JP4908191B2 - センサ及びセンシング装置 - Google Patents

Description

本発明は、被検出物質を該被検出物質と選択的に結合する標識粒子にて標識して、被検出物質の検出を行うセンサ及びそれを用いたセンシング装置に関するものである。

免疫反応の特異結合性を利用して被検出物質の有無及び／又は濃度を検出する免疫測定法として、用途等に応じた種々の方法が利用されている。中でも特許文献１及び２に記載のイムノクロマトグラフィ法は、その簡便性から特に妊娠検査薬やインフルエンザウイルス抗原検出試薬等の定性分析の分野で近年急速に普及している。

一般に、イムノクロマトグラフィ法では、被検出物質と特異結合反応するように表面修飾されたセンシング面を有するセンサを用い、被検出物質を該被検出物質と選択的に結合する標識粒子にて標識し、標識粒子による発色を検出して、センシングを行っている。

従来のイムノクロマトグラフィ法には、標識粒子として金粒子を利用し、金粒子の局在プラズモン散乱による発色を検出する方法や、標識粒子として色素等で粒子に特定の色を付与したものを利用し、その付与された色を検出する方法等がある。
特開２００５−２１４６７０号公報 特願平５−１０９５０号公報

金粒子の局在プラズモン散乱による発色は赤色である。しかしながら、赤色の波長領域は、人間の目の感度において視認性が良好でないために目視判定の感度があまり良くない。また、色素等で粒子に発色機能を持たせた標識粒子の場合は、発色波長は自由に設計可能であるが、粒子に発色特性を付与するために色素コーティング等の処理が必要となる。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、標識粒子の調製に色素コーティング等の特殊処理が不要であり、測定が簡便で、且つ、検出光の波長特性の設計自由度が高い免疫測定用センサ及びそれを用いたセンシング装置を提供することを目的とするものである。
本発明は免疫測定用に好ましく適用することができるが、免疫測定以外のセンシングにも適用することができる。

本発明のセンサは、特定の被検出物質のみが結合可能なセンシング面を有し、前記被検出物質が該被検出物質と選択的に結合する標識粒子にて標識されて、センシングが行われるセンサにおいて、前記標識粒子として少なくとも表面に反射性を有する粒子を用いて前記センシングが行われるものであり、反射体と、該反射体上に設けられ、表面が前記センシング面である透光体とを備え、前記センシング面に前記被検出物質及び前記標識粒子が結合されたときに形成される、前記反射体と前記透光体と前記標識粒子の層とからなる構造の光干渉効果が検出されるものであることを特徴とするものである。

上記本発明のセンサにおいて、前記センシング面に前記被検出物質及び前記標識粒子が結合されたときに、前記反射体と前記透光体と前記標識粒子の層とからなる構造が形成される。この状態で、本発明のセンサに光が入射すると、この光が前記反射体と前記標識粒子の層との間で反射されて干渉現象が起こり、この干渉現象により波長特性が変化された出射光が出射される。この出射光の波長特性を、「前記反射体と前記透光体と前記標識粒子の層とからなる構造の光干渉効果」と定義する。

前記センシング面に、前記被検出物質と選択的に結合する表面修飾が施されていることが好ましい。被検出物質と選択的に結合する表面修飾は、センシング面の全面的に施されていてもよいし、部分的に施されていてもよい。

上記本発明のセンサにおいて、被検出物質を標識粒子にて標識するタイミングは特に制限なく、センシング面に結合させる前でもセンシング面に結合させた後でも構わない。

前記センシング面と前記被検出物質との結合反応、及び前記被検出物質と前記標識粒子との結合反応は、特異結合反応であることが好ましい。

本発明のセンサにおいて、前記標識粒子は金属粒子であることが好ましい。

本発明のセンサを用いることで、前記被検出物質の有無及び／又は量を分析することができる。

本発明のセンシング装置は、上記本発明のセンサと、該センサに対して前記センシング面側から入射光を照射する光照射手段と、前記センサから出射される光の干渉効果を検出する検出手段とを備えたことを特徴とするものである。

本発明のセンサは、反射体と、該反射体上に設けられ、表面がセンシング面である透光体とを備えたものであり、被検出物質が該被検出物質と選択的に結合する性質を有し、少なくとも表面に反射性を有する標識粒子にて標識されて、センシングが行われるものである。本発明のセンサでは、センシング面に被検出物質及び標識粒子が結合されたときに形成される、反射体と透光体と標識粒子の層とからなる構造の光干渉効果が検出される。

かかる構成においては、例えば透光体の厚みを変化させることにより、干渉条件を任意に変えることができるので、標識粒子の調製に色素コーティング等の特殊処理を施さなくても、検出光の波長特性を任意に設計することができる。

検出光は目視検出でも機械による検出でもよいが、本発明のセンサを用いれば、検出光の波長特性を感度の高い波長特性に設計することができるので、感度の高い測定が可能である。

本発明のセンサでは、従来のイムノクロマトグラフィ法と同様に測定を実施できるので、測定も簡便である。本発明のセンサは、免疫測定用等に好ましく利用することができる。

「センサ」
図面を参照し、本発明に係る一実施形態のセンサについて説明する。図１において、（ａ）はセンサの全体斜視図であり、（ｂ）〜（ｄ）は（ａ）に示される検出部３１，反応確認部３２，及び非検出部３３のセンシング時における厚み方向断面図である。

図１に示されるように、本実施形態のセンサ１は、反射体１１上に、表面がセンシング面２０である透光体１２を備えたものである。センシング面２０は入射光Ｌ１が入射され、検出光である出射光Ｌ２が出射される面である。

センシング面２０には、被検出物質Ｒと選択的に結合する表面修飾Ａ２が施された検出部３１（テスト部）が設けられている。本実施形態のセンサ１では、被検出物質Ｒが該被検出物質と選択的に結合する標識粒子Ｓにて標識されて、センシングが行われる。標識粒子Ｓには被検出物質Ｒと選択的に結合する表面修飾Ａ１が施されている。

センシング面２０にはまた、被検出物質Ｒは結合しないが、標識粒子Ｓと選択的に結合する表面修飾Ａ３が施された反応確認部３２（コントロール部）が設けられている。反応確認部３２は、被検出物質Ｒの有無に関わらずセンシングが確実に実行されたことを確認するための部分である。

本実施形態において、検出部３１及び反応確認部３２はいずれもライン状であり、互いに平行に離間配置されている。センシング面２０において、検出部３１及び反応確認部３２以外の領域は、特に表面修飾が施されておらず、検出も反応確認も行われない非検出部３３である。図１において検出部３１及び反応確認部３２はライン状に表したが、その形状は制限されない。

入射光Ｌ１は特に制限なく、自然光でも、レーザ等の光源から出射される単波長光や白色光源等から出射されるブロード光でもよく、検出方法に応じて選択される。

透光体１２は透光性の膜又は平坦基板からなり、反射体１１は透光体１２の裏面（センシング面２０と反対側の面）に形成されたベタ金属層からなる。

透光体１２の材質は特に制限なく、ガラスやアルミナ等の透光性セラミック、（メタ）アクリル樹脂やカーボネート樹脂等の透光性樹脂等が挙げられる。

反射体１１の材質としては、任意の反射性金属を使用でき、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、及びこれらの合金等が挙げられる。反射体１１はこれら反射性金属を２種以上含むものであってもよい。ベタ金属層である反射体１１は、蒸着法、スパッタ法、塗布成膜法等の成膜方法により成膜することができる。

また、透光体１２は、被陽極酸化金属体（アルミニウム等）を陽極酸化して得られ、複数の微細孔を有する透光性の金属酸化物体（アルミナ等）でも構わない。この場合、反射体１１は被陽極酸化金属体の一部を陽極酸化して残る非陽極酸化部分により、構成することもできる。

本実施形態では、標識粒子Ｓとして、少なくとも表面に反射性を有する粒子が用いられる。標識粒子Ｓは、少なくとも表面に反射性を有していれば制限されないが、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，Ａｌ，及びこれらの合金等の金属粒子であることが好ましい。標識粒子Ｓの大きさは、粒子径が入射光Ｌ１の波長よりも小さいことが好ましく、３００ｎｍ以下であることが特に好ましい。本明細書において、入射光Ｌ１が自然光を用いる場合等、ブロード光である場合は、多くは目視による検出を対象とするので、「入射光Ｌ１の波長よりも小さい」とは、「可視光の波長より小さい」ことを意味し、この場合も３００ｎｍ以下であることが好ましい。

被検出物質Ｒと標識粒子Ｓとの結合反応、検出部３１と被検出物質Ｒとの結合反応、及び反応確認部３２と標識粒子Ｓとの結合反応は特に制限なく、特異結合反応が挙げられる。特異結合反応としては、抗原抗体反応等の生体分子結合反応が挙げられる。

図１（ｂ）〜（ｄ）は、検出部３１，反応確認部３２，及び非検出部３３における結合反応の様子、及びこれら各部における光の進路を模式的に示す図である。

例えば被検出物質Ｒが抗原である場合、標識粒子Ｓは被検出物質Ｒと特異的に結合する第１の抗体により表面修飾し（表面修飾Ａ１）、検出部３１は被検出物質Ｒと特異結合する第２の抗体により修飾しておけばよい（表面修飾Ａ２）。図１（ｂ）に示すように、標識粒子Ｓに表面修飾される第１の抗体と、検出部３１に表面修飾される第２の抗体とは、抗原である被検出物質Ｒに対して互いに別の部位に結合するものが用いられる。すなわち、図１（ｂ）に示すように、検出部３１及び標識粒子Ｓは、検出部３１の表面修飾Ａ２と被検出物質Ｒと標識粒子Ｓの表面修飾Ａ１とが結合するように、表面修飾が施される。

また、反応確認部３２は、標識粒子Ｓとのみ結合するように、抗原である被検出物質Ｒとは結合せず、標識粒子Ｓに修飾されている第１の抗体と特異的に結合可能な第３の抗体により修飾しておけばよい（表面修飾Ａ３）。

以下、本実施形態のセンサ１を用いたセンシングの手順について説明する。
まず、センシング面２０上に試料に流す。試料中に被検出物質Ｒが含まれていると、検出部３１の表面修飾Ａ２に被検出物質Ｒが結合される。次に、センシング面２０上に、あらかじめ表面修飾Ａ１が施された標識粒子Ｓを含む液を流す。検出部３１に被検出物質Ｒが結合されていれば、この被検出物質Ｒに標識粒子Ｓが結合される。反応確認部３２の表面修飾Ａ３には、試料中の被検出物質Ｒの有無に関係なく、標識粒子Ｓが結合される。

反応確認部３２は設けなくてもセンシングは可能であるが、その場合は被検出物質Ｒが検出部３１で検出されなかった場合に判断のタイミングがわかりにくい。反応確認部３２を設けることにより、センシングの終了時が特定されるため、センシングを確実に実行させることができる。

検出部３１と反応確認部３２への試料あるいは標識粒子Ｓを含む液の接触タイミングは、同時でも多少のずれがあっても構わない。検出部３１と反応確認部３２への試料あるいは標識粒子Ｓを含む液の接触タイミングがずれる場合には、接触タイミングは検出部３１が先で反応確認部３２が後になるように、液を流す方向等を工夫することが好ましい。こうすることで、検出部３１における反応が未終了にもかかわらず、反応確認部３２で反応終了と判定されてしまうことを避けることができる。

試料と標識粒子Ｓを含む液とを順次流す代わりに、試料中にあらかじめ標識粒子Ｓを添加して、試料中に被検出物質Ｒが含まれている場合には被検出物質Ｒと標識粒子Ｓとがあらかじめ結合されるようにし、センシング面２０上にこの試料だけを流してセンシングを行うこともできる。

検出部３１及び反応確認部３２に標識粒子Ｓが結合されると、標識粒子Ｓは反射性を有するので、透光体１２のセンシング面２０に標識粒子Ｓからなる反射層１３が形成される。センサ１において反射層１３の形成された場所では、入射光Ｌ１が入射すると、反射体１１と標識粒子Ｓからなる反射層１３との間で反射されて透光体１２内で干渉現象が起こり、この干渉現象により波長特性が変化された出射光Ｌ２が出射される光干渉効果を生じる。この光干渉効果を検出することにより被検出物質Ｒのセンシングを行うことができる。

反射層１３は、検出部３１及び反応確認部３２上に結合された複数の標識粒子Ｓにより形成されている。
複数の標識粒子Ｓは、離間部分を有して検出部３１及び反応確認部３２上に結合されていることが好ましい。標識粒子Ｓの径及び標識粒子同士の離間距離は、入射光Ｌ１の波長よりも小さいことが好ましく、３００ｎｍ以下であることがより好ましい。この場合は、電磁メッシュシールド効果により、反射層１３は、光に対しては半透過半反射性の薄膜として作用するので、反射体１１と標識粒子Ｓからなる反射層１３との間で多重反射を効果的に起こすことができる。

また、標識粒子Ｓの径が１０ｎｍ以下である場合は、複数の標識粒子Ｓが離間していなくても、反射層１３は半透過半反射性の薄膜となるため、同様に、反射体１１と標識粒子Ｓからなる反射層１３との間で多重反射を起こすことができる。

多重反射の効果は、標識粒子Ｓの径と標識粒子同士の離間距離によって決まる反射層１３の実効的な膜厚によって変化する。従って、多重反射がより効果的に起こるように、標識粒子Ｓの径及び標識粒子同士の離間距離を調整することにより、センシングの感度を向上させることができる。

更に、反射体１１と透光体１２と反射層１３とが共振構造を形成する場合は、多重反射によりある特定波長において共振を生じて（多重干渉のピーク波長）大きな吸収を生じることになる。従って、多重光干渉効果を検出部３１、反応確認部３２において検出することにより、被検出物質Ｒのセンシングを高感度に行うことができる。

図１（ｄ）に示すように、非検出部３３では、反射層１３が形成されないので、干渉現象は起らず、単に入射光Ｌ１が反射体１１で反射され、その反射光が出射光Ｌ２となって出射されるだけである。

図１では、検出部３１，反応確認部３２，及び非検出部３３からの出射光をすべて同じ符号Ｌ２で表しているが、上記したように、その光学特性は同一ではない。そして、本実施形態では、少なくとも検出部３１及び反応確認部３２からの出射光Ｌ２が検出されればよい。

図２は、検出部３１において、反射体１１と透光体１２と反射層１３とが共振構造を形成している場合の、標識粒子Ｓが結合される前と後の出射光Ｌ２の波長特性の変化の様子の一例（反射光スペクトル）を示す図である。標識粒子Ｓが結合されて反射層１３が形成されることにより、多重反射による共振を生じ、多重干渉のピーク波長（共振波長）の光が吸収された波長特性を有する出射光Ｌ２となることが示されている。

なお、図２中、標識粒子Ｓが結合される前のスペクトルは、非検出部３３における出射光Ｌ２のスペクトルと同様であり、標識粒子Ｓが結合された後のスペクトルは、反応確認部３２における出射光Ｌ２のスペクトルと同様である。

光干渉効果が多重反射による共振により得られている場合には、その共振波長λは下記式（１）で示されるように、透光体１２の厚みｄを変化させるにより容易に調整することができる。
λ≒２ｎｄ／（ｍ＋１）・・・（１）
（式中、ｄは透光体１２の厚み、λは共振波長、ｎは透光体１２内の平均屈折率、ｍは整数である。）
出射光Ｌ２の検出は目視検出でも機械による検出でもよいが、本実施形態のセンサ１を用いれば、検出光である出射光Ｌ２の波長特性を感度の高い波長特性に設計することができるので、感度の高い測定が可能である。

例えば、目視によるセンシングの場合は、検出光である出射光Ｌ２の波長を人間の目の感度の最も良好な波長付近に設計することが望ましい。図３は、人間の目の感度を表す比視感度分布曲線である（出典：コクヨＳ＆Ｔ（株）http://www.kokuyo.co.jp/stationery/lp/green.html）。検出光の波長が比視感度分布のピーク波長に近ければ近いほど、人間は明るくはっきりと発色を視認することができる。

図３には、「背景技術」の項において述べた従来のイムノクロマトグラフィ法において主に使用されている赤色の波長は比視感度が良好でなく、波長５６５ｎｍ付近において最も比視感度が高くなることが示されている。人間の視感度の個人差を考慮すれば、波長５００〜６００ｎｍの波長域の光（緑色光）を、人間は感度良く視認することができると考えられる。

すなわち、目視によるセンシングの場合、検出光である出射光Ｌ２が、５００〜６００ｎｍの波長域内の光を多く含むように設計することが好ましく、５６５ｎｍ付近の光を多く含むように設計することが特に好ましい。このように設計することで、目視による視認性を大幅に向上させることができる。例えば出射光Ｌ２の波長を５６５ｎｍ付近にした場合、従来のイムノクロマトグラフィ法において使用されている赤色光に比して、約８倍の明るさで視感することができる。

以上のようにして本実施形態のセンサ１によりセンシングすることができる。例えば、本実施形態のセンサ１は、特定の被検出物質Ｒの有無及び／又は量を分析することができる。

上記したように、本実施形態のセンサ１は、反射体１１と、反射体１１上に設けられ、表面がセンシング面２０である透光体１２とを備えたものであり、被検出物質Ｒが被検出物質Ｒと選択的に結合する性質を有し、少なくとも表面に反射性を有する標識粒子Ｓにて標識されて、センシングが行われるものである。本発明のセンサでは、センシング面２０に被検出物質Ｒ及び標識粒子Ｓが結合されたときに形成される、反射体１１と透光体１２と標識粒子Ｓの層とからなる構造の光干渉効果が検出される。

かかる構成においては、例えば透光体１２の厚みｄを変化させることにより、干渉条件を任意に変えることができるので、標識粒子Ｓの調製に色素コーティング等の特殊処理を施さなくても、検出光の波長特性を任意に設計することができる。検出光は目視検出でも機械による検出でもよいが、本発明のセンサを用いれば、検出光の波長特性を感度の高い波長特性に設計することができるので、感度の高い測定が可能である。

本実施形態のセンサ１では、従来のイムノクロマトグラフィ法と同様に測定を実施できるので、測定も簡便である。本実施形態のセンサ１は、免疫測定用等に好ましく利用することができる。

「センシング装置」
次に、図４に基づいて、上記実施形態のセンサ１を用いる場合を例として、本発明に係る第１及び第２実施形態のセンシング装置の構成について説明する。図４（ａ）、（ｂ）に示すセンシング装置２及び３はいずれも、上記実施形態のセンサ１と、センサ１の内部に入射光Ｌ１を照射する光照射手段４０と、センサ１からの出射光Ｌ２の光干渉効果を検出する検出手段５０とから概略構成されており、光照射手段４０と検出手段５０との組合せが各々異なっている。同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。

センシング装置２は、光照射手段４０がハロゲンランプ、キセノンランプ、クリプトンランプ等のブロード光源４１からなり、検出手段５０が分光器５１及びデータ処理部５２からなる装置である。光照射手段４０には必要に応じて、光源４１からの出射光を平行光束とするコリメータレンズ及び／又は集光レンズ等を含む導光光学系が備えられる。

センシング装置２は、光照射手段４０によってセンサ１に入射光Ｌ１としてブロード光を照射し、検出手段５０によって出射光Ｌ２の分光スペクトルを得、センサ１における干渉吸収ピーク等の光の干渉効果を検出して、試料の分析を行うものである（分光スペクトル及び吸収ピークは図２を参照）。

本実施形態のセンシング装置２では、出射光Ｌ２を機械的に検出するので、出射光Ｌ２の波長特性は検出手段５０により検出可能な範囲内であれば特に制限されない。センサ１では、例えばセンサ１の透光体１２の厚みｄを調整することによって、検出光である出射光Ｌ２の干渉吸収ピーク波長を、検出手段５０の感度の高い波長に設計することができる。したがって、本実施形態のセンシング装置２では、検出光である出射光Ｌ２の干渉吸収ピーク波長が、検出手段５０の感度の良い範囲内となるように、センサ１を設計することができ、良好な感度でセンシングを行うことが可能となる。

センシング装置３は、光照射手段４０がレーザ、発光ダイオード等の単波長光源４２からなり、検出手段５０がフォトダイオード等の光強度検出器５３及びデータ処理部５２からなる装置である。センシング装置３においても、光照射手段４０には必要に応じてコリメータレンズ及び／又は集光レンズ等を含む導光光学系が備えられる。

センシング装置３は、光照射手段４０によってセンサ１に入射光Ｌ１として単波長光を照射し、検出手段５０によって出射光Ｌ２の光強度を検出して、試料の分析を行うものである。ここでセンサ１の透光体１２の厚みｄを調整して、干渉吸収ピーク波長を入射光Ｌ１の波長と略一致させることが好ましい。このように設計すれば試料によって該波長の光強度が大きく変わるため、良好な感度にて試料の分析を実施することができる。

入射光Ｌ１の波長は干渉吸収ピーク波長に略一致させなくてもよい。干渉吸収ピーク波長とずれた波長であっても、干渉現象の有無によって光強度は変化するので、検出を行うことができる。

センシング装置３においては、光照射手段４０として単波長光源４２を用いる代わりに、光照射手段４０をブロード光源４１及び光源４１からの出射光から特定波長光のみを取り出す分光器等の波長分布可変手段とから構成しても、同様に試料の分析を行うことができる。

検出手段５０は光の干渉効果を検出するものであれば、分光スペクトルや特定波長の光強度を検出するもの以外でもよい。

本発明のセンサは、免疫測定用等のバイオセンサ等に好ましく利用できる。

（ａ）は本発明に係る一実施形態のセンサの構造を示す全体斜視図、（ｂ）〜（ｄ）はセンシング時における（ａ）に示される各部の厚み方向断面図 標識粒子の結合前後での出射光の波長特性変化を示す図 比視感度分布曲線 （ａ）及び（ｂ）は、本発明に係る第１及び第２実施形態のセンシング装置の構成を示す図

符号の説明

１ センサ
１１ 反射体
１２ 透光体
１３ 反射層（標識粒子の層）
２０ センシング面
３１ 検出部
３２ 反応確認部
２，３ センシング装置
４０ 光照射手段
５０ 検出手段
Ｒ 被検出物質
Ｓ 標識粒子
Ａ１〜Ａ３ 表面修飾
Ｌ１ 入射光
Ｌ２ 出射光（検出光）

Claims (5)

1. 特定の被検出物質のみが結合可能なセンシング面を有し、
   前記被検出物質が該被検出物質と選択的に結合する標識粒子にて標識されて、センシングが行われるセンサにおいて、
   前記標識粒子として、金属粒子を用いて前記センシングが行われるものであり、
   反射体と、該反射体上に設けられ、表面が前記センシング面である透光体とを備え、
   前記センシング面に前記被検出物質及び前記標識粒子が結合されたときに形成される、前記反射体と前記透光体と前記標識粒子の層とからなる構造の光干渉効果が検出されるものであることを特徴とするセンサ。
2. 前記センシング面に、前記被検出物質と選択的に結合する表面修飾が施されていることを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
3. 前記センシング面と前記被検出物質との結合反応、及び前記被検出物質と前記標識粒子との結合反応が、特異結合反応であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセンサ。
4. 前記被検出物質の有無及び／又は量が分析されるものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセンサ。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載のセンサと、
   該センサに対して前記センシング面側から入射光を照射する光照射手段と、
   前記センサから出射される光の干渉効果を検出する検出手段とを備えたことを特徴とするセンシング装置。

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