厚さの測定には、ガートナー製の楕円偏光測定器を使用した。ウェファの被膜処理溶液を除去して、脱イオン水で洗浄して、窒素噴流にて乾燥させた。
４．ヤギ用抗ＤＮＰをＰＢＳと混合して、１．２ｍｇ／ｍｌの濃度にしてから、ＤＮＰを水に溶かした。そして抗体とＤＮＰとを、１：１の割合で混合した。続いて、その混合物の２０μｌを被膜表面に塗布して、１０分のあいだ室温で培養した。脱イオン水で不要物を試験表面から洗浄除去して、窒素噴流で乾燥した。スライド部を目視検査してから、サガックス製の比較楕円偏光測定器の改良型を使って光量を変化させて、試験表面の質量変化を測定した（図１５参照）。その読取用プロトコルは、実施例２１に記述されている。目視検査の結果、試験物を基準曲線と比較した場合の濃度の半定量値の測定評価が得られた。その結果は、表６に記載してある。
【０２７９】
【表６】
Figure 0004060053
【０２８０】
実施例９：微細分子の検知
所定波長における屈折率が４．０２の４インチ単結晶シリコンのウェファを、オキシ窒化シリコンで被膜処理した。このオキシ窒化シリコン層の屈折率は、約５４０オングストロームの厚さにおいて１．９８であった。
【０２８１】
次にウェファを、フォトレジスト効果を作成できる従来のウェファスピン被膜技法を使い、５０±２オングストロームていどのポリエチレンイニミン（ペトラッチシステム、ペンシルバニア州ブリストル）を添加して化学的活性化させた。そして、２時間±０．１のあいだ１４℃の炉内で、ウェファを硬化させた。
【０２８２】
少量の分析剤、トリニトロベンセン・スルフォン酸（ＴＮＢＳ）、の未使用の１％溶液を脱イオン水内に用意した。そして、２５μｌの脱イオン水（制御用）と同量のＴＮＢＳ溶液とをアミン被膜ウェファの試験表面上に載置した。それらを、５秒間だけ試験表面と反応させてから水で清浄して、圧縮空気で乾燥した。多色光を照射した目視検査の結果、ＴＮＢＳを接触する区域は赤紫色であった。
【０２８３】
ＴＮＢＳ結合に因る試験表面上での厚さ変化は、ほぼ２０オングストロームであった。これは、ＴＮＢＳ結合の区域内における可視認識可能な色変化を発生させるには、十分な量である。
【０２８４】
実施例10：酵素検知４インチの単結晶シリコンウェファに、５２５オングストローム±３％の窒化物のＡＲ被膜（屈折率１．９７±０．０５）を作成した。
【０２８５】
深金色のウェファを、１００±２オングストロームていどのアミノアルキル（ｔ構造）ポリシロキサン（ペトラッチシステム、ペンシルバニア州ブリストル）にて被膜処理した。そして金色のウェファを、１４０℃で２時間のあいだ硬化させると、ウェファにはうすい紫色が表れた。
【０２８６】
シロキサン被膜ウェファを、酸溶解コラーゲンを含む燐酸塩緩衝液内に載置した。そのコラーゲン溶液は、以下の方法で調整されたものである。まず、子牛の皮からの酸溶解性Ｉ型コラーゲン（シグマ化学、ミズリー州セントルイス）を、５ｍｇ／ｍｌの濃度でｐＨ４に調整された１モル酢酸に溶かした。そして、２０μｇ／ｍｌの酸溶解コラーゲンを含んだｐＨ６．８の０．１モル燐酸塩緩衝サリンを生成した。この溶液を使って、ウェファを室温で２時間のあいだ被膜処理した。この溶液３０ｍｌをファルコン製組織培養皿に入れて、ウェファをそれに浸漬した。その後、ウェファを水で洗浄して圧縮空気で乾燥した。ウェファの色は暗い紫緑色であった。次に、コラーゲン被膜ウェファを評価測定するために、５０ｍＭのカルシウムイオンを含むｐＨ７．２の０．１モルＴｒｉｓ−Ｈｃｌ緩衝剤中のコラーゲン酵素溶液（ボーリンジャー−マンヘイム）を１ｍｌにつき０〜１作用単位分作成した。１単位とは、２５℃においてＦＡＬＧＰＡを毎分１μモルだけ加水分解できる酵素量に等しい。本実験例では、酵素によりウェファ上のコラーゲンが劣化され、膜厚が減少した。膜厚の減少は、本発明で説明する他の実施例に対抗するものであって、その結果として色変化が起こった。
【０２８７】
１ｍｌにつき０．５単位の濃度のコラーゲン酵素を２５μｌだけ投与して、５分間コラーゲン被膜ウェファと反応させた。その後、ウェファを脱イオン水で洗浄して圧縮空気で乾燥した。可視検査の結果、酵素の接触する区域は金色に変化したが、その周囲は暗い赤紫色のままであった。その検査結果は、表７に図示されている。
【０２８８】
【表７】
Figure 0004060053
【０２８９】
実施例11：装着層の評価
シリコン基板は、ラップ処理などの当業者には周知の作成方法により単結晶シリコンのインゴットからウェファをダイアモンド刃で切り出して作成した。切り出したウェファに、研磨材によるラップ処理、均一平坦表面作成のための酸またはその他腐食溶液を使ったエッチング処理、および、さらに微細表面粗さ仕上げのためのラップ処理を施した。この実験例では、平均が１５ミクロンであるような１２〜２１ミクロンの酸化アルミニウムの粉末の研磨剤を使って、拡散性反射表面を作成した。また、この実験例では、上記の方法で作成された基板上に、５５０オングストロームの厚さの窒化シリコンの被膜を形成した。前記の材料の組合せは自由であって、本発明におけるＡＲ材の厚さを変更しても構わない。そして試験表面に、実施例５に記述されているように複数の装着層を形成させた。
【０２９０】
前記の試験表面を、ｐＨ６．５の０．１ＭのＨＥＰＥＳ内のウサギＡ型抗連鎖球菌体（ストレップＡ）の抗体の２０μｇ／ｍｌ溶液にて２５℃で６０分のあいだ被膜処理した。そして、試験表面を、ラテックス質量増加試薬（実施例１４参照）と同じストレップＡ抗原を含む、あるいは、含まない１０マイクロリッタの制御溶液に入れて、室温で２分のあいだ培養させて反応をみた。試験表面を脱イオン水で洗浄してから、窒素噴流で乾燥させた。
【０２９１】
１部の２ＭのＮａＮＯ の１部の２Ｍの酢酸を混ぜて、０．６６ＮのＮａＯＨで中性化して陰性制御剤を作成した。陽性制御剤は、市販されている培養ストレップＡ細胞から抽出された抗原の緩衝調整剤を使い、使用前に抽出媒体液で希釈した。試験表面に添付する前に、サンプルを２次ラテックス試薬と１：２の割合で混合した。その結果は表８に記載されており、陰性制御剤上で可視化可能な陽性制御剤の高度希釈液としての特徴が見られる。
【０２９２】
【表８】
Figure 0004060053
【０２９３】
本実験例では、結果が拡散反射基板上の可視信号として示される抗原捕捉方法における装着層の有効性が判明した。ＢＡＳやＰＥＩの場合、作用上の受容材結合はあまり見られなかった。個々のシロキサンでは、受容材に付着する様々な能力を示した。最高反応結果を示したのは、Ｔポリマーシロキサンであった。分子自己結合装着層とＴＣ７Ａの表面活性剤のどちらも、やはり本方法の実験例装置においての有効性をもっている。
【０２９４】
実施例12：器材利用
この実験例での単結晶シリコン基板は、研磨表面をもつウェファである。装着層を実験例５と同じように処理してから、実験例１１のように、抗体を付着させた。この評価測定も、実験例１１と同じである。使用した陽性制御剤は、Ａストレップ抗原の希釈液を含んでいる。乾燥させた後、反応試験表面をサガックス製の比較楕円偏光測定器で調べて、反射光の強度を光学分析量をミリボルト単位の数値で記録した。（表９参照）。
【０２９５】
【表９】
Figure 0004060053
【０２９６】
試験した装着層はすべて、ＰＥＩ、ＭＳＡ、Ｔポリマーにての実験例法の有効性を示し、最良結果を生み出した。
【０２９７】
実験例13：コラゲナーゼ活動
実験例５のような方法でＴＣ７Ａ試験表面を作成して、単結晶シリコンウェファを直接被膜処理した。その試験表面を、４．９μｇ／ｍｌの１型人体コラーゲンを含むｐＨ９．０の０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（シグマ化学、ミズリー州セントルイス）内に浸漬した。試験表面は、２５℃で６０分のあいだ被膜処理させた。そして、脱イオン水で表面を洗浄して、使用前に窒素噴流で乾燥した。その結果、不動化コラーゲンの１４３オングストローム層が作成された。０．００５ＭのＣａＣｌとｐＨ７．６の０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌとを含んだ緩衝剤で、コラゲナーゼ（ボーリンジャー・マンヘイム、インディアナ州インディアナポリス）の異なった割合の希釈液を調整した。コラゲナーゼの希釈液を５マイクロリッタ、それぞれ試験表面に点適して室温で５分のあいだ培養させた。反応試験表面を脱イオン水で洗浄して、窒素噴流で乾燥した。その反応試験表面をサガックス製の比較楕円偏光測定器で調べて、反射光の強度を記録した。本実験例では、受容材の層がコラゲナーゼにて劣化され、コラゲナーゼの活動や濃度を増加させるような作用を示す陰性信号である孔が受容材に形成された。コラゲナーゼの活動は、１０ ／ｍｌの単位で記録されている。活動測定の光強度の単位はミリボルトである。（表１０参照）
【０２９８】
【表１０】
Figure 0004060053
【０２９９】
本実験例では、酵素活動を検知できる試験表面の作成例が示されている。この場合、その活動状況は低下しているが、合成的活動の観点からの酵素活動を測定できる構成の存在が確認できる。この実験例では、ＴＣ７Ａ装着層におけるＴポリマーシロキサンに対する受容材の受容度合は、３倍ほど増加していることが判る（ただし、結果は図示されていない）。
【０３００】
実施例14：質量強大
本実験例では、質量ラベル付け抗体の使用と質量作成試薬の選定について説明している。本発明の他の構成においての最適質量ラベル決定の際にも、前記の選択方法利用できる。
【０３０１】
そのような表面活性剤粒子は、インディアナ州カルメルのバング研究所の、アミド粒子、ロット番号Ｌ９１０１０８（ＳＡ−０１５／７５８）やロット番号９０１０１５Ｊ（Ｂ７−０１５ＦＦ１８１）、カルボキシル酸塩粒子、ロット番号９００４１０８（Ｂ７−０１５ＦＦ／７８７）などが入手できる。その他、インディアナ州インディアナポリスのセラディン社のＴＣ３、ＴＣ３Ｘ、ＴＣ７、ＴＣ７Ｘのフィルム形成粒子も同様に適用できる。それらＴＣ型の薬剤はすべて、スチレン−ブタジエン−コポリマーを含むカルボキシル酸である。これら薬剤のうちＴＣ７だけを、特に詳しく調べた。ＴＣ３は、タンパク色フィルムを形成するので使用しなかった。検査したセラディン社の粒子材は、ＴＣ−７Ａ、製品番号ＣＭＬ、ロット番号ＩＫ３０、ＴＣ−７Ｘ、ロット番号１Ｍ９２、ＴＣ−７、ロット番号１Ｖ１８（Ｆ０４０６９０）、ＴＣ−３Ｘ、ロット番号１Ｒ３５、ＴＣ−３、ロット番号１Ｊ４４である。表面活性剤処理の結果、カルボキシル酸塩とアミドの両方の粒子が存在するため、化学的不動状態がよりフレキシブルになった。米国特許第４、４２１、８９６号に記載されているように、アミノ粒子は簡単にヒドラジド粒子に変換できる。
【０３０２】
この実験例では、単結晶シリコンの処女試験ウェファを直接に使用した。それらウェファには、スピン被膜装置を使って保存シロキサンの２メチル２ブタノールでの１：３００（ｖ／ｖ）希釈液３００マイクロリッタを添加して、Ｔポリマーシロキサン（ペトラーチ・システム、ペンシルバニア州ブリストル、カタログ番号ＰＳ４０１）の被膜処理をした。そしてＴポリマーを、１２０℃で１２０分のあいだ熱処理して硬化させて、ウェファ試験表面を形成した。活性化させた基板を、ｐＨ６．０の０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液内の、Ａ型連鎖球菌に対するウサギポリクローン性抗体が２０マイクログラム／ｍｌ含まれた溶液に浸漬した。そして、そのウェファを２５℃で６０分のあいだ前記抗体溶液に浸した後、脱イオン水で洗浄して窒素噴流で乾燥させた。サガックス製の比較楕円偏光測定器にて反応ウェファを検査したら、層厚つまり光学濃度の変化が確認された。
【０３０３】
前記のさまざまな被膜をもつフィルム形成粒子材の検査結果が、表１１に示されている。表１１では、抗体濃縮、粒子濃縮、必要に応じたブロック剤の添加を説明している。フィルム形成粒子を被膜処理するのに使われた抗体は、楕円偏光測定ウェファ上の受容材に使われたものと同じである。粒子材表面への抗体の被膜処理は、２５℃で１６時間のあいだ混合物を培養することにより行った。ＴＣ７材を、保存溶液の希釈液として準備し、水に対して透析して、抗体との反応作用前に混合ベッドレジンで処理した。
【０３０４】
【表１１−１】
Figure 0004060053
【表１１−２】
Figure 0004060053
【表１１−３】
Figure 0004060053
【０３０５】
最終濃度１％（w/v）のカルボジイミド（１-シクロヘキシル-３-（２-モルホリノエチルカルボジイミドメト-p-トルエンスルホネート；Aldrich Chemical, Co., Milwaukee, WI, カタログ No.Ｃ１０、６４０-２、ロット No.０９９１５ＰＷ）を加えることにより、抗体の共有結合形付加をカルボキシレート粒子に関して検討した。抗体を添加する前にカルボジイミドを加えた。抗体を加える直前にヒドラジド処理したアミド粒子を最終濃度０.０５％のグルタルアルデヒドで処理して、粒子表面への抗体の共有結合形付加を導くこともできる。特に記載がない限り、pH７.２の０.０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水中において粒子を抗体で被覆した。
【０３０６】
陽性対照の作製のために使用したストレプＡ抗体試料は市販のものであった。この抗体を２Ｍ NaNO2、２Ｍ酢酸、０.６６Ｎ NaOHの１：１：１混合物中で１：６００の希釈レベルまで希釈した。同じ試料の抗体を含まないものを陰性対照として用いた。増幅試薬を表１１に示したような様々な比率で陽性および陰性対照と混合し、５μlを抗体被覆したオブラートの表面に塗布した。サンプルを２５℃で２分間インキュベートして洗浄し、その後窒素流下で乾燥させた。反応させたオブラートを修正Sagax Ellipsometerで検査し、その厚さをミリボルトで測定した強度の変化として記録した。
【０３０７】
これらのデータは、増幅試薬中の極めて高い粒子密度はその試薬と被検表面との非特異的結合を導くことを示している。補助たんぱくあるいは界面活性剤を加えても抗体被覆した粒子の成績は改善されない。表面活性剤よりもわずかに硬性であるＴＣ-７粒子も同様にこの特定適用に関して作用しないが、他のいくつかのラテックス製剤に比べると、ＴＣ-７粒子は有意の反応性を示す。温度上昇は粒子への抗体の取り込みのレベルを改善する、従って遊離抗体のレベルを低下させると思われる。これらの粒子から遊離抗体は取り除かれなかったが、限外濾過のような技法によって非結合抗体を除去することは有用であると考えられる。アミド粒子も良好に作用するが、ヒドラジド誘導アミド粒子は最良の全体的反応性を与えると思われる。表面活性剤であるカルボキシレート粒子はアミド粒子ほどには働かない。
【０３０８】
実施例15：ラテックス
この試験では、増幅フィルム形成粒子を実施例１４におけると同様にして調製し、実施例１４と同様にして検定を行なった。使用した基質は、１２〜２０ミクロン（平均粒子サイズ１５ミクロン）の酸化アルミニウム粒子で被覆して、半導体産業の当業者には周知の工程を用いて粗構造の表面を創造した、半結晶性珪素オブラートであった。この基質を窒化珪素の薄膜で被覆した。３５０〜５５０Åの窒化珪素フィルムはこの適用のための標準品であるが、どのような厚さのフィルムも使用可能である。光学的スライドガラスのＴポリマー処理は実施例５および１４の中で述べた。
【０３０９】
結果を表１２に示す。視覚的結果は楕円体測定システムで行なった観察とは異なっている。非常に高い粒子密度は明らかな陰性結果をもたらすが、強い陽性の視覚的シグナルは生じない。粒子に取り込まれたより高濃度の抗体は、機器を用いた検定で認められるように、より低レベルの抗体よりも強いシグナルを生じる。この試験は、粒子の抗体被覆が不十分であると、ラテックス粒子と被検表面との非特異的結合が生じることを示唆している。ひとたび抗体被覆が十分になると、しかしながら、陽性および陰性の結果は容易に検出可能且つ識別可能となる。
【０３１０】
【表１２】
Figure 0004060053
【０３１１】
実施例16：酵素増幅
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Sigma グレードVI）を、髄膜炎菌Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ135の培養物からの細胞懸濁液をあらかじめ注射しておいたウサギの貯留高力価血清からのカプリル酸沈降反応によって精製した免疫グロブリンに化学的に結合した。結合は、試薬Ｓ-アセチルチオ酢酸Ｎ-ヒドロキシスクシニミドを使用し、Analytical Bio-chemistry１３２（１９８３）６８−７３に述べられている方法に従って行なった。結果として生じた複合体は、ＭＯＰＳ緩衝液、５０mM、pH ７.０中でペルオキシダーゼ（１０４μM）と免疫グロブリン（３５μM）を含んでいた。ペルオキシダーゼ‐免疫グロブリン複合体をカゼイン（５mg/ml）と共にＭＯＰＳ緩衝液中で希釈し、等量の髄膜炎菌培養物からの細胞不含濾液の希釈溶液と混合した。
【０３１２】
該混合物（２５μl）を、窒化珪素、Ｔポリマーシロキサンおよび同じ髄膜炎菌に対するウサギ抗体試料からの精製免疫グロブリンの層で被覆した珪素オブラートの表面にピペットで滴下した。抗体を、５０mM ＭＯＰＳ、pH ７.０中１０μg/mlの抗体を含む溶液から、Ｔポリマー／珪素オブラートに被覆した。オブラートを室温で１時間抗体中に放置し、脱イオン水で洗浄して、窒素流下で乾燥させた。抗体被覆した基質を、室温で１時間、５０mM ＭＯＰＳ、pH ７.０中０.５mg/mlの加水分解したカゼインと共にインキュベートし、その後洗浄して乾燥させた。
【０３１３】
サンプルを１：１の割合で複合体と混合した。１０μlを被検表面に塗布した。２分後、サンプルを水で洗い流し、オブラートを窒素流下で乾燥させるか、もしくは濾過装置で吸い取った。ＴＭブルー沈降基質（ＴＭブルーは市販の製品で、Transgenic Sciences,Inc.の商標であり、米国特許５,０１３,６４６に開示されている）をオブラートの同じ部分に適用し、５分間そのまま放置した。オブラートを洗浄し、乾燥させた。反応が起こった部分では紫色の斑点が見えた。その後、この生じた沈殿物を肉眼と偏光解析装置で読取り、髄膜炎菌の存在を確認した。抗体の１：２０,０００の希釈溶液は肉眼で陰性の結果から明瞭に解像される（表１３参照）。
【０３１４】
【表１３】
Figure 0004060053
【０３１５】
上記の検定に基づき試験キットが作製できる。このキットは５０回までの光学的迅速免疫測定法を実施するために必要なすべての成分を含んでいる。キットは、必要とされる適切な洗浄と乾燥のステップを容易にするようにデザインされた固体支持試験拠点を特徴とする。対象とする複合分析物に特異的な１〜５（またはそれ以上）の非反応性試験表面を含むスライドガラスを試験拠点上に置く。最初の反応が終了すると、スライドは操作者から離れて前方に傾く。試験表面は洗浄液で力強く洗浄され、その洗浄液は傾いた表面から下の貯水槽内に流れ込む。（貯水槽は殺菌剤で処理された酢酸セルロースの固体吸収塊を含む）。スライドはその後水平位置に戻り、１枚の吸取り紙が試験表面上に直接置かれる。数秒間の接触時間によって十分な吸取りが可能になる。吸取り紙は、試験キットの前面に便利に位置する個々の切り離し紙のパッドとして供給されるが、洗浄／乾燥工程は毛細管作用のようなその他の手段によって実現することもできる。さらに、酵素標識物質、すなわち対象とする分析物（抗原など）に特異的な酵素標識抗体が、適切に緩衝され、希釈されて供給される。最後に、市販のＴＭブルー液の容器のような沈降手段が、１〜３滴またはそれ以上が１滴づつ滴下されて酵素的にもたらされる質量変化を引き起こし、洗浄前に沈降反応を生じさせることができるように、都合のよい容量で供給される。該表面に基質を添加することにより第２のインキュベーションが開始され、洗浄／乾燥工程が繰り返されて試験が完了する。
【０３１６】
２つの異なるタイプの珪素オブラートを使用した；１つは金色の窒化珪素で被覆したオブラートであり、もう１つは窒化物被覆なしの銀色の珪素オブラートであった。１つの可能性は、窒化珪素上のペルオキシダーゼ／沈降基質系に関して認められた可視色が、厳密に表面上に沈殿した染料の吸光度によるものであるということである。この場合に相当し、且つ沈殿した染料が薄層として働かなければ、銀色の珪素オブラートはＴＭブルーのみの深青色の視覚的シグナルを生じさせることになる。
【０３１７】
Ｔポリマー被覆したオブラートを５つの別個の試験のために抗体で処理した：髄膜炎菌Ａ，Ｃ，Ｙ，Ｗ135；髄膜炎菌Ｂ；連鎖球菌Ｂ；インフルエンザ菌Ｂ；肺炎連鎖球菌。各々の試験のために作製した最初の試薬は、先に述べたように付着層（Ｔポリマーシロキサン）で被覆した金色と銀色のオブラートであった。オブラートを適切な溶液中に室温で１時間液浸して、５個の抗体全部を５０mMＭＯＰＳ、pH ７.０中１０μg/mlの抗体濃度でこれらのタイプのオブラートに被覆した。実施例１に述べたようにしてオブラートを洗浄し、乾燥させ、ブロックした。
【０３１８】
必要な第二の試薬は、上に述べた方法を用いて抗体‐ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合物を作製するため、同じ５個の抗体試料を使用した。複合体の原液試料を用いて、５mg/mlのカゼインを含む５０mM ＭＯＰＳ，pH ７.０中で最終的な複合体比率１：１００に希釈することにより作業用複合体を作製した。作業用複合体溶液を標準抗原試料と１：１の割合で混合し、２０μlサンプルを適当な抗体被覆オブラートに塗布した。
【０３１９】
２分間のインキュベーション、次いで洗浄と乾燥、その後オブラート表面上に産物を形成させるために５分間の基質インキュベーションを用いて迅速なプロトコールを実施した。洗浄と吸取り乾燥後、サンプルを裸眼と偏光解析装置で読み取った。肉眼で著明に見える紫色の斑点が金色の窒化珪素被覆したオブラート上に発現し、窒化物被覆していない銀色の珪素オブラートで灰色の斑点を認めた。窒化珪素被覆した表面上では、非常に強い陽性が白色の干渉色を生じさせた。厚さの上昇は偏光解析装置を用いて直ちに測定することができた。すべての場合に銀色オブラート上に発現した可視色は、沈殿した産物が真の薄膜として働き、ＡＲ被覆なしでも干渉効果を生じさせることを示している。発現する色は染料の吸光度特性には依存しない。
【０３２０】
色素原が認められる可視反応の産生に寄与しないことのさらなる証拠が次の実験によって得られた。ＴＭＢ／Ｈ2Ｏ2産物を反応停止試薬、Ｈ2ＳＯ4で処理すると黄色の沈殿物が生じる。ここで検討している光学的支持体に関して観察される可視反応が単に色素原のみによるものであれば、表面の沈殿物を反応停止試薬で処理すれば黄色の斑点が生じるはずである。固定化した表面沈殿物を硫酸で処理しても、窒化珪素被覆したオブラート上に生じる強い紫色あるいは青色の斑点には変化を及ぼさない。従って、生じるシグナルは全面的に薄膜の形成に依存する。窒化珪素の表面から沈殿物を取り除く接着剤の細片を用いて追加的な確認が得られた。接着剤で除去した沈殿物は、赤色成分を含まない微灰色／青色であった。認められる干渉効果は、強い赤色成分を伴う明紫色／青色を呈する。このことは、薄膜形成が認められる呈色作用産生の原因であることを裏付けている。
【０３２１】
表１４は、細菌抗原検定の全範囲について、質量増大検定と Wellcome Diagnostics が製造しているラテックス凝集検定との比較から得られた結果を示している。
【０３２２】
【表１４】
Figure 0004060053
注：１）ＯＩＡについては、希釈溶液は可視の陽性結果を生じる最終的希釈溶液である。
２）ここに示す細胞上清液は、０.５％ホルマリンの生理食塩水中で作製した濃い細胞懸濁液を＋４℃で１晩放置した後取り出した上清液である。これは高い含量の多糖類を含み、従ってかなりの希釈を必要とする。
３）ラテックス試験は、使用期限の来ていない市販の製品に関して実施した。
【０３２３】
表１５ａと１５ｂに示した結果は、触媒性質量増大法と酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）との比較である。データは、ＴＭＢを基質として使用し、髄膜炎菌Ａ，Ｃ，Ｙ，Ｗ135に関してＥＬＩＳＡに比べ酵素増幅検定法の高い効率を示している。ＥＬＩＳＡの試験表面と光学試験表面の作製を以下に述べる。
【０３２４】
これらの技法には２つの大きな違いがある。まず第一に、本発明の方法が抗体の固相吸着のために研磨した珪素オブラートを使用するのに対し、ＥＬＩＳＡは透明なポリスチレンのマイクロタイタープレートを用いる。第二に、そしてより重要な相違として、この触媒法の場合には、反応を発現させるために使用する基質は研磨珪素オブラートの表面上に沈着する不溶性産物を生じるが、ＥＬＩＳＡの基質はマイクロタイタープレートのウエル中に着色した溶液を生じる。この触媒法によって得られる結果の感受性がより高いのは、この重要な相違のためである。ＥＬＩＳＡが色素原から生じる可視色に依存するのに対し、本発明の装置は装置上に沈着する色素原の薄層にのみ依存する。
【０３２５】
詳しく述べると、一方の表面は研磨した珪素オブラート（ＯＩＡ）であり、他方の表面は透明ポリスチレンのマイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡ）である。両方の表面に１０μg/mlの抗体溶液を室温で１時間適用し、脱イオン化水で洗浄して、０.５mg/mlのカゼイン阻止溶液を室温で１０分間適用し、最後に脱イオン化水で洗浄する。
【０３２６】
検定において、抗原の希釈は次の通りであった：１：５,０００；１：１０,０００；１：２０,０００；１：４０,０００；１：８０,０００；１：１６０,０００；また複合体溶液は、５mg/mlのカゼインと５０mM ＭＯＰＳＯ、pH ７.０を含むＨＲＰ標識抗体の１：１００希釈溶液であった。使用の直前に各々の抗原希釈溶液を複合体溶液と１：１の割合で混合し、各表面に適用した。これを室温で２分間反応させ、次に各表面を脱イオン化水で洗浄した。その後各表面に基質を添加した。珪素オブラートにＴＭブルー、ＥＬＩＳＡプレートにＴＭＢを添加した。これを室温で５分間反応させた。この時点で反応を終了させ、珪素オブラートを脱イオン化水で洗浄し、窒素で乾燥させた。ＥＬＩＳＡはＨ2ＳＯ4で停止させた。視覚的読取りを行なって、陰性と識別しうる最小抗原希釈を判定し、表面上に沈着した不溶性産物を含む試験表面を偏光解析装置に入れてそれぞれの電圧量を測定した。１：１０,０００〜１：２０,０００の希釈までしか読取れなかったＥＬＩＳＡ（停止せず）に比べ、ＯＩＡは１：４０,０００の抗原希釈溶液まで読取ることができた。一方ＥＬＩＳＡ（停止）は肉眼で１：５,０００〜１：１０,０００希釈までしか読取れなかった。機器を用いた読取りの結果を表１５ａと１５ｂに示す。
【０３２７】
【表１５−１】
Figure 0004060053
【０３２８】
【表１５−２】
Figure 0004060053
【０３２９】
実施例17：ラテックスと触媒性増大検定酵素標識検定を用いて連鎖球菌Ａから抗原を検出し、アミド変性表面活性剤ラテックス、０.１６１μm（Rhone-Poulenc）を使用した検定と同じ珪素オブラートに関して比較した。
【０３３０】
いずれの技法も、抗原の１：８０希釈を限界とする市販（Wellcome Diagnostics）のラテックス凝集技法よりは感受性が高い。２つの技法の直接機器読取りの比較を以下の表１６に示す。ここに示したミリボルト読取りは、修正Sagax Comparison Ellipsometerで記録された光の強さの変化の関数である。
【０３３１】
【表１６】
Figure 0004060053
【０３３２】
実施例18：複数分析物プロトコール
試験表面と複合抗体試料を、次の微生物のそれぞれについて実施例１６で述べたように作製した：髄膜炎菌、インフルエンザ菌Ｂ群、肺炎連鎖球菌、連鎖球菌Ｂ群、大腸菌Ｋ１。試験装置をこれら５つの試験表面を収容するようにデザインし、試験表面を装置内の高くなった台上にのせた（図９および１１参照）。次の微生物のそれぞれについて一定量の各複合体試料を調製した：髄膜炎菌、インフルエンザ菌Ｂ群、肺炎連鎖球菌、連鎖球菌Ｂ群、大腸菌Ｋ１。
【０３３３】
等量（７５μl）の脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルとこの複合体試料を混合し、５つの抗体被覆した試験表面のそれぞれにピペットで１滴（２５μl）滴下した。ＣＳＦサンプルは、実施例１６で述べたように、試験微生物から誘導した抗原の既知レベルおよび既知の組合せに関して調製した。サンプルを２分間インキュベートし、その後試験オブラートを脱イオン化水で洗浄して吸取り乾燥させた。基質（ＴＭＢ沈降反応試薬）を各表面に添加して、５分間インキュベートした。オブラートを脱イオン化水で洗浄し、吸取り乾燥して、読取りを行なった。このように、１またはそれ以上の分析物が存在する場合でも単一サンプルが容易に分析できた。この複数特異的試薬は単一特異的試薬に関して認められる特異性を保持していた。偽陽性反応は認めず、また陽性反応は単一特異的試験工程で生じるシグナルと同等であった。
【０３３４】
実施例19：ストレプＡ検定装置
図８Ａ〜８Ｇに示した装置の作製の詳細をここで述べる。直径１００mm、一方の側を研磨した２０ミル±２ミルの単結晶性珪素オブラートを半導体供給業者から購入した。オブラートを、上に述べた工程を用いて４９５ű１５Åの窒化珪素または二酸化チタンで被覆した。各々のオブラートに、０.７５cm2切片のパターンを作りながら３.５ミルの深さまで切り目を入れた。これによってオブラートはその後のプロセシングの間も無傷のままとなる。次にオブラートを実施例５で述べたようにＴポリマーシロキサンで被覆した。最終的なポリマーの厚さ１００ű５Åを使用する。ポリマー被覆したオブラートを１４５℃±５℃で２４±２時間保存する。
【０３３５】
ポリマー被覆したオブラートを、０.１Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｎ-［２-ヒドロキシエチル］ピペラジン-Ｎ'-［２-エタンスルホン酸］）、pH ８.０中５μg/mlの親和性精製ウサギ抗ストレプＡ抗体を含む溶液中に浸した。オブラートを２℃〜８℃で１６〜２０時間、抗体溶液により被覆した。オブラートを脱イオン化水で洗浄し、その後窒素流下で乾燥させた工程上の対照を、ｘ，ｙ翻訳段階を用いてそれぞれの０.７５cm2の中心に適用した。１〜２μlの斑点を適用し、室温（２０℃）で３分間インキュベートした。使用した抗原の濃度は、中間的な色の変化を生じるように経験的に決定した。抗原を脱イオン化水中に混合した。抗原溶液を脱イオン化水で表面から洗い流し、その後窒素流下で乾燥させた。次にオブラートを、５０mM ＭＯＰＳ（３−［Ｎ-モルホリノ］プロパンスルホン酸）、pH７.０中０．５％の分解したゼラチンを含む溶液中に室温で２０分間浸した。オブラートを溶液から取り出し、窒素流下で乾燥させた。ゼラチン層は抗体被覆を安定化させる役割を果たし、装置の保存を助ける。オブラートは紫色である。オブラートを３０秒間蒸気に接触させてゼラチン層を十分に水化させた。次にオブラートを空気乾燥させた。オブラートはもとの金色に戻るはずである。その後該オブラートを各０.７５cm2の試験片に解体した。
【０３３６】
図８Ａ〜８Ｇを参照すると、成形した試験装置はあらかじめ切断した吸収パッドが底に置かれており、その保護カバーがしっかりはめ込まれている。装置の蓋には吸取り材料が上部に積層されており、保護カバーがきっちりとはまっている。装置の中心の高くなった台座に小量のエポキシを適用し、試験表面を適用する。接着剤を固まらせ、その後装置を閉じてキット内に入れる。
【０３３７】
表面を被覆するのに使用した抗体試料あるいは別個の抗体試料を、ナカネが述べている標準過ヨウ素酸化学作用を用いてＨＲＰに結合した。質量増大試薬において使用する結合抗体の正確な希釈は、ＨＲＰの取り込みのレベルならびに使用する抗体試料の親和性と抗体結合力に依存する。複合体試料を、５０mM ＭＯＰＳＯ（３-［Ｎ-モルホリノ］-２-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、pH７.０、標準アルカリ処理カゼイン２０mg/ml、０.３％（v/v）トゥイーン２０、および０.５％（v/v）プロクリン３００（Rohm and Haas）を含む中で希釈した。複合体溶液を Wheaton Natural のポリエチレン点滴びんに入れた。供給される滴の大きさは約３０μlであった。他のすべての試薬も同様に Wheaton Natural点滴びんに入れた。
【０３３８】
２.３Ｍ ＮａＮＯ2と０.０１％イソプロパノールを含む溶液１００μlをポリエチレンチューブに入れ、溶液をチューブ上で乾燥させることにより、抽出チューブを作製した。これは循環空気の下に室温で、または４５℃で乾燥させることにより達成されうる。
【０３３９】
試薬の組成は次の通りであった：試薬 No.１：０.２５Ｍ酢酸と０.０３５mg/lのブロムクレゾールグリーン試薬 No.２：１.５Ｍ ＭＯＰＳＯ，pH＝７.３と０.２％（v/v）トゥイーン２０、０.５％（v/v）プロクリン３００および２０mM ＥＤＴＡ試薬 No.３：複合体試薬 No.４：０.１％プロクリン３００を含む脱イオン化水試薬 No.５：沈降反応ＴＭＢの市販製剤
【０３４０】
この装置の使用のための試験工程は次の通りであった：１．試薬を低温保存から取り出し、室温に暖まるまで放置する。
２．キットから乾燥試薬を含む抽出チューブを取り出し、それをラックまたはホールダーに垂直に立てる。
３．抽出チューブおよび試験装置に適切な患者情報のラベルを貼付する。検定を実施している間は試験装置を水平な表面上に置く。
４．試薬１を３滴抽出チューブ内に添加し、静かに振盪して底にある乾燥試薬を溶解させる。溶解し、適切に混合した時には液体は淡緑色になるはずである。血液の混じった標本の場合には抽出チューブの色の変化が明白でないこともあるが、検定の成績には影響を及ぼさない。
５．１分以内に、標本または陽性対照を含む管口スワブをチューブ内に入れる。液体がファイバーチップから中に移動していくように、スワブを回しながらチューブの側面にスワブを押しつける。スワブを抽出液中で２分間以上インキュベートさせる。
６．スワブの柄を側面に保持し、試薬２を３滴直接抽出チューブに加える。溶液の色が緑色から青色に変わるまで、スワブを使って試薬と抽出物を混合する。
７．スワブを引き出す時、チューブの側面を押しながら抽出チューブの壁にスワブを押し当てて回すことにより、スワブから抽出液を分離する。スワブを廃棄し、チューブの内容物を取っておく。スワブからできるだけ多くの液体から取っておくようにする。
８．試薬３を１滴抽出物に加え、十分に混合する。３０分間以上放置してはならない。
９．清潔なピペットを使って該溶液１滴を対応する試験装置の表面の中心上に直接移す。試験装置の表面全体をおおってはならない。
１０．試験表面上の滴を２〜５分間インキュベートする。
１１．１〜２秒間力強く洗浄することが重要である。装置の周囲の吸収性物質の容量を超えないように注意しながら、試薬４の洗浄液を使って装置の表面を洗い流す。
１２．吸取り装置が No.１の位置にあることを確認する。少しの間装置の蓋を閉じ、残存する湿気を表面から除去する。吸取りのたびに清潔な表面で吸取ることが必要である。初めて吸取りを行う時には、吸取り紙はＩの位置にあるはずである。IIの位置にあれば、２回目の吸取りのためにＩの位置まで動かす。同じ位置で吸取りを反復することは試験結果を損なう可能性がある。
１３．蓋を開き、試薬５を１滴直接試験装置の表面の中心に適用し、４〜１０分間インキュベートする。最初の滴下が直接装置の中心上に行われなかった場合には、試薬５の滴を最初の滴下部分に直接移動させる。
１４．試薬４の洗浄液を用いて１〜２秒間装置の表面を力強く洗い流す。
１５．吸取り紙を装置の上部の No.２の位置まで動かし、少しの間装置の蓋を閉じて表面から残存する湿気を除去する。蓋を開き、試験表面を色の変化に関して検査する。
陽性結果：いかなる強さであっても一様な青色／紫色の反応円が装置表面の中心部に現われる。
陰性結果：いかなる強さでも、青色／紫色の反応円が試験表面上に現われない。
【０３４１】
工程上の対照は各試験表面上に存在する。各々の陽性または陰性試験の終了時に試験表面の中心に小さな青色／紫色の点として現われる。陰性試験結果は工程対照のみを示す。陽性対照結果は反応円の中に工程対照を示す。非常に強い陽性結果の場合には、工程対照は反応円内であまり明白でないこともある。
【０３４２】
工程対照が現われなければ、指示に従って工程を反復することができる。反応した試験表面および陽性反応に結びついた色の変化は時間が経過しても劣化しない。従って、試験装置は永続的記録とみなしうる。試験装置を参考のために取っておく場合には、蓋の中の吸取り材料を取り出して、生物災害容器に廃棄する。保存のため装置は閉じておくべきである。
【０３４３】
実施例20：ＯＩＡ装置の感受性
ストレプＡ ＯＩＡの分析感受性を、既知の濃度の細胞懸濁液を使用し、各々のキットの検定プロトコールに従ってこの懸濁液の一部を抽出することにより、市販のストレプＡキットと比較した。化膿連鎖球菌、ランスフィールド分類Ａ群を、斜面培養管での一次培養として American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ No.１２３４４）から入手した。細胞懸濁液は滅菌通常生理食塩水から作製し、通常生理食塩水で無菌的に希釈した。試験からの結果は、本発明のＯＩＡ装置が少なくとも６種類の市販試験キットと比べて少なくとも１０〜１００倍感受性が高いことを示している。
【０３４４】
表１７は、ストレプＡ ＯＩＡの臨床的感受性をいくつかの市販の迅速ストレプＡ検定の製品取り扱い説明書の記載と比較したものである。これらの迅速検定の大部分は、ストレプＡコロニー計数が２０未満のサンプルはすべて切り捨てるが、ストレプＡ ＯＩＡ検定で示された数字においては、いかなるサンプルも差し引かれなかった。ストレプＡ ＯＩＡはこれらの迅速試験に比べて感受性の有意の改善を示す。
【０３４５】
【表１７】
Figure 0004060053
１．製造業者の製品取扱い説明書から得たデータ２．すべての標本に基づく３．製品取扱い説明書の中の表から計算したデータ４．標本プレートのコロニー計数が製品取扱い説明書に示されていない。
【０３４６】
スワブ１本と標準採集技法を用いて咽頭炎の症状を呈する患者からスワブ を収集した。この試験では、４つの独立した検査施設を使用した。標本採集 後直ちにスワブを輸送チューブに戻し、輸送媒体を含むカプセルを押し砕い た。各施設で５％ヒツジ血液寒天（ＳＢＡ）プレートに標本を接種し、次に ３５℃〜３７℃でインキュベートした。４施設の内２施設では嫌気的条件下 でプレートを２４〜４８時間インキュベートし、２施設では二酸化炭素強化 環境でプレートをインキュベートした。各施設は結果を陰性または陽性とし て報告し、陽性に関してはセロタイピング法によって確認した。
【０３４７】
接種後、スワブを輸送チューブに戻し、ストレプＡ ＯＩＡ試験工程に従って検定した。溶液を生じる酸を３滴抽出チューブに加え、よく混合して乾燥試薬を溶解した。スワブを抽出チューブに入れ、抽出試薬で十分に飽和させ、溶液中で２分間インキュベートした。中和溶液３滴を抽出チューブに加え、スワブを使って試薬を混合した。抽出したスワブをチューブの側面に押しつけて絞りだし、その後廃棄した。この抽出技法はほとんどの迅速ＧＡＳ試験に共通するもので、細菌からＧＡＳ抗原を遊離させる。
【０３４８】
触媒１滴を抽出物に加え、十分に混合した。この溶液１滴を試験片（図８Ａ〜８Ｇ）の中心に適用した。サンプルを試験表面上で２分間インキュベートし、その後試験表面を水で洗い流し、蓋を閉じて吸取り乾燥した。質量増大剤１滴を試験表面の中心に適用し、４分間インキュベートした。表面を再び水で洗い流し、先と同様に吸取った。試験結果は培養結果の知識なしに判定した。
【０３４９】
増大培養法を、細菌の存在を確認するようにデザインした。この方法では、すべての輸送チューブから外科用綿撒糸（輸送媒体とスワブを分離する栓子）を取り出し、トッド・ヒューウィット培地に入れて、３５℃〜３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。細菌に一致する増殖パターンが認められれば、コロニーを選択し、必要であれば再分離して、市販の連鎖球菌セロタイピングキットを用いて確認した。
【０３５０】
臨床試験では、４施設から合計７７８サンプルを検査した。ＳＢＡ培養法は７０標本を陽性と判定し、これらの標本の内４つは増大培養法によると陰性と判定された。増大培養法は９２標本を陽性と判定した。ＳＢＡ培養の感受性は、検討した頻度と個体群に関して増大培養法に比し７１.７％であった。これらのデータは、従来のＳＢＡ培養法が増大培養法よりも感受性が低いことを示す先の文献の結果を裏付けている。従って、従来のＳＢＡ培養法を「ゴールドスタンダード」とみなすことは再評価されるべきである。
【０３５１】
ＯＩＡの結果をＳＢＡ培養法と増大培養法の両方に関して評価した。ストレプＡ ＯＩＡは検討した頻度と個体群について９２.９％の感受性、９４.８％の特異性、９４.６％の正確度を生じた。ストレプＡ ＯＩＡはＳＢＡ培養法に比べ特異性が低いと思われる。しかしながら、ストレプＡ ＯＩＡでの２６の見かけ上の偽陽性は実際には真性陽性であったので、本当の限界はＳＢＡ培養技法の方に存在する。培養に関するストレプＡ ＯＩＡの感受性は、４つのＳＢＡ陽性結果がストレプＡ ＯＩＡでは陰性であったために低いように思われる。これらの結果はその後増大培養法で培養非分離株であると判定された。ストレプＡ ＯＩＡは９２の増大培養陽性のうち９１を検出し、９８.９％の感受性を生じた。能率結果はコロニー計数にかかわりなく収集したすべてのデータを含むことに注意することが重要である。
【０３５２】
実施例21：機器による読取りのプロトコール１）フォトダイオード修正比較偏光解析装置上記に述べたように比較偏光解析装置を修正した。接眼鏡をＣＣＤカメラに接続し、サンプルを楕円十字線内の中心に置いた。サンプルの斑点が楕円内に完全に納まるようにズームを調節した。
【０３５３】
検定に使用した試験細片は幅１cm、長さ４〜５cmであった。これらの寸法は手で取り扱いやすい。適切なデザインのサンプル位置定め装置があればどのような寸法の試験片も使用できる。サンプルを、スライドの長さに沿って均一な間隔で２０μlの滴として適用した。試験表面の背景測定のために１切片を残した。サンプルをこれまでの実施例の中でで述べたように検定した。
【０３５４】
試験細片を機器のサンプル台の上に乗せ、表面の背景切片を楕円の中心に置いた。サンプル台はｘ，ｙ位置付け能力を持つ。試験表面が位置付けられれば、フォトダイオードで背景の読取りを行った。ＬＥＤは背景切片の背景強度をボルトで表示する。コンピュータのソフトウェアも背景強度を記録するようにデザインされていることもある。この測定が終了した後、台を進めて陰性サンプルからの読取りを記録した。電圧量を直接記録したが、サンプルから背景を差し引いたものを記録してもよい。すべてのサンプルが測定されるまで台を前進させた。
【０３５５】
機器による読取りは、あらかじめセットされたシグナルに関してイエスまたはノーの定性的回答を与えることができる。検定は陰性対照と低陽性、あるいは遮断濃度を含み、この閾値に関してサンプルを客観的に評価する。
【０３５６】
検定が定量的であれば、試験表面あるいは試験装置は陰性対照と１またはそれ以上の既知の陽性対照を測定することができる。定量のためにサンプルの数値をこの曲線と比較する。考慮している適用に半定量的回答が適していれば、陽性対照はいくつかの広範囲をカバーしうる。
【０３５７】
単色光源比較偏光解析装置この機器は、照準を合わせた光源の使用によるより小さな光路、より小さな参考表面、より小さなサンプル台、光源のすぐ隣に位置する偏光子、および検出器を有しており、表面の視覚検査に必要なレンズ系が排除されている。
【０３５８】
この特殊機器の読取りのプロトコールは、５つの別個のサンプル、あるいは４つの対照と１サンプル、２対照と３サンプル、等々に適応する。サンプルスライドを、スライドの位置を制御する回転柱に接続する。整列は視覚による位置付けではなく、試験表面上へのサンプルの配置と台の前進によって達成される。ｘ，ｙ位置付け台を修正することにより、試験表面のどのような配列も使用できる。このことは、多数のサンプルを検査することのできる試験表面の使用を可能にする。
【０３５９】
この機器は、一定のサンプルサイズに適合するように遮蔽されたフォトダイオード検出器を使用しており、スライドの位置付けとサンプル適用によってサンプルの斑点が遮蔽を満たす。読取りは機器のカバーのＬＥＤ表示から行う。読取りはミリボルトである。
【０３６０】
実施例22：Ｂ群連鎖球菌多クローン性または単クローン性のいずれかの抗ＧＢＳ抗体を前に述べたシロキサン被覆表面に固定化することにより、光学的に活性な試験表面を作製した。抗体は群特異的であったが、ＧＢＳ多糖類に関して認められる群特異的エピトープのいずれに対しても特異的であると考えられる。使用した多クローン性試料は、全細胞に吸着させたＧたんぱく精製ＩｇＧ分画であった。被覆抗体濃度は１００mmオブラートにつき抗体１５０〜５００μgの範囲であり、２〜８℃で１２〜１６時間被覆した。１００mmオブラートは４９５Å窒化珪素被覆があってもなくてもよい。特に、単クローン性抗体は５０mM 酢酸ナトリウム、pH ５.０を含む緩衝液中２００〜３００μg/オブラートで最も良好に被覆することを認めた。多クローン性抗体は、同様であるが０.１Ｍ ＨＥＰＥＳ、pH ８.０を含む緩衝液中で良好に表面被覆することを認めた。５.０〜９.０の pH 範囲をカバーする緩衝液は有効な抗体被覆を与えることが示されている。ひとたび抗体が試験表面上に固定化されれば、５０mM ＭＯＰＳ、pH ７.０中０.５％分解ゼラチンのオーバーコートを前に述べたように適用する。抗体被覆した試験表面を使用前に試験装置のひとつに置いた。
【０３６１】
ＧＢＳ検定の質量増大のため、ナカネの過ヨウ素酸塩法を用いて群特異的多クローン性抗体試料をＨＲＰに結合した。９.７５以上の高い pH でのＨＲＰへの抗体の結合は、非特異的結合の上昇を生じた。最適の結合 pH は９.０〜９.７５と確認された。
【０３６２】
ＧＰＳ群特異的抗原を、酸抽出プロトコールを用いて微生物から抽出した。０.２５Ｍ酢酸と２.３Ｍ亜硝酸ナトリウムの混合物を使用して次亜硝酸を生成した。酢酸は０.１Ｍ〜１.０Ｍの範囲でＧＢＳ抗原を有効に抽出することを認めた。２分間抗原を微生物から抽出した。ここで述べるすべての結果はＡＴＣＣ菌株 No.１２３８６を使用した。１.５Ｍ ＭＯＰＳＯ、pH ７.３、０.２％トゥイーン２０、０.５％プロクリン３００および２０mM ＥＧＴＡを含む緩衝液を使用し、等量の中和緩衝液を加えることのよって溶液を中和した。最終的な pH の範囲は６.０〜７.５が望ましい。
【０３６３】
抽出した抗原を、５０mM ＭＯＰＳＯ、pH ７.０、アルカリ処理カゼイン２０mg/ml、０.３％トゥイーン２０および０.５％プロクリン３００を含む複合体試料の１：１５０希釈溶液と５：１の割合（サンプル：複合体）で混合した。３：１から１０：１の間のサンプル：複合体比率が受け入れ可能であった。サンプル／複合体混合物を室温で５分間インキュベートし、その後混合物２０μlを試験装置に適用して、室温で５分間インキュベートした。装置を前に述べたように使用して試験表面を洗浄し、乾燥させた。試験表面が乾いた後、ＴＭＢ沈降反応基質１滴を装置に適用し、室温で５分間インキュベートした。洗浄／乾燥プロトコールが完了した後、試験結果を解釈した。機器による結果が望ましい時には、試験表面を脱イオン化水流の下で洗浄し、窒素流下で乾燥することにより洗浄／乾燥プロトコールを実施する。サンプル／複合体の最初のインキュベーションは必要ではなかったが、検定の感受性を上昇させることが認められた。インキュベーションの時間を追加すれば検定の感受性はさらに上昇すると考えられた。
【０３６４】
現行のＧＢＳ検定は最終抽出 pH の変化に対してすぐれた耐性を示した。低陽性の視覚化は６.７５から８.０の範囲にわたる pH の変化によって影響されなかった。表１９参照。評点結果のために視覚尺度を確立した。１＋または２＋は金色の背景に非常に弱い紫色の斑点であった。１０＋の数値は非常に強い青色の結果である。
【０３６５】
【表１８】
Figure 0004060053
【０３６６】
【表１９】
Figure 0004060053
【０３６７】
実施例23：クラミジアの検出
４９５Å窒化珪素被覆を施した、または施さない光学的に活性な試験表面を、前に述べたように重合体シロキサン、Ｔポリマーで被覆した。これらの重合体被覆した支持体を、１００mM 炭酸ナトリウム、ｐＨ９.６中１〜１０μg/mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液により、２〜８℃で１２〜１６時間さらに被覆した。次に試験表面を５０mM ＭＯＰＳ、ｐＨ７.０中０.５％分解ゼラチンにより室温で２０分間被覆し、その後窒素流下で乾燥させた。被覆した試験表面を前に述べた単回使用試験装置に乗せた。
【０３６８】
サンプルの採集に使用した合成ファイバースワブを０.１％（w/v）ケノデオキシコール酸（ＣＤＯＣ）とナトリウム塩を含む０.０１Ｍ ＰＢＳ溶液（約１２０μl）中に液浸することにより、スワブからクラミジア特異的ＬＰＳ抗原を抽出した。前記の溶液は、あらかじめ１.０Ｎ ＮａＯＨの緩衝液１０μl/mlで最終ｐＨ１１.５にアルカリ化しておいた。最初に、ＣＤＯＣを無水メタノール中０.２g/mlで可溶化した。スワブを、理想的にはこの溶液中で約１０秒間渦状撹拌し、その後室温で５分間インキュベートした。次に弾性抽出チューブ（ポリプロピレン）に圧迫を加えてスワブから残留溶液を絞り出した。０.１％ＣＤＯＣを含む等量の１００mM Ｎａ2ＨＰＯ2、ｐＨ７.０を加えて最終ｐＨを７.０〜７.５に調整した。
【０３６９】
ナカネの方法を用いて抗クラミジアＬＰＳ抗体をＨＲＰに結合することにより、質量増大試薬を調製した。複合体原液を、５０mM ＭＯＰＳＯ、ｐＨ７.０、アルカリ処理カゼイン２０mg/ml、０.３％トゥイーン２０および０.５％プロクリン５００を含む希釈剤中で１：７５〜１：２００に希釈した。
【０３７０】
抽出したサンプル約３０μlをＢＳＡ／重合体シロキサンの試験表面上に乗せ、室温で５〜１０分間インキュベートした。次に、ＨＲＰに結合した抗クラミジアＬＰＳ抗体約３０μlを試験表面上のサンプル斑点に添加し、室温で１〜５分間インキュベートした。試験表面を水１〜２mlで洗浄し、前に述べたように装置内で乾燥させた。ＴＭＢ沈降反応基質約３０μlを表面に適用し、室温で１０〜１５分間インキュベートした。試験装置を前に述べたように洗浄し、乾燥させた。
【０３７１】
上記の代わりに、抗原試料を０.０１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７.４中で１：１００〜１：３２０に連続的に希釈した。これらの希釈溶液５μlを、１０mM ＮａＯＨを含む０.０１ＭＰＢＳ中０.１％ケノデオキシコール酸５００μlに加えた（最終ｐＨは１１.５であった）。これらを渦状撹拌し、室温で５分間放置した。１００mM リン酸緩衝液（一塩基と二塩基混合）５００μlを加えて抽出緩衝液を中和し、この溶液１５μlをオブラート表面に添加した。これを室温で１０分間、表面上でインキュベートした。抗ＬＰＳ抗体‐ＨＲＰ複合体の１：７５希釈溶液の部分標本１５μlを表面上の抗原斑点に直接加え、指定された時間室温でインキュベートした。オブラートを脱イオン化水で洗浄し、窒素流下で吹付乾燥した。基質（３０μl）を抗原／複合体斑点に適用し、指定された時間インキュベートした。オブラートを前記のように洗浄して乾燥させ、捕獲した抗原の強度をフォトダイオード修正比較偏光解析装置で記録した。データを背景に関して矯正した。読取りはミリボルトで、２回の読取りの平均値である。表２０参照。表２０は検定の感受性への培養時間上昇の影響を示したものである。
【０３７２】
【表２０】
Figure 0004060053
【０３７３】
実施例24：ヒト抗ＨＩＶ検出直径１００mmの珪素オブラートを前に述べたようにしてポリブタジエン（ＰＢＤ）で被覆した。ＰＢＤ被覆した光学的試験表面を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合したＨＩＶウイルスのＧＰ４１に相当する合成ペプチド２０μg/mlで被覆した。この抗原試料を１０mM リン酸カリウム、０.８５％ＮａＣｌ、ｐＨ７.０中で希釈し、試験表面を室温で２〜３時間、撹拌しながら抗原で被覆した。試験表面を被覆溶液から取り出し、脱イオン化水で洗浄して、窒素流下で乾燥させた。ＧＰ４１たんぱくは非常に疎水性が高く、疎水性ＰＢＤ表面によく結合する。一連の漿液陰性および漿液陽性のヒト血清サンプルを使用してＧＰ４１／ＢＳＡ被覆表面を試験した。血清の５μlサンプルを試験表面に適用し、室温で１５分間インキュベートした。ＣＣＤカメラの付いた修正比較偏光解析装置を用いて抗原表面上の抗体捕獲を測定した。結果はグレースケール単位で報告した。
【０３７４】
【表２１】
Figure 0004060053
【０３７５】
１２.１５グレースケール単位（陰性＋３標準偏差）の数値を陽性反応とし、漿液陰性血清について報告された平均値は５.８５±２.１グレースケール単位であった。漿液陽性サンプルについて報告された様々なレベルのグレースケールは様々な抗体力価を反映している。
【０３７６】
ＨＩＶウイルスのＧＰ４１とＰ２４の融合である組換え抗原試料も同様に、本発明の光学的試験表面のための被覆材料として評価した。直径１００mmの珪素オブラートを前に述べたようにしてＰＥＩで被覆した。５０mM炭酸ナトリウム、ｐＨ８.０中２.５μg/mlの融合たんぱくを含む被覆溶液中にこの光学的試験表面を浸し、室温で３時間インキュベートした。その後光学的試験表面を脱イオン化水で洗浄し、窒素流下で乾燥させた。光学的試験表面を血清対照に対する反応に関して試験した：陰性、低度、中等度、および高度陽性抗ＨＩＶ。各血清サンプル５μlを表面に適用し、室温で１５分間インキュベートした。表面を脱イオン化水で洗い流し、窒素流下で乾燥させた。上記に述べたようにして修正比較偏光解析装置で結果を得た。
【０３７７】
【表２２】
Figure 0004060053
【０３７８】
実施例25：ＲＳＶ検出光学的に活性な試験表面を前に述べたようにして重合体シロキサンで被覆した。これらの表面を多クローン性抗ＲＳＶ抗体溶液１０μg/ml中に入れた。次のものを含めた多数の緩衝液を抗体被覆ステップにおいて検討した：ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８.０；アセテート、ｐＨ５.０；炭酸塩、ｐＨ９.５；ホウ酸塩、ｐＨ８.０；およびリン酸塩、ｐＨ７.４。緩衝液はすべて０.１Ｍの濃度であった。０.１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９.５が最適であることを認めた。系列検定を用いて表面試料を分析した。陽性対照の部分標本２０μlを表面に適用し、室温で１０分間インキュベートした。表面を脱イオン化水で洗い流し、窒素流下で乾燥させた。抗体‐ＨＲＰ複合体（２０μl）を試験表面に適用し、１０分間インキュベートして洗浄・乾燥し、次に沈降反応基質２０μlを１０分間適用して洗浄／乾燥ステップを行った。２〜８℃で１２〜１６時間抗体を被覆した。表面を洗い流し、０.５％分解ゼラチン、５０mM ＭＯＰＳ、ｐＨ７.０を含む溶液中室温で２０分間インキュベートして、その後窒素流下で乾燥させた。
【０３７９】
質量増大試薬をナカネの方法によって調製した。ＲＳＶの核ペプチドに対する単クローン性抗体をＨＲＰに結合した。複合体原液を、５０mM ＭＯＰＳＯ、ｐＨ７.０、アルカリ処理カゼイン２０mg/ml、０.３％トゥイーン２０および０.５％プロクリン３００を含む溶液中で１：３０〜１：２５０に希釈した。
【０３８０】
もうひとつの検定プロトコールは、鼻腔洗浄液３０μlとＰＢＳ中１０％トゥイーン２０を３０μl、複合体の１：４０希釈溶液３０μlを十分に混合することを含んだ。このサンプルの部分標本３０μlを試験表面に適用し、室温で１２分間インキュベートした。単回使用試験装置について述べた洗浄と乾燥のプロトコールを使用した。ＴＭＢ沈降反応基質を表面に適用し、室温で８分間インキュベートして、洗浄し、乾燥させて解釈した。
【０３８１】
【表２３】
Figure 0004060053
【０３８２】
ＲＳＶの長菌株からのＵＶ不活性化抗原試料を購入した。これは合計２×１０5ＰＦＵを含んだ。この抗原試料を緩衝液中１：１に希釈し、上記に述べたように検定した。それぞれのサンプル１５μlを表面に適用し、これは使用しうる総抗原の７.５％に相当した。
【０３８３】
【表２４】
Figure 0004060053
【０３８４】
実施例26：薄膜アナライザー（Thin Film Analyzer）の波長依存性Lundstromらの米国特許第4,521,522号には、入射光が偏光子を通過し、測定される物質に対してブルースター角で膜から反射される装置が記載されている。その入射光は入射面と入射角に対し平行に偏光される。この装置は一つの偏光子しか使用する必要がないが、第二の偏光子を用いる場合は、第二偏光子は第一偏光子に対して正確に90゜に設置しなければならない。入射光が反射されるとき偏り（polarization）に変化が全くないので、単一の偏光子が必要なもののすべてである。この偏りについて、入射角に対する偏りに変化がないということは、偏光子が入射光または反射光のいづれかに設ければよいということによって実証される。試料に対する入射光および入射面に対して平行に偏光された反射光の両者のごく一部だけが測定される。
【０３８５】
この方法は、入射面に平行に偏光された光が、誘電媒体間の界面に入射するとき、この角度で観察される反射率が最小であることに基づいている。この現象はブルースター角においてのみ観察される。屈折率が高い基板が必要である。反射性は高いが屈折率が低い金属は、この方法に対してレフレクションミニマム（reflection minimum）が浅すぎる。
【０３８６】
小さい厚みの変化のよりすぐれたシグナルレゾリューション（Signao resolution）を得るには、上記の方法には、最小の読取り値を偏光について観察される反射曲線に容認できる状態にシフトして、小さな厚みの変化で反射光強度の大きな変化を起こさせるため、基板を酸化物の層で覆う必要がある。接着層がある場合は、この層はレフレクタンスミニマム（reflectance minimum）に対して基板を最適化するために設けられているもので受容材料（receptive material）の性能を増大するためのものではない。
【０３８７】
Lundstromが報告している純粋な平行偏光（p-偏光）を用いると、被検体（analyte）を取付けた場合の反射率（％）の変化が非常に小さいことが観察され、光偏りに変化が全くない。本発明では、入射光には、p-偏光に加えて直角偏光（s-偏光）の成分がある。薄膜との相互作用によって偏光の回転に非常に大きな変化がみとめられ、そして偏光の回転のこれらの変化は強度の変化とともに測定される。
【０３８８】
入射光の角度が非常に大きい場合、本発明を使用すると、試験面から反射される光にある程度の楕円偏光性（ellipticity）が生じる場合がある。本発明によれば、付加された集合体（mass）によって反射される場合の偏りの回転の変化が最大になり、これに伴い、反射率が最小になることはない。本発明によって観察される反射時の偏りの回転は、純粋平行偏光の場合全くない。本発明の別の利点は、本発明はブルースター角には依存していないので、ほとんどすべての基板と誘電薄膜を用いることができるということである。また入射光の角度は重要ではなく、かつ基板の材料の種類によって変える必要がない。
【０３８９】
本発明は、レーザーのような単色平行光源を用いる。また本発明には、光源と試験面との間に、p-偏光成分とs-偏光成分の両者が試験面上に入射するように配置された偏光子が含まれている。その光源が充分に偏光されている場合はこの偏光子は不要である。試験面から反射された光は第二の偏光子（アナライザー）を通過してホトダイオードに入る。s-偏光の一部分が選択されて、そのシグナル変化を厚みの関数として最大にい、一方低いバックグランド光の強度を維持する。その光は反射時に楕円偏光され、偏りの楕円偏光性と回転角はその面の光学的特性に非常に鋭敏に依存している。次にその光は、米国特許第4,332,476号、同第4,665,595号および同第4,647,207号に記載されているような比較エリプソメーター（comparison ellipsometer）内で参照面で反射され、その参照面は、試料の面と光学的に同一である領域で楕円偏光性を消去する。本発明は、与えられた材料の正確な物理的な厚みまたは屈折率を確かめるよう設計されていないので参照面を必要としない。かわりに、アナライザーを通過した光の強度が、楕円偏光性には付随する偏りの回転の尺度になり、その結果、その面の光学的特性の相対的尺度になる。したがって上記光の強度は、表面材料の厚みと屈折率の変化を測定するための簡単な手段になる。
【０３９０】
測定のプロトコルは、読取りを行う場所を決定するｘ、ｙ位置決めプラットホームを用いる上記装置の場合、ほとんど変えなくてもよい。しかし分析を行う偏光子（analyzing polarizer）は、初期読取りを行う前にバックグランドに対して予め選択された値まで回転させねばならない。好ましい実施態様ではアナライザーの近くに偏光子を備えている。光はアナライザーを通過して検出器に入る。読取り値は、ボルトもしくはミリボルトの単位で記録される。読取り値は、ＬＥＤもしくは他の表示装置に表示してもよく、またはデータ処理パッケージで捕獲してもよい。
【０３９１】
薄膜の明度に対する衝撃および、シリコンから反射される光の波長依存性を、コンピュータシミュレーションでモデル化した。屈折率が1.459の薄膜の応答を、シリコンの表面を用い、かつ厚みを０から12nmまで変えてモデル化した。試験した波長の範囲は、400〜420nm、540〜560nmおよび680〜700nmであった。最小明度から最大明度まで明度が増大することは、厚みの増大の関数として光の強度が増大することを示す。明度は光の強度の対数関数である。このデータから、厚みの関数として最大の感度の変化は540〜560nmの光源で得られた。これらのデータは70゜の入射角を用いて得たが、その値は入射角によってわずかに変化する。
【０３９２】
【表２５】
Figure 0004060053
【０３９３】
これらの観察結果を確認するため、実施例28に記載されている９分間抗原検定法（9 minute assay）を用いて、標準抗原希釈曲線を作成した。その抗原希釈曲線からの強度を、ホトダイオードを改変した比較エリプソメーター（comparisonEllipsometer）を用いて、入射光の波長の関数として測定した。薄膜アナライザーは比較エリプソメーターを簡略化したものであるから、類似の試験結果が得られるであろう。各種の波長の入射光は、白色光を狭い帯域フィルターでフィルターし、特定の波長光を選択することによって得た。フィルターはすべてCorinP70シリーズのフィルターであった。
【０３９４】
【表２６−１】
Figure 0004060053
【表２６−２】
Figure 0004060053
【０３９５】
実施例27：薄膜アナライザーの角度依存性図14ａに示す薄膜アナライザーは、672nmのダイオード光源およびセットアップダイアグラム化された二元偏光子（dual polarizer set-up diagrammed）を使用した。レーザーダイオードとホトダイオードはともに、入射光の法線角（normal angle of incidence）に対して入射と検出の角度を正確に測定するよう設置した。ストレップＡ（sorep A：（連鎖状球菌Ａ）抗原の希釈曲線を使用してアナライザーの角度依存性について試験した。薄膜アナライザーとともに使用した検出器は予め飽和し、実際のダイナッミクレンジは3500+mVである。参考のため上記抗原曲線も、672nmのレーザーダイオード源を備えた小型の比較エリプソメーターで試験した。
【０３９６】
【表２７】
Figure 0004060053
【０３９７】
【表２８−１】
Figure 0004060053
【表２８−２】
Figure 0004060053
【０３９８】
30°〜40°の範囲の入射角で薄膜アナライザーは優れた感度を示し、そして観察されたダイナミックレンジは、限定された範囲の必要条件での検定に適している。50°〜60°の角度が感度とダイナミックレンジの両者の必要条件に適合している。バックグランドは、65°を超える角度の場合、単一の偏光子では充分最小にすることはできない。このバックグランドは電子的手段によって減らすことができる。これらの角度のダイナミックレンジはかような修正機構を作動させるのに充分なものである。
【０３９９】
実施例28：ストレップＡ検定に対する比較エリプソメーターの感度低陽性の試料の読取り易さをさらに高めるストレップＡ検定法のプロトコルが開発された。試料（ストレップＡ抗原）を接合体（conjugate）と混合し、次に室温で３分間インキュベートした。この混合物の20μlを試験面に塗布し、３分間インキュベートした。すすぎ／乾燥のプロトコルを先に述べたようにして、一回使用の器具もしくは窒素気流下で行った。基質を塗布し、３分間インキュベートし、続いてすすぎ／乾燥のプロトコルを実施した。抗原希釈曲線についての試験結果を、窒素ケイ素がある場合とない場合（可視：非可視）について試験面で得た。可視の試験結果は、パープルが薄いパープルから暗青色に色相が濃くなるのを採点した。窒素ケイ素なしの面は反応させ、すすぎ、次いで一回使用の器具内に入れることなく乾燥した。これらの面を、ホトダイオードを改変した比較エリプソメーターで試験した。読取り値はmVの単位で報告し、かつバックグランド測定値について修正した。抗原希釈試験に基づいた装置による検出によって、ストレップＡ ＯＩＡ検定法の性能が８倍に増大することが観察された。合計５個の曲線を試験した。
【０４００】
【表２９】
Figure 0004060053
【０４０１】
本願に記載された試験キット、免疫検定装置、下塗りコーティングおよび検出法は、記載された検定方式、または各種の試薬に対照物、キャリブレータ（calibrator）について示した容積、濃度もしくは特定の成分によって限定されない。また層、層コーティングまたは各種の試薬、添加物、対照物およびキャリブレータのいずれかに使用した成分の類似の化学的機能もしくは他の機能を有する均等物は、本発明の範囲内で利用できると解すべきである。
【０４０２】
上記の実施例は、基板、ＡＲ材料、活性化剤および受容材料からなる予め作製したスライドを使用して各種の被検体を検出し、被検体結合のシグナルとして干渉色を変化させる上記の方法の効率を有用性を示すのに役立っている。
【０４０３】
先行実施例で利用した基板の形態もしくは材料に束縛されることなく、その表面にＡＲ材料を結合させることができるかまたは、活性化されて受容材料を結合することができる機能的に均等な代替品である基板形態および基板材料の多様な組合わせを利用することができる。
【０４０４】
本願に記載の発明の懸念は異なる実施態様をもっており、後記の特許請求の範囲は、本発明のこのような別の実施態様のすべてを、従来技術によって限定されているものを除いて含んでいると解すべきである。
【０４０５】
【発明の効果】
本発明は、試料中の分析対象の存在有無または量を検出するための装置の改良、およびこのような装置を使用する方法の改良を特徴とするものである。従来の装置とは対照的に、本発明の装置は試料中の極く少量の分析対象を検出することができる。僅か0.1nM、0.1ng/mlまたは２×103の生物、あるいは数分間だけの迅速測定で僅か50fgの量まで測定できる。測定の総所要時間は測定手続きの開始から（すなわち、分析対象が装置に接触する時点から）一時間から数分間である。事実、本発明の装置によれば、従来の装置と方法とで連鎖球菌Ａ抗原の測定等で可能であったより30％以上もより多くの試料を検出できる。本発明は、Sandstromら（上記参照）の記載のものと比較して、より優秀な構成のものを見つけた結果によるものであり、その詳細を以下に説明する。この装置は機器で構成されている。また、これらは色の変化が目視できる場合、特にその色変化が、例えば金色から暗紫色または青色に変化する等、非常に説明し易い場合は有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の装置および方法の中枢をなす干渉現象の略図である。
【図２】 鏡面、および非鏡面または散乱性の基板表面の略図である。
【図３】 本発明の装置で使用する最適な干渉膜を選定する方法の略図である。
【図４】 光学的表面への3-アミノプロピルトリエトキシシランの取付け状態を表示したものである。
【図５】 本発明の装置の作製に有用な多価シロキサンの取付け状態の略図である；ここで、Rは化学的に活性な基の光学的表面に存在するケイ素原子への付着に干渉せず、かつ受容体（生物学的）部分の付着にも干渉しない、多数の基のいずれか一つであり、例えば、このようなＲ基には第一、第二、第三アミン、アルコール類、エトキシ基、フェニル基および芳香族基等がある。
【図６】 計器読取り結果または目視読取り結果に有用である本発明の装置の略断面図である。
【図７】 光学的表面に薬剤を付与することにより光シグナルが得られかつ強化される本発明の方法の略図である；例えば、ラテックスビードを有する抗体を使用するか、または酵素の抗体を使用して基板上に生成物を析出させる。
【図８Ａ】 本発明の装置の斜視図および分解組立て図である；特に、装置の平面図である。
【図８Ｂ】 本発明の装置の斜視図および分解組立て図である；特に、装置の底面図である。
【図８Ｃ】 本発明の装置の斜視図および分解組立て図である；特に、装置の斜視側面図である。
【図８Ｄ】 本発明の装置の斜視図および分解組立て図である；特に、装置の側面図である。
【図８Ｅ】 本発明の装置の斜視図および分解組立て図である；特に、測定のために開放した装置の斜視図である。
【図８Ｆ】 本発明の装置の斜視図および分解組立て図である；特に、装置のテスト面分解組立て図である。
【図８Ｇ】 本発明の装置の斜視図および分解組立て図である；特に、装置内部の各種構成品を示す分解組立て図である。
【図９Ａ】 本発明の多重テスト装置の斜視図およびその他であり、特に、装置の平面図である。
【図９Ｂ】 本発明の多重テスト装置の斜視図およびその他であり、特に、装置の斜視図である。
【図９Ｃ】 本発明の多重テスト装置の斜視図およびその他であり、特に、装置の分解組立て図である。
【図９Ｄ】 本発明の多重テスト装置の斜視図およびその他であり、特に、装置の前面蓋の背部を示す。
【図９Ｅ】 本発明の多重テスト装置の斜視図およびその他であり、特に、前面蓋を外した装置の平面図である。
【図１０】 第８Ａ〜８Ｇ図に示した装置を使用する方法の各行程を示す略図である。
【図１１】 第９Ａ〜９Ｅ図に示したと同じ装置を使用する方法を示す略図である。
【図１２】 回分サンプリング方式の略図である。
【図１３】 従来の偏光解析計の光路の略図である。
【図１４Ａ】 本発明に有用な薄膜分析計の略図であり、単色光源および感光性半導体素子またはアレイを使用する。
【図１４Ｂ】 多色光源および光電子倍増管検出計の略図である。
【図１５】 従来の偏光解析計の光路の改造型の略図であり、シグナル検出の新規の方法を表示する。
【図１６】 光路長の短い偏光解析計の略図である。
【図１７】 従来の蛍光法に対する蛍光測定法における反射性基板の利点の略図である。
【図１８】 第５世代スターポリマーまたはデンドリマー（分子状自己集合ポリマー）の略図である。
【符号の説明】
２０：装置、２２：クリップ、２４：くぼみ、２６：テスト表面、２８：ピラミッド状構造物、３０：蝶番、３２：装置の上半分、３４：装置の下半分、３６：プレート、３８：壁、４０：蝶番、４２：アパーチャ、４４：蝶番、４６：プレート、４７：アパーチャ、４８：アパーチャ、４８：蝶番、５０：縁、５２：濾過紙、５４：濾過紙、５６：ハンドル、５８：矢印、６０：フィルターパッド（吸収材）、６２：アパーチャ、６４：濾過紙、６６：プレート、６８：リップ部分、７０：リップ部分、７２：棚、７４：内部空間、１００：テスト装置、１００：テスト表面、１０２：テスト装置、１０２：テスト表面、１０４：テスト装置、１０４：テスト表面、１０６：テスト装置、１０６：テスト表面、１０８：テスト装置、１０８：テスト表面、１１０：カバー、１１２：セクション、１１２：棚部分、１１４：フィルター材料、１１６：ワイヤーループ、１２０：アパーチャ、１２２：アパーチャ、１２４：アパーチャ、１２６：方形のアパーチャ、１２８：吸収性スポンジ、１３０：吸収性スポンジ、１３２：円筒形伸張部分、１３４：円筒形伸張部分、１３６：円筒形伸張部分、１３８：円筒形伸張部分、１４０：円筒形伸張部分、１４２：円筒形伸張部分、１４６：標識、１４８：標識、１５０：標識、１５２：空間、１５４：矢印、１５６：矢印、１５８：アパーチャ、１６４：部分。

Claims (30)

  1. 適当な光源による励起によって蛍光信号を発生し得る標識を用いて被検体の存在又は量を検出する装置であって、
    反射性固体である光学支持体、前記支持体上の付着層、被検体に対して特異的に結合することができる一次的受容性材料から成る前記付着層に結合する受容層、入射光源、及び前記蛍光信号を捕獲するための検出器から成り、かつ、
    前記付着層が、デンドリマー、星形高分子、分子自己集合性高分子および高分子シロキサンからなる群から選択された材料から成り、
    被検体が存在するときに、前記標識が前記被検体を介して前記一次的受容性材料に間接的に結合できることを特徴とする検出装置。
  2. 前記標識が二次的受容性材料に付着し、前記二次的受容性材料は前記一次的受容性材料に特異的に結合する前記被検体に結合することができる請求項１に記載の装置。
  3. 前記適当な光源の励起によって蛍光信号を発生し得る標識が前記一次的受容性材料に結合する前記被検体と比較するための試薬に付着する請求項１に記載の装置。
  4. 前記支持体が前記支持体と前記付着層の間に非反射膜を有し、前記非反射膜は入射光を非反射するように選択されている請求項１に記載の装置。
  5. 前記非反射膜が、窒化珪素、シリコン／二酸化珪素複合材、シリコンオキシニトライド、二酸化チタン、チタン酸塩、ダイヤモンド、ジルコニウム酸化物および炭化珪素から成る群から選択された材料からなる請求項１に記載の装置。
  6. 前記支持体が、単結晶性シリコン、ガラス、ガラス／無定形シリコン複合材、金属、セラミック、多結晶性シリコンおよびこれらの複合材から成る群から選択された材料からなる請求項１に記載の装置。
  7. 前記標識が前記入射光源から直接捕獲した光と前記光学支持体による前記入射光源の反射により捕獲された光によって励起される請求項１に記載の装置。
  8. 受容層が抗体である請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
  9. 受容層が核酸である請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
  10. 受容層がオリゴヌクレオチド、キレート剤、酵素、酵素基質、バクテリア、細菌性ピリ、細菌性鞭毛状物、核酸、ポリサッカライド、脂質、タンパク質、炭水化物、金属、ウイルス、ホルモン、およびこれらの物質に対するレセプターからなる群から選択される物質から形成される請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
  11. 前記被検体が、抗体、酵素、ホルモン、ポリサッカライド、脂質、炭水化物、および核酸から成る群から選択される物質である請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
  12. 前記被検体が抗原である請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
  13. 前記被検体が、有機性小分子、麻薬、環境薬剤の１又は２以上から選択される請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
  14. 前記被検体が蛋白質である請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
  15. 前記検出器および光源が、試験支持体に対して等角度で配置された請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
  16. 前記光源が単色性または多色性である請求項１〜６のいずれかに記載の装置。
  17. 反射性固体である光学支持体、前記支持体上の付着層、被検体が存在するときに前記被検体に対して特異的に結合することができる一次的受容性材料を含む受容層、
    入射光源、及び前記蛍光信号を捕獲するための検出器から成り、前記支持体上の付着層が、デンドリマー、星形高分子、分子自己集合性高分子および高分子シロキサンからなる群から選択された材料からなる装置を、目的とする前記被検体を含む可能性のある試料および適当な光源による励起によって蛍光信号を発生する標識に接触させ、その際、二次的受容性材料は前記一次的受容性材料に特異的に結合する前記被検体に特異的に結合することができる状態において、前記標識は前記二次的受容性材料に付着されており、
    次いで、前記標識を前記入射光源により励起させ、さらに、前記信号を前記被検体の存在または量を示す指標として検出器に捕獲させることからなる試料の被検体の存在または量を検出する方法。
  18. 前記支持体と付着層の間に非反射膜を有し、前記非反射膜は入射光を非反射するように選択されている請求項１７に記載の方法。
  19. 前記非反射膜は、窒化珪素、シリコン／二酸化珪素複合材、シリコンオキシニトライド、二酸化チタン、チタン酸塩、ダイヤモンド、ジルコニウム酸化物および炭化珪素から成る群から選択された材料からなる請求項１７に記載の方法。
  20. 前記支持体が、単結晶性シリコン、ガラス、ガラス／無定形シリコン複合材、金属、セラミック、多結晶性シリコンおよびこれらの複合材から成る群から選択された材料からなる請求項１７に記載の方法。
  21. 前記標識が前記入射光源から直接捕獲した光と前記光学支持体による前記入射光源の反射により捕獲された光によって励起される請求項１７に記載の方法。
  22. 受容層が抗体である請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 受容層が核酸である請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
  24. 受容層がオリゴヌクレオチド、キレート剤、酵素、酵素基質、バクテリア、細菌性ピリ、細菌性鞭毛状物、核酸、ポリサッカライド、脂質、タンパク質、炭水化物、金属、ウイルス、ホルモン、およびこれらの物質に対するレセプターからなる群から選択される物質から形成される請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
  25. 前記被検体が、抗体、酵素、ホルモン、ポリサッカライド、脂質、炭水化物、および核酸から成る群から選択される物質である請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
  26. 前記被検体が抗原である請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
  27. 前記被検体が有機性小分子、麻薬、環境薬剤の１又は２以上から選択される請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
  28. 前記被検体が蛋白質である請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
  29. 前記検出器および光源が、試験支持体に対して等角度で配置された請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
  30. 前記光源が単色性または多色性である請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
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