JP3979843B2 - 抗mrsa薬剤 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗MRSA薬剤に関し、特に、ワタヨモギ(Artemisia gilvescens)に由来し、副作用が少ない抗MRSA薬剤に関する。
【0002】
【従来の技術】
MRSA(methicilin-resistant Staphylococcus aureus)は、ペニシリン耐性黄色ブドウ球菌に効力を有する抗菌薬として最初に開発された合成ペニシリンであるメチシリンに耐性を有する黄色ブドウ球菌である。MRSAの病原性は一般の黄色ブドウ球菌とほぼ同等と考えられ、ヒトへの定着性が強く、コアグラーゼ、エンテロトキシン、ロイコシジン、TSST−1(トキシックショックシンドロームトキシン)、エクソフォリアチン(表皮剥脱毒)、溶血毒等の種々の毒素や菌体外酵素(細胞外酵素)を産生することが知られている。このMRSAはメチシリンのみならず、β−ラクタム系抗生物質、すなわち、耐性ブドウ球菌用ペニシリンを始めとして総てのペニシリン系、第1、第2、第3世代と呼ばれる総てのセフェム系、モノバクタム系、カルバペネム系抗生物質等、現在市販されている殆ど総てのβ−ラクタム系抗生物質に耐性を示すばかりでなく、アミノグリコシド系、マクロライド系抗生物質等の多くの抗生物質に対し耐性を示し、最近開発されたニューキノロン系抗生物質にも耐性を示すなど、MRSA感染症は極めて難治性の疾患として現在大きな問題となっている。例えば、MRSA感染症は、現医療において血管や気道の確保のために用いられるカテーテル等の医療器具がMRSAに汚染されている場合に容易に発症すると共に院内感染が生じやすく、中でも、免疫不全状態になっている患者、長期抗菌薬投与患者、抵抗力が弱い寝たきり老人・未熟児等に特に発症しやすく、最近特に、院内感染対策としての抗MRSA薬剤の早急な開発が望まれている。
【0003】
MRSAに抗菌活性を有する薬剤として、特開平9−278779号公報には、新規セフェム化合物及びその薬理学上許容される塩並びに生理的に加水分解可能なカルボン酸エステルが開示されている。また、特開平11−228407号公報には、フラボン誘導体を有効成分として含有する抗MRSA活性医薬組成物が記載されている。しかしながら、これら合成薬剤においては強い副作用、毒性等の問題があることが多く、免疫力の低下した患者に施用する場合など制約が多く、MRSA感染症の治療は一般には極めて困難であって、副作用の少ない抗MRSA薬剤の開発が望まれている。
【0004】
一方、キク科(Compositae)植物は広く世界に分布しており、約1000属、20000種が知られている。この科に属するヨモギ属(Artemisia)植物は、北半球に広く分布している植物であって約250種を数え、日本だけでも特産種を含めて30種あり、薬用植物として使われているものも多く、成分研究も数多くなされている。例えば、シナヨモギ(A.cina)は回虫駆除作用のあるα−santoninの原料植物として用いられ、カワラヨモギ(A.cappillaris Tunb.)は胆汁分泌促進作用のあるcapillartemisin A,B、capillarisin等を含み、黄疸、肝炎、胆嚢炎等の薬効を有するものとして漢方薬に用いられている。また、抗マラリア薬剤として使用されるartemisininは黄花蒿(A.annua L.)から単離されている。しかしながら、ヨモギ属に属するワタヨモギ(A.gilvescens Miq.)は中国の一部(Anhui, Hunan, Hubei, Jiangxi, Shaanxi, Sichuan)と、日本では徳島県鳴門市にしか生育が確認されていない希少植物であって、薬用としては使用されたことはなく、徳島、沖縄で強い繁殖力のある栽培品として栽培されているに留まっている。
【0005】
ところで、2,7−ジヒドロ−3,5,8−トリメチルアズレノ[6,5−b]フラン−2,7−ジオンは、深海の海洋生物から単離された化合物として明らかにされ(Tetrahedron Letters, Vol.25, No.20, 2109−2110, 1984, Printed in Great Britain等)、更に、化学変換や結晶構造が報告されていた(Zeitschrift fur Kristallographie, 177, 287−290, 1986等)が、この化合物が抗MRSA活性を有することは報告されていなかった。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、副作用、毒性の少ない抗MRSA薬剤であって、院内感染が問題となる免疫力が低下した患者に対し、安全に使用することができる天然物由来の抗MRSA活性を有する抗MRSA薬剤を提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、薬用植物として用いられていない植物の評価を実施すべく、対象植物として徳島県に生育するワタヨモギ(A.gilvescens Miq.)を選択した。2000年に徳島大学薬用植物園で栽培したワタヨモギを採取し、その地上部3.3kgを乾燥後粉砕し、ソックスレー抽出器で順次ヘキサン、酢酸エチル、メタノールで抽出処理した。まず、ヘキサン抽出残渣の酢酸エチル抽出物58gを表1に示すように各種クロマトグラフィーにより分離精製し、化合物I〜IXで表されるセスキテルペン9種を単離し、構造を決定した。そして、その一部については、ヒト大腸癌由来細胞株HCT116を用いて細胞毒性を調べ、また、MRSA、MSSA(methicilin-sensitive Staphylococcus aureus)に対する抗菌活性を調べた。その結果、化合物1で表されるセスキテルペン ケトラクトン(sesquiterpene ketolactone)に抗MRSA活性が見い出された。
【0008】
【表1】
【0009】
化合物1で表されるセスキテルペン ケトラクトン(sesquiterpene ketolactone)は黄色結晶として得られ、IRスペクトルによりラクトン(1758cm-1)、カルボニル基(1686cm-1)の存在が示唆された。表2に示すように、1HNMRスペクトルデータにおいては、6本のシングレットからなる非常にシンプルなシグナルを示し、3個のメチル基[δH2.12(s)、2.32(s)、2.71(s)]、低磁場側に二重結合性メチン3個[δH6.24(s)、6.54(s)、6.86(s)]の存在が確認され、13CNMRスペクトルデータにおいては、15本のシグナルが確認された。また、HREIMSスペクトルが、m/z 240.0816,[M]+calcd.240.0786であるところから、分子式はC15H12O3であることが判明した。
【0010】
【表2】
【0011】
HMBCスペクトルデータでは、メチル基δH2.32(s、H−13)からδC132.7(C−3)のメチン炭素、δC146.0(C−4)、160.8(C−5)の四級炭素に、δH6.24(s、H−3)からδC195.2(C−2)のカルボニル炭素、δC127.1(C−1)、146.0(C−4)の四級炭素、δC14.3(C−13)のメチル炭素に相関がみられ、図1に示す部分構造が考えられた。また、ラクトン部分のカルボニル炭素と考えられるδC169.2(C−12)には、メチル基δH2.12(H−15)からのみ相関がみられ、さらにこのメチル基δH2.12(H−15)からδC116.9(C−11)、156.1(C−7)、144.7(C−8)の四級炭素に相関がみられることから、図2に示す部分構造が考えられた。
【0012】
これらのデータから、マラフィリディン(malaphyllidin)(図3)やリンデルアズレン(linderazulene)(図4)の構造が考えられたが、HMBC、1H−1HCOSY、NOESYスペクトルデータから、セスキテルペン ケトラクトン(sesquiterpene ketolactone)と推定した。
【0013】
このセスキテルペンケトラクトンは、以前に海綿gorgonianのparamuricea chamaleonから単離されたリンデルアズレンのphoto artifactとして初めて構造決定された(Tetrahedron Letters, Vol.25, No.20, pp2109-2110, 1984)が、その後、同じ海綿のPlacogorgia sp.から天然物質として単離された(Zeitschrift fur Kristallographie 177, 287-290, 1986)。また、最近、キク科タンポポ属のTaraxacum wallichiiから単離され、13CNMRが測定され帰属されている。しかし、これらの文献に報告された1HNMR、13CNMRスペクトルデータの帰属が一部誤っていることがわかった。このようにして、ワタヨモギから抽出された上記セスキテルペン ケトラクトンが、2,7−ジヒドロ−3,5,8−トリメチルアズレノ[6,5−b]フラン−2,7−ジオンであることを確認した。
【0014】
そこで、上記化合物2,7−ジヒドロ−3,5,8−トリメチルアズレノ[6,5−b]フラン−2,7−ジオンのMRSA、MSSAに対する最小発育阻止濃度(MIC)値を微量液体希釈法により測定した。また、イソキサゾリル系合成ペニシリンであるオキサシリン(MPIPC)をポジティブコントロールとして用いた。その結果、2,7−ジヒドロ−3,5,8−トリメチルアズレノ[6,5−b]フラン−2,7−ジオンは、MSSA(ATCC6538)や臨床分離株であるMRSA(no.4)に対しては抗菌活性を示さなかったが、臨床分離株であるMRSA(no.5)に対しては強い抗菌活性を示し、特定のMRSA(no.5)に対してはオキサシリンよりも優れた抗菌活性を示すことがわかった。
本発明は、以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。
【0015】
すなわち本発明は、式[I]で表される化合物である2,7−ジヒドロ−3,5,8−トリメチルアズレノ [ 6,5−b ] フラン−2,7−ジオンを有効成分として含有することを特徴とする抗MRSA薬剤(請求項1)や、
【化2】
式[I]で表される化合物が、ワタヨモギ(Artemisia gilvescens)から抽出された化合物であることを特徴とする請求項1記載の抗MRSA薬剤(請求項2)に関する。
【0019】
【発明の実施の形態】
式[I]で表される化合物は、公知の反応を利用して化学合成することもできるが、ワタヨモギから簡便に抽出・単離することもできる。ワタヨモギからの上記化合物の単離は、例えば、乾燥地上部のヘキサン抽出残渣を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル抽出エキスをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン−酢酸エチル=1:1)で分画し、高抗MRSA活性の画分をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=10:1)で分画し、高抗MRSA活性の画分をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン−酢酸エチル=1:1)とゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)により行うことができる。
【0020】
本発明のセスキテルペンケトラクトンである化合物は、特定のMRSAに対して、強い抗菌活性を有する。式[I]で表される化合物のMRSAに対する抗菌活性は、最小発育阻止濃度(MIC)測定により確認することができ、MIC測定は、例えば、文献(Japan Society for Antimicrobial Chemotherapy 29,76-79, 1981)記載の抗菌感受性測定方法などにより実施することができる。例えば、ミューラーヒントン培地を基礎とした半合成培地を用いた寒天平板希釈法を用いた場合、一定時間、例えば、24時間培養後のコロニー数が数個(5個以内)であれば、発育が阻害されたと判断することができる。また、ミューラーヒントンブロスを用いて、MRSA等の供試菌の菌数を約106/mLに調整した接種菌液を用いる液体希釈法においては、一定時間、例えば、24時間培養後の波長570nmにおける光学密度(OD)が0.05以下となるとき、発育が阻害されたと判断することができる。
【0021】
上記式[I]で表される化合物は、予防若しくは治療用の抗MRSA薬剤とすることができる。医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、pH緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【0022】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例1:ワタヨモギ含有物の抽出
2000年に徳島大学薬用植物園で栽培したワタヨモギ(A gilvescens)の乾燥地上部293gを粉砕してソックスレー抽出器を用いて、ヘキサン抽出残渣を酢酸エチルで抽出し、得られた酢酸エチル抽出液を濃縮器で溶媒を留去して、酢酸エチル抽出エキス8.6gを得た。
【0023】
実施例2:抗MRSA活性物質の特定
酢酸エチル抽出エキスをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル800g、展開溶媒クロロホルム−メタノール=10:1)により、画分1〜画分18の計18画分に分画した。これら18画分についてディスク拡散法によりMSSA及びMRSAに対する抗菌活性スクリーニング試験を行なった。その結果、画分4(300mg)はMSSA(ATCC6538)に対しては抗菌活性を示さなかったが、MRSA(臨床分離株)に対しては強い抗菌活性を示した。そこで、この画分4をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル30g、展開溶媒ヘキサン−酢酸エチル=1:1)で画分4−1〜4−8の計8画分に分画し、これら8画分について、抗MRSA活性試験を行なった。画分4−4〜4−5(17mg)に強い抗MRSA活性が認められたことから、この分画からさらに高速液体クロマトグラフィー(カラム:GPC、移動相:クロロホルム)で合計5種の単一化合物を単離した。更に、抗MRSA活性試験を行なったところ、ats1205と仮称した化合物(2.5mg)に強い抗MRSA活性が認められた。
【0024】
ats1205についてNMRのデータは以下のとおりであった。
尚、1HNMRスペクトルは、BRUKER ARX-400 NMR spectrometer(400MHz)、BRUKER ARX-300 NMR spectrometer(300MHz)、13CNMRスペクトルはBRUKER ARX-400 NMR spectrometer(100.5 MHz)で測定した。カラムクロマトグラフィーはsilica gel 60 N(63-210 mesh:関東化学(株)社製)を用い、HPLCのカラムはMightysil Si 60 250-20(5μm:関東化学(株)社製)、GPCのカラムはshodex GPCH 2001,2002(CHCl3)を用いた。
PMR(chloroform−d1、TMS=0ppm):6.86ppm(1H、s)、6.54(1H、s)、6.24ppm(1H、s)、2.69ppm(3H、s)、2.32ppm(3H、s)、2.12ppm(3H、s)
CMR(chloroform−d1、TMS=0ppm):195.2、169.2、160.8、156.1、146.0、144.7、143.4、135.0、132.7、127.1、116.9、114.7、22.3、14.3、8.5
【0025】
実施例3:2,7−ジヒドロ−3,5,8−トリメチルアズレノ[6,5−b]フラン−2,7−ジオンのMRSA増殖阻害スクリーニング試験
文献(Japanese Society for Antimicrobial Chemotherapy 29, 76-79, 1981)記載の方法によりスクリーニング試験を行なった。即ち、ミューラーヒントン・ブロース(BBL社製)で臨床分離株であるMRSA(no.5)を37℃で20時間培養し、菌数を106/mLに調整した時点で、表4に示す量の2,7−ジヒドロ−3,5,8−トリメチルアズレノ[6,5−b]フラン−2,7−ジオン、又はポジティブコントロールとしてオキサシリン(MPIPC)をそれぞれ添加し、添加後18時間、24時間、48時間経過時における濁度(OD;波長570nm)をそれぞれ測定した。結果を表3に示す。通常、ODが0.05以下であれば、菌が増殖していないと判断されることから、18時間後、24時間後、48時間後のMIC値は、2,7−ジヒドロ−3,5,8−トリメチルアズレノ[6,5−b]フラン−2,7−ジオンの場合、それぞれ0.98μg/mL、1.95μg/mL、3.91μg/mLであり、MPIPCの場合は、それぞれ16μg/mL、64μg/mL、128μg/mLであり、2,7−ジヒドロ−3,5,8−トリメチルアズレノ[6,5−b]フラン−2,7−ジオンは特定のMRSAに対する抗菌活性が非常に優れていることがわかった。
【0026】
【表3】
【0027】
【発明の効果】
本発明の抗MRSA薬剤は、優れた抗MRSA活性を有し、ワタヨモギから抽出された天然物であり、副作用が少なく、毒性の少ない抗MRSA薬剤であって、院内感染が問題となる免疫力が低い患者に対し、安全に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の式[I]で表される化合物の一部分の構成を表す図である。
【図2】本発明の式[I]で表される化合物の一部分の構成を表す図である。
【図3】マラフィリデイン(malaphyllidin)の構造式を表す図である。
【図4】リンデルアズレン(linderazulene)の構造式を表す図である。
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