JP4059398B2 - システイン合成酵素遺伝子を利用したセリン豊富な蛋白質の製造方法 - Google Patents
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Description
Weickert et al., Curr. Opin. Biotechnol., 7:494-9,1996
公知の方法に基づいて、組換え大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)の人体由来レプチン生産前と後の細胞内蛋白質変化量を2次元電気泳動法を利用して比較した(Hochstrasser et al., Anal. Biochem., 173:424-5, 1998; Han et al., J. Bacteriol., 183:301-8,2001):すなわち、大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)を初期培養以後、レプチンの発現を誘導して高濃度で培養しながら、発現誘導以前の培養液と発現誘導以後の培養液とをそれぞれ分取した後、各培養物を4℃にて6000rpmで5分間遠心分離して沈殿物を収得し、500 μlの低塩緩衝液(KCl 3mM、KH2PO4 1.5mM、NaCL 68mM、NaH2PO4 9mM)で洗浄した。次いで、200 μlのTE緩衝液(Tris-HCl 10mM、EDTA 1mM)に懸濁し、超音波破砕機で細胞を破壊した後、4℃にて12,000rpmで10分間遠心分離し、上澄液を取って真空乾燥させた後、-20℃に保管して試料を用意した。
CysK蛋白質を発現するための組換えプラスミドpAC104cysKを次のように作製した:先ず、大腸菌BL21(DE3)染色体を鋳型として、プライマー1: 5'-gcgaattcatgagtaagatttttgaagataa-3'(配列番号1)とプライマー2: 5'-gcgaattctatatactgttgcaattctttctc-3'(配列番号2)とを用いてポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction:PCR)を行った。 この時、第1変性は95℃にて5分間1回行って、この後第2変性は95℃にて50秒間、アニーリングは55℃にて1分間、延長は72℃にて1分30秒間行って、これを30回繰り返し、以後72℃にて5分間最後の延長を1回行った。
IL-12p40(インターロイキン12β鎖)蛋白質を発現させるために下記のように組換えプラスミドpEDIL-12p40を作製した。すなわち、人体由来インターロイキンβ鎖遺伝子を含むプラスミドpUC18/p40を鋳型として、プライマー3: 5'-ggctagcattaatgatatgggaactgaagaaagat-3'(配列番号3)とプライマー4: 5'-gccggatccttattaactgcagggcacaga-3' (配列番号4)とを用いて重合酵素連鎖反応を、実施例2と同一の方法で行ってIL-12p40遺伝子を収得し、収得した遺伝子を制限酵素AdeI及びBamHIで切断し、レプチン発現ベクター(Jeong and Lee,Appl. Environ. Microbiol., 65:3027-32, 1999)に存在する制限酵素NdeI及びBamHIIの位置に挿入して、プラスミドpEDIL-12p40を作製した(図3)。
前記実施例2で作製された組換えプラスミドpAC104cysKと、従来のレプチン発現プラスミドpEDOb5(Jeong and Lee,Appl. Environ. Microbiol. 65, 3027-32, 1999)とで同時に大腸菌BL21(DE3)を形質転換して大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)(pAC104cysK)を作製し、これを培養してレプチンを製造した。この時、対照群としては、従来のレプチン発現プラスミドpEDOb5のみにより形質転換された大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)を同一の条件で培養し、これよりレプチンを生産した。
公知によれば、大腸菌内の蛋白質の平均アミノ酸組成は、 ロイシンが10.5%、アラニンが9.6%で第1、第2の組成比を示し、セリンは平均5.6%を示す(図5a、図5b、図5c、図5d)。 図5a乃至図5dは今まで公知された蛋白質のアミノ酸組成比を示すグラフであって、図5aは大腸菌蛋白質らのアミノ酸組成比、図5bはレプチンのアミノ酸組成比、図5cはG-CSFのアミノ酸組成比、図5dはIL-12p40のアミノ酸組成比をそれぞれ示す。
Claims (6)
- cysK遺伝子とレプチンまたはIL-12p40(インターロイキン12β鎖)をコードする遺伝子が導入された大腸菌を培養することを特徴とするレプチンまたはIL-12p40(インターロイキン12β鎖)の製造方法。
- 前記大腸菌は、cysK遺伝子とレプチンまたはIL-12p40(インターロイキン12β鎖)をコードする遺伝子とを同時に含むベクターにより形質転換されたことを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記大腸菌は、cysK遺伝子を含むベクターと、レプチンまたはIL-12p40(インターロイキン12β鎖)をコードする遺伝子を含むベクターとにより形質転換されたことを特徴とする請求項1記載の方法。
- cysK遺伝子は大腸菌由来であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- cysK遺伝子とレプチンまたはIL-12p40(インターロイキン12β鎖)をコードする遺伝子とを同時に含むことを特徴とする組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする大腸菌。
- cysK遺伝子を含むベクターと、レプチンまたはIL-12p40(インターロイキン12β鎖)をコードする遺伝子を含むベクターとにより形質転換されたことを特徴とする大腸菌。
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