KR101381323B1 - 항균활성을 가지는 신규의 마크로락틴류를 생성하는 해양 미생물, 이 해양 미생물로부터 생성된 신규의 마크로락틴류 및 이 마크로락틴의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균활성을 보이는 하기 화학식 1 ~ 3으로 표시되는 마크로락틴 화합물을 제공하며, 이 화합물을 효율적으로 생산할 수 있는 기탁번호 KCTC 11975BP로 기탁된 해양 미생물 및 염화나트륨 12 g/L로 조절된 배지를 이용한 제조방법을 제공한다. 이와 같은 발명에 의하면 항균활성을 보이는 신규의 마크로락틴 화합물 및 이의 제조방법에 제공되어 항생제 내성 병원균에 의한 위협, 항진균 약물의 제한적 효능 및 최근의 바이오테러리즘의 등장에 맞설 신규 항미생물 제제의 상업적 공급이 가능할 수 있다.
<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

Description

항균활성을 가지는 신규의 마크로락틴류를 생성하는 해양 미생물, 이 해양 미생물로부터 생성된 신규의 마크로락틴류 및 이 마크로락틴의 제조방법{Marine microorganism producing new marolactines having antimicrobial activity, the marolactines produced by the marine microorganism, and producing method of the new marolactines using the marine microorganism}

본 발명은 항균활성을 가지는 신규의 마크로락틴류 화합물을 해양 바실러스 (Marine Bacillus)속 미생물 및 이 해양 바실러스 속 미생물에 의해 생성된 신규의 마크로락틴류 화합물 및 이 신규 마크로락틴 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

해양생물들은 다양한 화합물을 생성할 뿐만 아니라 여러 가지 생리 활성을 보이고 있어서 미래의 아주 유망한 천연자원으로 인식되고 있다.

특히 해양 바실러스 속 미생물은 해양 생태계의 어디에나 다양하게 서식하며, 항균물질, 항암제, 생물계면활성제 등을 생성하는 것으로 알려져 있다.

항생제 내성 병원균에 의한 위협, 항진균 약물의 제한적 효능 및 최근의 바이오테러리즘의 등장에 맞설 신규 항미생물 제제가 긴급히 필요한 실정이다.

상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들에 의한 지속적인 연구 결과 해양퇴적토, 해양 조류 및 무척추 동물에서 분리한 해양 미생물들은 항균활성 등의 생리활성을 보이는 이차대사산물을 생성하는 것을 확인하였으며, 해양 미생물로부터 생리활성을 가지는 이차대사산물에 대한 본 발명자들의 지속적인 연구 결과 항균활성을 보이는 신규의 마크로락틴류 화합물을 생성하는 해양 바실러스 (Marine Bacillus)속 미생물을 찾아내어 본 발명을 완성하게 된 것으로서, 본 발명이 해결하고자는 기술적 과제는 항균활성을 가지는 신규 물질을 생성하는 해양 미생물, 이 해양 미생물로부터 생성된 신규 물질 및 이 신규 물질의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1 ~ 3으로 표시되는 화합물을 생성하는 기탁번호 KCTC 11975BP로 기탁된 해양 바실러스 속 미생물을 제공한다.

다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1 ~ 3으로 표시되는 마크로락틴 화합물을 제공하며, 이 화합물들은 항균활성을 가지는 것을 특징으로 한다.

또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 화학식 1 ~ 3으로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는데, 이 본 발명에 따른 제조방법은

기탁번호 KCTC 11975BP로 기탁된 해양 바실러스 속 미생물을 0.1% 효모 추출물, 0.1% 비프 추출물, 0.2% 트립톤, 1% 덱스트로즈, 염화나트륨 12 g/L, pH 7.6의 변형된 베넷 배지에서 배양하는 단계; 및

상기 배양물을 원심분리한 상등액을 에틸아세테이트(EtOAc)로 추출한 후 에틸아세테이트 층을 증발 건조한 후 잔류 현탁물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하고 분획물로부터 상기 화학식 1 ~ 3으로 표시되는 화합물을 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명은 항균활성을 보이는 상기 화학식 1 ~ 3으로 표시되는 마크로락틴 화합물을 제공하며, 이 화합물을 효율적으로 생산할 수 있는 해양 미생물 및 염화나트륨 12 g/L로 조절된 배지를 이용한 제조방법을 제공한다. 이와 같은 본 발명에 의하면 항균활성을 보이는 신규의 화합물 및 이의 제조방법에 제공되어 항생제 내성 병원균에 의한 위협, 항진균 약물의 제한적 효능 및 최근의 바이오테러리즘의 등장에 맞설 신규 항미생물 제제의 상업적 공급이 가능할 수 있다.

도 1은 09ID194 균주는 변형된 베넷 한천배지에서 잘 발달된 붉은 콜로니에 대한 사진이다.
도 2는 09ID194 균주의 계통도이다.
도 3는 CD₃OD에 용해된 화합물 1과 2의 NMR 데이터 도면이다.
도 4은 화합물 1과 3에 대한 COSY 및 HMBC 상관관계를 도시한 도면이다.
도 5는 화합물 3에 대한 Key ROESY 상관관계 도시한 도면이다.
도 6는 화합물 1의 (S)- and (R)-MTPA 에스테르에 대해 수득한 Δδ_H 값 [Δδ_H= δ_S - δ_R]을 나타낸 도면이다.
도 7은 CD₃OD에 용해된 화합물 3의 NMR 데이터 도면이다.

이하 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 균주의 분리 및 분류, 대량 배양을 통한 화합물을 정제 및 생리 활성 시험의 순서로 설명하고자 한다.

<균주 09 ID194 의 분리 및 분류>

균주 09ID194는 2009년 탐사에서 대한민국 남해의 이어도에서 채집한 퇴적물 샘플로부터 분리하였다.

분리과정을 설명하면, 퇴적물 샘플 1g을 무균 조건에서 멸균된 해수에 10^-1, 10^-2, 10^{- 3}및 10^-4로 희석시키고, 각 희석액 100㎕를 변형된 베넷 한천 배지(0.1% 효모 추출물, 0.1% 비프 추출물, 0.2% 트립톤, 1% 덱스트로즈, 100% 천연 해수, 1.8% 한천, 멸균전 7.2로 pH 조절)에 도말한 후 30℃에서 14일간 배양하여 생성된 균주 09ID194의 콜로니를 분리하였다.

상기의 변형된 베넷 한천 배지상에서 분리한 콜로니를 배양하였다. 09ID194 균주는 변형된 베넷 한천배지에서 잘 발달된 붉은 콜로니를 형성하였으며, 이에 대한 사진을 도 1로 첨부하였다.

상기 균주는 16S rDNA 서열분석에 의하여 Bacillus sp.로 동정되었다. 이 균주는 한국생명과학연구원 생명자원센터에 KCTC 11975BP로 기탁되어 있다. 기탁된 균주에 대한 계통도를 도 2로 첨부하였다.

<균주 09 ID194 대량 배양>

균주 09ID194 대량 배양은 변형된 베넷 배지(0.1% 효모 추출물, 0.1% 비프 추출물, 0.2% 트립톤, 1% 덱스트로즈, 염화나트륨 12 g/L, pH 7.6)에서 실시되었다. 상기 배지 200㎖를 500㎖들이 코니칼 플라스크에 분배하고 멸균하였다.

상기 분리과정에서 얻은 09ID194 균주의 단일 콜로니를 상기 플라스크에 무균적으로 접종시키고 24℃에서 2일간 120rpm의 회전 진탕배양기 상에서 배양하였다.

상기 배양물을 0.2% v/v가 되도록 1ℓ멸균 배양 배지를 함유하는 2ℓ들이 플라스크 총 300개 플라스크에 접종하여 동일한 조건하에서 7일간 배양한 후 수집하였다.

<화합물의 추출 및 분리>

상기 대량 배양에서 얻은 배양액 300ℓ를 원심분리하고 상등액을 에틸아세테이트(EtOAc, 2 x 300ℓ)로 추출한 후 40℃에서 회전 증발기를 사용하여 EtOAc 층을 건조 농축시켰다.

이어서 잔류 현탁액 200g을 ODS 개방 칼럼크로마토그래피에 주입한 후, 이동상으로서 MeOH/H₂O (v/v) (1:4, 2:3, 3:2, 4:1 및 100:0)을 사용하여 단계적 분리하였다.

MeOH/H₂O (3:2, v/v)로 분리된 분획물을 다시 실리카 개방 컬럼 크로마토그래피 처리한 후, n-헥산-EtOAc (v/v) (100:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4, 0:100) 및 EtOAc-MeOH (v/v) (4:1, 3:2, 2:3, 1:4, 0:100)으로 단계적으로 분리하였다. n-헥산-EtOAc (v/v) (0:100)로 용출한 분획물을 semipreparative 실리카 HPLC (10% n-헥산을 포함한 EtOAc 용액; 유동 속도: 1.5 mL/min; 검출기: UV)로 더 처리하여 13개 분획물을 얻었다 (F-1~13). F-8, F-11, 및 F-9로부터 분석용 ODS HPLC (유동 속도: 0.6 mL/min; 검출기: UV) 상에서 상기 화학식 1 ~ 3으로 표시되는 화합물을 하기 등용매 조건: 55% MeOH 수용액; 60% MeOH 수용액; 및 58% MeOH 수용액에서 정제하여 순수 화합물로서 화학식 1로 표시되는 화합물 6.0 mg, 화학식 2로 표시되는 화합물 3.1 mg, 및 화학식 3으로 표시되는 화합물 3.5 mg을 각각 얻었다.

<화학식 1로 표시되는 화합물(화합물 1)의 구조결정>

화합물 1은 무정형 고형물로서 얻었고, 이의 분자식은 C₂₄H₃₄O₆로서 HRESIMS (m/z 441.2242 [M+Na]⁺ 및 ¹³C NMR 데이터에 기반하여 불포화도 8을 가지는 것으로 결정되었다(도 3 참조). 화합물 1의 IR 스펙트럼은 3318 및 1681 cm^-1에서 밴드를 가지고 있고, 이는 각각 하이드록시 및 카르보닐 관능기에 해당한다. 232와 261 nm에서 UV 흡광은 연장된 공역시스템의 존재를 제시하였다. 이러한 가정은 ¹³C NMR 스펙트럼에서의 10개 sp² 탄소 신호들에 의해 뒷받침 되었다. 총 24개의 탄소 공명이 ¹³C NMR 스펙트럼에서 검출되었고, 이는 한 개의 카르보닐, 6개의 옥시메틴, 10개의 올리핀성 탄소, 6개 메틸렌 및 한 개의 메틸 탄소에 기인함이 HSQC 스펙트럼으로 밝혀졌다. ¹³C NMR은 화합물 1이 한 개의 에스테르와 5개의 이중 결합으로 구성되고, 이는 불포화도 8 중에 6개의 불포화도를 담당하고 있다. 나머지 두개의 불포화도는 화합물 1에서 두 개의 고리 시스템의 존재로 설명될 수 있다. ¹H 및 ¹³C NMR 신호는 명백히 화합물 1이 마크로락틴 족에 속하며, 마크로락톤이 상기 고리 중 하나를 담당하는 것을 나타낸다.

화합물 1의 평면구조(도 4 참조)는 COSY, HSQC 및 HMBC 분광 데이터의 분석으로 결정되었다. COSY 상관관계는δ_H 5.51 (d, J=11.5)의 H-2로부터 δ_H 1.25의 H₃-24까지 하나로 연결되는 커플링 서열을 나타내고 있다.

화합물 1의 마크로락톤 고리내에서 에스테르의 고리화 지점은 δ_H 4.95의 H-23의 화학 전이값(chemical shift)에 의해 알 수 있었으며, H-23은 H₃-24 메틸기와 명백히 커플링 하고 있으며,δ_C 168.3 (C-1)의 카르보닐 탄소와 H-23의 HMBC 상관관계 (도 4 참조)에 의해서 확인 되었다.

상기 분자 구조식과 다른 하나의 고리 시스템이 더 필요한 사실에 기반하여, 화합물 1에는 한 개의 환형 에테르 관능기가 있어야 한다. 환형 에테르의 위치는 상이한 NMR 용매에 기록된 COSY 데이터의 면밀한 조사와 커플링 상수 분석으로 결정되었다. DMSO-d₆ 및 C₆D₆에서의 COSY 스펙트럼의 분석으로 3 개의 서로 인접한 옥시메틴 양성자들 (H-15에서 H-17까지)의 커플링 시퀀스를 밝혀냈다. DMSO-d₆를 사용하여 찍은 COSY 스펙트럼에서, 옥시메틴 양성자 H-7, H-13 및 H-16은 각각 C-7, C-13, 및 C-16에 결합된 OH 양성자와의 COSY 상관관계를 나타내었다.

옥시메틴 탄소 C-23이 카르보닐 탄소 C-1과 에스테르 결합에 연루됨에 따라, 산소 다리가 C-15 및 C-17 사이에 형성되어야만 옥세탄 링을 만들어서 상기 분자식을 만족시킨다. 이러한 사실은, 화합물 1이 15,17-에폭시-16-하이드록시의 부분 구조를 가지고 있고, H-16은 H-15 및 H-17과 큰 커플링 상수값 (J=9.0)으로 결합하고 있기 때문에 이 부분 구조에서 에폭사이드가 존재할 가능성을 배제하여 옥세탄 링이 존재한다 것을 나타낸다.

화합물 1은 옥세탄-3-올의 부분구조를 가지고 있는데, 이 부분구조는 몇 가지의 천연물에서 발견된다. H-15와 H-16 사이, H-16과 H-17 사이의 큰 커플링 상수 및 H-15와 H-17 사이의 ROESY 상관관계는 H-15와 H-17이 시스 방향이라는 것을 나타낸다 (도 3 참조). C-2, C-4, C-8, C-10 및 C-18에서의 이중 결합의 입체구조는, 그들 각각의 ¹H NMR 커필링 상수(11.5, 15.5, 15.0, 11.0 및 15.1 Hz)에 기반하여, 각각 Z, E, E, Z 및 E로 결정되었다.

화합물 1의 절대구조는 변형 모셔 방법으로 결정하였다. 화합물 1은 (R)-(-)- 및 (S)-(+)-α-메톡시-α-(트리플루오로메틸)-페닐아세틸 클로라이드 (MTPA-Cl)를 각각 함유한 무수 피리딘으로 처리하여 트리스-(S)- 및 (R)-MTPA 에스테르 유도체 1a 및 1b를 각각 얻었다. 상기 두 개의 트리에스테르 유도체의 모든 양성자 신호들은 COSY 실험에 의해 알 수 있었고, 트리스-(R)-MTPA에스테르류 (1b)의 ¹H NMR 화학 전이 값을 트리스-(S)-MTPA 에스테르류 (1a)의 상응하는 값에서 차감하였다. Δδ_H(Δδ_H=δ_S -δ_R)값을 도 6(선택된 부위)에 도시한다.

트리스-모셔의 에스테르 유도체의 ¹H NMR 스펙트럼에서, 음의 Δδ_H 값이 H-2 ~ H₂-6에 대해서 관찰된 반면, 양의 값이 H-8 ~ H₂-12에 대해 나타났다. 이러한 데이터로부터 C-7의 절대 입체구조가 S임을 알 수 있었다. 리구에라에 의해 보고된 앤티-1,4-디올의 디에스테르류에 대한 전형적인 Δδ_H 패턴에 상응하는 H-13에서 H-16까지의 Δδ_H 값으로부터 화합물 1의 C-13 및 C-16의 절대 입체구조가 각각 S 및 R이라는 것을 알 수 있었다.

C-23의 절대 입체구조를 결정하기 위하여, 먼저 화합물 1을 NaOMe를 함유한 MeOH로 처리하여 선형의 메틸 에스테르로 전환시켰다. 상기 선형 메틸 에스테르의 (S)- 및 (R)-모셔 에스테르류 (1c 및 1d)를 각각 1a와 1b에 대한 것과 동일한 방법으로 제조하였다. 상기 1c와 1d의 에스테르화된 탄소 (C-23) (도 6 참조) 근처의 ¹H NMR의 화학 전이값 (Δδ_H=δ_S -δ_R)에 의하여, C-23의 절대 배치 구성이 R이라고 결정하였다.

화합물 1이 마크로락틴 A와 공통적으로 가지고 있는 스테레오 센터들의 입체구조는 마크로락틴 A의 tm테레오 센터들의 입체구조와 동일하였다. 따라서, 화합물 1은 마크로락틴 A의 새로운 유도체로서, 15, 17-에폭시-16-하이드록시 마크로락틴 A로 명하였다.

<화학식 2로 표시되는 화합물(화합물 2)의 구조결정>

화합물 2는 고분해능 질량분석기(HRESIMS)에 의해 C₂₄H₃₄O₆의 분자식을 가지고 있음을 알 수 있었다. 화합물 2의 UV, IR 및 1H와 13C NMR 스펙트럼은 화합물 1의 것과 거의 동일하였다. IR 흡수 스펙트럼은 3341cm^-1에서 강한 하이드록시 밴드 및 각각 에스테르 카르보닐과 에폭사이드 관능기에 기인한 1685와 1259cm^-1에서 밴드를 가지고 있고, 이것으로부터 화합물 2가 화합물 1의 위치 이성질체라는 것을 알 수 있었다. 234nm와 261nm에서의 UV 흡광도로부터 확장된 공역 시스템의 존재를 알 수 있었다.

자세한 분광 자료 분석 (COSY, HSQC 및 HMBC)에 기초하여 화합물 2의 평면 구조를 결정하였다. COSY 스펙트럼의 분석 결과, 화합물 2는 H-2부터 H₃-24까지 단일 스핀 시스템을 가지고 있음을 알 수 있었다. H-23부터 C-1(δ_C 168.3)으로의 HMBC 상관관계는 C-23이 에스테르 연결에 관계한다는 것을 나타내었다. 화합물 2에서 C-18과 C-19 위치의 에폭사이드는 화합물 1에서와 같은 방법으로 결정되었다.

화합물 2의 C-2, C-4, C-8과 C-10에서의 이중결합들의 기하입체구조는 커플링 상수에 기초하여 화합물 1과 동일한 것으로 나타났다 (도 3 참조). H-16과 H-17의 시그널은 CD₃OD 및 DMSO-d₆에서 중첩되어 이들의 커플링 상수를 직접적으로 측정할 수 없게 하였다. H-15와 H-17 사이 및 H-16과 H-18 사이의 ROE 상관관계는 16,17-올리핀의 입체배치가 E라는 것을 나타낸다. H-18과 H-19(J=2.5 Hz)의 커플링 상수는 에폭사이드 기의 트란스 배치를 나타낸다. H-18와 H-19 사이의 약한 COSY 상관관계 또한 에폭사이드 기의 트란스 배치를 나타낸다. 이러한 트란스 배치는 또한 H-16과 H-18 사이 및 H-17과 H-19 사이의 ROSEY 상관관계에 의해 지지된다. 비록 트란스 에폭사이드가 확립되었지만, 마크로시클릭 고리의 유연성과 ROSEY 상관관계의 부족으로 나머지 스테레오 센터들에 대한 에폭사이드의 상대 입체배치를 결정할 수 없었다.

화합물 2의 트리스-(S)-와 (R)-MTPA 에스테르 사이의 상응하는 ¹H NMR 화학 전이값 차이의 분석으로 C-7, C-13, 및 C-15 입체 센터의 절대 입체구조는 각각 S, S 및 R이라는 것을 알 수 있었다. C-23 (δ_C 72.7)과 H-23(δ_H 4.96, m)의 ¹³C 및 ¹H 공명값들은 화합물 1의 것과 유사하였고, 화합물 1과 화합물 2는 공통의 생합성 경로로 생성되는 것 같다.

따라서, 화합물 2의 C-23의 절대 입체구조는 R이라고 추정된다. 화합물 2의 구조는 화합물 1의 이성체로서, 18, 19-에폭시 마크로락틴 A로 확정하였다.

<화학식 3로 표시되는 화합물(화합물 3)의 구조결정>

화합물 3은 광학적 활성을 가지는 무정형 고체로 분리되었는데, 고분해능 질량분석 스펙트럼(HRESIMS)에서 m/z 441.2244 [M+NA]⁺ 이온을 나타내었고, 화합물 1과 2와 동일한 분자식인 C₂₄H₃₄O₆을 가지며, 화합물 1과 화합물 2의 이성체 임을 알 수 있었다.

화합물 3의 평면 구조는 화합물 1 및 화합물 2와 유사한 방식으로 결정되었다 (도 4 참조).

C-2부터 C-24까지 위치의 양성자들의 연결이 COSY 분광 데이터 분석에 의해 관찰되었다. H-23의 화학 전이값(δ_H 4.97)은 화합물 3이 환형 에스테르라는 것을 나타내며, 에스테르 카르보닐 탄소 C-1 (δ_C 168.1)과 H-23의 HMBC 상호관계에 의해 이 연결이 확인되었다.

¹³C NMR 스펙트럼에서 6 개의 옥시메틴 탄소의 공명이 관찰되었다. 이것들 중에서 세개의 옥시메틴 (H-7, H-15 및 H-16)은 DMSO-d₆를 사용하여 측정하였을 때 OH 양성자와 COSY 상관관계를 나타내며, 이는 OH 기가 C-7, C-15, 및 C-16에 부착되어 있는 것을 나타낸다.

그러나, 옥시메틴 H-13과 H-17은 OH기 양성자와 COSY 상관관계를 보이지 않는데, 이는 산소 다리가 C-13과 C-17 사이에 형성되어서 테트라하이드로피란 고리를 형성해야 한다는 것을 나타낸다. 이러한 사실은 H-13와 C-17의 HMBC 상관관계에 의해 확인되었다 (도 4 참조).

커플링 상수에 대한 분석으로, 화합물 3의 모든 이중치환된 이중결합의 상대적 입체배치는 화합물 1과 2의 경우와 동일한 것을 알 수 있었다(도 3 및 도 7 참조). H-13ax와 H-14eq, H-13ax와 H-15ax, H15ax와 H-16eq (J=3.8 Hz), 및 H-16eq와 H-17eq (J=3.8 Hz) 사이의 ROSEY 상관관계는 테트라하이드로피란 고리가 체어 형태를 취한다는 것을 의미한다(도 5 참조).

트리스 모셔의 에스테르에 대한 ¹H NMR의 화학 전이값의 차이인 Δδ_H(δ_S -δ_R)로부터 7R의 절대 입체구조를 알 수 있었다. Δδ_H 값에 대한 분석으로, 리구에라에 의해 설명된 syn-1,2-디올에 대한 변형된 모셔의 방법에 기반하여 화합물 3의 of C-15 및 C-16의 절대 배치구조가 R 임을 명확히 결정하였다.

ROESY 상관관계 (도 4 참조) 또한 C-13이 R 입체구조를 가지고 있음을 나타내었다. 따라서, 화합물 3의 구조는, 테트라아히드로피란 고리를 함유하는 마크로락틴 A의 신규 유도체인, 13,17-에폭시-16-하이드록시마크로락틴으로 결정되었다.

<화학식 1 ~ 3으로 표시되는 화합물 1 ~ 3의 구조>

<화학식 1>

15,17-에폭시-16-하이드록시 마크로락틴 A: 무정형 고체;[α]₂₃ ^D -220 (c 0.05, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε 200 (4.08), 232 (4.23), 및 261 (4.05) nm; IR (MeOH) ν_max 3318 (br), 2922, 1681, 1250, 1029 cm-¹; ¹H 및 ¹³C NMR 데이터 (CD3OD), 참조 도 3; HRESIMS m/z 441.2242 [M + Na]⁺ (이론치 C₂₄H₃₄O₆Na, 441.2253).

<화학식 2>

18,19-에폭시 마크로락틴 A: 무정형 고체; [α]₂₃ ^D -100 (c 0.05, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε 234 (3.95) 및 261 (3.76) nm; IR (MeOH) ν_max 3341 (br), 2922, 1685, 1259, 1029, 1037 cm^-1; ¹H 및 ¹³C NMR 데이터 (CD3OD), 참조 도 3; HRESIMS m/z 441.2248 [M + Na]⁺ (이론치 C₂₄H₃₄O₆Na, 441.2253).

<화학식 3>

13,17-에폭시-16-하이드록시 마크로락틴 A: 무정형 고체;[α]₂₃ ^D -250 (c 0.05, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε 200 (4.11), 234 (4.42), 및 261 (4.22) nm; IR (MeOH) ν_max 3373 (br), 2929, 1689, 1192 cm^-1; ¹H 및 ¹³C NMR 데이터 (CD₃OD), 참조 도 7;HRESIMS m/z 441.2244 [M + Na]⁺ (이론치 C₂₄H₃₄O₆Na, 441.2253).

<화합물 1 ~ 3의 항균활성>

화합물 1 ~ 3의 최소 저해 농도(MIC)를 통상적인 배양액 희석법을 사용하여 결정하였으며, 화합물 1 ~ 3을 세가지의 미생물 균주에 대하여 항균활성을 측정하였다: Bacillus subtilis(KCTC 1021), E. coli(KCTC 1923), 및 Saccharomyces cerevisiae (KCTC 7913).

항균 및 항효모 시험을 각각 영양 배양액 및 효모 말토즈 배양액에서 수행하였다. 각 화합물의 희석액을 0.5 ~ 256 ㎍/㎖의 범위에 걸쳐 96-마이크로타이터 플레이터에 마련하였다.

각 균주의 하루 배양액을 마련하여 균주의 최종 농도를 0.5 McFarland Standard와 배양액 탁도를 비교하여 1.5 x 10⁸ cfu/mL로 조정하였다.

배양액 30㎕를 화합물 1 ~ 3의 각 희석액에 첨가하고 각 웰의 최종 부피를, 각자의 배양 배지를 사용하여 200㎕로 조정하고, 플레이트를 세균에 대해서는 24 시간동안 37℃에서, 효모에 대해서는 48시간 동안 30℃에서 배양하였다. 최소 저해 농도 (MIC)는 미생물이 탁도의 존재에 의해 측정시 가시적인 성장을 나타내지 않는 샘플의 최소 농도이다.

화합물 1 ~ 3 각각은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 에스체리키아 콜리 (Escherichia coli)에 대하여 0.16μM의 최소 저해 농도 (MIC)를 나타냈다. 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)에 대한 이들의 MIC는 각각 0.16, 0.02, 및 0.16 μM 이었다.

미분류된 해양 미생물로부터 분리된 마크로락틴 A은 표준 디스크 확산 분석법 결과 S. aureus 및 B. subtilis를 저해하였고 및 또한 상당한 항바이러스성 및 항종양 활성을 보였다.

C-15의 수산화기는 항세균성 활성에 필수적인 반면, C-7 또는 C-9에서의 수산화기의 존재 및 고리를 구성하는 탄소의 수는 항세균 활성에 영향을 끼치지 않았다. 마크로락틴류는 주로 항세균활성 및 중등 또는 약한 항진균 활성을 보였다. 옥세탄 (화합물 1), 에폭사이드 (화합물 2), 및 테트라하이드로피란 (화합물 3)의 부분구조를 포함하는 상기 신규의 마크로락틴들은 보고된 마크로락틴류들과 유사한 항세균 활성을 나타내었으나, S. cerevisiae에 대하여 매우 우수한 항균 활성을 보였다.

<결론>

결론적으로, 세 개의 신규의 마크로락톤 화합물인 화합물 1~3을 해양 바실러스 종의 배양액의 EtOAc 추출물로부터 분리하였다. 화합물 1~3은 그람-양성 및 그람-음성 병원균 모두에 대하여 항균 활성을 보였다. 이들 화합물 1~3은 각각 옥세탄 (화합물 1), 에폭사이드 ( 화합물 2), 및 테트라하이드로피란 (화합물 3)의 부분구조를 포함하는 마크로락톤으로서 최초 보고되는 신물질들이다.

에폭사이드가 마크로락톤 고리에 존재하는 것이 S. cerevisiae에 대하여 항균활성에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 흥미롭게도, 화합물 1 ~ 3은 저염도(12 g/L)에서만 이러한 Bacillus sp.에 의해 생성되나 고염도 (32 g/L) 배양배지에서는 생산되지 않았다.

<참고>

화합물 1의 트리스 -(S)- MTPA 에스테르 (1a).

화합물 1 (1.0 mg)을 피리딘 150 ㎕에 용해하고 실온(rt)에서 10분간 교반하였다. 화합물 1의 트리스-(S)-MTPA 에스테르 (1a)를 만들기 위해, (R)-(-)-α-메톡시-α-(트리플루오로메틸)페닐아세틸 클로라이드 (MTPA-Cl) 20 ㎕를 반응 바이알에 첨가하고 혼합물을 실온에서 16시간 교반하였다. 반응 완료를 LC/MS를 사용하여 모니터하였다. 반응 혼합물을 감압 건조시키고 EtOAc에 재용해하고, 물로 세척하고, 5% MeOH을 함유하는 CHCl₃를 용리액으로서 사용하여 실리카 HPLC로 정제하여 1a (0.8 mg)를 수득하였다. 트리에스테르 유도체 (1a)의 모든 양성자 신호는 COSY 실험으로 분석하였다.

1a: 백색, 무정형 고체; ¹H NMR (CD₃OD) (선책 부위) δ_H 5.51 (d, J = 11.3, H-2), 6.50 (t, J = 11.3, H-3), 7.17 (dd, J = 15.3, 11.3, H-4), 5.88 (dt, J = 15.3, 7.0, H-5), 2.52 (m, H-6b), 2.65 (m, H-6a), 5.70 (dd, J = 14.8, 7.5, H-8), 6.78 (dd, J = 14.8, 11.0, H-9), 6.20 (t, J = 11.0, H-10), 5.61 (m, H-11), 2.23 (m, H-12b), 2.58 (m, H-12a), 3.57 (m, H-13), 1.61 (m, H-14b), 2.20 (m, H-14a), 5.15 (m, H-15), 3.15 (dd, J = 9.0, 9.0, H-16), 3.55 (dd, J = 9.0, 5.0, H-17), 5.64 (dd, J = 14.5, 5.0, H-18), 3.45 (OCH3, s), 3.54 (2 × OCH₃, s) 7.29-7.63 (15H, m); ESIMS m/z 1089.81 [M + Na]⁺.

화합물 1의 트리스 -(R)- MTPA 에스테르 (1b).

1a와 거의 유사한 방식으로, 트리스-(R)-MTPA 에스테르 (1b)를 (S)-(+)-MTPA-Cl을 사용하여 수득하였다.

1b: 백색, 무정형 고체 (0.75 mg); ¹H NMR (CD₃OD) (COSY 실험으로 분석) (선택 부위) δ_H 5.53 (d, J =11.3, H-2), 6.58 (t, J = 11.3, H-3), 7.26 (dd, J = 15.5, 11.3, H-4), 6.03 (dt, J = 15.5, 7.0, H-5), 2.56 (m, H-6b), 2.72 (m, H-6a), 5.65 (dd, J =14.8, 7.0, H-8), 6.66 (dd, J = 14.8, 11.0, H-9), 6.04 (t, J = 11.0, H-10), 5.53 (m, H-11), 2.14 (m, H-12b), 2.47 (m, H-12a), 3.56 (m, H-13), 1.38 (m, H-14b), 2.06 (m, H-14a), 5.10 (m, H-15), 3.16 (dd, J = 9.0, 9.0, H-16), 3.56 (dd, J = 9.0, 3.5, H-17), 5.63 (dd, J = 14.5, 3.5, H-18), (OCH₃, s), 3.53 (2 × OCH₃, s) 7.30-7.58 (15H, m); ESIMS m/z 1089.84 [M + Na]⁺.

화합물 1의 메탄올분해 및 (S)- 및 (R)- MTPA 에스테르 (1c 및 1d)의 제조.

화합물 1 (1.2 mg)을 0.5 N NaOMe 용액 (1.5 mL MeOH)에 용해하고 90℃에서 1 시간 교반하면서 재환류시켰다. 1 N HCl을 첨가하여 반응 혼합물을 중화시키고 감압 건조시켰다. 잔류물질을 EtOAc (3 mL)에 용해하고 H₂O (3 × 10 mL)로 세척하여 과량의 NaOMe를 제거하였다.

메탄올분해 산물(0.9 mg)은 ESIMS (m/z 449.23 [M - H]^-)로 확인하였다. 다음, 메탄올분해 산물 (각 0.45 mg) (화합물 1의 선형 메틸 에스테르)을 전술 방법에 따라서 (R)-(-)/(S)-(+)-MTPA-Cl로 에스테르화 시키고, 8% MeOH을 함유하는 CHCl₃를 사용하는 실리카 HPLC상에서 정제하여 화합물 1의 선형 메틸 에스테르의 (S)-MTPA (1c) (0.30 mg) 및 (R)-MTPA (1d) (0.31 mg) 에스테르를 얻었다. 모셔의 에스테르 유도체 둘 다에 대한 ¹H NMR를 선택된 부위 대하여 분석하였다.

1c: 백색, 무정형 고체; 선택된 ¹H NMR (CD₃OD) δ_H 2.04 (m, H2-20), 1.38 (m, H2-21), 1.60 (m, H2-22), 1.23 (d, J = 6.5, H3-24); ESIMS m/z 1314.56 [M - H]^-. 1d: 백색, 무정형 고체; 선택된 ¹H NMR (CD₃OD) δ_H 2.02 (m, H2-20), 1.37 (m, H2-21), 1.59 (m, H2-22), 1.24 (d, J = 6.0, H3-24); ESIMS m/ z 1314.56 [M - H]^-.

한국생명공학연구원 KCTC11975BP 20110612

Claims (4)

1. 하기 화학식 2로 표시되는 마크로락틴 화합물.
   <화학식 2>
   

   
2. 제 1항에 있어서 상기 화학식 2로 표시되는 마크로락틴 화합물이 Bacillus subtilis, E. coli, 및 Saccharomyces cerevisiae 에 대하여 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 화학식 2로 표시되는 마크로락틴 화합물.
3. 제 1항 또는 제2항에 있어서 상기 화학식 2로 표시되는 마크로락틴 화합물이 기탁번호 KCTC 11975BP로 기탁된 해양 바실러스 속 미생물로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 화학식 2로 표시되는 마크로락틴 화합물.
4. 기탁번호 KCTC 11975BP로 기탁된 해양 바실러스 속 미생물을 0.1중량% 효모 추출물, 0.1중량% 비프 추출물, 0.2중량% 트립톤, 1중량% 덱스트로즈, 염화나트륨 12 g/L, pH 7.6의 변형된 베넷 배지에서 배양하는 단계; 및
   상기 배양물을 원심분리한 상등액을 에틸아세테이트(EtOAc)로 추출한 후 에틸아세테이트 층을 증발 건조한 후 잔류 현탁물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하고 분획물로부터 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마크로락틴 화합물의 제조방법.
   <화학식 2>
   

   

   
   

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