JP3991034B2 - 検出方法 - Google Patents

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本発明は検出方法に関し、特に微小流路内の流体の流れの層を利用した、検体中の複数の異なる物質を検出するための検出方法に関するものである。
触媒反応による生成物、例えば酵素反応による生成物を用いるバイオセンサとして、電気化学的手法は、簡便で安価であるため広く使用されている。さらに、近年では、検出部の電極の微小化により、微小電極を多数配置したアレイ型のセンサの開発も行われている（特許文献１参照）。
アレイ型にすることにより、同一の被検体に対する２次元的な位置情報、物質の分布の動的変化を得ることが可能になる。また、アレイ状に配置されたそれぞれの電極が特異的に別個の被検体と反応することにより多項目検出を行うものもある（非特許文献１参照）。
一方、マイクロ流体デバイスとして、微小流路中でサンプリング及び計測を行う測定装置がある。丹羽らは、微小流路と薄層流路を組み合わせた、オンラインバイオセンサーを提案し、連続的に微量の試料の定量分析を行っている（特許文献２参照）。
特開２００２−７１６２０号公報 特開平１１−８３７８４号公報 Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｋｏｊｉｍａ，Ａｔｓｕｎｏｒｉ Ｈｉｒａｔｓｕｋａ，Ｈｉｒｏａｋｉ Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋａｚｕｙｏｓｈｉ Ｙａｎｏ，Ｋａｚｕｎｏｒｉ Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏ，Ｉｓａｏ Ｋａｒｕｂｅ，"Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"２００３，７５，ｐ．１１１６−１１２２
しかしながら、これらの手法のみでは、実際の測定サンプル（例えば、血液）に含まれる複数種の被検体を同時に同一の流路で分離し検出することは難しい。例えば、測定サンプルを複数の流路に振り分け、それぞれ流路中で目的の被検体を検出することも考えられるが、測定サンプルの必要量が多くなってしまう。また、１つの流路に検体中に含まれる複数の被検体を捕捉するための捕捉部位を形成した場合、触媒反応による生成物は、いくつかの被検体について同一の物質である場合が多く、触媒反応生成物は液体中での拡散が起こるため、どの被検体から生成された物質であるかを１つの検出部（例えば、電極）にて同定することは困難であった。
本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、流路を利用した検出素子において、一つの流路を用いて流路を複数に分割しないため、複数の異なる物質を含有する微量の検体を分けることなく物質捕捉部に供給でき、また流路中に検出対象の異なる複数の物質捕捉部を形成することで、検体中に含まれる微量の複数の異なる物質を効率的に同時に検出することができる検出方法を提供することにある。
本発明は、検体に含まれる複数の異なる物質を同一の標識を用いて検出する検出方法であって、
前記検体に含まれる第一の物質を特異的に捕捉する第一の物質捕捉体が固定された第一の物質捕捉部と、前記検体に含まれ前記第一の物質とは異なる第二の物質を特異的に捕捉する第二の物質捕捉体が固定された第二の物質捕捉部と、流路と、を有する検出素子に前記検体を流す工程と、
前記第一の標的物質捕捉体が固定された前記第一の物質捕捉部および前記第二の標的物質捕捉体が固定された前記第二の物質捕捉部に標識を含む溶液を流す工程と、
前記第一の物質捕捉部に流れる第一の流れの層と前記第二の物質捕捉部に流れる第二の流れの層とを同時に存在させた状態で、前記第一の流れの層に前記第一の物質捕捉部に固定された標識からの信号を発生させるための溶液を流す工程と、前記第一の物質捕捉部からの信号を得る工程と、
前記第一の物質捕捉部に流れる前記第一の流れの層と前記第二の物質捕捉部に流れる前記第二の流れの層とを同時に存在させた状態で、前記第二の流れの層に前記第二の物質捕捉部に固定された標識からの信号を発生させるための溶液を流す工程と、
前記第二の物質捕捉部からの信号を得る工程と、
をこの順に有することを特徴とする検出方法である。
前記情報を検出するための検出部を更に備えていることが好ましい。
前記検体中の複数の異なる物質は標識を有し、前記複数の流れの層を流れる流体は前記標識と作用することにより作用物を放出させるための流体であることが好ましい。
前記標識が触媒作用を有する物質、電気化学的に発光する物質または蛍光物質であることが好ましい。
本発明は、流路を利用した検出素子において、一つの流路を用いて流路を複数に分割しないため、複数の異なる物質を含有する微量の検体を分けることなく物質捕捉部に供給でき、また流路中に検出対象の異なる複数の物質捕捉部を形成することで、検体中に含まれる微量の複数の異なる物質を効率的に同時に検出することができる検出方法を提供することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の検出方法に用いられる検出素子は、検体中の複数の異なる物質を検出するための検出素子であって、基体に設けられ、流体の流れの層（以降、層状流と記す）を複数形成可能な流路と、前記物質を特異的に捕捉するために前記流路中に設けられた、複数の異なる物質捕捉部とを備え、前記物質捕捉部は、前記層状流の一方の層を流れる流体を切り替えることにより、前記物質に対する独立の情報が得られるように配置されていることを特徴とする。
また、本発明の検出方法は、検体中の複数の異なる物質を検出する検出方法であって、前記物質を特異的に捕捉するため複数の異なる物質捕捉部を有する流路に前記検体を導入する工程と、前記流路内に複数の層状流を形成する工程と、前記層状流の一方の層を流れる流体を切り替えることにより、前記物質に対する独立の情報を得る工程とを有することを特徴とする。
本発明の検出方法に用いられる検出素子の一般的な形態は、図１に代表されるようなμＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）型の検出素子であって、図２のように、微小流路中に、検体中の物質と特異的に結合する抗体を物質捕捉部に固定化して用いる。
物質捕捉部は、流路中に複数形成され、検体中に含まれる複数種の物質をそれぞれ捕捉する。
物質捕捉部は、流路の複数の層状流の一方を流れる流体を切り替えることにより、物質に対する独立の情報が得られるように配置されている。ここで、層状流の一方の層を流れる流体とは、検体中に含まれる物質の有する標識と作用することにより、作用物を放出させるための流体（基質）であり、その放出された作用物を検出することにより物質捕捉部に捕捉された検体中の物質の量等の情報を得ることができる。
標識としては、触媒作用を有する物質、電気化学的に発光する物質または蛍光物質等を用いることができる。また、検体中に含まれる物質自体が、標識として働く場合もある。
検体中の物質の検出については、例えば、物質捕捉部に捕捉された検体と、物質特異的な２次抗体に酵素標識したものとの複合体を形成せしめ、物質捕捉部ごとに層状流を流れる流体を用いて酵素標識と作用する酵素基質を選択的に供給し、生成した酵素反応生成物（作用物）を物質捕捉部の下流に位置する検出用電極により検出する。
検体としては、生体物質（タンパク質、核酸、糖鎖）やアレルゲン、バクテリア、ウイルス等の抗体が特異的に認識できるものが対象となる。
また、物質捕捉部に形成せしめる複合体は、触媒標識された２次捕捉体の他に、検体と２次捕捉体との複合体に対して特異的に結合する３次以降の触媒標識抗体でもよい。
また、標識物質として、蛍光物質を使用した場合、選択的な検出には、層状流のｐＨを変更し、選択的にスペクトルシフトさせて行う。
触媒作用を有する物質としては、グルコース酸化酵素、コリン酸化酵素、ラクトース酸化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。それぞれ、基質として、グルコース、コリン、ラクトース、ルミノールと過酸化水素が挙げられる。電気化学発光物質としては、トリス（ビピリヂル）ルテニウムが挙げられる。蛍光標識物質としては、５−カルボキシフルオレセイン、Ｑｕｅｎｅ−１（８−アミノ−２−（トランス−２−アミノスチリル）−６−メトキシキノリン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸テトラナトリウム塩）、ＢＣＥＣＦ（２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−４または５−カルボキシフルオレセイン）が挙げられる。
本発明の検出方法を用いることにより、検出素子に検体中の複数の物質を検出するための物質捕捉部の集積化が可能となり、より少ない検体量で効率的に定量することができる。また、検体をマルチチャンネルに分割して流す必要が無く、検体を最大限有効に利用することができる。
また、バイオセンサにおける検出方法により、それぞれの物質捕捉部からの信号（酵素反応生成物、化学発光、蛍光）を選択的に検出することが可能となり、それぞれの反応個所に特定した検出部を持つ必要が無く、検出部を共通化することができる。また、物質捕捉部、検出部の集積化、共通化が図れ、安価で、微小なセンサを作製することができる。
以下、図面を参照して、本発明を実施例により更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
図１は、本発明の一実施の形態におけるバイオセンサの構造を示すものである。ここでは、触媒作用を有する物質として、グルコース酸化酵素（ＧＯＸ）を用いる。また、測定対象とする検体として、ヒトαフェトプロテイン（ＡＦＰ）及びヒトβ２マイクログロブリン（β２ＭＧ）を用いる。
バイオセンサは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）基板とガラス基板を張り合わせた構造を有している。ＰＤＭＳ基板上（図３参照）には、幅１００μｍ、深さ１００μｍの矩形の微小流路１４がパターニングされている。ガラス基板上（図４参照）には、過酸化水素検出用の薄膜電極１６，１７，１８および電極パッド１９，２０，２１がパターニングされている。前記電極および電極パッドは、チタン、白金を順にスパッタで積層し、形成されている。また、検体注入に用いる２つのインレット１，２と、１つのドレイン３に用いる貫通孔（径１００μｍ）２２，２３，２４を有する。参照電極上には、参照物質として銀をメッキしている。
図２のように、物質捕捉部１０、１１は微小流路中に配置され、それぞれ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を介してヒトＡＦＰに対するウサギ由来抗体と、ヒトβ２ＭＧに対するウサギ由来抗体をグルタルアルデヒド蒸気により架橋し固定化する。ＰＤＭＳ基板及びガラス基板は、自己吸着により張り合わせる。測定溶液としては、リン酸緩衝生理食塩水を用い、２つのインレット１，２からそれぞれ流速２μｌ／ｍｉｎでシリンジポンプにより送液する。
図６のように並んだ、参照電極、対向電極、作用電極の３つの電極パッド３２，３３，３４は、ポテンシオスタットの端子にそれぞれ接続される。測定溶液中には、検体として、ヒトＡＦＰ及びヒトβ２ＭＧの混合溶液を２つのインレットより送液すると、ヒトＡＦＰ及びヒトβ２ＭＧは、それぞれに対する前記固定化抗体により物質捕捉部において結合する。次に、ヒトＡＦＰ及びヒトβ２ＭＧに対する２次抗体（マウス由来）を送液する。最後に、３次抗体としてＧＯＸ修飾されたヤギ由来抗マウス抗体を送液し、図５のような複合体を形成させる。
ここから、検体の定量を行う。ヒトＡＦＰ及びヒトβ２ＭＧは、微小流路中独立に捕捉されており、それぞれの物質捕捉部にのみＧＯＸの酵素基質であるグルタミン酸が流れるように、微小流路中に層状流７１、７２を形成させる。このとき、２つインレット１，２からは、一方のみグルタミン酸を含んだ緩衝溶液を流し、ＡＦＰあるいはβ２ＭＧの一方のＧＯＸからの過酸化水素のみを下流に配置されている薄膜電極１６，１７，１８により還元電流として検出する。その後、グルタミン酸を導入するインレットを切り替え、前記とは別のＧＯＸからの過酸化水素を検出する。これらの操作により、１つの微小流路中に捕捉された２種類の検体（ＡＦＰおよびβ２ＭＧ）を同一標識を用い、且つ１つの検出部のみで独立に検出することができる。
実施例２
図７のような構造のバイオセンサを作製する。基板としてガラス基板を用いる。図９に示すような幅１００μｍ、深さ５０μｍ微小流路４８をウェットエッチング法により形成する。実施例１に於いて形成した層状流を更に厳密に検出し、基質の拡散を抑制し、物質捕捉部をより近接して形成できるようにする。これにより更なる物質捕捉部の高密度化が可能となる。
本実施例では、図８のようにインレットは３つ形成される。中央のインレットは、層状流をより厳密に検出するために用いられる溶液を送液する。そのため、溶液としては、水系よりも有機系のものが望ましい。本実施例では、エタノールを用いる。中央のインレットにつながる微小流路表面は、他の２つの流路との合流地点の直前４６で、疎水化処理し、他の２つのインレットから流れるリン酸緩衝生理食塩水溶液の逆流を防ぐ。疎水化処理には、フッ素化合物（ＣＦ3 （ＣＦ2 ）7 ＣＨ2 ＣＨ2 Ｓｉ（ＯＭｅ）3 ）を用い、コートする。また、標識酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いる。
実施例１と同様に、１次抗体を図８の物質捕捉部４２，４３に固定化する。図１０に示す様に、ガラス基板には、インレット、ドレイン用に貫通孔５０、５１、５２及び５３を形成しておく。２枚のガラス基板は、微小流路部分をマスクし、紫外線が当たらないようにした上で、紫外線硬化性の接着剤で張り合わせる。検体の測定は、まず、インレット３６、３８から、ヒトＡＦＰ及びヒトβ２ＭＧの混合溶液を流速２μｌ／ｍｉｎでシリンジポンプにより送液する。続けて、ヒトＡＦＰ及びヒトβ２ＭＧに対する２次抗体（マウス由来）を送液する。最後に、３次抗体としてＨＰＲ修飾されたヤギ由来抗マウス抗体を送液し、図１１のような複合体を形成させる。
ここから、検体の定量を行う。ヒトＡＦＰ及びヒトβ２ＭＧは、微小流路中独立に捕捉されており、それぞれの物質捕捉部４２あるいは４３にのみＨＲＰの酵素基質であるルミノールが流れるように、微小流路中に層状流を形成させる。このとき、２つインレット３６、３８からは、一方のみルミノール及び過酸化水素を含んだリン酸緩衝生理食塩水を流す。他方にはリン酸緩衝生理食塩水のみを流す。また、インレット３７から、エタノールを流し、２つの水相を分離し、ルミノールの拡散を低減させる。ＨＲＰの触媒作用により、ルミノールと過酸化水素が反応し、３−アミノフタレイトジアニオンが生成し、同時に化学発光が起こる。発光強度を測定することで、物質捕捉部４２あるいは４３に結合した、被検体の定量を行う。
その後、ルミノール及び過酸化水素を導入するインレットを切り替え、前記とは別のＨＲＰに起因する化学発光を検出する。これらの操作により、１つの微小流路中に捕捉された２種類の検体（ＡＦＰおよびβ２ＭＧ）を同一標識により独立に検出することができる。
実施例３
実施例１、２にある系において、酵素標識の代替として、蛍光標識用いることができる。
層状流により流体のｐＨを特定の１層のみ変更し、蛍光標識の蛍光特性が変化することで、被検体の区別が可能となる。特定波長における蛍光強度あるいは蛍光スペクトルの変化を検出する。３次抗体の標識としてｐＨ感受性蛍光色素５−カルボキシフルオレセインを用いて、実施例２と同様の検出が可能となる。
本発明の検出方法は、検体中に含まれる微量の複数物質を効率的に同時に検出することができるので、医療診断・健康診断・食品安全検査・環境汚染物質検査等のバイオセンサとして利用することができる。
本発明のバイオセンサの構造の一例を示す概略図である。 実施例１の微小流路中の物質捕捉部の詳細図である。 実施例１のＰＤＭＳ基板の構成を示す概略図である。 実施例１のガラス基板の構成を示す概略図である。 実施例１の物質捕捉部の反応模式図である。 実施例１の電極部の詳細図である。 実施例２に示すバイオセンサの構造を示す概略図である。 実施例２の微小流路中の物質捕捉部の詳細図である。 実施例２のガラス基板上の微小流路の構成を示す概略図である。 実施例２のガラス基板上の貫通孔の構成を示す概略図である。 実施例２の物質捕捉部の反応模式図である。
符号の説明
１，２ インレット
３ ドレイン
４，５，６ 電極パッド
７ 基板
９ 微小流路
１０、１１ 物質捕捉部
１３ ＰＤＭＳ基板
１４ 微小流路
１５ ガラス基板
１６，１７，１８ 薄膜電極
１９，２０，２１ 電極パッド
２２，２３，２４ 貫通孔
３２，３３，３４ 電極パッド
３５ 微小流路
３６、３７、３８ インレット
３９ ドレイン
４０ 基板
４２，４３ 物質捕捉部
４４、４５ 界面
４６ 疎水化処理部
４７ 基板
４８ 微小流路
４９ ガラス基板
５０、５１、５２、５３ 貫通孔
７１、７２ 層状流

Claims (3)

  1. 検体に含まれる複数の異なる物質を同一の標識を用いて検出する検出方法であって、
    前記検体に含まれる第一の物質を特異的に捕捉する第一の物質捕捉体が固定された第一の物質捕捉部と、前記検体に含まれ前記第一の物質とは異なる第二の物質を特異的に捕捉する第二の標的物質捕捉体が固定された第二の物質捕捉部と、流路と、を有する検出素子に前記検体を流す工程と、
    前記第一の標的物質捕捉体が固定された前記第一の物質捕捉部および前記第二の標的物質捕捉体が固定された前記第二の物質捕捉部に標識を含む溶液を流す工程と、
    前記第一の物質捕捉部に流れる第一の流れの層と前記第二の物質捕捉部に流れる第二の流れの層とを同時に存在させた状態で、前記第一の流れの層に前記第一の物質捕捉部に固定された標識からの信号を発生させるための溶液を流す工程と、前記第一の物質捕捉部からの信号を得る工程と、
    前記第一の物質捕捉部に流れる前記第一の流れの層と前記第二の物質捕捉部に流れる前記第二の流れの層とを同時に存在させた状態で、前記第二の流れの層に前記第二の物質捕捉部に固定された標識からの信号を発生させるための溶液を流す工程と、
    前記第二の物質捕捉部からの信号を得る工程と、
    をこの順に有することを特徴とする検出方法。
  2. 前記標識が酵素であり、前記標識からの信号を発生させるための溶液が前記酵素の基質を含む溶液であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
  3. 前記標識がｐＨ感受性蛍光色素であり、前記標識からの信号を発生させるための溶液が前記ｐＨ感受性蛍光色素の蛍光特性が変化するｐＨの溶液であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
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