KR100761639B1 - 회절계 바이오센서의 제조를 위한 잉크-젯 인쇄의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 매질 중에 존재하는 피분석물을 검출 및 정량하는, 비용이 저렴하고 감도가 높은 시스템 및 방법을 제공한다. 이 장치는 결합제, 예를 들어 항체의 특정 패턴이 표면 상에 인쇄된 금속화 필름을 포함한다. 표적 피분석물이, 결합제가 인쇄된 플라스틱 필름의 특정 영역에 부착된 후, 투과광 및(또는) 반사광의 회절이 피분석물의 물리적인 치수 및 소정의 정확한 배치를 통해 발생한다. 육안으로 또는, 임의로는 센싱 장치를 사용해 쉽게 볼 수 있는 회절상이 생성된다.

바이오센서, 회절, 투과, 반사, 센싱 장치

Description

회절계 바이오센서의 제조를 위한 잉크-젯 인쇄의 용도 {Use of Ink-Jet Printing to Produce Diffraction-Based Biosensors}

본 발명은 일반적으로 매질 중에서 피분석물을 검출하는 분야에 속하며, 보다 구체적으로는 매질 중 피분석물의 존재를 표시할 수 있는 센싱 장치에 관한 것이다.

다양한 매질에서 다양한 피분석물을 검출하는 많은 시스템 및 장치가 있다. 이들 시스템 및 장치의 대부분은 비교적 고가이며, 시험을 수행하기 위해 숙련된 기술자를 필요로 한다. 많은 경우, 피분석물의 존재 여부를 신속하고 저렴하게 측정하는 것이 유리할 것이다. 제조가 용이하고 제조 비용이 저렴하며, 크기가 작은 피분석물을 포함한 피분석물을 신뢰성 있고 높은 감도로 검출할 수 있는 바이오센서 시스템이 요구된다. 또한, 최적 스케일-업 프로세싱이 가능한 바이오센서를 쉽고 융통성있게 제조하는 방법이 필요하다.

샌드스트롬 (Sandstrom) 등의 문헌 [Sandstrom et al., 24 Applied Optics 472, 1985]에는 유전체 필름으로서 형성된 일산화규소층과 규소층이 있는 규소 광학 기판의 사용이 기재되어 있다. 샌드스트롬 등은 필름의 두께가 변하면 광학 기판의 특성이 변하여 필름의 두께에 따라 다른 색상이 나타남을 지적하였다. 필름 의 두께는 관찰되는 색상과 연관성이 있으며, 광학 기판의 상면에 제공된 필름이 가시적인 색상 변화를 일으킬 것이다. 이 문헌의 저자들은 수학적 모델을 이용하여 색상 변화를 정량할 수 있음을 지적하였고, 다음과 같이 진술하였다: "컴퓨터 모델을 이용하여 수행한 계산으로 다층 구조를 이용한 경우 광학 특성이 매우 소량 얻어짐을 알 수 있으나, 표면의 바이오층은 광학 특성이 다층 구조 내부의 계면에 의해 주로 결정되기 때문에 그러한 구조의 반사를 거의 변화시키지 않는다. 가장 감도가 높은 바이오층 검출 시스템은 단일층 코팅이지만, 대부분의 다른 적용시 시스템의 성능은 부가의 유전체층에 의해 얻을 수 있다."

샌드스트롬 등은 금속 상의 금속 산화물로부터 형성된 슬라이드가 특정한 단점을 가지고 있으며, 금속 이온의 존재는 또한 다수의 생화학적 적용에 유해할 수 있음을 지적하였다. 샌드스트롬 등은 이상적인 최상단 유전체 필름은 일산화규소층이 주변 대기에서 침착될 때 자발적으로 형성되는 2 내지 3 nm 두께의 이산화규소이고, 40 내지 60 nm의 일산화규소층 상의 70 내지 95 nm의 이산화규소층이 유리 또는 플라스틱 기판 상에 사용될 수 있음을 지적하였다. 또한, 그들은 일산화규소의 선택적인 에칭, 이산화규소 표면의 디클로로디메틸실란으로의 처리, 및 항원 및 항체의 바이오층 도포에 의해 일산화규소의 쐐기 (wedge)를 형성하는 것에 대해 설명하고 있다. 이 쐐기 구조물로부터, 이들은 타원계로 필름의 두께를 측정할 수 있었고, "최대 콘트라스트는 간섭 색상이 보라색에서 파란색으로 변하는 약 65 nm의 영역에서 나타난다"고 진술하였다. 이들은 그러한 시스템의 감도가 충분히 높아서 부동화된 항체에 의해 단백질 항원을 검출할 수 있다고 지적하였다. 이들은 "주어진 디자인이 넓은 범위에 적용하기에 충분할 정도로 감도가 높다"고 결론을 내렸다. 이 물질, 즉 유리, 규소 및 산화규소는 화학적으로 불활성이며, 연구 대상인 생화학적 반응에 영향을 미치지 않는다. 상기 컴퓨터 조작을 이용하여 다른 분야에 대해 최적인 슬라이드를 디자인할 수 있다. 이런 슬라이드는 제조 가능하고, 슬라이드의 질은 산업적 방법에 의해 보장되며, 현재 2가지 디자인이 상업적으로 시판되고 있다.

쿠마르 (Kumar) 등에 허여된 미국 특허 제5,512,131호는 금속으로 코팅된 중합체 기판을 포함하는 장치에 대해 기재하고 있다. 항체-결합 단백질 층이 코팅된 기판에 고정되어 있다. 이 장치는 스탬핑을 위한 공정에서 사용되거나 스위치로서 사용된다. 피분석물이 이 장치에 결합할 때 회절 패턴이 생성된다. 분광계와 같은 가시화 장치를 사용하여 회절 패턴의 존재를 측정할 수 있다.

그러나, 쿠마르 등에 의해 설명된 장치는 여러 가지 단점을 지니고 있다. 한 가지 단점은 임의의 회절 패턴을 보기 위해 별도의 가시화 장치가 필요하다는 것이다. 가시화 장치가 필요하기 때문에, 쿠마르 등이 장치는 육안으로 피분석물의 존재를 측정할 수 없으므로 다수의 샘플을 시험할 수 없다.

보가르트 (Bogart) 등의 미국 특허 제5,482,830호에는 빛이 부딪히면 이에 반응하여 제1 색상을 나타내는 광학 활성 표면이 있는 기판을 포함하는 장치에 대해 기재되어 있다. 이 제1 색상은 방사되는 빛의 스펙트럼 분포로서 정의된다. 또한, 기판은 (제1 색상에서 나타나는 조합과는 다른 빛 파장의 조합을 갖거나, 또는 상이한 스펙트럼 분포를 갖거나, 또는 제1 색상에서 나타나는 것과는 다른 빛의 파장 1종 이상의 강도를 가짐으로써) 제1 색상과는 다른 제2 색상을 나타낸다. 이 제2 색상은 피분석물이 표면에 존재할 때 동일한 빛에 반응하여 나타난다. 한 색상에서 다른 색상으로 변하는 것은 특정 기구를 이용하거나, 또는 육안으로 검출할 수 있다. 그러한 감도 높은 검출은 상기 샌드스트롬 및 니그렌 (Nygren)에 의해 설명되는 장치보다 우수하며, 상업적으로 발전 가능하고 경쟁적인 방식으로 장치를 사용할 수 있게 해준다.

그러나, 보가르트 등의 특허에 기재된 방법 및 장치는 여러 가지 단점을 지니고 있다. 한가지 단점은 장치의 비용이 높다는 것이다. 이 장치의 다른 문제점은 웨이퍼에 놓여 있는 다양한 층들을 신뢰성 있게 판독하도록 제어하기가 어렵다는 것이다.

종래 기술은 또한 특정 용도에서 젯팅 기술의 사용을 포함한다. 예를 들어, 헤이에스 (Hayes) 등에게 허여된 미국 특허 제4,877,745호에는 피분석물을 분석하는 방법 및 장치가 개시되어 있다. 상기 방법 및 장치는 정확한 양의 진단 시약 및 유체 샘플을 기판상에 분산시키는데 사용되는 젯팅 챔버를 포함한다. 상기 장치는 기판상에 진단 시약 또는 유체 샘플 중 하나를 배치하는 수단을 사용한다. 이어서, 진단 시약 또는 유체 샘플 중 나머지 하나를 먼저 배치된 유체와 반응하도록 젯팅한다. 상기 방법은 목적한 양의 유체가 기판상에 분산될 때까지 전기기계적인 수단을 사용하여 진단 유체 및 샘플을 교대로 잉크-젯팅한다. 이 방법은 기판을 젯팅 챔버에 대응하게 배치하는 것 및 전기적 펄스를 사용하여 진단 유체를 기판에 소정의 방식으로 도포하는 것을 포함한다. 장치의 사용동안 부피가 변화되 는 접을 수 있는 용기에 진단 시약을 넣는다. 그러나, 상기 방법은 피분석물-특이적 수용체 물질 및 시험하려는 샘플 둘 다를 인쇄하기 때문에, 조작이 어려우며 복잡한 전기기계적 수단을 필요로 한다.

따라서, 제조가 용이하고 제조 비용이 저렴하며, 검출하려는 피분석물을 신뢰성 있고 높은 감도로 검출할 수 있는 바이오센서 장치가 요구되고 있다.

<발명의 개요>

본 발명은 매질 중 존재하는 피분석물을 검출하기 위한 저렴하고 높은 감도의 장치 및 방법을 제공한다. 상기 장치는 그 위에 항체 또는 티올화된 항체 또는 DNA를 포함하는 결합제의 특정 패턴이 잉크-젯 인쇄된 금속화 중합체 필름과 같은 기판을 갖는 바이오센싱 장치를 포함한다. 또는, 항체-결합 단백질, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G를 잉크-젯 인쇄할 수 있다. 이어서 목적 피분석물에 대해 특이적인 항체에 노출시켜 상기 항체가 패턴대로 침착되게 한다. 전체적으로, 이 방법으로 모듈식 생산 포맷이 가능하고 상이한 피분석물에 사용하기 위한 패턴화된 단백질의 대형 롤로 제조할 수 있다. 이어서, 필요하다면 최종 생성물을, 필요한 항체에 노출시킴으로써 제조할 수 있다.

빛을 산란시킬 수 있는 표적 피분석물이, 단백질 및(또는) 항체의 패턴이 형성되어 있는 중합체 필름의 특정 영역에 부착되면, 피분석물의 물리적인 치수 및 소정의 정확한 배치를 통해 투과광 및(또는) 반사광의 회절이 발생한다. 눈으로 또는 임의로는 센싱 장치를 이용해 쉽게 볼 수 있는 회절상이 생성된다.

본 발명은 패턴화된 결합제의 잉크-젯 인쇄 방법을 이용한다. 이들 결합제 들은 항체 또는 단백질일 수 있다. 단백질을 사용할 경우, 이들 단백질은 항체에 결합하여 수용체 항체에 대한 최적의 배향을 유지할 뿐만 아니라 표면상에 이들을 패턴화시킨다. 수용체 항체는 사용한 단백질에 따라 특정 피분석물 또는 피분석물류에 대해 특이적이다.

패턴화된 항체는 피분석물의 패턴화된 배치 또는 그 위의 결합을 야기한다. 본 발명에 의해 제조된 바이오센싱 장치는 피분석물의 크기에 따라 2 가지 방법 중 하나로 사용될 수 있다. 미생물과 같이 그들 자신에 의해 회절을 야기할 수 있는 피분석물의 경우, 시스템은 우선 선택한 피분석물을 함유하는 매질에 바이오센싱 장치를 노출시키고 적절한 배양 기간 후 레이저와 같은 빛을 필름을 통해 투과시키거나, 필름으로부터 빛을 반사시킴으로써 사용된다. 피분석물이 매질 중 존재하여 패턴화된 항체 층에 결합되어 있다면, 빛은 가시상을 형성하는 방식으로 회절된다.

임의로는, 단백질 또는 DNA와 같은 매우 작은 피분석물의 경우, 시스템에서 표적 피분석물 및 바이오센서에 결합할 수 있으며 높이 및(또는) 굴절률에서 실질적인 변화를 일으킴으로써 바이오센서의 회절 효율을 증가시키고 작은 피분석물의 검출을 가능하게 할 수 있는 "회절 증진 성분"을 사용할 수 있다. 사용시, 표적 피분석물은 회절 증진 성분에 부착한 후 바이오센서에 부착하거나, 또는 항체의 패턴이 형성되어 있는 중합체 필름의 선택된 영역에 직접 부착한다. 이어서, 투과광 및(또는) 반사광의 회절이 피분석물의 물리적인 치수 및 정해진 정확한 배치를 통해 발생한다. 눈 또는 임의로는 센싱 장치를 이용해 쉽게 볼 수 있는 회절상이 생성된다.

상기 센서를 사용하는 또다른 경우는 항체인 피분석물의 검출을 포함한다. 센싱 장치는 패턴화된 항체-결합 단백질 만을 포함할 수 있고, 이어서 검출하려는 항체에 대해 특이적인 항체를 갖는 매질과 회절 증진 입자를 합한 것에 노출할 수 있다. 입자상의 항체는 바람직하게는, 패턴화된 항체-결합 단백질에는 비-특이적인 결합을 하지 않고 대신 피분석물 항체도 결합한 경우에만 결합하도록 선택된다. 이러한 방식으로, 회절 증진 성분은 피분석물 항체가 존재할 경우 높이 및(또는) 굴절률에서 실질적인 변화를 야기하여 회절상이 형성되도록 할 것이다. 동일한 포맷을 다른 면역분석 포맷, 예를 들어 측면 유동 분석 또는 마이크로웰 플레이트와 함께 사용할 수 있다는 것이 고려되고 있다.

따라서, 그 위에 결합된 피분석물이 있는 항체 및 항체층은 광학 회절 패턴을 생성하여 피분석물의 존재를 나타낼 수 있다. 빛은 가시 스펙트럼 내의 것일 수 있으며, 필름으로부터 반사되거나 또는 필름을 통해 투과될 수 있다. 빛은 백색의 점광원이거나, 또는 단색 전자기 방사선일 수 있다. 본 발명은 가요성 지지체 상에 직접 인쇄하는데 사용할 수 있다. 지지체는 항체가 인쇄되는 금 또는 다른 적합한 금속 또는 금속 합금의 층을 포함할 수 있다.

본 센서를 사용하는 또다른 경우는 뉴클레오티드계 피분석물, 예를 들어 DNA의 검출이다. 이러한 경우에는 표적에 상보적인 패턴화된 올리고뉴클레오티드를 갖는 센싱 장치를 사용하며, 이 센싱 장치는 표적 DNA의 또다른 절편에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 갖는 매질과 회절 증진 입자를 합한 것에 노출된다. 뉴클레오티드는 이어서 상기 논의된 방식으로 회절상을 조사하여 검출된다.

본 발명은 대량 생산될 수 있는 저가의 1회용 바이오센서를 제공한다. 본 발명은 항체 또는 항체-결합 단백질을 이용한, 패턴이 형성된 표면의 사용을 포함한다. 통상적으로, 항체-결합 단백질은 불변부 (F_c)를 통해 항체와 결합하므로 항체의 항원-결합부 (F_ab)는 자유로와 결합 활성이 최적이 된다. 패턴화된 단백질 표면의 제조는 센서 제조에서 최대 융통성도 또한 허용한다. 패턴화된 영역에 목적 항체를 포획하는 최종 생산 단계는 목적하는 피분석물에 따라 필요하다면 (즉, 제조시에) 수행될 수 있다.

본 발명의 바이오센서는 피분석물을 검출하기 위한 단일 시험용으로 제조되거나, 또는 다수 시험 장치로서 구성될 수 있다. 본 발명의 바이오센서는 기저귀와 같은 의류의 의학적 상태 또는 오염을 검출하고, 미생물에 의한 오염을 검출하는데 사용될 수 있다.

바람직한 잉크-젯 인쇄 방법으로, 항체와 같은 온도-감응성 단백질의 인쇄시에는 압전기 프린터-헤드를 갖는 프린터가 바람직할 수 있다.

본 발명은 또한 콘텍트 렌즈, 안경, 유리판, 약병, 용매 용기, 물병, 접착 붕대 등의 오염을 검출하는데도 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 및 다른 특징과 장점은 하기 개시된 실시태양의 상세한 설명을 참고하면 더욱 명백해질 것이다.

도 1은 매질 중 몇몇 상이한 피분석물을 동시에 측정가능한 바이오센서의 평 면도이다.

도 2는 피분석물의 존재를 나타내는, 잉크-젯 인쇄된 특징부에서 패턴화된 미립자의 현미경 사진을 보여준다.

본 발명은 매질 내에 관심있는 피분석물의 존재 또는 양을 검출하는 개선된 바이오센싱 장치, 및 상기 바이오센싱 장치의 제조 및 사용 방법을 특징으로 한다. 본 발명에 의해 검출될 수 있는 피분석물에는 박테리아, 효모, 진균류 및 바이러스와 같은 미생물이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 선행 기술의 장치와는 달리, 본 발명의 장치는 매질 중에 존재하는 매우 소량의 피분석물을 단지 수 분 내의 신속한 분석법으로 검출할 수 있게 해준다. 또한, 상기 바이오센싱 장치는 다른 바이오센싱 장치들보다 훨씬 저렴한 비용으로 및 빠른 속도로 제조될 수 있다.

본 발명에는 플라스틱 필름과 같은 중합체 필름 상에 결합제를 잉크-젯 인쇄하는 방법이 개시되어 있다. 중합체 필름은 또한 금속 코팅을 가질 수 있다. "결합제"는 항체, 예를 들어 티올화 항체, 또는 항체-결합 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명은 고속 제조에 적합한 쉬운 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 의해, 피분석물의 존재를 나타내는 빛의 회절에 근거한 1회용 바이오센서의 개발이 가능하게 되었다. 표적 피분석물이 결합제를 함유하는 중합체 필름의 특정 지역에 부착되면, 피분석물의 물리적 치수 및 정해진 정확한 배치를 통해 투과광 및(또는) 반사광의 회절이 발생한다. 예를 들어, 효모, 진균류 또는 박테리아는 표면상에 형성 된 패턴에 배치될 때 가시광에 대한 회절 성분으로 작용하기에 충분할 정도로 크다. 추가적으로, 본 발명은 바이오센서의 회절 효율을 증가시켜 임의 개수의 상이한 피분석물을 검출할 수 있도록 하는 회절 증진 성분을 포함할 수 있다. 간단한 회절상을 형성하는 것 이외에, 피분석물의 패턴은 홀로그래피 센싱 화상의 형성 및(또는) 가시적인 색상의 변화를 가능하게 할 수 있다. 따라서, 홀로그램의 출현 또는 기존 홀로그램의 변경은 양성 반응을 의미할 것이다. 투과광의 회절에 의해 형성된 패턴은, 피분석물의 수용 물질로의 결합시에 하나의 패턴에서 다른 패턴으로 패턴 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 형태일 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 피분석물을 본 발명의 바이오센싱 장치와 접촉시킨 후 1 시간이 안 되어서 회절 패턴을 인식할 수 있다.

피분석물과의 상호작용시 광 회절을 생성할 수 있는 회절 격자는 바람직하게는 주위의 매질과는 상이한 굴절률을 갖는다. 매우 작은 피분석물, 예를 들어 바이러스 또는 분자는 작은 피분석물에 대해 특이적인 대형 입자를 사용함으로써 간접적으로 검출될 수 있다. 작은 피분석물을 검출할 수 있는 한 실시태양은 라텍스 비드와 같은 입자를 관심있는 피분석물에 특이적으로 결합하는 단백질 물질로 코팅하는 것을 포함한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 입자는 유리, 셀룰로오스, 합성 중합체 또는 플라스틱, 라텍스, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 단백질, 박테리아 또는 진균 세포 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 입자의 형상은 바람직하게는 구형이지만, 입자의 임의의 구조적 및 공간적 형상을 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 입자들은 길죽한 (sliver) 형, 타원형, 정육면체형 등일 수 있 다. 바람직한 입자 크기는 직경이 약 0.2 ㎛ 내지 50.0 ㎛, 바람직하게는 약 0.4 내지 1 ㎛의 범위이다. 입자의 조성도 또한 변화될 수 있다.

표면상에 부동화/패턴화되는 항체는 회절 증진 성분과의 결합에 사용되는 피분석물 상의 에피토프와는 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 것이다. 따라서, 바이러스 입자와 같은 작은 피분석물이 있는 매질을 검출하기 위해서는 매질을 우선 바이러스 입자가 결합되는 회절 증진 성분 입자, 예를 들어 라텍스 입자에 노출시킨다. 그 후, 회절 증진 성분 입자들을 임의로 세척하고 바이러스 특이적 항체로 인쇄된 중합체 필름에 노출시킨다. 이어서 항체를 성분 입자 상에서 바이러스성 입자에 결합시켜 필름상의 항체와 동일한 패턴으로 성분 입자를 고정시킨다. 결합된 성분 입자들이 가시광의 회절을 야기할 것이기 때문에, 회절 패턴이 형성되는데, 이는 액체 중에 바이러스 입자가 존재함을 나타낸다. 추가적으로, 중합체 필름은 그 위에 금속 코팅을 포함할 수 있다. 이 경우, 인쇄된 항체 층은 필름의 금속화 표면에 배치되게 된다.

또는, 기판을 피분석물 함유 매질에 먼저 노출시키고, 피분석물을 인쇄된 피분석물-특이적 항체와 결합하도록 함으로써 피분석물을 검출할 수 있다. 이어서, 회절 증진 성분 입자 함유 용액을 피분석물이 결합되어 있는 기판과 접촉시킨다. 그 후, 입자는 피분석물에 결합한다. 결합된 성분 입자가 가시광선의 회절을 야기하므로 회절 패턴이 형성되는데, 이는 액체 중에 피분석물이 존재함을 나타낸다.

또다른 실시태양으로, 바이오센서, 회절 증진 성분 입자 및 피분석물 함유 매질을 동시에 혼합할 수 있다. 이는 상기 논의된 결합 절차가 조합되는 결과를 가져온다. 피분석물의 일부는 회절 증진 성분와 먼저 결합된 후 기판과 결합될 것이다. 다른 피분석물들은 기판과 먼저 결합한 후 성분 입자와 결합될 것이다. 점광원을 센서 전체에 비출 때, 회절 패턴이 형성되는데, 이는 액체 중에 피분석물이 존재함을 나타낸다.

마지막으로, 역시 또다른 실시태양에서, 회절 증진 성분을 이용하는 회절 진단 장치의 사용자가 수행해야 하는 단계의 수가 감소될 수 있다. 이 접근법은 결합하지 않은 표지 입자 및 샘플로부터의 임의 잔류 액체를 제거하기 위한 흡상제 (wicking agent)의 사용을 포함한다. 흡상제는 사용자에게 부담되고 보다 어려울 수 있는 임의의 부가적인 세정 단계를 피하게 해준다. 또한, 작은 구멍 (예를 들어, 4/32 인치 (0.32 ㎝))이 흡상제의 중심에 뚫려 있어서, 샘플과 잉여 입자가 흡상되면, 흡상 물질을 제거하지 않고도 이 구멍을 통해 사용자가 즉시 회절상을 확인하게 해준다. 흡상제의 예로는 니트로셀룰로오스 막, 셀룰로스 아세테이트 막, 및 유리 미세섬유 구조가 포함된다.

또한, 막의 공극 크기는 흡상의 속도 및 힘을 제어하기 위해 달라질 수 있다. 막의 공극 크기는 진단 장치의 정밀도에 영향을 미칠 수 있으며, 1단계 장치를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 1단계 장치는 금-코팅된 폴리에틸렌-테레프탈레이트 기판 (금/마일러 (등록상표, MYLAR))와 같은 기판 상에 잉크-젯 인쇄된 포획 항체로 구성되며, 이는 기판의 표면에서 미리 건조된 표지 입자를 갖게 된다. 또한, 잘려나간 구멍이 있는 작은 공극 크기의 막 (예를 들어, 0.45 미크론의 니트로셀룰로오스)이 장치의 상단에 놓여 있어서 그 장치를 완성하 게 된다. 사용자는 단순히 시험하려는 샘플 (예를 들어, 혈청 또는 혈액)을 첨가한 후, 일단 흡상이 발생하면 회절상을 관찰하기만 하면 된다. 공극 크기가 작으면 항원-항체 상호작용이 일어나는 데 필요한 시간동안 적당하게 배양되도록 충분히 흡상을 지연시킨다. 별법으로, 흡상은 흡상제 구멍의 주변에 침식성 시약을 사용함으로써 지연될 수도 있다. 이 시약은 특정 시간 후에 결국 용해되거나 유도체화되어 흡상이 일어나게 된다.

본 발명의 장치를 사용하여 검출될 것으로 예상되는 피분석물로는 박테리아; 효모; 진균; 바이러스; 류머티즘성 인자; IgG, IgM, IgA 및 IgE 항체 등의 항체; 암발생성 항원; 연쇄상구균 A군 항원; 바이러스 항원; 자가면역 질병과 관련된 항원; 알레르겐; 종양 항원; 연쇄상구균 B군 항원; HIV I 또는 HIV II 항원; 또는 이와 같은 그리고 다른 바이러스 반응성 숙주 (항체); RSV에 또는 바이러스 반응성 숙주 (항체)에 특이적인 항원; 항원; 효소; 호르몬; 다당류; 단백질; 지질; 탄수화물; 약물 또는 핵산; 살모넬라 종; 칸디다 알비칸스 및 칸디다 트로피칼리스 등의 칸디다 종; 살모넬라 종; 수막염균 A군, B군, C군, Y군 및 W 아군 135, 페렴연쇄상구균, 대장균 K1, 헤모필루스 인플루엔자 B형; 미생물로부터 유도된 항원; 하프텐, 남용 약물; 치료 약물; 환경적 약제; 및 간염 특이적 항원을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 특정종의 미생물에 대한 영양물이 결합제 층에 혼입될 수 있다. 이런 식으로, 먼저 본 발명의 바이오센서를 혼입하려는 영양물과 접촉시키고 이어서 결합된 미생물의 성장에 적합한 조건하에서 바이오센서를 배양함으로써 매우 저농도의 미생물도 검출할 수 있다. 회절 패턴을 형성하기에 충분한 유기물이 존재할 때까지 미생물을 성장시킨다. 물론, 일부 경우에는, 패턴화된 결합제 상에 영양물이 존재하지 않더라도 회절 패턴을 형성하기에 충분할 정도로 미생물이 증식할 수 있다.

본 발명의 일부는 중합체 필름 또는 금속화 중합체 필름상에 항체와 같은 수용체를 패턴화시키는데 사용되는 방법이다. 일부에서, 상기 방법은 항체에 결합하는 잉크-젯 인쇄 단백질을 포함한다. 이들 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 뿐만 아니라 이들의 재조합 형태도 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이들 단백질의 상업적인 형태, 예를 들어 지메드 (Zymed, 캘리포니아주 샌프란시스코)의 카팔록 (KAPPALOCK, 상표명)도 또한 적합하다. 따라서, 이 단백질 재료는 상대편으로 관심있는 피분석물에 특이적인 항체와 특이적인 결합 쌍을 형성하는 염기 물질로 한정된다.

본 발명에서, 항체와 같은 생물학적 활성 물질을, 금속화 중합체 필름 (예, 금/마일러 기판)에 잉크-젯 프린터를 사용하여 소정의 패턴으로 인쇄한다. 720 dpi의 해상도는 표적 피분석물 및 표지된 미립자가 결합되면 회절상을 생성할 수 있는 배열을 제공한다. 그러나, 다른 해상도도 또한 사용할 수 있다. 더 낮은 해상도의 잉크-젯 프린터도 또한 충분히 작은 특징부 크기 (40 - 100 미크론의 직경)을 제공하여 회절상을 형성한다. 항체는 티올화될 수 있고, 그 결과 얻어진 포스페이트-완충된 용액은 또한 글리세린 (40 중량% 이하)을 가질 수 있는데, 글리세린은 필름상에 인쇄된 특징부들의 번짐을 방지하기 위해 용액에 첨가된다. 얻어진 장치는 상기 논의된 바와 같이 사용될 수 있다. 회절상이 형성된다면 피분석물이 존재함을 의미하는 것이다. 회절각은 특징부 간격에 반비례하기 때문에, 인식가능한 회절상을 얻기 위해서는 광원으로부터의 거리가 더 멀어야 한다는 것이 밝혀졌다. 더 용이한 검출을 위해 특수 관찰기기를 사용할 수도 있다.

패턴화된 단백질에 결합된 수용체 물질은 관심 대상인 피분석물(들)에 특이적으로 결합하는 능력으로 정의된다. 선택된 관심 대상인 피분석물이 무엇이든 간에, 단백질 물질은 관심 대상인 피분석물과 특이적으로 결합되도록 고안된다. 바람직한 실시태양에서, 바이오센싱 장치는 관심 대상인 피분석물이 항체와 회절 증진 성분간에 놓일 때 다색광의 투과에 반응하여 눈으로 식별가능한 패턴을 제공하도록 만들어지고 배열된다. 또다른 실시태양에서, 피분석물이 빛을 회절시키기 충분할 정도로 큰 경우, 회절 증진 성분이 필요없을 수 있다.

많은 경우에, "차단제"는 비특이적 결합을 방지하기 위해 필요할 수 있다. 본원에 사용된 "차단제"란 용어는 피분석물 이외의 물질이 표면 (패턴 영역 또는 비패턴 영역)에 비특이적으로 결합하는 것을 "차단하거나" 방지하는, 센서 표면에 부착되는 시약을 의미한다. 차단 단계는 이미 잉크-젯 인쇄된 표면의 후처리 ("후차단") 단계로서 행해지고, 비-잉크-젯 인쇄 영역을 다른 티올로 충전시키는 표준 기술이다. 그러나, 본 발명자들은 후차단 기술에 비해 "전차단" 기술이 바람직함을 발견하였다. 전차단 기술에서, 기판 표면이 티올을 함유하지 않은 차단제로 미리 처리되고 이어서 잉크-젯 인쇄된다. 어떠한 이론에도 얽매이길 원치 않지만, 이론상으로 (일반적으로 황 함유) 잉크-젯 인쇄 물질이 물리흡착 차단제를 대신함 으로써 인쇄된 물질이 기판 표면에 직접적으로 결합하게 된다. 필요에 따라, 후속적인 후차단을 또한 수행할 수 있다. 차단제로는 β-카세인, 우혈청 알부민과 같은 알부민, 플루로닉(pluronic) 또는 다른 계면활성제, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 또는 상기 화합물의 황 유도체, 및 당업자에게 공지된 임의의 다른 차단 물질을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

관심 대상인 피분석물 함유 매트릭스는 고체, 기체 또는 체액, 예를 들어 간질액, 점액, 타액, 소변, 대변, 조직, 골수, 뇌 척수액, 혈청, 혈장, 전혈, 활액 객담, 완충액, 추출액, 정액, 질 분비액, 심막, 위, 복막, 늑막, 인두 면봉 (throat swab) 또는 다른 세척액 등일 수 있다. 관심 대상인 피분석물은 항원, 항체, 효소, 독소, 환경적 약제, 세포질 성분, 털 또는 편모 성분, 단백질, 다당류, 약물, 또는 항체에 의해 인식가능한 임의의 다른 물질일 수 있다. 예를 들어, 박테리아에 대한 수용체 물질은 표면 멤브레인 성분, 단백질 또는 지질, 다당류, 핵산 또는 효소를 특이적으로 결합시킬 수 있다. 박테리아의 지표가 되는 피분석물은 당류 또는 다당류, 효소, 핵산, 멤브레인 성분, 강글리오시드 또는 박테이라에 반응하여 숙주에 의해 생성된 항체일 수 있다. 피분석물의 존재는 감염성 (박테리아성 또는 바이러스성) 질병, 암, 알레르기, 또는 다른 의학적 질환 또는 증상을 나타낼 수 있다. 피분석물의 존재는 물 또는 음식물 오염 또는 다른 유해 물질을 나타내는 지표일 수 있다. 피분석물은 약물 남용을 나타내거나 또는 치료제의 수준을 모니터링할 수 있다.

일부 경우에, 피분석물은 단순히 수용체 물질을 결합시킬 뿐 아니라 관찰가 능할 정도로 수용체 물질의 변형을 일으킬 수 있다. 이같은 상호작용은 시험 표면에서 질량 증가 또는 시험 표면에서 수용체 물질의 양 감소를 일으킬 수 있다. 수용체 물질의 양을 감소시키는 예로는 특이적인 고정된 기질과 분해성 효소 또는 물질의 상호 작용이다. 이 경우, 관심 대상인 피분석물과의 상호작용 전에는 회절 패턴을 관찰할 수 있으나, 피분석물이 존재한다면 회절 패턴은 사라지게 될 것이다. 피분석물과 수용체 물질과의 결합, 혼성화, 또는 상호작용이 일어나는 특이적 메카니즘은 본 발명에 중요하지 않지만, 최종 분석 프로토콜에 사용된 반응 조건에 영향을 미치지 않는다.

피분석물이 잔류할 수 있는 매질은 고상, 겔형, 액상 또는 기상일 수 있다. 체액 중의 피분석물을 검출하려는 목적을 위해, 유체는 소변, 혈청, 혈장, 척수액, 객담, 전혈, 타액, 요생식기 분비물, 대변, 심막, 위, 복막, 늑막 세척액, 질 분비액, 또는 인두 면봉으로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는며, 상기 방법은 임의로는 굴절 패턴의 출현을 측정하기 위해 분광광도계를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 바이오센싱 장치에 사용될 수 있을 것으로 사료되는 가장 일반적인 기체는 공기이다.

본 발명의 바이오센싱 장치는 패턴화된 결합제를 기판, 바람직하게는 금속화 중합체 필름에 잉크-젯 인쇄한 후 항체에 노출시켜 패턴화된 항체를 달성하는 방법, 이로부터 제조된 조성물 및 이 조성물의 유용성을 이용한다. 패턴화된 결합제 층은 피분석물이 결합할 수 있는 항체의 배치를 제어할 수 있다. 본 원에 사용된 "패턴화된 결합제 층"이란 용어는 연속된 패턴을 포함하는 기판에 임의의 패턴으로 결합제 (예, 단백질 또는 항체)와 바람직한 항체를 합한 것을 의미한다.

패턴화된 결합제 층을 갖는 필름이 항체와 반응할 수 있는 피분석물에 노출될 때, 필름은 항체와 관심 대상인 피분석물과의 반응에 따라 달라지는 광학 회절 패턴을 형성할 것이다. 액체는 물과 같은 고표면장력 유체일 수 있다. 빛은 가시 스펙트럼 내에 존재할 수 있고, 필름으로부터 반사되거나, 이를 투과할 수 있고, 피분석물은 패턴화된 결합제 층과 반응하는 임의의 화합물일 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 이 방법은 기판이 굴절률의 변화를 야기하는 조건하에서 피분석물을 잠재적으로 함유하는 시험 시료와 기판을 접촉시키는 것을 포함한다. 빛이 패턴화된 결합제 층이 있는 필름을 통해 투과하여, 가시 회절 패턴이 형성되며 상기 패턴은 표면에 빛을 향하게 함으로써 또는 기판을 통해 직접 봄으로써 가시화될 수 있다.

다르게는, 회절상은 점광원 및 광학 성분, 예를 들어 렌즈 및 거울로 구성된 간단한 관찰 장치를 이용하여 가시화될 수 있다. 이러한 관찰기는 잉크-젯 인쇄 방법으로부터 얻어진 시료에 대해 특이적으로 고안될 수 있다. 적절히 고안된다면, 관찰기는 관찰기를 사용하기 않고 훨씬 더 긴 관찰 경로 길이로부터 얻어진 화상 (예, 약 5 피트 (152.4 cm))에 필적하는 핸드-헬드 (hand-held) 장치로부터의 화상 (예, 치수가 약 6 인치 (15.24 cm)임)을 제공할 수 있다. 보통 종래 기술의 접촉 인쇄 방법에 비하여 잉크-젯 프린터로부터 얻어지는 더 넓은 간격 (>50 미크론 기간)으로 인해 관찰기가 없을 경우 더 긴 관찰 경로 길이가 필요로 될 것이다.

한 실시태양에서, 본 발명은 잉크-젯 인쇄 금속화 필름이 딥스틱 (dipstick) 말단에 설치되는 딥스틱형인 것으로 사료된다. 사용시에, 딥스틱은 의심스러운 피분석물이 존재할 수 있는 액체에 침지되고 수 분 동안 유지된다. 그 후, 딥스틱을 제거하고, 이어서 빛을 필름에 투과하거나, 필름 뒤의 빛에 의해 필름을 관찰한다. 패턴이 관찰되면, 피분석물이 액체 중에 존재한다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 단일 지지체 스트립을 사용하여 복수개의 피분석물에 대해 시험할 수 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 그 위에 인쇄된 패턴 (40)을 각각 갖는 수개의 잉크-젯 인쇄 필름 (20, 25, 30 및 35)를 스트립 (10)에 제공한다. 각각의 잉크-젯 인쇄 필름 (20, 25, 30 및 35)은 상이한 피분석물에 대해 특이적인 상이한 항체를 그 위에 갖는 필름이 있는 금속화 중합체 필름일 수 있다. 본 발명이 각종의 잉크-젯 인쇄 필름과 임의 정렬된 형태를 갖출 수 있어서, 본 발명의 바이오센서 장치의 사용자는 흡상제에 의해 단일 지지체를 사용하여 복수개 피분석물의 존재를 검출할 수 있게됨을 알 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 바이오센서는 뒷면이 접착성인 스티커 또는 전사지에 부착한 후 경질의 표면 또는 용기의 벽에 배치할 수 있다. 바이오센서는 음식물 포장 또는 유리병과 같은 용기의 내부 표면에 배치될 수 있다. 이어서 바이오센서는 가시화되어 피분석물의 존재를 결정할 수 있다.

전형적으로, 5 내지 2000 nm 두께의 금 필름은 폴리에틸렌-테레프탈레이트 필름, Si/SiO₂ 웨이퍼 또는 유리 시트 상에서 지지된다. 티탄과 같은 접착 촉진제는 금과 지지체 간의 접착 촉진제로서 사용될 수도 있다. 결합제는 잉크-젯 인쇄 동안 금 표면에 부착된다.

본 발명의 방법 및 조성물에 대한 보다 상세한 설명은 다음과 같다. 본원에 인용된 모든 공개문헌을 이 거명을 통해 그 전문이 본 명세서에 참고로 인용된다.

임의의 중합체 필름이 본 발명에 적합하다. 바람직하게는, 중합체 필름은 플라스틱 필름이다. 더욱 바람직하게는, 중합체 필름은 또한 그 위에 침착된 금속 코팅을 가질 수 있다. 플라스틱 필름으로는 폴리에틸렌-테레프탈레이트 (예를 들어, 마일러 (등록상표, MYLAR)), 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌, 아크릴로니트릴-메틸 아크릴레이트 공중합체, 셀로판, 셀룰로오스계 중합체, 예를 들어 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 트리아세테이트, 셀룰로오스 트리아세테이트, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 아이오노머 (에틸렌 중합체) 폴리에틸렌-나일론 공중합체, 폴리프로필렌, 메틸 펜텐 중합체, 폴리비닐 플루오라이드 및 방향족 폴리술폰과 같은 중합체를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 플라스틱 필름은 80% 초과의 광학 투명도를 갖는다. 다른 적합한 열가소성 플라스틱 및 공급원은 예를 들어 문헌 [Modern Plastics Encyclopedia (McGraw-Hill Publishing Co., New York 1923-1996)]과 같은 참고 문헌에 기재되어 있다.

본 발명의 한 실시태양에서, 중합체 필름은 그 위에 금속 코팅을 갖고, 얻어진 금속화 중합체 필름은 약 5% 내지 95%의 광학 투명도를 갖는다. 본 발명에서 사용된 중합체 필름에 대한 보다 바람직한 광학 투명도는 약 20% 내지 80%이다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 중합체 필름은 적어도 약 80%의 광학 투명도를 갖고, 금속 코팅의 두께는 약 20% 이상의 광학 투명도를 유지할 수 있는 정도의 두께이므로 회절 패턴이 반사광 또는 투과광에 의해 생성될 수 있다. 광학 투명도는 필름을 통해 통과하는 가시광의 파장의 가시적인 투과도를 기준으로 한다. 상기 수준의 광학 투명도는 약 10 nm의 금속 코팅 두께에 상응한다. 그러나, 본 발명의 다른 실시태양에서, 금 두께는 약 1 nm 내지 1000 nm일 수 있다.

필름 상에 침착되는 바람직한 금속은 금이다. 그러나, 은, 알루미늄, 크롬, 구리, 철, 지르코늄, 백금 및 니켈, 뿐만 아니라 이들 금속의 산화물과 같은 다른 금속들이 사용될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 관심이 있는 하나의 피분석물에 대해 표면 상에서 다수의 샘플을 동시에 분석할 수 있도록 만들어지고 배열된 광학적으로 활성인 수용성 표면, 및 샘플 및 시약 용액을 표면에 분산시키도록 만들어지고 배열된 자동화된 액체 취급 장치 (예, 피펫팅 장치)를 갖는 광학 분석 장치를 특징으로 한다.

하기에 제공된 설명에 의하여, 본 발명의 광학 시험 표면의 구조에 유용한 광학 재료 및 방법을 제조할 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 피분석물의 직접 검출을 위한 신규한 광학적으로 활성인 시험 표면을 포함한다. 이러한 시험 표면은 시험 표면에 특이적인 패턴으로 인쇄된 피분석물-특이적인 항체를 갖는다. 검출 방법은 관심있는 피분석물을 함유하는 샘플 유체와 상기 장치를 접촉시킨 후 회절 패턴이 형성되는가를 관찰함으로써 투과광 또는 반사광의 회절에서의 변화를 시험 하는 것을 포함한다.

다르게는, 피분석물-특이적인 항체를 부착 층 (즉, 항체-결합 단백질)을 이용하여 결합시킨다. 따라서, 본 발명은 광학 기판을 선택하고, 항체-결합 단백질의 패턴을 인쇄한 후 이를 목적하는 피분석물에 대한 항체에 노출시키는 것을 포함하는 검출 장치를 제공한다.

한 예에서, 피분석물은 뉴클레오티드계 피분석물, 예를 들어 DNA일 수 있다. 표적 DNA에 대한 상보성 올리고뉴클레오티드는 기판위에 잉크-젯 인쇄되고, 이어서 센서는 임의로는 차단 물질, 예를 들어 β-카세인, 알부민, 계면활성제, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올 또는 그의 황 유도체로 차단되고 헹구어지고 공기-건조될 수 있다. 이어서 센서를 관심있는 DNA 스트랜드를 함유하는 피분석물 용액에 넣는다. 다음, 피분석물 DNA의 다른 지역에 상보성인 올리오뉴클레오티드가 있는 회절 증진 성분 입자를 센서에 첨가한다. 센서 및 입자를 이어서 가열한 후 헹굴 수 있다. 그 후, 점광원을 센서 샘플을 통해 투과시키거나 반사시킬 수 있다. 회절상은 DNA 피분석물의 존재하에서 광선의 다른 면에서 볼 수 있을 것이다.

본 발명은 넓은 적용 범위를 가지며, 다양한 특이적 결합 쌍 분석 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치는 항원 또는 항체 검출을 위한 면역분석 방법에 사용될 수 있다. 상기 장치는 직접, 간접 또는 경쟁 검출에 사용하기에 적합할 수 있다.

본 발명의 한 실시태양에서, 항체-결합 단백질 층은 화학식 X-P-Ab를 갖는다.

X는 금속 또는 금속 산화물에 화학흡착을 가능하게 하는 수단으로 선택적이다. 예를 들어, X는 비대칭 또는 대칭인 디술파이드 (-R'SSY', -RSSY), 술파이드 (-R'SY', -RSY), 디셀레나이드 (-R'Se-SeY'), 셀레나이드 (-R'SeY', -RSeY), 티올 (-SH), 니트릴 (-CN), 이소니트릴, 니트로 (-NO₂), 셀레놀 (-SeH), 3가 인 화합물, 이소티오시아네이트, 크산테이트, 티오카르바메이트, 포스핀, 티오산 (thioacid), 디티오산 (dithioacid), 카르복시산, 히드록시산 및 히드록삼산일 수 있다.

P는 X를 이용해 유도될 수 있는 항체-결합 단백질을 나타낸다. Ab는 목적 피분석물에 특이적인 항체를 나타낸다.

다른 실시태양에서, 센싱 장치는 그 위에 결합제 물질, 예를 들어 항체 또는 단백질이 기판 전체의 표면에 도포된 (예, 디핑 또는 전체 표면에의 분무에 의해) 기판을 포함할 수 있다. 결합제는 중합체 필름 또는 금속-코팅된 중합체 필름과 같은 기판의 전체 표면을 덮을 것이다. 다음, 불활성화제, 예를 들어 프로테아제 또는 강음이온성 계면활성제, 예를 들어 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 결합제 물질 일부의 불활성화를 야기하는 방식으로 결합제-코팅된 기판에 인쇄한다. 불활성화된 부분은 기판상에 미리선택된 패턴으로 형성될 것이다. 이어서, 장치의 패턴화된 부분이 불활성일지라도, 장치는 상기 논의된 바와 같이 사용될 것이다. 피분석물은 결합제 물질의 활성 부분에만 부착할 것이다. 투과광 또는 반사광은 또한 육안에 의해, 바람직하게는 특별히 고안된 관찰 장치를 사용하여 볼 수 있는 회절 패턴의 형성을 야기할 것이다.

하기 실시예를 들어 본 발명을 더 설명하나, 이들 실시예에 의해 어떠한 식으로든 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 반대로, 당업자에게는 본 명세서 기재 내용을 숙독한 후 본 발명의 주제에서 벗어나지 않는 한 다양한 다른 실시태양, 변형양태 및 등가양태가 가능하다는 것이 명확하게 이해될 것이다.

<실시예 1>

본 실시예는 단백질 (예, 항체 또는 항체-결합 단백질, 예를 들어 단백질 A)의 티올화 공정에 관한 것이다.

1 g의 단백질에 450 ㎕의 포스페이트 완충 식염수 (PBS, 피어스 (Pierce) 카탈로그 #28372의 지시에 따라 0.1 M 나트륨 포스페이트 및 0.15 M 염화나트륨을 이용해 pH 7.2를 얻음)을 첨가하였다. 그 후, 술포-LC-SPDP (피어스 카탈로그 #21650)의 10 mM 수용액 50 ㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 60 분 동안 반응하도록 한 후, D-염 폴리아크릴아미드 탈염 컬럼 (피어스, 적절한 완충액으로 평형화된 5 ml 층 부피)에 부었다. 그 후 디술파이드 결합의 환원이 수행되었다면 0.1 M 아세트산나트륨 및 0.1 M 염화나트륨으로 pH 4.5로 제조한 아세테이트 완충액을 사용하였고, 단백질 유도체가 디술파이드 형태로 남아있다면 PBS 완충액 (pH 7.2)를 사용하였다. [주의: 후속 환원 단계를 필요로 하지 않기 때문에 PBS 완충액으로부터 제조되는 것이 적합한 형태이지만, 두 형태 모두가 바이오센싱 장치를 제조하는데 적합한 것으로 밝혀졌다.] 각각 500 ㎕의 분획물들을 컬럼으로부터 수집하고 단백질 유도체가 있는 분획물을 쿠마시 (COOMASSIE, 등록상표) 플러스 단백 질 분석을 사용하여 결정하였다.

<실시예 2 내지 7>

실시예 2 내지 7은 잉크-젯 인쇄 기술을 사용하는 센싱 장치에 관한 것이다.

<실시예 2>

연쇄상구균 B군에 대한 티올화 폴리클로날 항체 (예, 조지아주 그래이슨 소재의 리 라보레토리즈 (Lee Laboratories)로부터의 Cat 제M-C664-50L호)를 사용하여 720 dpi로 금-코팅된 폴리에틸렌-테레프탈레이트 마일러 (MYLAR, 등록상표)를 인쇄하였다. 금-코팅된 마일러는 "Icl 453/Au-20"/코팅이었으며, 캘리포니아주 카노가 파크 소재의 코타울즈 퍼포먼스 필름 (Courtaulds Performance Films)으로부터의 19 내지 20 Ω/cm² (+ 20 %)의 평균 표면 저항을 제공하는 금 코팅이 있는 200 게이지 폴리에틸렌-테레프탈레이트 필름이었다. 프린터는 다음과 같이 설정된 잉크 젯 프린터 (예, 엡슨 스타일러스 (Epson Stylus) 640 또는 740 프린터)이었다: 종이 = 사진용 종이; 잉크 = 흑색 잉크만 사용; 인쇄 품질 = 720 dpi; 반명암 = 반명암 없음. 1500 화소/인치의 해상도로 설정된 x,y 배열의 20 MB 화일 (아도베 포토샵 (Adobe Photoshop))이 예 중 하나이다. 인쇄시, 상기는 직경이 40 내지 100 미크론의 범위인 것을 특징으로 하는 항체의 패턴화된 x,y 배열을 제조하며, 이는 피분석물 침착시 회절하는데 적절하다. 인쇄된 필름의 위에 소적으로서 연쇄상구균 B군 항원-소량첨가 (spiked) 완충 용액 (예, pH 7.2에서 포스페이트 완충된 식염수; 항원 = 디프코 (Difco) Cat 제2979-50호) 34 마이크로리터를 배치함으로써, 얻어진 인쇄된 샘플을 상기 용액에 노출시켰다. 5 분 후, 연쇄상구균 B군에 대한 폴리클로날 항체에 결합된 0.5 미크론 입자 11 ㎕를 항원 함유 소적의 위에 직접 피펫팅함으로써 첨가하였다. 입자를 베타 카세인 함유 식염수/트윈 (Tween) 20 용액 (예, 0.005 내지 0.01 % 트윈 20, 0.001 내지 0.01 M NaCl 및 5 mg/ml 베타 카세인) 중 약 10 %의 고체로 현탁시켰다. 10 분 동안 배양 후, 중심에 구멍 (예, 4/32 인치 (0.32 ㎝)의 직경)을 갖는 니트로셀룰로오스 디스크 (예, 0.8 미크론 공극 크기)를 액체/입자 혼합물의 위에 놓았다. 상기는 비결합 입자 및 과량의 액체를 흡상하여 샘플을 점광원 (예, 레이저)를 사용한 회절상에 대해 조사할 수 있었다. 빛을 구멍을 통해 비추도록 조준하여, 피분석물이 존재할 경우 회절상이 보였다. 다르게는, 거울 및 현미경 대물 렌즈를 이용하는 소형의 핸드-헬드 관찰 장치도 또한 피분석물이 존재할 경우 회절상을 표시하는데 사용될 수 있다.

<실시예 3>

실시예 2의 금-코팅된 폴리에틸렌-테레프탈레이트 필름에 720 dpi로 IgE에 대한 티올화된 모노클로날 항체 (예를 들면, IgE의 C3 내지 C4 도메인에 특이적인 것과 같은 것)를 인쇄하였다. 프린터는 잉크-젯 프린터 (예, 엡슨 스타일러스 640 또는 740 프린터)이었다: 종이 = 사진용 종이; 잉크 = 흑색 잉크만 사용; 인쇄 품질 = 720 dpi; 반명암 = 반명암 없음. 1500 화소/인치의 해상도로 설정된 x,y 배열의 20 MB 화일 (아도베 포토샵)이 예 중 하나이다. 인쇄시, 상기는 직경이 40 내지 100 미크론의 범위인 것을 특징으로 하는 항체의 패턴화된 x,y 배열을 제조하며, 이는 피분석물 침착시 회절하는데 적절하다.

<실시예 4>

실시예 2의 금-코팅된 폴리에틸렌-테레프탈레이트 필름에 1440 dpi로 IgE에 대한 티올화된 모노클로날 항체 (예를 들면, IgE의 C3 내지 C4 도메인에 특이적인 것과 같은 것)를 인쇄하였다. 프린터는 잉크-젯 프린터 (예, 엡슨 스타일러스 640 또는 740 프린터)이었다: 종이 = 사진용 종이; 잉크 = 흑색 잉크만 사용; 인쇄 품질 = 720 dpi; 반명암 = 반명암 없음. 1500 화소/인치의 해상도로 설정된 x,y 배열의 20 MB 화일 (아도베 포토샵)이 예 중 하나이다. 인쇄시, 상기는 직경이 40 내지 100 미크론의 범위인 것을 특징으로 하는 항체의 패턴화된 x,y 배열을 제조하며, 이는 피분석물 침착시 회절하는데 적절하다.

<실시예 5>

실시예 2의 금-코팅된 폴리에틸렌-테레프탈레이트 필름에 720 dpi로 IgE에 대한 티올화된 모노클로날 항체 (예를 들면, IgE의 C3 내지 C4 도메인에 특이적인 것과 같은 것)를 인쇄하였다. 프린터는 잉크-젯 프린터 (예, 엡슨 스타일러스 640 또는 740 프린터)이었다: 종이 = 사진용 종이; 잉크 = 흑색 잉크만 사용; 인쇄 품질 = 720 dpi; 반명암 = 반명암 없음. 1500 화소/인치의 해상도로 설정된 x,y 배열의 20 MB 화일 (아도베 포토샵)이 예 중 하나이다. 인쇄시, 상기는 직경이 40 내지 100 미크론의 범위인 것을 특징으로 하는 항체의 패턴화된 x,y 배열을 제조하며, 이는 피분석물 침착시 회절하는데 적절하다. 인쇄된 필름의 위에 소적으로서 IgE-소량첨가 완충 용액 (예, pH 7.2에서 포스페이트 완충된 식염수; IgE = 바이오디자인 (Biodesign)으로부터의 사람 폴리클로날 IgE, Cat 제A10164H호) 34 마이 크로리터를 배치함으로써, 얻어진 인쇄된 샘플을 상기 용액에 노출시켰다. 5 분 후, 누룩곰팡이 (Aspergillus fumigatus) 알레르겐 추출물 (예, 그리어 라보레토리즈 (Greer Laboratories) 제품))에 결합된 0.5 미크론 입자 11 ㎕를 항원 함유 소적의 위에 직접 피펫팅함으로써 첨가하였다. 입자를 베타 카세인 함유 식염수/트윈 20 용액 (예, 0.005 내지 0.01 % 트윈 20, 0.001 내지 0.01 M NaCl 및 5 mg/ml 베타 카세인) 중 약 10 %의 고체로 현탁시켰다. 10 분 동안 배양 후, 중심에 구멍 (예, 3/32 인치 (0.24 ㎝)의 직경)을 갖는 니트로셀룰로오스 디스크 (예, 0.8 미크론 공극 크기)를 액체/입자 혼합물의 위에 놓았다. 상기는 비결합 입자 및 과량의 액체를 흡상하여 샘플을 점광원 (예, 레이저)를 사용한 회절상에 대해 조사할 수 있었다. 빛을 구멍을 통해 비추도록 조준하여 피분석물이 존재할 경우 회절상이 보였다. 다르게는, 거울 및 현미경 대물 렌즈를 이용하는 소형의 핸드-헬드 관찰 장치도 또한 피분석물이 존재할 경우 회절상을 표시하는데 사용될 수 있다.

<실시예 6>

실시예 2의 금-코팅된 폴리에틸렌-테레프탈레이트 필름에 720 dpi로 IgE에 대한 티올화된 모노클로날 항체 (예를 들면, IgE의 C3 내지 C4 도메인에 특이적인 것과 같은 것)를 인쇄하였다. 프린터는 잉크-젯 프린터 (예, 엡슨 스타일러스 640 또는 740 프린터)이었다: 종이 = 사진용 종이; 잉크 = 흑색 잉크만 사용; 인쇄 품질 = 720 dpi; 반명암 = 반명암 없음. 1500 화소/인치의 해상도로 설정된 x,y 배열의 20 MB 화일 (아도베 포토샵)이 예 중 하나이다. 인쇄시, 상기는 직경이 40 내지 100 미크론의 범위인 것을 특징으로 하는 항체의 패턴화된 x,y 배열을 제조하 며, 이는 피분석물 침착시 회절하는데 적절하다. 인쇄된 필름의 위에 소적으로서 IgE-소량첨가 완충 용액 (예, pH 7.2에서 포스페이트 완충된 식염수; IgE = 바이오디자인으로부터의 사람 폴리클로날 IgE, Cat 제A10164H호) 34 마이크로리터를 배치함으로써, 얻어진 인쇄된 샘플을 상기 용액에 노출시켰다. 5 분 후, 누룩곰팡이 알레르겐 추출물 (예, 그리어 라보레토리즈 제품))에 결합된 0.5 미크론 입자 11 ㎕를 항원 함유 소적의 위에 직접 피펫팅함으로써 첨가하였다. 입자를 베타 카세인 함유 식염수/트윈 20 용액 (예, 0.005 내지 0.01 % 트윈 20, 0.001 내지 0.01 M NaCl 및 5 mg/ml 베타 카세인) 중 약 10 %의 고체로 현탁시켰다. 10 분 동안 배양 후, 중심에 구멍 (예, 3/32 인치 (0.24 ㎝)의 직경)을 갖는 니트로셀룰로오스 디스크 (예, 0.8 미크론 공극 크기)를 액체/입자 혼합물의 위에 놓았다. 상기는 비결합 입자 및 과량의 액체를 흡상하여 샘플을 점광원 (예, 레이저)를 사용한 회절상에 대해 조사할 수 있었다. 빛을 구멍을 통해 비추도록 조준하여 피분석물이 존재할 경우 회절상이 보였다. 다르게는, 거울 및 현미경 대물 렌즈를 이용하는 소형의 핸드-헬드 관찰 장치도 또한 피분석물이 존재할 경우 회절상을 표시하는데 사용될 수 있다.

<실시예 7>

실시예 2의 금-코팅된 폴리에틸렌-테레프탈레이트 필름을 1 % 폴리비닐피롤리돈 (예, Cat 제PVP-10호, 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 (Sigma) 제품) 증류수 용액으로 10 분 동안 예비-처리한 후, 증류수로 헹구었다. 다르게는, PVP 용액은 또한 1 % 트리톤 (Triton) (예, 트리톤 X-100) 계면활성제를 함유할 수도 있다. 예비-처리된 필름을 이어서 잉크-젯 프린터 (예, 엡슨 스타일러스 640 또는 740)의 용지 트레이에 적재하였다. 10 내지 30 %의 글리세린을 함유하는 IgE에 대한 티올화 모노클로날 항체 (IgE의 C3 내지 C4 도메인에 특이적인 것과 같은 것, 예를 들어 마인네 켄느벙크 소제의 바이오디자인으로부터의 Cat 제Z86410호)를 빈 "흑색 잉크" 카트리지에 넣고, 하기 파라미터를 사용하여 720 dpi에서 금/마이어에 인쇄하였다:

종이 - 사진 용지

잉크 - 흑색 잉크만 사용

인쇄 품질 - 미세 720 dpi

반명암 = 반명암 없음

아도베 포토샵 3.0에 의해 생성한 것과 같은 화소의 x,y 배열의 패턴 (해상도는 1500 화소/인치, 총 크기는 20 메가바이트)를 금/마이어 상에 인쇄하였다. 글리세린이 PVP-처리된 금 표면 상에 인쇄될 때 소적의 번짐을 방지함으로써 소형의 인쇄된 원 (예, 통상 40 내지 100 um의 크기)을 제공하는 것을 돕는 것을 알게 되었다. 인쇄시, 상기는 직경이 40 내지 100 미크론의 범위인 것을 특징으로 하는 항체의 패턴화된 x,y 배열을 제조하며, 이는 피분석물 침착시 회절하는데 적절하다. 인쇄된 필름의 위에 소적으로서 IgE-소량첨가 완충 용액 (예, pH 7.2에서 포스페이트 완충된 식염수; IgE = 바이오디자인으로부터의 사람 폴리클로날 IgE, Cat 제A10164H호) 34 마이크로리터를 배치함으로써, 얻어진 인쇄된 샘플을 상기 용액에 노출시켰다. 5 분 후, 누룩곰팡이 알레르겐 추출물 (예, 그리어 라보레토리즈 제 품))에 결합된 0.5 미크론 입자 11 ㎕를 항원 함유 소적의 위에 직접 피펫팅함으로써 첨가하였다. 입자를 베타 카세인 함유 식염수/트윈 20 용액 (예, 0.005 내지 0.01 % 트윈 20, 0.001 내지 0.01 M NaCl 및 5 mg/ml 베타 카세인) 중 약 10 %의 고체로 현탁시켰다. 10 분 동안 배양 후, 중심에 구멍 (예, 3/32 인치 (0.24 ㎝)의 직경)을 갖는 니트로셀룰로오스 디스크 (예, 0.8 미크론 공극 크기)를 액체/입자 혼합물의 위에 놓았다. 상기는 비결합 입자 및 과량의 액체를 흡상하여 샘플을 점광원 (예, 레이저)를 사용한 회절상에 대해 조사할 수 있었다. 빛을 구멍을 통해 비추도록 조준하여 피분석물이 존재할 경우 회절상이 보였다. 다르게는, 거울 및 현미경 대물 렌즈를 이용하는 소형의 핸드-헬드 관찰 장치도 또한 피분석물이 존재할 경우 회절상을 표시하는데 사용될 수 있다.

당 업자들은 본 발명은 그 범위를 벗어남 없이 많은 변형과 변이가 가능하다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 상기 상세한 설명 및 실시예는 오직 예시를 위한 것이며, 어떠한 방법으로도 첨부된 청구항에 기재된 바와 같은 상기 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

Claims (27)

1. 중합체 필름, 및

   중합체 필름 상에 패턴으로 직접 잉크-젯 인쇄되고 피분석물에 대해 특이적인 항체를 포함하는 결합제 층

   을 포함하는 바이오센서.
2. 제1항에 있어서, 중합체 필름이 금속 코팅을 더 포함하는 바이오센서.
3. 중합체 필름 및

   결합제 층

   을 포함하며, 상기 결합제 층은 중합체 필름 전체에 생성된 후, 결합제 층의 패턴화 부분이 불활성화되도록 중합체 필름 상에 직접 잉크-젯 인쇄되는 것인, 바이오센서.
4. 제3항에 있어서, 결합제 층이 그 위에 피분석물에 대해 특이적인 항체를 갖는 바이오센서.
5. 제3항에 있어서, 결합제 층이, 프로테아제 또는 강음이온성 계면활성제로부터 선택되며 피분석물-결합 활성을 파괴할 수 있는 물질을 중합체 필름 상에 직접 잉크-젯 인쇄하는 것에 의해 패턴에 따라 불활성화된 것인 바이오센서.
6. 제3항에 있어서, 중합체 필름이 금속 코팅을 더 포함하는 바이오센서.
7. 중합체 필름 및

   중합체 필름상에 패턴으로 직접 잉크-젯 인쇄되고 항체에 결합할 수 있는 항체-결합 단백질 층

   을 포함하는 바이오센서.
8. 제7항에 있어서, 항체가 피분석물에 대해 특이적인 바이오센서.
9. 제7항에 있어서, 중합체 필름이 금속 코팅을 더 포함하는 바이오센서.
10. 피분석물에 특이적인 항체를 포함하는 결합제 층의 패턴을 중합체 필름 상에 직접 잉크-젯 인쇄하는 단계를 포함하는, 바이오센서의 제조 방법.
11. 제10항에 있어서, 중합체 필름이 금속 코팅을 더 포함하는 것인 방법.
12. 중합체 필름상에 결합제 층을 코팅하는 단계; 및

    불활성화 물질을 중합체 필름 상에 직접 잉크-젯팅하여 결합제 층의 패턴화된 부분을 불활성화시키는 단계

    를 포함하는, 바이오센서의 제조 방법.
13. 제12항에 있어서, 결합제 층이 그 위에 피분석물에 특이적인 항체를 갖는 것인 방법.
14. 제12항에 있어서, 프로테아제 또는 나트륨 도데실 술페이트로부터 선택되며 피분석물-결합 활성을 파괴할 수 있는 물질을 잉크-젯 인쇄함으로써 결합제 층을 패턴에 따라 불활성화시키는 것인 방법.
15. 제12항에 있어서, 중합체 필름이 금속 코팅을 더 포함하는 것인 방법.
16. 항체에 결합할 수 있는 항체-결합 단백질 층의 패턴을 중합체 필름 상에 직접 잉크-젯 인쇄하는 단계를 포함하는, 바이오센서의 제조 방법.
17. 제16항에 있어서, 항체가 피분석물에 대해 특이적인 것인 방법.
18. 제16항에 있어서, 중합체 필름이 금속 코팅을 더 포함하는 것인 방법.
19. 중합체 필름, 및 중합체 필름 상에 패턴으로 직접 잉크-젯 인쇄되고 피분석물에 대해 특이적인 항체를 포함하는 결합제 층을 포함하는 바이오센싱 장치와, 피분석물을 함유하는 것으로 의심되는 매질을 접촉시키는 단계;

    중합체 필름을 통해 빛을 투과시키거나 중합체 필름으로부터 빛을 반사시키는 단계; 및

    투과광 또는 반사광의 회절에 의해 형성된 패턴을 검출함으로써 항체에 결합된 피분석물의 존재를 검출하는 단계

    를 포함하는, 매질 중 피분석물의 검출 방법.
20. 제19항에 있어서, 중합체 필름이 금속 코팅을 더 포함하는 것인 방법.
21. 중합체 필름, 및 결합제 층을 포함하는 바이오센싱 장치(상기 결합제 층은 중합체 필름 전체에 생성된 후, 결합제 층의 패턴 부분이 불활성화되도록 중합체 필름 상에 직접 잉크-젯 인쇄되는 것임)와, 피분석물을 함유하는 것으로 의심되는 매질을 접촉시키는 단계;

    중합체 필름을 통해 빛을 투과시키거나 중합체 필름으로부터 빛을 반사시키는 단계; 및

    투과광 또는 반사광의 회절에 의해 형성된 패턴을 검출함으로써 항체에 결합된 피분석물의 존재를 검출하는 단계

    를 포함하는, 매질 중 피분석물의 검출 방법.
22. 제21항에 있어서, 결합제 층이 그 위에 피분석물에 특이적인 항체를 갖는 것인 방법.
23. 제21항에 있어서, 프로테아제 또는 나트륨 도데실 술페이트로부터 선택되며 피분석물-결합 활성을 파괴할 수 있는 물질을 잉크-젯 인쇄함으로써 결합제 층이 패턴에 따라 불활성화된 것인 방법.
24. 제21항에 있어서, 중합체 필름이 금속 코팅을 더 포함하는 것인 방법.
25. 중합체 필름, 및 중합체 필름상에 패턴으로 직접 잉크-젯 인쇄되고 항체에 결합할 수 있는 항체-결합 단백질 층을 포함하는 바이오센싱 장치와, 피분석물을 함유하는 것으로 의심되는 매질을 접촉시키는 단계;

    중합체 필름을 통해 빛을 투과시키거나 중합체 필름으로부터 빛을 반사시키는 단계; 및

    투과광 또는 반사광의 회절에 의해 형성된 패턴을 검출함으로써 항체에 결합된 피분석물의 존재를 검출하는 단계

    를 포함하는, 매질 중 피분석물의 검출 방법.
26. 제25항에 있어서, 항체가 피분석물에 대해 특이적인 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, 중합체 필름이 금속 코팅을 더 포함하는 것인 방법.

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