JP3935317B2 - 表面上の液体層中の生物学的活性分子のためのフロースルー剪断分析器 - Google Patents

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は急速な攪拌のための、および測定のためのメインクレームの、とりわけ表面上の生物学的活性分子の吸着−解離および反応速度特性の特徴をもつ超薄液体層を作成するための方法を持つフロースルー剪断分析器に関し、またこれらの特性を決定する方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
表面はたとえば純粋な表面を持つ多重相が他と出会うような不均一系で発生し、そこで個々の成分は境界で区切られている。境界に近い表面で相の拡張が観察された場合、境界層をしめす。たとえば表面上の境界層のタンパク質の濃縮において、濃縮は非共有結合力によって影響を受け、吸着反応速度によって特徴づけられる吸着（枯渇の場合、解離）過程についてしめす。タンパク質に配例変化または構造的変化（初期構造）が起こりうるようなタンパク質の進行における表面での引き続く変化において、共有結合−反応速度によって特徴づけられる工程を介してリガンドと結合できまた表面と結合でき、吸着反応がしばしば完了する。
【０００３】
表面上の生物学的に重要な分子、たとえばタンパク質分子の挙動は生物学、生化学における、またバイオセンサーの方法における、および生物医学的物質の評価における過程の評価で重要である。したがって、クロマトグラフィー方法での、および移植したもののバイオセンサーおよび生体適合性での表面の特性は、タンパク質とそれらのリガンドの表面への結合能に依存する。移植において外来物質上の血漿タンパク質の析出が血栓の成長および補体活性化を引き起こしうるのに対して、バイオセンサーにおいては特定の表面へのプロテオホルモンの結合からの血液−ホルモン濃度に関する情報を得ることができる。
【０００４】
表面でのタンパク質とそのリガンドの相互作用の直接のオンライン測定のために、先行技術が、たとえば表面プラズモン共鳴、インターフェロメトリー、エリプソメトリ−、リフレクトロメトリー、または好ましくは入射角が光学的に濃密な媒体の臨界角より大きい場合、光の放射が光学的により濃密な媒体（たとえば固体）と光学的に濃密でない媒体（たとえば液体）間の境界層で完全に反射する事象の使用を可能にする全内部反射蛍光、ＴＩＲＦの使用を記述している。光学的に濃密な媒体での反射の点で、入射光の振動数と同じ振動数の波が濃密な溶媒の表面に対して垂直に発生し（即時消退波と呼ばれる）、濃密でない溶媒中に伝波する。この一過性波の振幅は光学的に濃密でない溶媒内で 指数関数的に減少する。アッセイ溶液中に伝波したこの一過性波の透過深度は波長に依存し、一般的に２００−３００ｎｍより短く、しかしながら、蛍光発色団を励起するための深度は十分に境界に近く、それによって溶液（バルク溶液）に局在するタンパク質の大部分の励起はさけられる。
【０００５】
２９０ｎｍの励起波長を使用する場合、タンパク質内のトリプトファン発色団を選択的に励起することができ、３５０ｎｍで最大蛍光を持つ。一方化学修飾によってタンパク質内にさらなる蛍光団を組み込むことも可能であり、しかしながらそこにはタンパク質の構造の配座的な変化の危険が存在する。
【０００６】
試料を試料チャンバー内で混合した後、流動がないかまたはただ最小の流動である表面上での測定したタンパク質の吸着速度は３つの異なる段階、１．液体および固体表面間の境界層でのタンパク質の量輸送、２．本質的な結合速度、３．本質的な解離速度に依存する。たとえば固相上のタンパク質に対する結合部位のかなり低い表面濃度での場合のように結合速度かかなり低い場合、境界層でのタンパク質の枯渇が起こらず、吸着速度は本質的な結合速度のみに依存するであろう。
【０００７】
しかしながら多くの場合、拡散が一定のレベルでの表面層のタンパク質濃度を保持するのに十分ではないために結合速度は輸送速度よりも大きく、全反応が量輸送に依存することを示す。このことは、吸着速度はたとえば攪拌に強く依存することを意味する。
【０００８】
この場合は、また試料チャンバーの受容している容量での試料の混合速度が、輸送速度または結合速度より小さく、従ってタンパク質の吸着速度の速度決定となっておこる。現在までに、１００−２００μｌ容量の試料チャンバーで２−８秒間であるように混合時間を減少させるための簡単な溶液は先行技術ではみられなかった。
【０００９】
吸着反応速度のデータの測定のために試みた様々な溶液が先行技術で発表され、質量輸送を公平に評価するように試みている。Ｋｍ＝Ｄ／ｄ（Ｄ＝拡散定数、ｄ＝層の薄さ）で定義した１０μｍの非攪拌層の暑さについての量輸送係数（Ｋｍ）はフィブリノーゲンに対してたとえばもっともよい場合２×１０^−６ｍ／ｓであり、輸送の明らかな限定へと導く。しかしながら、量輸送の影響を妨げることなしに直接の反応速度信号を得たい場合、非攪拌層厚を減少させなければならず、吸着速度が層を通した量輸送から独立となるようなくらいまで行わなければならない。現在までに、後者の問題に対する溶液は先行技術で提案されてきていない。
【００１０】
本発明の目標はそれによって生物学的に活性な分子に対する吸着−解離または反応速度測定値が混合の、および量輸送の阻害影響がなく測定できるような測定系および測定方法を提供することである。
【００１１】
本発明者らは驚くべきことにこれらの問題が、（１）放射可能な生物学的に活性な分子の吸着反応速度が表面でできるような補助のあるフロースルー剪断分析器を提供することよって解決することを発見し、ここで、フロースルー剪断分析器は解析溶液または緩衝溶液を受けるためにその中に局在した試料チャンバーをもつ試料チャンバーブロック、 試料チャンバーが放射透過物質でできた試料チャンバー壁、たとえば石英壁を持ち、解析溶液または緩衝溶液のための試料チャンバーへの供給路、および試料チャンバーから出る解析溶液または緩衝溶液のための排出路、および試料溶液を試料チャンバーの供給路側の供給路内へ導入するための閉めることのできる注入口をもち、放射透過チャンバー壁の表面上での放射可能な分子の吸着の速度が溶液および表面間のこの境界層への分子の量輸送によって影響を受けないように、混合時間を大いに短くするための、およびとりわけ試料チャンバーに局在している解析溶液または緩衝溶液内にきわめて薄い液体層を生成するための方法であり、同様に必要であれば放射源、放射線導管および放射線分析器および試料チャンバー内へ供給線を介して緩衝溶液を供給するためのポンプおよび場合によっては排出路を介して試料チャンバーから緩衝溶液を導き出すためのポンプからなる、生物学的に活性な分子によって放射される放射光の方向付けおよび評価のための放射解析ユニットである。
【００１２】
本発明による分析器の補助によって、とても短い混合後、きわめて薄い層の厚さでの表面に関してタンパク質およびそのリガンドのような生物学的に活性な分子の吸着−解離速度定数および反応速度定数を決定することが可能であり、そこで表面は、結合親和性または特異性に関して生物学的に活性な分子の吸着−解離および反応特性を制御するために、化学的または物理的方法の補助またはとても異なる無機または有機または生物学的分子または物質とのこれらの方法の組合せで修飾またはコートすることができる。
【００１３】
本発明によって、生物学的に活性な分子によって、任意の方法によって生物学的な活性を示す任意の型の分子が知られており、単量体のまたは多量体の生物分子およびそのリガンドが含まれる。このような生物学的に活性な化合物はたとえば任意の方法で生態系で効果的なタンパク質、医薬品または他の化学的または生化学的化合物であり得る。しかしながら、表面上または境界内の化合物はシグナル生成特性を介して検出されやすいことがある場合決定的に重要である。このことはたとえば表面プラズモン共鳴、表面干渉スペクトル、屈折率、表面反射、偏光板の回転における誘発された変化、またはこのましくは分子から放射された放線での変化を介した場合であり得る。このような放線はたとえば光でまたは放射性アイソトープでの生物学的に活性な分子の標識化を介して分子に存在している化学発光団を励起することで生成される。標識化または生物学的に活性な分子内に例えば化学発光団を導入することにおいて、吸収特性は非標識化状態と比べてできるだけ代わらずに残るべきである。
【００１４】
本発明によって、好ましくはＴＩＦＲ法が生物学的に活性な分子から放出された放射線の解析のために使用されるべきであり、放射線解析ユニットは例えば単色光光線を提供する光源からなる光学的ユニット、たとえば光学プリズムなどの放射線導管およびたとえば評価ユニットと一緒になった放射線分析器などの放射モノクロメーターからなり、そこでプリズムおよび光源は、光源から放たれた光線は光学的に連結した様式で、濃密な媒体に対する臨界角より大きい角度での光透過石英板上に配列されたプリズムを介して石英板と溶液の間の境界層状にうつされるような方法で、たがいに関連して配置され、蛍光が生成され、蛍光は試料チャンバー中の石英板と試料流体の間の境界層で生成され、石英板表面へ充分に垂直に発光し、発光モノクロメーター中の光学系を介して検出される。
【００１５】
この薄い層の好ましい厚さを成し遂げるために、剪断力およびギャップ圧力を生成するための方法が本発明によって提供され、この方法が石英板の表面の試料チャンバー内で働く。この方法において、これらの剪断力は本発明によって機械的に生成されうる。最も簡単な場合、剪断力はチャンバーによる容量流動によってまたは測定表面のすぐ近くでのシリンダーローターの回転によって生成されうる。この方法にて生成された剪断速度は典型的に１０⁴−１０⁵ｓ^−１のオーダーであり、５−１５μｍの厚さの液体層を導き、本発明による超薄層の生成および生成された層のさらなる移動のための方法の手法を促進している。
【００１６】
５μｍ未満の層の厚さの明白な減少は、供給路側、配置した器具によって、本発明によって可能になり、１０−１００％、好ましくは５０−７５％のチャンバー容量のオーダーでの容量ユニットであり、容量単位はチャンバー溶液内で混じり合わない流体であり、チャンバー溶液内に好ましくは同一容量の容量流動部分で送り、容量ユニットが測定セルおよび測定表面上の液体層での液体容量をかなり減少させる方法として役に立つ。チャンバー溶液は親水性水溶液または疎水性有機液体であり得、混じり合わない流体は、第一の場合親水性液体で混じり合わず、第二の場合疎水性液体に混じり合わないような特性である。チャンバー溶液は好ましくは親水性水溶液型の緩衝溶液である。好ましくは、配列は先に言及した流体の容量単位が、試料チャンバーを通して供給された緩衝溶液中に解析溶液を加える直前に導入され、チャンバー容量およびしたがって液体容量を置換することで混合時間を減少させ、試料チャンバーをすすぎ、この進行において、流体と試料チャンバー壁間のギャップ圧力が、フィブリノーゲンに関する量輸送計数が１０^-4〜１０^-2 ｍ／ｓの量の多重オーダーまで減少するのでもはや測定可能な輸送バリアを表さない１０乃至３００ｎｍの間の液体層を生成する。
【００１７】
緩衝溶液中に導入された流体はたとえば緩衝溶液内に混合できない気体または液体であり得る。気体の使用、最も簡単な場合は空気の使用が好ましい。供給路の流動状態に依存している混合できない流体としての気体の使用において、単一気体泡が供給路内への導入において「パールの鎖（ｃｈａｉｎ ｏｆ ｐｅａｒｌｓ）」として連続的な小さな気体泡内に破裂されうる。さらに、気体を供給路内に導入する圧力を増加させることによって試料チャンバー内の気体泡と試料チャンバー壁間の層の厚さを減少させるために混じり合わない流体として気体を使用することも可能である。したがって、本発明のフロースルー剪断分析器は好ましく閉鎖系として形成され、すなわち外部圧力に関連した圧力の上昇が分析器の導管系で維持される。
【００１８】
流体を試料チャンバーへ供給路を通して供給路側に供給することは、たとえば緩衝溶液および流体を供給するための、および形成された容量流動の取り除きのための個々の接続からなる２方式弁を介して行われうる。流体の供給は連続的にまたは非連続的に行われえ、これによって、たとえば後者の可能性に対して緩衝溶液および流体の供給間の２方式弁の位置を介して前後へ切り換えられる。
【００１９】
剪断分析器の最も簡単な実施様態において、閉鎖系が存在し、簡単なチャンバーでその流動方向への交差部位垂直面が長方形または円形であるフロースルーキュベットで、このフロースルーキュベットは例えば試料チャンバーブロック内に配置し、その壁部分が放射線解析ユニット、たとえば分子から放出された放射線を検出し測定するための光学ユニットを配置される。フロースルー容量は、チャンバー容量１００〜２００μｌで、１〜１０００ｍｌ／時間、好ましくは１５０〜２００ｍｌ／時間の値まで達することができ、それにより１０⁴ｓ^-1以上のオーダーでの剪断速度が起こる。供給路側において、混じり合わない流体の定義された容量ユニットが、チャンバー内の流体を減少させ、すなわち混合時間を減少させる方法として、しかし、とりわけきわめて薄い液体層を生成する方法として、解析されるべき試料の前に供給される。連続的なフロースルーは、超薄液体層が液体流動を通してＴＩＲＦ−測定領域に移動することによって１方向で一定の剪断速度（好ましくは５００〜１０００ｓ^-1）を生成する間好ましく、それによって温度は一定に保たれる。生物学的に活性のある分子は、試料チャンバーの石英ガラス壁上の固体／液体境界領域で吸着され、分析器上の光学ユニットによって検出される。
【００２０】
とても速い緩和運動速度実験が行われるべき場合、混じり合わない流体の容量単位が解析溶液の前に高フロースルー速度にて一定の流動で試料チャンバー内へ供給される。混合できない流体容量および、したがってきわめて薄い液体層が測定場の領域で好ましい場合、そこで液体流動が一瞬停止し（「ストップドフロー（ｓｔｏｐｐｅｄ ｆｌｏｗ）」または「ストップドフロー濃度ジャンプ」（ｓｔｏｐｐｅｄ ｆｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｊｕｍｐ）」と呼ぶ）、そのため剪断力のない場合、生物学的に活性のある分子の表面との相互作用が石英ガラス壁の明確な部位で光学系によって記録されうる。そのような実験の進行において、たとえばきわめて薄い液体層の、また境界のまたは流体層の他の領域に、さらにまた同一の実験での測定に対して他の温度で行うために、流体流動のその方向を反転させることが必要になりうる。温度はまた、「ストップドフロー温度ジャンプ（ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｊｕｍｐ）」実験を行うために流動のないところでジャンプすることで変更できる。本発明によるフロースルー剪断分析器において、生物学的に活性のある分子は、混じり合わない流体の導入に続いて４つの領域に局在されうる。（１）固体／液体境界、（２）液体／流体境界、（３）液体大量相、（４）流体大量相である。先に言及した流体によって生成された超薄液体層の領域において、すべての４つの領域での生物学的に活性な分子の濃度変化が即時消退波の十分な透過深度を与える測定を受けやすかった。
【００２１】
開放系の他の好ましい実施様態において、本発明の分析器は、きわめて薄い液体層を生成するための方法が、解析物または緩衝溶液を受け入れるためのシリンダー型のレオメーターチャンバーの形で試料チャンバーを形成することで行われるような方法で行われ、その一端が、そこでシリンダー型のローター、好ましくは光透過性物質でできているものが回転して載せられた光透過可能な石英板で密封されており、その外径がレオメーターチャンバーの内径にあわせられ、石英板の方に向いている側面上のシリンジ型ローターは円錐形に作られ、ローターの回転軸に横たわる円錐形の部分で石英に接触し、レオメーターチャンバー内壁からなる試料チャンバー内への緩衝溶液のための１本の供給路および１本の排出路を含み、ローターを駆動するためのモーターが提供される。
【００２２】
本発明による分析器のこの実施様態は、重要な成分として分析器ユニットおよび分析器ユニットと結合する光学ユニットを持つ。ここで、分析器ユニットはそこに局在するシリンダー型レオメーターチャンバーを持つチャンバーブロックを含み、その中でローターはたとえば回転して搭載されたポリメチルメタクリル酸などの光透過性物質からなり、ローターの外径はシリンジ型分析器チャンバーの内径に適合する。
【００２３】
分析器チャンバーの末端はたとえば石英ガラス板などの光透過性固体板で閉じられ、その表面は化学的にまたは物理的に修飾でき、光透過性石英板に向かっている側面上のローターは円錐形で形成され、ローターは円錐部分で光透過性石英板と接触し、実際の分析器チャンバーを形成する。回転軸への円錐部分の角度（円錐傾斜／回転軸）はおよそ８５°から８９．９°、好ましくは８９°であり、それによってローターの回転軸の周りに存在している三角放射交差部分を持つ単純なチャンバーが形成され、円錐の部分の三角角度は約０．１°から５°、好ましくは１°である。
【００２４】
一般的に約２〜４ｃｍであるレオメーターチャンバーのまたはローターの直径は、１０から１０００μｌまで、好ましくは５０から１５０まで、とりわけ好ましくは１００〜１２０μｌの試料チャンバー容量をつくるために、すでに言及した三角角依存するように決定される。緩衝溶液を供給路を介して試料チャンバー内へ供給し、石英板で好ましく配置された排出路を介して排出する。試料チャンバー内の緩衝溶液を介して剪断速度を作り出すための剪断力領域は、その上にタンパク質が吸着されるべきである石英板上の回転している円錐によって生成され、タンパク質を含む解析溶液の導入後、表面上へのタンパク質の吸着が、ローターの回転速度に依存するように一致して研究された。
【００２５】
ここで、チャンバーは好ましくは、同時に、すなわちローターの回転の間に、フロースルー容量（１°の角度のチャンバー）が時間あたり１〜５００ｍｌの間、好ましくは時間あたり１５０ｍｌの値を受け入れられるように形成される。この容量フロースルーは、さらに、系が総剪断速度がフロースルーの剪断速度および円錐回転の剪断速度の合計としてみることができるように立ち上がるように、１０⁴ｓ^-1のオーダーで明らかな剪断速度を生成する。
【００２６】
本発明による装置を使用し、この装置を使用する方法を使用して、正確に定義された外部剪断力および層の厚さの下での石英ガラス板上の固体／液体境界でのタンパク質吸着を決定できる。装置はまた、たとえば生体内の血液流動での剪断状態におけるタンパク質吸着のシミュレーションのために、そしてタンパク質分画のための吸着カラムクロマトグラフィーでの流動によって誘導された剪断の解析のためにも使用できる。
【００２７】
好ましい実施様態において、試料チャンバー内の緩衝溶液の供給路および排出路は石英板上の円錐部分による線中でで配置し、さらに供給路が円錐部分の近くに配置されることが好ましい。この方法において、試験されるべき溶液は、そこで後者が最小の軸膨張を持つような試料チャンバーの部分で導入されえ（したがって石英板の可能な修飾をした表面上のタンパク質の吸着の間、透過されるべき層は可能な限り薄く提示される）、この方法では、厚さが可能な限り薄いことは、可能な修飾を施した石英板上のタンパク質の吸着のためのタンパク質によって透過されなければならない。
【００２８】
試料溶液の導入のための注入口は好ましくは試料チャンバーへの緩衝溶液の供給路に、とりわけ好ましくは石英板と供給路が互いに連結している地点で石英板と近い供給路に位置する。好ましくはポンプおよび試料チャンバー内への供給路の方法によって注入口を介してローターの回転軸に近くに試験すべきタンパク質を含む試料溶液を導入する際、試料溶液を緩衝溶液で希釈し、放射性にそして接線方向に外に動き、したがって溶液中に含まれたタンパク質が可能な修飾を施した石英板と接触するようになり、吸着される。
【００２９】
およそ供給と同様の重要性のあるのがチャンバーからの緩衝溶液の排出である。チャンバーの排出路はチャンバーの外に液体を活発に絞り出す吸引ポンプと接続でき、好ましは開放系に適用される方法である。この方法において、５００ｍｌ／時間までの極めて高いフロースルー速度が可能であうる。
【００３０】
驚くべきことに、本発明者らは本法の感度が、試験すべき溶液の直前に、チャンバー容量の１０〜１００％、好ましくは試験すべき溶液に混じり合わない流体のチャンバー容量の５０〜７５％の容量単位をレオメーターチャンバーに導入した場合、完全に増強されうることを決定した。この流体は試験すべき溶液またはそれ自身不活性でないまたは不活性ガス、または代わる代わる両方より成り立ちうる気体泡で成り立ちうる。この工程を、外来物質の石英板上の吸収表面をまずすすぐため、０．５〜１秒内のとても素早い混合間の１０〜３０％までのとても短い時間内で、チャンバー内の効果的な液体容量を減少させるために、しかし主として石英ガラス表面上で１０〜３００ｎｍの厚さのきわめて薄い液体層を生成するために行う。
【００３１】
ここで、流体の試料チャンバー内への導入が、試料液体の直前に試料チャンバー内に導入され、そしてまずほぼ完全に試料チャンバーに存在している緩衝溶液を置換した空気泡の形態で発生することが好ましく、これによって試験すべきタンパク質含有試料溶液で石英板上の吸着表面の直接の濡れが可能である。ここで、デッドボリューム（死空間）の大きさ、または空気泡の大きさは１０００μｌまで、好ましくは１５０μｌまでおよびとりわけ好ましくは７５μｌまでである。次いで空気泡は吸引装置によってすぐに除去される。
【００３２】
他の適用において、好ましくは空気泡が、したがってきわめて薄い液体の層が石英ガラス板の測定領域に局在する場合、ローターの回転および液体流動は保持される。
【００３３】
本発明はしたがって、液体中に含まれる成分に対して液体を解析する方法で、試料解析チャンバーを通した解析すべき液体流動で特徴づけられる方法を示し、液体流動が成分について調査されるべきであり、試料解析チャンバー内への導入の前に液体に混合可能ではない容量ユニットにさらに分け、この形態で試料チャンバーへ入れる。この方法では、液体流動を液体または空気泡または両方に混合することのできない液体の容量ユニットを供給することによって容量流動部分に細分割することができ、それによって表面上のきわめて薄い液体層の繰り返した生成がもたらされる。このことはたとえば、低濃度範囲でのとてもゆっくりした反応速度で必要である。このことは、緩衝溶液の液体流動および混合することのできない流体に対してそれぞれの１つの先導によって、および試料解析チャンバーの方向の共通排出路で、２方式弁を介して液体流動を方向づけることによる最も簡単な場合に成し遂げられる。そこで解析の間、試料解析チャンバー内の液体流動は両方の２方式弁の供給位置の間の間隔で周期的に切り替えられる。このために、液体流動および混合することのできない液体または空気の両方の２方式弁がポンプの補助で供給される。
【００３４】
たとえばタンパク質のような生物学的に活性な分子が試験すべき液体中に含まれる場合、吸収されたタンパク質は２９０ｎｍの励起波長および３５０ｎｍの発光波長での蛍光分光光度計の補助で光学的に検出できる。さらに、プリズムが石英板上に搭載され、プリズムはたとえばグリシンのような同一の屈折率の溶媒の方法によって石英板と光学的に連結している。さらに、キセノンランプからの単色光光線が、励起モノクロメーターを介して向かって、近い光角にてプリズムに進入し、即時消退波が固体／液体境界上で吸収されたタンパク質と相互作用し、そこにあるここで蛍光団として作用するトリプトファンを励起させ、蛍光を発光させる。この蛍光は石英板へのローター垂直の回転軸に平行な方向で現れ、鏡の光学系を介して導かれ、それ自身が光強度の検出のための光電子倍増管に結合している発光モノクロメーターに集束する。
【００３５】
第２の好ましい適用において、非吸着性石英板を用いて、即時消退波が荷電していない固体／液体（液体／石英板）を介して通過し、たとえば生物学的物質の分画のための浮遊物−または泡−分離法の産生物として、時間−分解様式で境界にて濃縮され、または境界で吸着された生物学的に活性のある分子の蛍光を測定するために、液体膜の他の側で液体／気体泡相境界層へ浸透する。
【００３６】
第３の好ましい適用の型において、本発明は即時消退波の補助によってきわめて薄い液体膜それ自身の厚さの決定を指示される。このために、フロースルー細胞はたとえば４．５ｍＭヒドロキシトリプトファンのような高い蛍光溶液でスロースルーし、チューブ中の２つの空気泡によって遮られ、次いで発光する。空気泡相が測定している領域を通過する場合、および液体層の厚さが即時消退波の進入深度より大きい場合、ここで蛍光シグナルに検出可能な変化はないであろう。他方、超薄液体層の厚さが即時消退波の進入深度よりも小さい場合、ここで即時消退波は完全に液体膜に進入し、言い換えれば波は固体／液体境界で進入し、液体／空気境界で再び発光し、泡の内部の非蛍光空気中に入り、蛍光シグナルの即座の減少になる。即時消退波の進入深度は公知であるので、液体層の層の厚さが決定できる。さらに即時消退波の進入深度は光の波長に依存しているので、任意の好ましい層の厚さに対する任意の好ましい進入深度を生成できる。この型の層の薄さの決定は反応速度または緩和速度測定のための境界相で、とりわけバイオセンサー系にて生物学的活性な分子の量輸送率の解明のためにとても重要である。さらに、化学工業における物質コーティング方法での超薄層の産出が、このような層の厚さを決定するための方法で検討されえた。
【００３７】
蛍光シグナルは、緩衝対照の蛍光と関連したＣＰＳを（１秒あたり測定シグナルで）測定する。供給および除去線をもちろんまたレオメーターチャンバーの外壁に配置し、しかしながらすでに記述したローターの回転軸または円錐の部分の線での石英板中の供給路および排出路が最も有用な実施様態を示している。
【００３８】
図１は、最も重要な要素に簡略化し、流動中キュベットのような試料チャンバー（７）の片方に構成されたフロースルー剪断分析器を示し、その試料チャンバー（７）は流動方向で環状の断面を持つ。光学ユニットは壁面の上部に位置し、光源（２）、光学的プリズム対（３）、分子から発せられる光放射を伝え、計測する蛍光分析器（１）から構成される。決められた量単位の混じり合わない流体（６）、むしろ気泡、は前方へ流れる緩衝液の後ろと、分析される試料の前の供給路の左側に送り込まれる。流体と壁面の間に、間隙圧力により極めて薄い（厚さ１００〜２００ｎｍ）液体膜（８）が生じ、それは液体／固体（４）液体／流体（５）表面を形成する。そのような閉じたフロースルー剪断分析器系では、液体流動は通常矢印の方向に進むが、どうしても必要ならば、流れをとめること（停止流動）、あるいは流れの逆転も起こる。同時に、間隙圧を変化させることでチャンバー内の静水圧を上昇させたり、低下させたりできる。さらに、例えば、間隙圧を変化させるために、温度を上昇させることにより気泡中の部分圧を変えられる。光線（２）の反射部で、超薄型液体膜を下方に貫き、流動方向に垂直な即時消退波が生じ、液体／固体（４）表面、液体／流体（５）表面、あるいは超薄液体膜（８）の大部分の相中あるいは気体腔中の揮発性分子自体の境界の状態によって、生物学的活性分子の分析を可能にしている。
【００３９】
以下図２、３に関する本発明に従ったレオメーターの好ましい実施様態を記述する。
【００４０】
ここで、図２は回転子の回転軸の高さで発明に従ったレオメーター単位を持つ分析器を通る縦に交差する部分の略図を示す。図３は光学ユニットを用いた略式の構造を示す。
【００４１】
図２の発明に従ってレオメーター単位を通る縦に交差する部分で示されるように、回転する回転子（１）はここで略式に示したように、回転子チャンバー壁（２）の中に回転できる型に取り付けてある。回転子は石英板（３）に一点で接触し、石英板（３）は回転子チャンバーの側壁（２）の間に固く密閉してある。供給路（５）が、石英板（３）の円錐接触部の近くで試料チャンバー（４）に入り、供給路（５）を経由して供給された液体は排出路（６）を経由して吸収によって試料チャンバーから活発に移動する。モーターにより動かしている（図には示していない）回転できるように取り付けられた回転子の回転中、剪断力が、試料チャンバーに面した石英板の側面に付着している液体膜に働く。その液体膜は図２で黒い点で示してあるタンパク質（７）を含むが、液体膜の厚さは回転速度の上昇で剪断力により分解される。
【００４２】
プリズム（８）は石英板（３）の試料チャンバーと反対側に緩衝液の供給路（５）のできるだけ近く、あるいは試験される試料の注入口（図には示していない）のできるだけ近くで光学的に対に取り付けてある。試料の注入口は緩衝液の供給路中に配置してある。光発生ユニット（９）から発生する光線は、それ自体はここではほんの簡単にしか示していないが、プリズムを経て吸収されたタンパク質に注がれ、タンパク質に存在するトリプトファン蛍光発色団を刺激し、回転子（５）の回転軸に平行なプリズムの方向に垂直にでて、図２には示していないが、分析ユニットにつながれた放射単色光分光器の方向に進む蛍光（１０）を発生する。
【００４３】
図３で、発生した単色光の光路がさらに詳しく示されている。キセノンランプ（１１）により発生した光はまず、単色光に変換され、細長い格子、プリズム（８）と連絡するレンズや鏡（１２）のような光学的な成分を経て進み、試料から放射される蛍光線（１０）はレンズや鏡（１３）を経て放射単色光分光器（１４）へ進む。それは光電子倍増管に接続していて、信号はそれに接続した計算機ユニット（１５）で評価される。
【００４４】
図２、３で示したような発明に従ってレオメーターを使うことにより、例証として、フィブリノーゲンの吸着の動的性質を測計測し、定温２３℃で得られた結果を図４、５に示した。
【００４５】
図４は調査されるべき溶液の前の１２０ｍｌチャンバー中に７５μｌの気泡を注入したもの（四角）と気泡を含まないもの（三角）の石英ガラス上のフィブリノーゲンの吸着率の比較を示す。ここでのタンパク質濃度は１００μｇ／ｍｌ、流動割合は１５０ｍｌ／時間、レオメーターの剪断割合は７２００ｓ^-1である。図表１で得られたように、吸着の半減期は気泡の前注入により１２．７秒（気泡なし）から２．６秒（気泡あり）まで減少する。さらに、曲線のＳ字性は指数関数的な性質により消失する。修正されていない１００％値は気泡なしで２３００ｃｐｓ、気泡ありで２０００ｃｐｓである。
【００４６】
図５は気泡の前注入をしたＴＩＲＦレオメトリー法により計測した石英ガラス上のフィブリノーゲンの指数関数的吸着運動を示す。この計測では、タンパク質濃度は、フロースルーで一定に保ったが、１８８μｇ／ｍｌで、流動割合は１５０ｍｌ／時間、レオメーターの剪断割合は７２０ｓ^−１である。運動のオンラインの原記録が上の図表Ａに描かれている。４４３の実験値が指数関数的に非直線に決められ、〔（Ｆ＝Ｆ_max （１−ｅ^{＊ kobs t}））ここでは、Ｆはｃｐｓ中の蛍光を表し、Ｆ_maxはｃｐｓ中の最大蛍光を表し、ｋ_obsは指数関数的作用の増加の観測比定数を表し、ｔは時間を表す。〕ｋ_obs値＝０．２６１＋０．００６ｓ^-1、残余物のＰ値＝０．１３８、ｒ²＝０．９０が得られた。ｋ_obs値を様々なフィブリノーゲン濃度（Ｃ₀）で計測した時は、平衡状態ｋ_obs＝ｋ₊₁Ｃ₀＋ｋ_-1に従って濃度Ｃ₀で応用し、縦座標でさえぎる脱着比定数（ｋ_-1＝０．０８２ｓ^-1）と、直線の傾きとしての吸着比定数（ｋ₊₁＝３．５ｘ１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1）に同いることができる直線が得られた。気泡技法を用いたフィブリノーゲンの脱着比定数の独立決定は、表面に吸着した分子と構造的な変化（ｋ_S〜０．１ｓ^-1）あるいは吸着したタンパク質のリガンドとの反応の間の反応運動と相関しうる、脱着の付加的な比定数の解明を可能にした（ｋ_-2＝２ｘ１０^-4ｓ^-1、ｋ_-3＝５．８ｘ１０^-6ｓ^-1）。最も簡単な場合、緩衝液に溶解しなかった二次フィブリノーゲン分子とそのようなリガンドの１つを表す表面に吸着した一次フィブリノーゲン分子の結合は表面の二重あるいは多重タンパク質膜ができることが分かっている。そのようなリガンドはイオン、有機分子あるいは補助因子でも表すことができ、比定数の変化を導ける。
【００４７】
図６の発明に従ったレオメーターの体系は定温２５℃で気泡の気体腔中の超薄液体膜にはいる、また通り抜ける即時消退波の波の浸透の測定を説明している。ヒドロキシトリプトファンの標準濃度０．２２ｍＭ（一次上昇約２００ｃｐｓから２５００ｃｐｓ）は測定チャンバーを通して二次濃度０．６８ｍＭ（二次上昇５２００ｃｐｓまで）の気泡によって単独に与えられ、水を通して単独に取り除かれる（５２００ｃｐｓから２００ｃｐｓまでの減少）。泡の空腔中への一過性の波の浸透はすぐに先の５２００ｃｐｓまでの増加レベルから２５００ｃｐｓの蛍光の急激な下降（“鼻”）のように明らかである。レオメーターチャンバー（チャンバー容量：１２０μｌ）を通した１４５ｍｌ／時間の流動割合と、シリコン管（直径１．３ｍｍ）中の５、１０、１５ｃｍの気泡、これは近似空気容量７５μｌ、１５０μｌ、２２５μｌを意味する、において供給した。“鼻”の表面は気泡の大きさとともに増加し、それは泡中の一過性の波の持続時間の延長を意味する。一過性の波は、用いられた実験的な条件のもとでは２５０から３００ｎｍの浸透の深さを持つが、貫通した液体膜の層の厚さは３００ｎｍよりも少ないに違いない。

Claims (27)

1. 表面上にシグナルを生じる特性を持つ分子の吸着−解離及び反応動態を測定するためのフロースルー剪断分析器であって、
   ａ） i.サンプルチェンバーが放射線透過性物質で作られた少なくとも１つのサンプル
   チェンバー壁を含む、分析液あるいは緩衝液を入れるためのサンプルチェンバーがその中に位置しており、ii ．分析液あるいは緩衝液をサンプルチェンバーに供給するためのラインと、分析液あるいは緩衝液をサンプルチェンバーから排出するためのラインを備え、iii.さらにサンプルチェンバーの供給路側にサンプル液を導入するための閉鎖可能な注入口を持つ、サンプルチェンバーブロックと、
   ｂ）測定表面上のシグナル生成分子の吸着率が溶液と表面間の極めて薄い液体界面層への分子の大量輸送によって影響を受けないように、サンプルチェンバー内に位置する分析液あるいは緩衝液中にこの極めて薄い液体層を生成するための手段と、
   ｃ）シグナル生成分子が発するシグナル、あるいは測定可能な表面シグナル又は表面から生じる表面放射線の変化により、かかる分子によって測定される測定表面の物理的及び光学的パラメータの影響の方向付けと評価のための、放射線源、少なくとも１つの放射線導管及び放射線分析器とを含む分析計ユニットと、
   ｄ）サンプルチェンバー内の供給路を通して分析液あるいは緩衝液を供給するためのポンプと、
   ｅ）排出路を通してサンプルチェンバーから分析液あるいは緩衝液を排出するためのポンプとを含み、
   極めて薄い液体層を生成するための手段は、分析液あるいは緩衝液に非混和性である流体の少なくとも１つの容量ユニットを導入して供給路中のチェンバー液の容積流を再分する、供給路側に配置された装置として形成されるフロースルー剪断分析器。
2. 緩衝液が親水性（極性）又は疎水性（非極性）液体から成ることを特徴とする、請求項１に記載の分析器。
3. それぞれの緩衝液と非混和性である流体が、ガス又は液体から成ることを特徴とする、請求項１〜２に記載の分析器。
4. 非混和性流体が空気から成ることを特徴とする、請求項１〜３に記載の分析器。
5. 分析液又は緩衝液を受け入れるサンプルチェンバーが、流れの方向に垂直な長方形又は円形横断面を持つ放射線透過性フロースルーキュベットとして備えられていることを特徴とする、請求項１〜４に記載の分析器。
6. サンプルチェンバー壁が、石英ガラスプレートの形態の石英ガラスでできた放射線透過性材料から成ることを特徴とする、請求項５に記載の分析器。
7. 極めて薄い液体層を生成するためのさらなる手段が、サンプルチェンバーが分析液あるいは緩衝液を受け入れるための円筒状レオメーターチェンバーとして形成される形態で提供され、
   前記レオメーターチェンバーは、
   i.その１つの末端が光透過性石英プレートによって固く閉じられており、
   ii ．光透過性材料でできた円筒状ローターが回転可能に据え付けられていて、その外径
   はレオメーターチェンバーの内径に適合し、円筒状ローターは石英プレートに面する側が円錐形に形づくられていて、石英プレートをローターの回転軸に位置する円錐の頂点に接触させ、そして
   iii. レオメーターチェンバーの内壁で形成されるサンプルチェンバーに分析液あるいは
   緩衝液を供給するラインと排出するライン、ローター円錐及び光透過性石英プレートを含み、さらに
   iv ．ローターを推進するためのモーターを備えていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の分析器。
8. サンプル液の供給路と排出路が基本的にローターの回転軸に相対して配置されていることを特徴とする、請求項７に記載の分析器。
9. 供給路と排出路が光透過性石英プレートに配置されていることを特徴とする、請求項７又は８に記載の分析器。
10. 供給路がローターの回転軸の近くに配置され、排出路が光透過性石英プレート上のローターの回転軸と整列するサンプルチェンバーの外縁に配置されていることを特徴とする、請求項９に記載の分析器。
11. ローターの軸と円錐表面の接線との角度が８５°〜８９．９°であることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれかに記載の分析器。
12. サンプル液をサンプルチェンバーに導入するための閉鎖可能な注入口が供給路中に配置されていることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の分析器。
13. 分析計ユニットｃ）が、単色光線を発する光源、放射線導管、及び、それに接続された評価ユニットを持つ放射線分析器から成る光学ユニットからなることを特徴とし、光源から生じる光線が、より密な媒質についての臨界角より大きい角度で放射線透過性サンプルチェンバー上に光学的結合方法で配置された放射線導管を通してサンプルチェンバー壁と溶液の間の界面層に衝突し、さらにサンプルチェンバー壁とサンプルチェンバー内のサンプル液の間の界面層に生じる、サンプルチェンバー壁の表面に対して基本的に垂直に発生する蛍光が、光学系を通して放射線分析器へと方向づけられるように、放射線導管と光源が互いに対して配置されている、請求項１〜１２のいずれかに記載の分析器。
14. 放射線導管がプリズム又はガラス繊維導線であることを特徴とする、請求項１３に記載の分析器。
15. 放射線分析器が発光モノクロメータであることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の分析器。
16. シグナルを生成する分子が生物学的に活性な分子であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の分析器。
17. シグナルを生成する生物学的に活性な分子が、放射可能であり、且つリガンドと反応することができる蛋白質であることを特徴とする、請求項１６に記載の分析器。
18. サンプルチェンバーの内側向きに方向づけられている放射線透過性材料でできたサンプルチェンバー壁の側面が、放射可能分子の連結又は結合を促進する被覆を備えており、かかる被覆が特定されているように作用することができることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の分析器。
19. 固体／液体界面で吸着しない強い蛍光を発する蛍光体の液体流に非混和性流体を供給することによって測定表面に超薄液体層を生成し、蛍光シグナルの測定可能な低下が、即時消退波が非蛍光流体の内部に入り込むことによって発せられる程度に、高い透過深度の即時消退光波が放射されることを特徴とする、超薄液体層の厚さを測定するための方法。
20. サンプル分析チェンバーを通して供給される液体の流れが、サンプル分析チェンバーに入る前に、当該液体に混和性でない流体によって容積流セグメントに再分され、再分された容積流セグメントはその後サンプル分析チェンバー内へと方向づけられ、分析チェンバー内の容積流セグメントが固相／液体間又は流体／液体間の超薄液体層に界面層において豊富な成分に関して検討されることを特徴とする、サンプル分析チェンバーにおいて液体中の超薄液体層に存在する成分に関して液体を分析するための方法。
21. 液体流の液体に非混和性である流体が、ガス又は非混和性液体から成ることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 液体の流れが、液体流及び分析液あるいは緩衝液に非混和性の流体のための各々１つの供給路と共通の排出路を持つ二方向弁を通してサンプル分析チェンバーの方向に方向づけられ、サンプル分析チェンバー内での液体流の分析の間に、二方向弁の２つのサンプルラインの位置間で間欠的な切り換えが起こることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 表面上の流体の助けによって生成される超薄液体層を流れの方向に動かす、剪断力を生じさせる液体流が、液体中に存在する成分の測定のため、あるいは液体層の厚さを測定するために停止することを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
24. 液体中に存在する成分の測定のため、あるいは層の厚さの測定のために、液体流の方向が逆向きになることを特徴とする、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
25. 液体中に存在する成分の測定のための温度が飛躍的に変化することを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれかに記載の方法。
26. 請求項１〜１８のいずれかに記載の分析器を用いて表面上のシグナル生成分子の吸着−解離あるいは反応速度定数を測定するための方法であり、
    ａ）分析器内のサンプルチェンバーを通して緩衝液を方向づける段階と、
    ｂ）サンプルチェンバー内の注入口を通して検査するサンプル液を導入する段階と、
    ｃ）約７０°の臨界角で単色光により光学プリズムを照射する段階と、
    ｄ）石英プレートとサンプルチェンバーの間の界面層で生成され、基本的に石英プレートに対して垂直に存在し、発光モノクロメータに基本的に垂直に入射する蛍光の光の強さを測定する段階とを含むことを特徴とする方法。
27. 流体を気泡の形態でサンプルチェンバーに導入することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。

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