ES2271256T3

ES2271256T3 - Procedimiento para aceleracion e intensificacion de union diana-receptor y dispositivo para el mismo.

Info

Publication number: ES2271256T3
Application number: ES02732596T
Authority: ES
Inventors: Gert Desmet; Gino Baron
Original assignee: Vrije Universiteit Brussel VUB; Universite Libre de Bruxelles ULB
Current assignee: Vrije Universiteit Brussel VUB; Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date: 2001-04-26
Filing date: 2002-04-11
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2022-04-11
Also published as: CY1105742T1; DE60214155T2; DK1383603T3; EP1627686A1; EP1383603B1; US20040171002A1; DE60214155D1; PT1383603E; EP1383603A1; JP2004536694A; WO2002087761A1; US20060078934A1; ATE337094T1

Abstract

Un dispositivo para la realización de reacciones de unión diana-receptor dentro de un canal de flujo provisto de moléculas receptoras, por el que dicha reacción de unión se está generando en contacto con una muestra de fluido que comprende una o más moléculas diana con dichas moléculas receptoras, comprendiendo además dicho dispositivo: - una primera superficie sólida provista de posiciones discretas y aisladas para dicha reacción de unión dentro de dicho canal de flujo, - una segunda superficie sólida capaz de moverse de un modo paralelo pasando por o sobre la primera superficie y configurada de un modo de interacción de flujo con dicha muestra de fluido y dicha primera superficie para formar un canal a un grosor de entre 10 nanómetros y 10 micrómetros, - en el que dicha segunda superficie está configurada para moverse en una serie alternante de secuencias de movimiento-parada.

Description

Procedimiento para aceleración e intensificación de unión diana-receptor y dispositivo para el mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento operativo para sistemas de análisis biológico y químico que se basan en sucesos de unión diana-receptor.

Antecedentes

Con la demanda creciente de información genómica y proteómica de la industria farmacéutica y agrobiotecnológica y del sector médico (véase diagnóstico clínico), en la década pasada ha surgido un tremendo interés en el desarrollo de sistemas de ensayo de unión o detección selectiva miniaturizados. Esta tendencia hacia sistemas de análisis miniaturizados y sobre un chip se ha iniciado mediante la introducción de las potentes técnicas de micromecanizado desarrolladas originalmente para la industria microelectrónica en el campo de la química analítica y bioanalítica. Las ventajas más importantes de la miniaturización son: la cinética de transferencia de masa potenciada desde las distancias de transferencia de masa reducidas, la posibilidad de realizar análisis múltiples en paralelo en una superficie pequeña y la reducción del consumo de muestra y reactivo. En consecuencia, se obtiene un rendimiento superior (y, con ello, más información por unidad de tiempo) y mejor economía global del procedimiento.

Actualmente, se están adoptando dos formatos principales para sistemas de análisis bioquímico miniaturizados. En un formato, referido comúnmente como sistemas de micromatrices y que es la etapa evolutiva lógica de los sistemas de placas de microvaloración de 96 pocillos usados en tantos procedimientos bioquímicos de ensayo y detección selectiva, los reactivos o muestras desconocidas se ponen en contacto con un gran conjunto de moléculas receptoras o de reactivo conocidas inmovilizadas en la superficie de una placa portadora fija y dispuestas en matrices de puntos (normalmente) circulares. En el segundo formato, referido comúnmente como microfluídica, se bombea fluido a través de un colector de microcanales grabados para realizar separaciones, operaciones de mezclado y para suministrar muestra a lugares predefinidos, todo en la misma superficie minúscula de un chip de microelectrónica de tamaño convencional.

Tradicionalmente, se efectúan ensayos de detección selectiva de micromatrices de ADN o proteínas aplicando una gota de muestra entre dos placas paralelas, llevando una de ellas una micromatriz de alta densidad de los denominados puntos de moléculas de sonda o receptoras, mientras que la otra placa sirve simplemente para sellar el sistema y para evitar la evaporación del líquido de muestra. En dichos sistemas, el transporte de las moléculas de muestra hacia los puntos receptores se produce a menudo de un modo pasivo, es decir, el transporte tiene que producirse todavía por difusión molecular pura (véase trayectoria de difusión 3 en la Fig. 1). En consecuencia, las detecciones selectivas de micromatriz son todavía relativamente lentas, y normalmente tienen que realizarse durante toda la noche.

Se han propuesto dos descripciones recientes para aliviar el problema de difusión de las micromatrices. En la patente de EE.UU. 6.017.696, el transporte en la dirección y (es decir, perpendicular a la superficie que lleva los puntos de sonda, según se indica en la presente solicitud mediante las flechas 4 en la Fig. 2) se potencia aplicando un campo eléctrico perpendicular a la superficie que lleva los puntos de sonda (patente de EE.UU. 6.017.696). En otro enfoque, se usa una membrana nanoporosa a través de la cual se dirige un flujo de filtrado (es decir, también en la dirección y indicada mediante flechas 4 en la Fig. 2) (patente de EE.UU. 5.843.767). Una limitación de ambos conceptos es que el transporte sólo se acelera en la dirección y. Esto implica que, durante el procedimiento de hibridación, la sonda inmovilizada o las moléculas receptoras presentes en un punto dado sólo se ponen en contacto con las moléculas diana presentes en el volumen de fluido situado directamente encima del punto dado. Muy a menudo, el número de moléculas asociadas presentes en este volumen limitado no es suficiente para generar una señal medible. En los dos procedimientos citados anteriormente, ha de tener lugar todavía un suministro adicional de moléculas asociadas que proceden de los volúmenes de fluido que cubren los puntos vecinos a través del (lento) procedimiento de difusión (siguiendo la trayectoria de difusión 3 indicada en la presente Fig. 2). Otro inconveniente del procedimiento de la patente de EE.UU. 6.017.696 es que el campo eléctrico puede inducir uniones inespecíficas no deseables, de manera que tenga que añadirse una etapa adicional de prueba de control restrictivo. Además, el uso de un campo eléctrico para acelerar la transferencia de masa radial no es aplicable para moléculas diana que tengan una carga neta cero. Otro inconveniente es que ha de afrontarse una serie de problemas específicos, como la formación de burbujas de gas en los electrodos. Para el procedimiento de filtro nanoporoso de la patente de EE.UU. 5.843.767, puede encontrarse un inconveniente adicional en el hecho de que la generación del flujo a través de los nanoporos requiere la aplicación de una sobrepresión suficientemente grande cerca de un lado de la membrana. Esto lleva inevitablemente a problemas de sellado. Además, como la velocidad de flujo a través de los poros es proporcional a la sobrepresión aplicable, la velocidad de flujo que puede obtenerse a través del dispositivo tiene un claro límite superior (véase ley de Poiseuille).

Aparte de encontrar una respuesta a la cuestión de cuántas moléculas asociadas están presentes en una muestra dada, otras aplicaciones, por ejemplo, en detección selectiva de fármacos, requieren también información sobre la velocidad del procedimiento de unión (por ejemplo, para investigar fenómenos de unión competitivos). Actualmente, el sistema usado más frecuentemente para la medida de la cinética de unión diana-receptor es el denominado aparato BIAcore (comercializado por Biacore AB, Upsala, Suecia), en el que se hacen fluir muestras pasando por un punto de moléculas receptoras conocidas y en el que la cantidad unida se vigila continuamente por medio de una técnica de detección superficial como resonancia de plasmón superficial. El sistema Biacore adolece de un inconveniente importante. Como el sistema está impulsado por presión, se necesitan cubetas de flujo relativamente grandes. En consecuencia, el tiempo de difusión necesario para alcanzar las moléculas receptoras es parte del tiempo de unión medido. Las medidas cinéticas obtenidas aquí no se refieren exclusivamente al procedimiento de unión intrínseco, sino que están sesgadas por el lento procedimiento de difusión. En realidad, este problema es común a todos los sistemas de medida de cinética de unión conocidos en la técnica. Para obtener medida más precisa del procedimiento de unión intrínseco en sí, sería beneficioso aquí tener un procedimiento que fuese capaz de acelerar sustancialmente la etapa de transporte de difusión. Además, sería preferible tener un procedimiento de aceleración que no se basase en la aplicación de un campo eléctrico, porque influiría ciertamente en el procedimiento de unión en sí.

La generación de flujos que pasan por los puntos de moléculas receptoras inmovilizadas dispuestas en la superficie de canales microfluídicos se conoce, por ejemplo, en la técnica de fabricación de biosensores miniaturizados. Según conocen los expertos en la materia de microfluídica, los movimientos de fluidos en sistemas de canales microfluídicos no se generan en general por medio de una bomba de presión, sino por medio de un campo de fuerzas eléctricas. Esto se debe a las grandes resistencias de flujo y las caídas de presión correspondientemente grandes encontradas en sistemas de microcanales impulsados por presión (véase ley de Poiseuille). Los flujos impulsados eléctricamente (también referidos como flujos electroosmóticos, FEO) no adolecen del problema de la caída de presión y están, por tanto, mucho mejor adaptados para aplicaciones microfluídicas. Sin embargo, el problema de flujos impulsados eléctricamente es que se ven acompañados inevitablemente de efectos electromigradores (en dirección axial y radial). Para algunas aplicaciones, como Electroforesis Capilar, existe un efecto altamente deseado, pero para el transporte de un grupo de moléculas de muestra diferentes a una velocidad predefinida, estos efectos electromigradores podrían conducir a una dispersión axial indeseable o podrían conducir a una adsorción de pared o repulsión de pared indeseable, dependiendo de la carga de las moléculas de muestra (en FEO, las paredes siempre llevan una carga neta). Otro inconveniente de los flujos impulsados eléctricamente es que, como su generación se basa en la formación de una doble capa eléctrica a lo largo de las paredes del canal, su velocidad de flujo se distorsiona fácilmente (y, con ello, adolece de baja reproducibilidad) por adsorción de las moléculas de muestra a las paredes del canal. Este problema es especialmente grave en el caso de moléculas grandes y cargadas como las proteínas. Otro inconveniente más es que, cuando los capilares o los canales se hacen demasiado estrechos, las dobles capas de las paredes opuestas del canal empiezan a solaparse, de manera que los efectos de atracción y repulsión eléctrica radial se hacen dominantes respecto al movimiento axial deseado. Esto impide el uso de canales finos submicrométricos. Finalmente, los flujos impulsados eléctricamente están sometidos también (análogamente a los flujos impulsados por presión) a la existencia de un límite superior de velocidad. Como la velocidad de fluido es directamente proporcional a la caída de tensión eléctrica aplicada, y como existe un claro límite superior (aproximadamente 30 kV) para esta caída de tensión, por razones de seguridad y para evitar un calentamiento Joule excesivo y formación de burbujas, la existencia de un límite superior de velocidad es obvia.

En el documento WO-99/61.896, se describe un dispositivo en el que la unión de biomoléculas se potencia creando capas finas de fluido forzando burbujas de aire a través de una cubeta de detección de flujo transversal. El efecto ventajoso, es decir, la creación de una capa fina de fluido con tiempos de difusión ultracortos, de estas burbujas de aire es, sin embargo, sólo temporal. Además, ha de llenarse con muestra la cubeta entera, de manera que el dispositivo requiere todavía volúmenes de muestra, que son al menos del orden del volumen de tamaño de las burbujas. Cuando las burbujas están después de la cubeta, la fracción principal de la muestra correrá por delante de la burbuja y, con ello, será expulsada de la cubeta sin haber alcanzado las moléculas receptoras fijas a la pared.

El objeto de la presente invención es proporcionar dispositivos y procedimientos mejorados que dan como resultado tiempos más cortos de detección selectiva o ensayo, límites mejorados de detección selectiva y medidas más precisas de cinética de unión y equilibrios. En particular, dichos dispositivo y procedimiento de la presente invención eliminan casi completamente la etapa de difusión que limita la velocidad.

En la presente invención, se desvelan un dispositivo y un procedimiento en los que todo el dispositivo está miniaturizado y en el que se mantiene continuamente una capa fina de fluido conservando el fluido entre dos superficies sólidas sustancialmente paralelas. Al mover una de las dos superficies para generar un flujo de cizalla continuo, se asegura que cada molécula de la muestra pase por las moléculas receptoras dentro de una distancia, que es suficientemente pequeña como para cubrirse por difusión molecular pura durante el tiempo de detención.

Resumen

El propósito de la presente invención es proporcionar un modo operativo nuevo y aplicable generalmente para los sistemas de micromatrices y biosensores usados actualmente para, pero sin limitarse a, la detección y la cuantificación de moléculas biológicas como ácidos nucleicos y proteínas (incluyendo hormonas, receptores de hormonas, anticuerpos, antígenos, proteínas estructurales, enzimas, etc.,), la detección selectiva del efecto terapéutico de moléculas, ensayos de reacción enzimática, la purificación de cantidades de producción de moléculas terapéuticas y biomoléculas valiosas, y la cinética y la medida de afinidad de unión ligando/receptor, superando los inconvenientes anteriores y produciendo velocidades de análisis y límites de detección superiores y permitiendo medidas de cinética de unión más precisas.

La presente invención puede explicarse mediante un cálculo teórico (representado en todo detalle en la Sección de Descripción) que muestra que, en lugar de poner en contacto un punto de molécula receptora directamente con una capa de fluido de muestra de, por ejemplo, 100 micrómetros de grosor, es más ventajoso poner en contacto el punto con una capa fina de fluido de, por ejemplo, 0,1 micrómetros de grosor y refrescar continuamente la capa 1.000 veces, siempre que la velocidad de refresco pueda hacerse suficientemente grande. Como se basan en la acción de arrastre de una superficie en movimiento, que induce una velocidad de fluido igual a la mitad de la velocidad de la superficie móvil, independiente del grosor del canal o de la longitud del canal, los flujos de fuerza de cizalla son el único tipo de flujo capaz de producir velocidades de fluido suficientemente grandes a través de canales finos submicrométricos.

La presente invención se refiere a un dispositivo y un procedimiento según las reivindicaciones 1 y 18.

Otras formas de realización más preferidas se describen en todo detalle en la descripción siguiente y en las reivindicaciones dependientes.

Dentro del significado de la presente invención, una "primera superficie" denota en general una superficie o un sustrato provisto de una o más moléculas receptoras iguales o diferentes. Estas moléculas receptoras están generalmente fijas al menos parcialmente a dicha superficie. Dentro del significado de la presente invención, una "segunda superficie" denota una superficie que se proporciona de manera móvil en el canal de flujo. El movimiento de dicha segunda superficie proporcionará un campo de fuerza de cizalla que actúa sobre una muestra de fluido, si está presente, en dicho canal de flujo.

En varias formas de realización, las superficies primera y segunda delimitan el canal de flujo. Como en estas formas de realización, dichas superficies primera y segunda pueden moverse independientemente entre sí. En consecuencia, el canal de flujo según estas formas de realización se caracteriza porque en general no está sellado herméticamente a lo largo de la superficie del manto, sino que consiste simplemente en dos superficies independientes.

En general, las moléculas diana están presentes en una muestra de fluido forzada sobre estas moléculas receptoras para potenciar la eficacia de la unión.

El procedimiento y los dispositivos según la presente invención pueden basarse en la combinación de tres características específicas de flujos de microcanal impulsados por cizalla. La primera característica es que el grosor del canal puede seleccionarse de manera que sea sólo un número de veces mínimo (preferentemente de 1,5 a 5 veces) mayor que las dimensiones de las moléculas que se van a analizar. De este modo, las moléculas diana pueden transportarse convectivamente al interior de algunos diámetros moleculares de moléculas receptoras asociadas inmovilizadas en una superficie sólida, eliminando así casi por completo el tiempo necesario para la difusión. La segunda característica es que la velocidad de flujo puede ser suficientemente grande para transportar volúmenes de muestra del orden de 10 a 200 \mul a través de canales de micromatriz con un volumen del orden de sólo 0,1 \mul mientras, en combinación con la primera característica, se sigue ganando sustancialmente en tiempo de detección selectiva con respecto a las micromatrices basadas en difusión convencional de ADN y proteínas en las que se pone en contacto directamente la totalidad del volumen de muestra de 10 a 200 \mul con toda la matriz. La tercera característica es que, debido al hecho de que el grado de dispersión axial en canales con un grosor submicrométrico es extremadamente pequeño, pueden inyectarse tapones de muestra cortos (es decir, con una longitud del orden de 10 a 500 \mum) a una alta frecuencia y posteriormente pueden transportarse a través de un canal microfluídico sin ningún entremezclado sustancial entre los tapones de muestra sucesivos. Esta tercera característica permite, en combinación con la primera característica, un verdadero análisis de detección selectiva de alta productividad de, por ejemplo, moléculas terapéuticas potenciales. El pequeño grado de dispersión axial implica también que pueden analizarse y recuperarse cantidades minúsculas de muestra con un mínimo de dilución. Ésta es una característica altamente deseada en aplicaciones bioanalíticas y de purificación. Como en un flujo impulsado por cizalla la velocidad de fluido es independiente de la naturaleza (carga, tamaño, etc.,) de las sustancias de fluido que se van a transportar, otra ventaja del procedimiento según la presente invención es que las moléculas de naturaleza diferente pueden transportarse en un solo tapón, es decir, a la misma velocidad. Esto es especialmente ventajoso para investigar los sucesos de unión o reacción que implican un cofactor, o para realizar ensayos de unión competitiva. Una ventaja adicional respecto a flujos impulsados eléctricamente, en los que el perfil de velocidad es uniforme, es que la velocidad de los flujos de fuerza de cizalla varía linealmente en el grosor del canal y es casi cero en la superficie estática en la que se va a producir la unión. Por ello, la unión puede ocurrir con una influencia mínima de la fuerza de cizalla aplicada. En un sistema impulsado eléctricamente, el campo eléctrico es de igual intensidad en todas partes, de manera que tiene una posibilidad mayor de perturbar el procedimiento de unión.

Para la unión selectiva de moléculas lineales largas (ácidos nucleicos, proteínas desnaturalizadas), otra ventaja del procedimiento según la presente invención es que el campo de velocidad lineal de flujos impulsados por fuerza de cizalla induce una preorientación ventajosa de las moléculas. Debido a las grandes fuerzas de cizalla, las moléculas lineales se estirarán a lo largo de la dirección del campo de flujo, y estarán así menos arrolladas. De este modo, puede obtenerse un contacto potenciado diana-receptor.

Otra ventaja del procedimiento según la presente invención es que la velocidad de fluido puede usarse como un parámetro adicional de control restrictivo. Las moléculas no asociadas, y por ello, las ligadas con menos fuerza, se desprenderán en mayor medida que las moléculas asociadas perfectas bajo la influencia de un intenso campo de fuerza de cizalla.

Otra ventaja de las formas de realización según la presente invención es que es muy sencillo pasar de un modo de flujo continuo a un modo de transporte que consiste en una serie continua de secuencias de flujo-parada. Esta posibilidad es altamente ventajosa en casos en que un intenso flujo convectivo perturba los sucesos de unión: durante los (breves) períodos de parada, el procedimiento de unión puede tener lugar sin perturbaciones mediante cualquier efecto de convección, mientras que los períodos de flujo se usan para generar una rápida renovación de la capa de fluido que cubre un punto dado de molécula receptora.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Representación esquemática del transporte por difusión en dispositivos convencionales de detección selectiva basados en difusión de ADN y proteínas.

Figura 2. Representación esquemática de soluciones de la técnica anterior para la aceleración del transporte radial, que implica membranas porosas de flujo transversal o hibridación asistida electrónicamente.

Figura 3. Representación esquemática de la organización de flujo en los dispositivos de detección selectiva de ADN y proteínas impulsados por cizalla según la presente invención.

Figura 4. Representación esquemática de canales básicos de transporte de fluidos usados en el procedimiento de detección selectiva diana-receptor desvelado en la presente invención: vista longitudinal (a), vista en sección transversal (b) y vista desde arriba (c).

Figura 5. Volumen de fluido en la parte superior del punto de sonda en un sistema convencional impulsado por difusión (a) y en un sistema impulsado por cizalla según la presente invención (b).

Figura 6. Representación esquemática de dispositivos de correa móvil (a) y disco giratorio según la presente invención: vista lateral (b) y vista desde arriba (c).

Figura 7. Vista desde arriba de dispositivo de disco giratorio que muestra una de las numerosas posibilidades del procedimiento según la presente invención de usar una sola superficie móvil para generar un flujo que pasa por una multitud de superficies de moléculas receptoras.

Figura 8. Vista desde arriba (a) y vista longitudinal (b) de sistema de superficie móvil que lleva una matriz de salientes micromecanizados para proporcionar sostén adicional del movimiento del fluido y/o para inducir un mezclado adicional.

Figura 9. Ejemplos de matrices de salientes micromecanizados que permiten generar desviaciones intermitentes de la dirección de flujo para promover el mezclado en la dirección z.

Figura 10. Vista lateral de posición y diseño conceptual para un dispositivo de deposición de muestra integrado con una superficie de matriz de detección selectiva.

Figura 11. Vista desde arriba de un procedimiento de detección selectiva impulsado por cizalla en el que el transporte convectivo es sólo en una dirección (a). Vista desde arriba de segundo paso de muestra después de haber girado la superficie de matriz del punto 90° (b).

Figura 12. Vista desde arriba de un procedimiento de detección selectiva impulsado por cizalla en el que se establece un transporte convectivo en dos direcciones mutuamente perpendiculares.

Figura 13. Vista desde arriba de un procedimiento de detección selectiva impulsado por cizalla en el que se establecen transportes convectivos de traslación y de rotación.

Figura 14. Representación esquemática de dispositivos dobles de disco giratorio según la presente invención: vista desde arriba de superficie receptora (a), y vista lateral de aparato ensamblado con espaciamiento de disco variable, y que muestra el flujo periférico de salida del fluido de muestra (b).

Figura 15. Representación esquemática de dispositivos dobles de disco giratorio con espaciamiento de disco variable, y con una superficie receptora que tiene poros u orificios micromecanizados que permiten el flujo de salida del fluido de muestra.

Figura 16. Vista esquemática de un procedimiento para la inyección de tapones de muestra delimitados claramente en los dispositivos según la presente invención.

Figura 17. Vista esquemática de un transporte de alta productividad de diferentes tapones de muestra.

Figura 18. Vista esquemática de las diferentes secuencias implicadas en un procedimiento para la medida de la cinética de unión diana-receptor según la presente invención, que comprende transporte de moléculas de muestra impulsado por cizalla hacia una sección de unión que contiene moléculas receptoras selectivas (a); puesta en contacto de dichas moléculas de muestra con dichas moléculas receptoras selectivas durante un tiempo t_{cont} dado (b), y transporte al exterior de las moléculas no ligadas (c).

Figura 19. Vista longitudinal de una forma de realización según la presente invención en la que las moléculas receptoras se inmovilizan en una parte rebajada de la superficie estática.

Descripción

En particular, el dispositivo de la presente invención permite mejorar el rendimiento de sistemas analíticos de diagnóstico y detección selectiva basados en la unión específica entre moléculas de ligando o diana en una muestra con moléculas receptoras complementarias fijas a una superficie sólida, y usados para la detección, la cuantificación y el análisis funcional de analitos biológicos y químicos, incluyendo, pero sin limitarse a, ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos, antígenos, hormonas, receptores de hormonas, enzimas y pequeñas moléculas de bibliotecas de química combinatoria. El aparato de la invención puede aprovecharse también para investigar la velocidad de reacción y la formación de productos de conversiones enzimáticas de sustratos.

En referencia a los dibujos mostrados en el presente documento, debe observarse que, aunque la forma de algunas de las moléculas representadas debería sugerir que el dispositivo y procedimiento representados de la invención según se describe más adelante sólo se refieren específicamente a ácidos nucleicos o anticuerpos, todos los procedimientos y dispositivos según la presente invención se refieren al grupo completo de analitos químicos y biológicos mencionados anteriormente.

En lugar de ser de una naturaleza molecular, el medio receptor puede ser también un rebaje superficial micromecanizado que tiene un tamaño y/o una forma específicos que permiten retener selectivamente pequeños cristales, células enteras o nanodispositivos.

La Fig. 1 muestra la organización de transporte del fluido en dispositivos convencionales de detección selectiva de ADN y proteínas basados en difusión. En estos dispositivos, moléculas diana desconocidas 1a, 1b, 1c, etc., de diferente composición tienen que difundirse en las direcciones y y x (es decir, tienen que seguir una trayectoria de difusión 3 tortuosa) antes de poder unirse a uno de los puntos de moléculas receptoras asociadas 2a, 2b, 2c, etc., inmovilizados en la superficie 10. La Fig. 2 muestra la organización de transporte del fluido en los dispositivos de detección selectiva de ADN según la técnica anterior en, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.843.767 y la patente de EE.UU. 6.103.479. En estos dispositivos, el transporte se acelera sólo en la dirección radial 4. Durante el rápido transporte radial, el transporte en la dirección transversal 4, es decir, de punto a punto, tiene que suceder todavía a través de la lenta difusión molecular siguiendo la trayectoria de difusión 3. Como el tiempo para el transporte radial es de órdenes de magnitud menores al tiempo necesario para el transporte transversal punto a punto, el último no puede suceder en una magnitud significativa, y los límites de detección permanecen bajos.

Según una forma de realización de la presente invención, el dispositivo de esta invención según se describe anteriormente se caracteriza porque el medio que genera el campo de fuerza de cizalla comprende una segunda superficie que es preferentemente mayor que dicha primera superficie, y capaz de moverse mecánicamente de un modo sustancialmente paralelo después de dicha primera superficie.

En la presente invención, el concepto de flujos impulsados por cizalla se usa para acelerar procedimientos de unión diana-receptor aprovechando el hecho de que en un flujo impulsado por cizalla el grosor de canal puede reducirse sustancialmente sin que haya que sacrificar la velocidad de fluido alcanzable. Según se explica de una manera cuantitativa más adelante, la combinación de ambos hechos produce el factor clave en la posibilidad de acelerar ensayos de detección selectiva según la presente invención.

La Fig. 3 muestra una forma de realización preferida de la organización de transporte del fluido en los dispositivos de detección selectiva de ADN y proteínas según la presente invención. El transporte en la dirección radial se acelera en el presente documento reduciendo el grosor de la capa de fluido, mientras que en la dirección transversal (es decir, la dirección x), se organiza un transporte convectivo, y por ello rápido, punto a punto. En un dispositivo según la presente invención, la muestra que contiene las moléculas diana desconocidas 1a, 1b, 1c, etc., se transporta en una capa muy fina (con grosor d) después de una matriz de puntos de puntos de moléculas de sonda asociadas 2a, 2b, 2c, etc., inmovilizadas en una primera superficie 10, usando un campo de fuerza de cizalla. Este campo de fuerza de cizalla según esta forma de realización se origina en el movimiento de una segunda superficie 20, impulsada por cualquier sistema de motor adecuado 40, e induciendo un flujo con un perfil sustancialmente lineal 511. La segunda superficie 20 constituye junto con la primera superficie 10 en esta forma de realización las fronteras del canal de flujo.

Las fuerzas impulsadas por cizalla se conocen como una fuerza de transporte en técnicas de separación como cromatografía. En el documento WO 98/55.858, por ejemplo, en nombre del presente solicitante, se ha desvelado una serie de posibles diseños de canal que permiten establecer un transporte continuo impulsado por cizalla de fase móvil desde un depósito de entrada a uno de salida para una aplicación en el campo de la cromatografía líquida. Se desvela el modo en que puede establecerse el flujo impulsado por cizalla, a través de y hacia fuera de un canal microfluídico que consiste en dos partes diferentes de pared, siendo una parte sustancialmente mayor que la otra parte y moviéndose de un modo sustancialmente paralelo después de la parte más corta.

En la figura 4 se muestra un canal de flujo de fluido básico en tres vistas por el que se transporta una capa fina de muestra 100 a lo largo de una superficie de chip de micromatriz 10 en la dirección 99 por un efecto de fuerza de cizalla que se origina en la parte de pared móvil 20.

Según otra forma de realización más, el dispositivo de la invención se caracteriza además porque la primera superficie comprende rebajes superficiales micromecanizados y/o microestructurados que tienen preferentemente la misma profundidad aproximadamente que la altura de las moléculas receptoras inmovilizadas en los mismos. Esto protege las moléculas receptoras del alto campo de cizalla en el caso de aplicaciones de grandes velocidades de fluido.

Como se usan canales que son sólo un número mínimo de veces (preferentemente entre 1,5 y 5 veces) mayores que las moléculas diana que se van a analizar, el tiempo necesario para difusión se reduce sustancialmente y se elimina casi completamente, de este modo, el transporte radial se acelera, mientras que el transporte en la dirección lateral (es decir, de punto a punto) se produce por convección rápida, con velocidades de flujo independientes del grosor de canal. De este modo, el inconveniente del pequeño volumen de canal, que normalmente llevaría a límites de detección deficientes, puede superarse fácilmente debido a la renovación continua y rápida de la capa de fluido dentro del canal de detección selectiva.

En los dispositivos según la presente invención, el espacio de canal formado por las superficies segunda móvil y primera estática tiene preferentemente una sección transversal rectangular plana, es decir, los canales tienen un grosor de entre 10 nanómetros y 10 micrómetros, y más preferentemente entre 50 y 1.000 nanómetros, mientras que su anchura sería mucho mayor, preferentemente entre 100 micrómetros y 10 cm (véase Fig. 4b, no a escala). La longitud de los canales estaría preferentemente entre 1 milímetro y 10 cm.

En un sistema de canal como el ilustrado en la Figura 4, el flujo (en dirección 99) del líquido de muestra 100 se genera por el efecto de arrastre o de fuerza de cizalla que se origina en la superficie móvil 20. En la presente invención, se aprovecha la ventaja del hecho de que, como puede deducirse del perfil de flujo lineal 5 de la Figura 3, la velocidad de fluido en un flujo impulsado por cizalla es siempre igual a la mitad de la velocidad de la parte móvil, con independencia de la longitud del canal, el grosor del canal o la naturaleza del fluido. Suponiendo, por ejemplo, una velocidad de pared móvil de 10 cm/s, esto implica que una capa fina de muestra 100 (por ejemplo, 50 nm de grosor) puede transportarse a lo largo de una superficie de chip de micromatriz 10 de, por ejemplo, 5 cm de largo a una velocidad de, por ejemplo, 5 cm/s. En un canal impulsado por presión con una sección transversal rectangular plana, esto requeriría una presión de entrada, imprácticamente elevada, de 60.000 bar. En el dispositivo según la presente invención, la ventaja anterior de flujos impulsados por cizalla se aprovecha para transportar convectivamente sustancias de fluido molecular al interior de algunos diámetros moleculares de una molécula receptora (potencialmente) complementaria de composición conocida e inmovilizada en una superficie sólida (véase Figura 3).

Con referencia a las Fig. 3 y 5, el razonamiento siguiente permite cuantificar la ganancia del procedimiento de detección selectiva impulsado por cizalla según la presente invención para el caso de una aplicación de detección selectiva de ADN. El razonamiento parte de la observación de que los valores de difusión típicos de ADN (Chan y col., 1995) oscilan entre D_{dif} = 9\cdot10^{–11} m^{2}/s para ADNmc de 30 pb y un D_{dif} = 5\cdot10^{-12} m^{2}/s para ADNmc de 1.000 pb. Considerando ahora la disposición típica de un chip de ADN (véase la representación unidimensional dada en la Fig. 1), siendo una matriz compuesta por puntos circulares con un diámetro típico de 200 \mum y con una distancia de punto intermedia de 30 a 50 \mum, y considerando que el tiempo \tau necesario para cubrir una distancia dada l puede estimarse a partir de la ecuación de difusión de Einstein:

(1)\tau = l^{2} / (2\cdot D_{dif})

puede verificarse fácilmente que se necesita aproximadamente 1 h para que una cadena de ADN con D_{dif} = 1\cdot10^{-11} m^{2}/s se desplace desde un punto a otro punto, y que se necesitan aproximadamente 2\cdot10^{8} segundos (200 millones de segundos) para desplazarse la longitud completa de 7,5 cm de una micromatriz de ADN típica (que tiene las mismas dimensiones que un portaobjetos de microscopio convencional). Este cálculo básico muestra que, en un chip de ADN típico, un punto sólo "ve" el fluido en su entorno inmediato. El cálculo del radio para el que un punto dado es capaz de muestrear el material durante un experimento de toda la noche de 15 h, resolviendo la ec. (1) para l y poniendo \tau = 15 h, se encuentra una distancia de muestreo del orden de l = 1 mm. Esto implica que un punto dado sólo "ve" la muestra situada 1 mm a su izquierda y 1 mm a su derecha. Esto se explica también porque, para conseguir un límite de detección suficiente, han de usarse capas de fluido relativamente gruesas, del orden de 20 a 100 micrómetros, en micromatrices de ADN (orden de 100 \mum, Duggan, D.J., y col., 1999. Nature Genetics Supplement 21, 10-14).

En el procedimiento impulsado por cizalla según la presente invención (Fig. 3), en el que la muestra se difunde en una capa de fluido ultrafina de, por ejemplo, 100 nm de grosor (u otro grosor adecuado, dependiendo de las dimensiones de las cadenas de ADN), la ec. (1) predice un aumento de 1 millón de veces en la velocidad de difusión radial (es decir, en la dirección y, véanse Fig. 1 y 3). Esta ganancia es extremadamente grande, pero se debe observar que una capa de 100 nm de grosor contiene también 1.000 veces menos material diana de ADN. Esto implica que, para obtener cantidades de detección comparables, la capa debe renovarse continuamente. Ésta es una de las características singulares del concepto de flujo impulsado por cizalla, es decir, la posibilidad de generar grandes velocidades de fluido, incluso en canales submicrométricos, se hace especialmente útil. Como el procedimiento según la presente invención permite establecer velocidades de fluido del orden de decenas de centímetros por segundo, e incluso más, el tiempo necesario para el transporte a través, por ejemplo, de un chip de ADN de 7,5 cm de longitud (que es del orden de 100 millones de segundos para un sistema puramente impulsado por difusión) puede reducirse fácilmente a unos segundos o decenas de segundos (dependiendo del tiempo de detención de punto necesario para dejar que las moléculas se difundan hacia las moléculas receptoras y completen la reacción de unión).

En referencia a la Figura 5, y suponiendo un ensayo basado en difusión con un punto de molécula receptora rectangular 2 (dimensiones = a x b), y considerando sólo difusión radial (dirección y), el punto "ve" un volumen total de líquido 5 de V_{a} = a\cdotb\cdoth. Según la ec. (1), el tiempo necesario para la difusión total a través de la altura h es:

(2)\tau_{as} = h^{2} / (2\cdot D_{dif})

Considerando ahora el enfoque impulsado por cizalla, en el que el volumen de fluido 5 en contacto con dicho punto de molécula receptora 2 sólo tiene una altura d, y en el que se usa una acción convectiva en dirección 99 para transportar el mismo volumen V_{a} a través del punto, ha de tomarse una decisión sobre la velocidad de flujo aplicable. Este valor puede calcularse a partir del hecho de que el tiempo t_{detención} durante el cual un volumen de fluido dado se desplaza a lo largo del punto debe tomarse de tal forma que, dentro de este tiempo de detención t_{detención}, las moléculas han tenido tiempo de difundirse a través del grosor de capa d y han tenido tiempo de hibridar. Expresando el tiempo necesario para la hibridación como una fracción dada o múltiplo del tiempo de difusión, se obtiene, de nuevo según la ec. (1):

(3)\tau_{detención} = (1 + \alpha) \cdot d^{2} / (2 \cdot D_{dif})

Con este tiempo de residencia requerido, la velocidad máxima permisible v puede calcularse como:

(4)v = a / t_{res}

y con esta velocidad, la velocidad volumétrica de flujo F en el sistema impulsado por cizalla puede calcularse como:

(5)F = v\cdot b\cdot d\cdot = a \cdot b \cdot d \cdot d / t_{res}

Tomando valores típicos para d = 0,1 \mum y D_{dif} = 1\cdot10^{-11} m^{2}/s y a = 200 \mum (tamaño de punto típico en micromatrices) y suponiendo que \alpha = 1, la velocidad requerida según la ec. (4) es de 0,2 m/s. Considerando un grosor de 100 nm, y por ejemplo, un canal de 5 cm de longitud, debe resultar evidente que, considerando las limitaciones de flujos impulsados por presión e impulsados eléctricamente, dicha velocidad sólo puede alcanzarse de un modo de flujo impulsado por cizalla.

Con el tiempo de detención t_{detención} requerido, dado por la ec. (3), puede encontrarse fácilmente que el tiempo total \tau_{SD} necesario para dejar hibridar el volumen total de líquido V_{a} viene dado por:

(6)\tau_{SD} = V_{a} / F = (1 + \alpha) \cdot h\cdot d / (2 \cdot D_{dif})

Tomando ahora la proporción entre \tau_{as} y \tau_{SD}:

(7)\frac{\tau_{as}}{\tau_{SD}} = \frac{h}{d \cdot (1 + \alpha)}

y suponiendo que t_{hibr} = t_{dif} (es decir, \alpha = 1), la ec. (7) muestra que la ganancia que puede obtenerse pasando de una micromatriz basada en difusión con altura h = 100 \mum a una micromatriz impulsada por cizalla con altura d = 0,1 \mum es del orden de un factor de 500.

La ganancia es mayor incluso cuando, durante una detección selectiva dada, un punto de molécula receptora dado necesita "ver" una cantidad de líquido extendido inicialmente en N puntos. Con N suficientemente grande (por ejemplo, N \geq 5), la distancia de difusión característica en la matriz basada en difusión no corresponde ya con la altura radial (l = h), sino que ahora debe tomarse a lo largo de la coordenada lateral, es decir, en la dirección x, de manera que l = N\cdota. Ahora con V_{a} = N\cdota\cdotb\cdoth, y \tau_{as} = (N\cdota)^{2}/(2\cdotD_{dif}), y siguiendo el mismo razonamiento que antes, la proporción entre \tau_{as} y \tau_{SD} se convierte en:

(8)\frac{\tau_{as}}{\tau_{SD}} = \frac{N \cdot a^{2}}{h \cdot d \cdot (1 + \alpha)}

Con N = 8 (véase cálculo anterior sobre la distancia de muestreo de 2\cdotl = 2 mm), y con \alpha = 200 \mum, h = 100 \mum y d = 0,1 \mum, la ganancia en tiempo de detección selectiva es ahora del orden de 16.000 (tomando todavía \alpha = 1). Como el cálculo presentado supone un modelo 1-D, se ha ignorado que los puntos sólo se direccionan fila a fila, mientras que en un sistema basado en difusión las filas y las columnas se direccionan simultáneamente. Sin embargo, al girar la placa de ensayo 90° después de que se haya completado una serie dada y repitiendo a continuación el ensayo (véase Fig. 11) sólo se reduce la productividad en un factor de 2, dejando todavía espacio suficiente para una mejora con respecto a los sistemas de detección selectiva impulsados por difusión.

En el razonamiento anterior, se ha hecho también evidente que, en el procedimiento impulsado por cizalla según la presente invención, la matriz tiene que ponerse en contacto sólo con un volumen correspondiente al que cubre aproximadamente de 8 a 10 filas de puntos, mientras que en una matriz basada en difusión se aplica un volumen correspondiente a entre 100 y 300 filas de puntos (a partir de lo cual cada punto sólo ve del 5 al 10% aproximadamente). Este hecho implica que en el procedimiento según la presente invención, es previsible una reducción de la cantidad de muestra de diez o veinte veces con respecto a las cantidades necesarias actualmente para un ensayo clásico de hibridación. Enfocando el problema de otra forma, y considerando el envío del volumen de muestra completo de 10 a 200 \mul usado normalmente en micromatrices convencionales impulsadas por difusión de un modo impulsado por cizalla a través de un canal de 100 nm de grosor, cada punto "vería" aproximadamente de 10 a 20 veces más muestra. Por ello es evidente que, en este modo de operación, los límites de detección de los sistemas impulsados por difusión usados actualmente pueden superarse considerablemente.

Considerando el cálculo anterior sobre la velocidad de fluido requerida, debería ser evidente que en el procedimiento según la presente invención, la capa de fluido debe transportarse preferentemente a una velocidad comprendida entre 1 mm/s (para cadenas de ADN largas de difusión lenta) y 40 cm/s aproximadamente (para cadenas de ADN cortas de difusión más rápida). Debe observarse que el procedimiento descrito anteriormente según la presente invención puede aplicarse también para acelerar la detección selectiva de otras moléculas, como proteínas o sustancias farmacológicas potenciales.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, el espaciamiento entre las superficies primera y segunda en el dispositivo de la presente invención se controla mediante una matriz de separadores micromecanizados, que sobresalen de al menos una de las superficies, y estando recubiertos preferentemente con una capa de material sin desgaste y de bajo rozamiento.

Se dispone una matriz de separadores micromecanizados 50 en las superficies segunda móvil y/o primera estática y se permite mantener la distancia entre la placa móvil y la estática lo más constante posible. Estos separadores pueden tener cualquier forma deseada, incluyendo, pero sin limitarse a, cilindros, conos truncados, semiesferas, cubos y prismas rectangulares. En una forma de realización, los separadores de canal micromecanizados se extienden sustancialmente a lo largo de toda la longitud de la primera superficie estática, con su dimensión más larga orientada a lo largo de la dirección x. En esta forma de realización preferida, los separadores del canal deben tener preferentemente una forma sustancialmente lineal cuando la pared móvil (segunda superficie) se traslada en una dirección sustancialmente rectilínea, mientras que debe tener preferentemente una forma circularmente curva cuando la pared móvil se somete a un movimiento de rotación. Los separadores del canal pueden estar hechos, o revestidos, con cualquier material resistente al desgaste adecuado conocido por los expertos en la materia de tribología. Los separadores del canal pueden fabricarse según cualquiera de los procedimientos de deposición de capas adecuados (por ejemplo, deposición química en fase de vapor) y técnicas de grabado (por ejemplo, grabado de izado) conocidos por los expertos en la materia de micromecanizado. Pueden encontrarse ejemplos de procedimientos para el mecanizado de estructuras de separadores que tienen tolerancias de altura pequeñas nanométricamente, junto con procedimientos para la adición de una capa de recubrimiento sin desgaste sobre la parte superior de estas estructuras, por ejemplo, en Tanaka, H., y col., 1993, J. Tribol. 115, 573-576; Li, Y. y Menon, A. K., 1995, J. Tribol. 117, 279-284. Para mantener las dos superficies en contacto íntimo, puede aplicarse una carga 501.

En una forma de realización básica de la presente invención, según se muestra en la Figura 4c, la segunda superficie móvil puede moverse de un modo lineal de proceso directo después de la primera superficie estática. Sin embargo, para poder transportar una cantidad de muestra suficiente, es preferible tener un sistema de superficie móvil que proporcione una trayectoria de flujo infinita (es decir, recirculante continuamente). La Figura 6 muestra dibujos conceptuales de dispositivos de correa móvil (cerrados o no) y discoidales giratorios que proporcionan dicha trayectoria de flujo infinita.

Según otra forma de realización más, dicha segunda superficie del dispositivo de la presente invención es una placa plana móvil linealmente, una correa flexible móvil linealmente, un dispositivo giratorio o un cilindro giratorio.

Según se ha explicado antes, dicha segunda superficie móvil se usa para generar un flujo que pasa por las moléculas diana fijas en la superficie del sustrato.

Según una forma de realización preferida, dicha segunda superficie en un dispositivo de la invención es una superficie plana móvil linealmente, una correa flexible móvil linealmente, un disco giratorio o un cilindro giratorio.

El movimiento de la segunda superficie móvil puede efectuarse preferentemente usando cualquier dispositivo de desplazamiento motorizado adecuado (no representado en el dibujo), incluyendo, pero sin limitarse a, una mesa de disco giratorio o un sistema de traslación automática lineal).

La Figura 7 muestra una de las muchas configuraciones concebibles del dispositivo de la presente invención en la que puede usarse una sola superficie móvil 20 para organizar el transporte de la muestra después de una multitud de placas de matriz 10. En el dibujo, los separadores del canal 50 usados para mantener una distancia sustancialmente constante entre las superficies móvil y estática se representan como parcialmente visibles a través de las placas de matrices estáticas 10. Puede configurarse un sistema multimatriz similar para el caso de un dispositivo de correa móvil, por ejemplo, poniendo varias placas de matrices diferentes unas detrás de otras.

Según otra forma de realización más, la segunda superficie móvil del dispositivo de la presente invención lleva una matriz de salientes micromecanizados que se extiende desde dicha segunda superficie. Dichos salientes micromecanizados proporcionan un sostén adicional del movimiento del fluido, y/o pueden usarse para inducir un mezclado adicional en la dirección radial y lateral, y para limitar el mezclado en la dirección axial.

Según otra forma de realización, la primera superficie comprende una matriz de orificios porosos.

En una posible variante (Figura 8), dichos salientes tienen forma de varillas rectangulares; con su dimensión más larga 151 orientada a lo largo de la dirección z y, por supuesto, seleccionada de manera que encaje entre los separadores del canal. Aparte de proporcionar un sostén adicional del movimiento del fluido (es decir, la velocidad media de fluido será mayor que en ausencia de los salientes), dichos salientes pueden inducir también un mezclado radial adicional deseado a lo largo de la dirección 152. Para crear un patrón de mezclado óptimo, la distancia de intervalos entre los diferentes salientes en la dirección x debería ser preferentemente igual a entre 1 y 10 veces la altura del canal. Otra ventaja más de la forma de realización representada en la Figura 8 es que la dispersión de difusión en la dirección axial se reduce. Otros medios salientes preferidos que se deben disponer en la superficie móvil se ilustran en la Figura 9. En estas formas de realización, la forma y posición de los salientes 150 se selecciona de manera que generan desviaciones intermitentes 153 de la dirección de flujo. Dichas desviaciones de la dirección de flujo son especialmente preferidas porque inducen un flujo adicional en la dirección z, en el que el transporte normalmente tiene que producirse por la lenta difusión molecular. En un enfoque alternativo, y sin perder su efecto, los salientes ilustrados en la Figura 9 pueden disponerse también en la primera superficie estática.

La Figura 10 muestra otra forma de realización preferida según la presente invención, en la que se acopla un denominado dispositivo portamuestras 60 o se integra dentro de la estructura de placas 20 que lleva la matriz de puntos de moléculas receptoras 2. El dispositivo portamuestras puede servir, por ejemplo, como un medio para evitar la evaporación de la parte de la muestra 100 que espera a ser transportada a través del canal de detección selectiva formado por las superficies 10 y 20. Cuando se coloca en la salida del canal, el dispositivo portamuestras puede servir también como un medio para recoger la muestra para un análisis subsiguiente después de haber recorrido un paso a través del canal de detección selectiva. Preferentemente, el dispositivo portamuestras debe tener una conexión que pueda cerrarse 611 con la atmósfera circundante o con una cámara presurizada o de vacío (no se representa en el dibujo). El dispositivos portamuestras necesario en la presente invención puede fabricarse con cualquier técnica estándar de micromecanizado, como grabado iónico reactivo, LIGA y grabado en húmedo, y en una forma de realización preferida, los portamuestras se mecanizan directamente en el sustrato que lleva los puntos de moléculas receptoras. En otra variante preferida, los portamuestras se integran dentro de un plato de vacío, o cualquier otro dispositivo de fijación adecuado, usado para acoplar la superficie estática para un marco de sujeción fijo (no representado en ninguno de los dibujos en el presente documento).

Según otra forma de realización más, dichas superficies segunda y/o primera del dispositivo de la presente invención son suficientemente finas y flexibles para adecuarse óptimamente a la superficie opuesta.

En principio, la superficie de pared móvil 20 puede estar hecha de cualquier sustrato suficientemente plano y suavemente pulido hecho de cualquier material adecuado como vidrio, silicio, polímeros, ... ; y preferentemente de entre 50 y 1.000 \mum de grosor. Para mejorar el funcionamiento de los dispositivos según la presente invención, la superficie, o partes de la superficie, de las superficies segunda móvil y/o primera estática pueden recubrirse con una capa repelente de pared como, por ejemplo, un recubrimiento hidrófobo (para impedir que las moléculas de muestra se adhieran o se unan a la superficie en posiciones indeseadas e inespecíficas). Dicho recubrimiento puede ser, por ejemplo, una monocapa hidrófoba de 3-[(heptafluoroisopropoxi)propil]triclorosilano. En otro aspecto, se prefiere también proporcionar un recubrimiento de bajo rozamiento y bajo desgaste como, por ejemplo, una capa de teflón (para mejorar el comportamiento tribológico de los dispositivos) en las partes de las superficies segunda móvil y/o primera estática que se deslizan una con respecto a otra. Las partes en las que se necesita dicho recubrimiento son la superficie superior de los separadores micromecanizados 50 y las partes de la superficie opuesta que entran en contacto con dichos
separadores.

Según otra forma de realización más, dicha primera superficie del dispositivo de la presente invención se cubre con una matriz 1-D o 2-D de moléculas receptoras.

La primera superficie puede cubrirse con una matriz 2-D de moléculas receptoras de forma sustancialmente circular o cuadrada, o bien con una matriz 1-D de puntos de moléculas receptoras que tienen una dimensión mucho más larga que las otras, y que se extiende sustancialmente a lo largo de toda la anchura o longitud o primera superficie.

Según otra forma de realización más, el dispositivo de la presente invención comprende medios para controlar la temperatura y/o medios de detección, y/o medios para el desplazamiento automatizado de dicha segunda superficie. La temperatura en los dispositivos según la presente procedimiento puede controlarse, por ejemplo, usando un circuito integrado resistivo micromecanizado en la parte posterior del sustrato que lleva la superficie estática, o por simple puesta en contacto de dicho sustrato con un bloque calefactor. El hecho de que, debido al grosor submicrométrico de canal, la transferencia de calor en los canales es extremadamente rápida, es otra ventaja de la presente invención.

En todas las formas de realización desveladas del procedimiento según la presente invención, la detección de la cantidad de ligandos de enlace o de analitos diana puede producirse mediante cualquiera de los procedimientos de detección conocidos para los expertos en la materia de detección de micromatrices y biosensores, incluyendo procedimientos de detección óptica, eléctrica, acústica o basada en radioactividad. En una forma de realización preferida, la detección sucede fuera del chip, después de lavado y secado apropiados, usando escáneres de matriz como, por ejemplo, los sistemas de exploración láser confocal o los sistemas de detección basados en CCD que están disponibles actualmente en una base comercial. En otra forma de realización preferida, de uso especial para la medida de la cinética de unión, la detección sucede en un chip.

En otro aspecto, la presente invención se refiere también a un procedimiento para unir una o más moléculas diana comprendidas dentro de una muestra de fluido a al menos una molécula receptora al menos parcialmente fija a una primera superficie de un sustrato, en el que dichas moléculas diana se transportan en paralelo a dicha primera superficie por medio de un campo de fuerza de cizalla.

Las ventajas de usar dicho campo de fuerza de cizalla se han expuesto en todo detalle anteriormente en relación con el aparato de esta invención.

Según una forma de realización, el campo de fuerza de cizalla en el procedimiento de la invención se origina en una segunda superficie que es mayor que dicha primera superficie y se mueve mecánicamente de un modo sustancialmente paralelo después de dicha primera superficie.

Según otra forma de realización más, el tiempo de contacto entre las moléculas diana y receptoras en el procedimiento de la invención se toma suficientemente largo, preferentemente entre 0,1 ms y 10 minutos. Dicho tiempo de contacto puede controlarse exactamente controlando la velocidad de la segunda superficie móvil. Un tiempo de contacto entre 0,1 ms y 10 minutos debería permitir la terminación de las reacciones de unión que se van a investigar.

Otra ventaja más de las formas de realización según la presente invención es que es muy sencillo cambiar de un modo de flujo continuo a un modo de transporte que consiste en una serie continua de secuencias de flujo-parada. Esto puede conseguirse fácilmente usando uno de los sistemas de desplazamiento rotacional o lineal automatizado disponibles comercialmente, por ejemplo, impulsados por un motor paso a paso, y ofreciendo una resolución de desplazamiento en la escala micrométrica, como medio de impulso del movimiento de la pared móvil. Es bien conocido que dichos sistemas de desplazamiento pueden programarse fácilmente para realizar una serie de secuencias alternativas de movimiento-parada, y que la longitud y velocidad del desplazamiento, así como la duración de las pausas, pueden seleccionarse con un grado muy grande de libertad. La posibilidad de realizar secuencias alternativas de flujo-parada es enormemente ventajosa en casos en que un flujo convectivo intenso perturba los sucesos de unión: durante los (breves) períodos de parada, el procedimiento de unión puede tener lugar sin perturbaciones debidas a efectos de convección, mientras que los períodos de flujo se usan para generar una rápida renovación de la capa de fluido que cubre un punto dado de molécula receptora.

Preferentemente, este modo de transporte flujo-parada alternativo debe organizarse de manera que los rápidos desplazamientos de fluidos (con una velocidad comprendida preferentemente entre 1 cm/s y 1 m/s y que cubre una distancia igual preferentemente a la distancia entre dos centros de puntos consecutivos) se alternen con períodos de parada tomados suficientemente largos (por ejemplo, entre 1 ms y 1 s) para permitir que las moléculas asociadas diana hibriden o se unan con las moléculas receptoras en ausencia de cualesquiera efectos de convección o de fuerza de cizalla. De este modo, un líquido dado del volumen de muestra (con superficie de base aproximadamente igual a la superficie de un punto dado, y con una altura igual a la altura del canal) se desplaza de un punto a otro de un modo escalonado, desplazándose así por toda la superficie del chip de ADN en un tiempo relativamente breve y encontrándose con un gran número de tipos diferentes de moléculas receptoras. Desde el punto de vista de los puntos de moléculas receptoras, la acción de desplazamiento es ventajosa porque la fina capa de difusión (por ejemplo, de 100 nm de grosor) en la parte superior de los puntos se renueva continuamente con líquido de muestra nuevo. Como este suministro convectivo puede organizar órdenes de magnitud más rápidamente que el transporte difusivo en las capas de fluido más gruesas (por ejemplo, de 50 micrómetros de grosor) típicas de la hibridación de ADN convencional, puede comprenderse fácilmente la ganancia en el tiempo de detección selectiva.

Para realizar las detecciones selectivas y ensayos unión según la presente invención, pueden usarse todos los procedimientos de variación de composición del fluido (concentración salina, pH, ...), y todos los procedimientos de variación de temperatura y campo eléctrico conocidos por los expertos en la materia de detección selectiva de micromatrices de ADN y proteínas.

Según otra forma de realización más, en el procedimiento de la invención dicha primera superficie se somete a un movimiento de traslación o rotación en una dirección diferente de la dirección de movimiento de dicha segunda superficie.

A excepción de las formas de realización de la Fig. 9, las formas de realización presentadas hasta ahora tienen un inconveniente común porque un flujo de cizalla generado, por ejemplo, en la dirección 70, sólo afecta a los puntos de moléculas receptoras 2 en una fila en forma de fila, mientras que el transporte en la dirección perpendicular (dirección 71) sigue teniendo que producirse por el lento procedimiento de difusión molecular (Figura 11a). Un posible enfoque para resolver este problema sería recoger la muestra en un dispositivo portamuestras 61 que se extiende a lo largo de al menos dos paredes paralelas de la placa de ensayo 20, girando la placa de ensayo 20 90°, según la dirección 62, y repitiendo el procedimiento de detección selectiva en la dirección 71. Debido al efecto de fuerza capilar, el líquido recogido en el extremo 11 de la superficie del punto receptor 20 se extenderá automáticamente igualmente sobre los dos brazos 61a y 61b del dispositivo portamuestras 61.

En otra forma de realización preferida de la presente invención, se genera un transporte convectivo en dos direcciones diferentes 70 y 71 según se muestra en la Figura 12. Mientras que el movimiento básico en la dirección 70 se efectúa por la superficie móvil 20, la superficie 10 que lleva los puntos inmovilizados de moléculas receptoras 2 puede someterse a un movimiento preferentemente recíproco en la dirección 71. Para este fin, puede usarse un segundo dispositivo motor (no mostrado en el dibujo). Para tener suficiente muestra disponible para ser transportada a lo largo de las direcciones 70 y 71, debería ponerse en su lugar un dispositivo portamuestras 61 que se extienda a lo largo de al menos tres paredes laterales de la placa de ensayo 10, según se indica en la Figura 12.

En la Figura 13 se ilustra otra forma de realización más preferida de la presente invención que permite generar un transporte convectivo en más de una dirección. En esta forma de realización, la superficie 10 que lleva los puntos de moléculas receptoras 2 se somete a un movimiento de rotación 71. En esta forma de realización, el dispositivo portamuestras 61 debería extenderse preferentemente a lo largo de toda la circunferencia de la superficie de ensayo 20.

En otra forma de realización preferida (ver Figura 14), tanto la superficie estática 10 que lleva los puntos receptores como la superficie móvil 20 tienen forma discoidal. En esta forma de realización preferida, deja de ser necesario un dispositivo portamuestras, ya que todo el espacio del canal entre las dos superficies de discos se usa para sujetar toda la muestra. La generación de un movimiento relativo de rotación entre los dos discos (en realidad no importa cuál de las dos superficies está girando) permite así generar un transporte convectivo en la dirección tangencial 70. Esto es altamente ventajoso porque el transporte convectivo en toda la circunferencia del disco se produce a una escala de tiempo que es varios órdenes de magnitud menor que el transporte por difusión puro.

En una variante adicional del concepto de disco giratorio doble, el hueco entre los dos discos se reduce gradualmente durante la operación de ensayo, sometiendo uno de los dos discos a un movimiento en dirección 72. Preferentemente, se usa una matriz de separadores micromecanizados 50 para mantener un espaciamiento mínimo al final de la operación. En esta forma de realización preferida, el movimiento de una de las dos superficies 10 ó 20 en dirección 72 induce un flujo convectivo en la dirección radial 71, con un movimiento neto del fluido hacia el exterior a través de la región periférica del disco 73. Ésta es una situación altamente preferida, ya que implica que se establece un transporte convectivo tanto en la dirección tangencial como en la radial. Preferentemente, el espaciamiento inicial entre las dos superficies de disco debe estar entre 5 y 100 \mum, mientras que el espaciamiento final debe estar preferentemente entre 50 y 1.000 nm.

En una versión alternativa del sistema de hueco decreciente entre canales presentado en la Figura 14, el flujo de salida puede ocurrir también a través de una matriz de poros u orificios micromecanizados 51 grabados a través de la superficie receptora (Figura 15). Los orificios pueden estar distribuidos homogéneamente sobre la superficie receptora, pero también pueden concentrarse en una región específica, por ejemplo, cerca del centro del disco. Los sistemas de hueco decreciente entre canales presentados en la Figura 14 y 15 permiten omitir los dispositivos portamuestras en las formas de realización presentados en las Figuras 10-13: debido a la pequeña difusividad molecular, las moléculas receptoras en la superficie receptora sólo "ven" las moléculas de muestra en una capa de fluido 160 de apenas unos diámetros moleculares de grosor inmediatamente adyacentes a la superficie receptora. Las moléculas diana presentes en las capas de fluido 161 alejadas de la superficie receptora están simplemente esperando su turno antes de que puedan entrar en la zona activa 160 (impulsadas por el movimiento del fluido en dirección 72). Así, la capa 161 actúa de hecho como un portamuestras. En la Figura 15, la frontera entre las zonas 160 y 161 se representa por la línea de puntos 162. En una forma de realización preferida, la velocidad de la rotación 70 es suficientemente mayor que la velocidad de fluido en la dirección 72, de manera que las moléculas de muestra presentes en la capa 160 han tenido tiempo de ser transportadas al menos una vez alrededor de toda la superficie receptora estática de disco 10 (véase Figura 14a) antes de salir del sistema a través de los orificios 51.

Según otra forma de realización más, el procedimiento de la presente invención puede usarse para la purificación de cantidades de producción de un analito diana dado comprendido dentro de una muestra de fluido. Dicho procedimiento se realiza cubriendo partes más grandes de la superficie del sustrato con las mismas moléculas receptoras. Después de terminar el procedimiento de unión, puede usarse la segunda superficie móvil para transportar un volumen dado de muestra desorbente de fluido después de que se desorban dichas moléculas receptoras y se recojan los analitos diana ligados.

Considerando la posibilidad de transportar grandes volúmenes de fluido, el procedimiento según la presente invención puede usarse para la purificación de cantidades de producción de anticuerpos, factores de crecimiento, ADN sonda, etc. En este caso, grandes partes de la superficie del punto receptor, comprendidas preferentemente entre el 10 y el 100%, deben cubrirse con el mismo tipo de molécula receptora. Después de una prueba de control restrictivo subsiguiente, puede producirse la "recolección" de las moléculas capturadas selectivamente haciéndolas pasar por soluciones líquidas promotoras de la desorción a través del canal, cambiando las condiciones de temperatura, aplicando un campo eléctrico o aplicando cualquier otro procedimiento de desorción o regeneración conocido para los expertos en la materia de medidas de biosensores o detección selectiva con micromatrices. Aquí debe observarse de nuevo que, considerando el grado alcanzable de reducción del grosor del canal, una de las ventajas del procedimiento según la presente invención es que las moléculas desorbidas pueden recogerse con un mínimo de dilución, simplemente usando la pared móvil para transportar un volumen dado de líquido de desorción que pase por las moléculas receptoras.

Según otra forma de realización más, en el procedimiento de la presente invención la cantidad de muestra puesta en contacto con las moléculas receptoras oscila preferentemente entre unos picolitros y varios cientos de microlitros.

Dicha cantidad puede controlarse exactamente por la distancia sobre la que se transporta la segunda superficie, y en la que, durante la inyección, preferentemente no hay ningún otro líquido presente corriente arriba del punto de introducción de la muestra introducción, y en el que la muestra no introducida se aspira, se limpia o se desecha.

Todas las formas de realización presentadas hasta ahora se han diseñado especialmente para el tratamiento de grandes volúmenes de muestra (es decir, para el caso en que el volumen de muestra es normalmente igual a o mayor que el volumen del canal). Cuando las muestras están suficientemente concentradas, como es a menudo el caso de la detección selectiva de fármacos mediante bibliotecas de química combinatoria, se desea poder tratar cantidades de muestra menores. En este punto, aparece otra ventaja del procedimiento según la presente invención. Después del procedimiento de inyección ilustrado en la Figura 16, y con la posibilidad de controlar el desplazamiento 90 de la pared móvil 20 con incluso una precisión de desplazamiento submicrométrica (usando, por ejemplo, un sistema automático de desplazamiento lineal con motor paso a paso), es evidente que pueden inyectarse tapones de muestra extremadamente cortos 100 de un modo controlable y reproducible. En la Figura 16, se muestra cómo, usando dos dispositivos de inyección diferentes, uno lleno con muestra (dispositivo de inyección 80) y otro lleno con una solución líquida sin muestra (dispositivo de inyección 81), la muestra inyectada con el dispositivo 80 y que no ha entrado en el canal puede diluirse usando el dispositivo de inyección 81. Cuando se usan, por ejemplo, las boquillas de inyección micromecanizadas y accionadas piezoeléctricamente conocidas por los expertos en la materia, es posible una alta velocidad de dispensación de cantidades diminutas de muestra y pueden obtenerse frecuencias de inyección muy altas. En referencia a la secuencia de la Figura 16, debe observarse que la muestra debe añadirse preferentemente después de eliminar (por ejemplo, por lavado o aspirado) todo el líquido de la superficie 21 delante de la entrada del canal. En esta forma de realización preferida, no hay ningún otro líquido presente corriente arriba del punto de introducción de la muestra, y con ello se evita la dilución de la muestra (véase la situación de la Figura 10). La inyección de la muestra puede producirse también a través de dispositivos portamuestras miniaturizados como el representado en la Figura 10. Otra ventaja de la posibilidad de usar el movimiento de la pared del canal para controlar el volumen de inyección en el procedimiento según la presente invención es que pueden manejarse volúmenes de inyección muy pequeños (del orden del picolitro) sin causar ninguna dilución innecesaria.

Según otra forma de realización más, puede usarse la segunda superficie en el procedimiento de la invención para inyectar y transportar volúmenes bien controlados de mezclas de fluido con características de promoción de la desorción. Esto puede hacerse, por ejemplo, para pruebas de control restrictivo, para la desorción y la recogida de las moléculas ligadas, para la regeneración de las moléculas receptoras y para el análisis de desplazamiento de ligandos.

De un modo semejante a la inyección y el transporte de líquidos de muestra, las formas de realización desveladas en esta invención pueden usarse también para inyectar y transportar tapones bien definidos o soluciones líquidas promotoras de la desorción sin volúmenes de muestra, por ejemplo, para realizar pruebas de control restrictivo, para la eliminación de moléculas ligadas no específicamente o para desorber los ligandos unidos de las moléculas receptoras.

Puede usarse también un dispositivo portamuestras similar al ilustrado en la Figura 10 para contener un líquido de prueba de control restrictivo o un líquido de lavado antes y/o después de su paso a través del canal. En una forma de realización preferida, el dispositivo portamuestras se usa como una cámara de premezclado en la que la composición del líquido de prueba de control restrictivo se cambia continuamente, de manera que puede realizarse una prueba de control restrictivo de tipo gradiente.

Según otra forma de realización más, en el procedimiento de la presente invención se inyecta un tapón de muestra limitado que contiene una o más moléculas diana diferentes en el canal formado por dichas dos superficies, y en el que dicho tapón de muestra se transporta posteriormente pasando por al menos uno de los puntos de moléculas receptoras fijos, y en el que la anchura axial de dicho tapón de muestra oscila preferentemente entre 0,5 y 10 veces la anchura de dichos puntos y en el que dicho tapón de muestra está precedido y seguido por un tapón de líquido sin muestra que tiene una anchura axial que es preferentemente mayor que 100 \mum.

Combinando la posibilidad de inyectar tapones de muestra claramente delimitados con el hecho que el grado de dispersión axial en los canales con un grosor submicrométrico es muy pequeño, es evidente que en uno de los procedimientos preferidos según la presente invención, tapones muy cortos (es decir, con una longitud del orden de 10 a 500 \mum) de diferentes muestras 101-106, sólo separados por tampones comparablemente cortos 110 de líquido tampón sin muestra (es decir, de manera que los tapones de muestra están separados por tapones de líquido sin muestra con una longitud de sólo 50 a 500 \mum), pueden transportarse a través del canal de micromatrices formado por las superficies 10 y 20 sin ningún entremezclado hidrodinámico o arrastre significativo entre los diferentes tapones de muestra (Figura 17). La posibilidad de generar transportes de alta frecuencia de tapones de muestra cortos puede comprenderse a partir del hecho de que el grado de dispersión axial o ensanchamiento máximo en canales con un grosor submicrométrico es extremadamente pequeño, ya que cualquier diferencia en la velocidad radial se elimina inmediatamente por la rápida difusión molecular. Este es un hecho que se conoce para flujos impulsados por presión, pero que puede trasponerse fácilmente a flujos impulsados por cizalla. Se ofrece una expresión de la dispersión axial en flujo por tubo circular laminar impulsado por presión en Cussler, E.L., 1984, Difussion: mass transfer in fluid systems, Cambridge Universidad Press, Cambridge, EE.UU., pág. 90.

Inyectando diferentes pulsos de muestra breves consecutivamente unos después de otros y transportándolos a través de una matriz de diferentes puntos de moléculas receptoras, la forma de realización descrita actualmente permite una productividad detección selectiva verdaderamente alta de muestras altamente concentradas. En una variante preferida, se usa un dispositivo de detección de formato de matriz (como una matriz de dispositivo de acoplamiento de carga o una matriz de fluorescencia inducida por láser de microlentes del tipo presentado en Bruno, A.E., y col., 1998, Microoptical fluorescence detection for chip-based multiplexed analysis systems, en Micro Total Analysis Systems, ed. Harrison, D.J. y van den Berg, A., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Países Bajos, pág.281-285) capaz de llevar un seguimiento de toda la placa de matrices para detectar y llevar un seguimiento de la ocurrencia de sucesos de unión en los puntos de moléculas receptoras. En la Figura 17, las flechas de dos puntas 200 representan posibles puntos de detección para dicho sistema de detección de matrices.

Según otra forma de realización preferida más, el procedimiento de la presente invención puede usarse para determinar la cinética de unión y la constante de equilibrio de unión variando el tiempo durante el cual dicho tapón de muestra limitado está en contacto con dichos puntos de moléculas receptoras y midiendo la cantidad de moléculas diana de fluido ligadas selectivamente con un dispositivo de detección en el punto durante o después del paso de la muestra.

Según otra forma de realización preferida más, dicho tapón de muestra limitado en el procedimiento de la invención tiene una anchura comprendida preferentemente entre 0,5 y 0,8 veces la anchura de dichos puntos de moléculas receptoras, y en el que el movimiento de la segunda superficie se detiene cuando dicho tapón de muestra ha alcanzado la posición de un punto de molécula receptora dado.

Según otra forma de realización preferida más, la unión de dichas moléculas diana en la muestra con dichas moléculas receptoras en la superficie del sustrato se sigue de un paso de reacción química, y en el que las cinéticas de reacción se determinan variando el tiempo durante el cual dicho tapón de muestra está en contacto con dicha molécula receptora.

Según otra forma de realización preferida más, en el procedimiento de la presente invención al menos un dispositivo de detección se coloca a una distancia dada, preferentemente entre 100 y 1.000 \mum corriente abajo o corriente arriba de una molécula receptora dada, y en el que la diferencia en concentración de analito diana entre y después del paso de dicho tapón de muestra a dicha molécula receptora se usa para determinar la cantidad de analitos diana ligados.

La representación esquemática dada en la Figura 18 muestra cómo, inyectando un tapón de moléculas de muestra 1 claramente delimitado, el procedimiento según la presente invención puede usarse también para determinar la cinética intrínseca de los sucesos de unión diana-receptor. Aprovechando la posibilidad de usar canales microfluídicos con un grosor que se limita sólo a un número limitado de veces mayor que el diámetro molecular de las moléculas de muestra, las moléculas tienen sólo que difundirse sobre una distancia insignificante, de manera que el tiempo de unión registrado está relacionado sólo con el procedimiento de unión actual, y no está sesgado por el lento procedimiento de difusión. Un procedimiento preferido de medida de la cinética de unión se basa en la inyección de un tapón de muestra que es preferentemente de aproximadamente de la misma anchura que la anchura 120 del punto de molécula receptora 2, y comprende un primer paso en el que dicho tapón de muestra 100 se transporta por medio de un flujo impulsado por cizalla hacia dicho punto de molécula receptora 2 (Fig. 18a). Cuando el tapón de muestra alcanza dicho punto (Fig. 18b), el flujo puede detenerse durante un durante tiempo de contacto preseleccionado dado t_{cont} o puede continuar a una velocidad preseleccionada dada u seleccionada de manera que el tiempo de paso del punto o tiempo de detención t_{detención}, determinado por la proporción entre la longitud del punto 120 y la velocidad seleccionada u, es igual al tiempo de contacto t_{cont} de interés. Este tiempo de contacto oscila preferentemente entre 0,5 milisegundos y varias horas, pero estará preferentemente entre 1 milisegundo y 10 minutos. Pueden conseguirse tiempos de contacto ultracortos en el orden de 1 milisegundo, por ejemplo, haciendo pasar un fluido con una velocidad de 0,2 m/s después de un punto con una anchura axial de 20 \mum. Al nivel molecular, los tiempos de contacto son incluso varios órdenes de magnitud menores. De ello sería evidente que el procedimiento según la presente invención permite realizar tiempos de contacto ultracortos de molécula a molécula que son del orden de los tiempos de unión intrínsecos. Ésta es una ventaja muy atractiva del procedimiento según la presente invención. Usando uno de los sistemas disponibles comercialmente de desplazamiento automatizado de alta resolución equipados con un motor paso a paso y proporcionando una precisión de desplazamiento incluso submicrométrica y permitiendo velocidades de desplazamiento grandes del orden de 10 cm/s o más, pueden controlarse con precisión la posición del tapón de muestra y la velocidad de desplazamiento.

Realizando diferentes experimentos a diferentes tiempos de contacto, y representando gráficamente la cantidad ligada N frente al tiempo de contacto o de detención t_{detención}, puede establecerse la curva de unión cinética completa. Para determinar el ritmo de la reacción de desorción, puede inyectarse un tapón de una solución líquida con características de promoción de la desorción y transportarse una distancia dada por detrás del tapón de muestra.

Para incrementar el límite de detección de la medida de la cinética de unión según el procedimiento de la presente invención, es posible también inyectar volúmenes de muestra mayores (es decir, con una longitud de tapón más larga) y transportarlos posteriormente a una velocidad predefinida después del punto de molécula receptora. Multiplicando la cantidad total N_{tot} ligada en estas condiciones por la proporción entre el tiempo de detención (t_{detención} = longitud del punto/velocidad de fluido) y el tiempo de contacto del tapón total (t_{total} = longitud del tapón de muestra/velocidad de fluido), se obtiene una cantidad N que contiene la misma información de cinética que la cantidad N obtenida de los experimentos de tapón corto citados anteriormente, salvo porque tiene un error de medida inferior.

Según otra forma de realización más, en el procedimiento de la presente invención se usa dicha segunda superficie móvil para transportar un tapón de moléculas diana desorbidas o los productos de una reacción de ensayo enzimática en un solo tapón hacia un dispositivo de detección. Dicho dispositivo de detección puede ser, por ejemplo, un espectrómetro de masas, capaz de cuantificar e identificar las moléculas diana desorbidas o los productos de reacción enzimática, y localizados corriente abajo de la molécula receptora.

Según otra forma de realización más, en el procedimiento de la presente invención se realiza una prueba de control restrictivo aplicando un cambio repentino en la composición o temperatura del fluido, o aplicando un campo eléctrico externo.

Según otra forma de realización más, el procedimiento de la presente invención puede usarse para medir la cantidad de moléculas diana ligadas selectivamente a moléculas receptoras fijas en la superficie del sustrato, usando un medio de detección. La cantidad de moléculas diana ligadas selectivamente puede medirse después de un lavado y secado apropiados de dicha superficie, usando, por ejemplo, un microscopio de exploración láser confocal, una matriz CCD o un dispositivo de exploración MALDI/EM.

Según otra forma de realización más, la cantidad de moléculas diana ligadas selectivamente puede medirse en un chip. Esto se hace usando, por ejemplo, fluorescencia por reflexión interna total, análisis de ondas acústicas superficiales, resonancia de plasmón superficial, análisis electroquímico o análisis de impedancia eléctrica, conductancia, amperométrico o de capacitancia para distinguir entre moléculas ligadas y no ligadas.

Actualmente, se conoce un gran número de procedimientos que permiten seguir continuamente la cantidad de moléculas ligadas en la superficie del punto sin los sesgos de las moléculas diana no ligadas presentes en la fase de fluido que rodea a las moléculas receptoras. Según conocen los expertos en la materia, dichos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, procedimientos de resonancia de plasmón superficial, onda acústica superficial, fluorescencia de reflexión interna total, electroquímicos, o procedimientos potenciométricos, conductométricos, amperométricos y de capacitancia. En otra forma de realización preferida más, la detección de la cantidad de moléculas ligadas se realiza después de que el tapón de muestra haya sido transportado fuera del punto de unión (véase Fig. 18c) y haya sido sustituido por una solución líquida sin muestra que tiene la composición correcta de sal y tampón para impedir la desorción de las moléculas diana ligadas. De este modo, el procedimiento de detección no debe limitarse a técnicas de detección superficial como los procedimientos citados anteriormente, sino que pueden usarse procedimientos de detección más universales y baratos como Fluorescencia Inducida por Láser (FIL). Según se ilustra en la Figura 18c, este procedimiento se basa en el uso de un haz de láser incidente 150 con luz coherente de una longitud de onda dada para inducir la emisión de un campo electromagnético fluorescente 160 a otra longitud de onda, que puede recogerse después en un ángulo diferente. En otra forma de realización preferida más, la cantidad de moléculas ligadas se detecta usando un dispositivo de detección situado a una distancia (corta) dada corriente abajo o corriente arriba de un punto de molécula receptora dado. En esta forma de realización, la disminución en la concentración de analito diana se usa como una medida indirecta de la cantidad ligada. En una forma de realización preferida, la cantidad de moléculas diana libres puede determinarse tanto antes como después del contacto con el punto de molécula receptora usando un punto de detección único. Colocando el dispositivo de detección en una posición dada corriente abajo del punto de molécula receptora, dicho dispositivo de detección puede usarse en una primera fase de transporte para medir la cantidad total de moléculas diana no ligadas presentes en una muestra dada antes de que la muestra se haya puesto en contacto con el punto de molécula receptora. Después de que la muestra haya pasado el detector y se haya puesto en contacto con dicho punto de molécula receptora, la superficie móvil puede moverse en la dirección opuesta a la de la primera fase de transporte, de manera que el tapón pase de nuevo por el mismo dispositivo de detección, permitiendo determinar la reducción de la concentración de moléculas diana libres.

En las formas de realización en las que las moléculas ligadas se deben desorber y transportarse posteriormente en un tapón diluido mínimamente hacia un dispositivo de detección o hacia el extremo del canal (con fines de recogida de fracciones), se prefiere que las líneas de velocidad del flujo impulsado por cizalla discurran en paralelo, de manera que se produzca un mínimo de entremezclado lateral (es decir, en la dirección z) entre los diferentes tapones de muestra que se están analizando en paralelo.

En otra forma de realización preferida según la presente invención, adecuada particularmente para determinar la estructura y la composición de ligandos desconocidos unidos a las moléculas receptoras, puede usarse la posibilidad de transportar tapones líquidos con una cantidad limitada de dispersión axial para transportar un tapón de un líquido promotor de desorción a un punto de molécula receptora dado, en el que las moléculas ligadas diana se desorben y posteriormente se transportan en un único tapón concentrado hacia un dispositivo de detección, como un espectrómetro de masas, situado corriente abajo del punto de molécula receptora. En el caso de ensayos de reacción enzimática, el procedimiento según la presente invención puede usarse también para transportar los productos de reacción en tapones de alta concentración hacia un dispositivo de espectrómetro de masas para análisis subsiguiente del producto de reacción. En otra forma de realización más, la caracterización de ligandos unidos desconocidos puede producirse a través de espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI/EM), después de un lavado y secado apropiados de la superficie del punto receptor.

Según otra forma de realización más, en el procedimiento según la invención las medidas pueden realizarse en un formato de matriz 1-D o 2-D y en el que se usa una matriz detectora 1-D o 2-D, y en el que todas las líneas de corriente de flujo discurren de un modo sustancialmente paralelo para impedir el entremezclado entre rutas de flujo paralelas.

La mayoría de los procedimientos de detección en un chip citados anteriormente puede aplicarse también en un formato de matriz, en el que se lleva un seguimiento simultáneamente de multitud de puntos. La detección de matriz-FIL usando una matriz 2-D de microlentes ha sido demostrada, por ejemplo, por Bruno y col. (1998). Todos los procedimientos eléctricos y piezoeléctricos y acústicos pueden aplicarse también fácilmente, usando la amplia gama de técnicas de micromecanizado existentes actualmente, en un formato de matriz. Se ha demostrado recientemente incluso la espectrometría de masas multiplexada, usando, por ejemplo, una EM para llevar un seguimiento del contenido de una placa de 96 pocillos, (Foret, F. y col., Microdevices for Electrospray Mass Spectrometry in Micro Total Analysis Systems, 1998, ed. Harrison, D.J. y van den Berg, A., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Países Bajos, pág. 35-38).

Según otra forma de realización más, en el procedimiento de la invención pueden transportarse diferentes sustancias de fluido en un único tapón, es decir, a la misma velocidad, para investigar sucesos de unión o reacción que impliquen un cofactor, o para realizar ensayos de unión competitiva.

En otra forma de realización (véase Figura 19), adecuada para aplicaciones que requieren una gran velocidad de fluido, las moléculas receptoras se inmovilizan en rebajes grabados superficiales para protegerlos del campo de alta cizalla 5.

Además, debe observarse que, en todas las formas de realización presentadas, la superficie que se pretende normalmente para generar el flujo de cizalla puede transportar también medios receptores selectivos.

Claims

1. Un dispositivo para la realización de reacciones de unión diana-receptor dentro de un canal de flujo provisto de moléculas receptoras, por el que dicha reacción de unión se está generando en contacto con una muestra de fluido que comprende una o más moléculas diana con dichas moléculas receptoras, comprendiendo además dicho dispositivo:

- una primera superficie sólida provista de posiciones discretas y aisladas para dicha reacción de unión dentro de dicho canal de flujo,

- una segunda superficie sólida capaz de moverse de un modo paralelo pasando por o sobre la primera superficie y configurada de un modo de interacción de flujo con dicha muestra de fluido y dicha primera superficie para formar un canal a un grosor de entre 10 nanómetros y 10 micrómetros,

- en el que dicha segunda superficie está configurada para moverse en una serie alternante de secuencias de movimiento-parada.

2. Un dispositivo según la reivindicación 1 en el que dicha secuencia de movimiento-parada comprende un desplazamiento de fluido que cubre una distancia que es igual a la distancia entre dos posiciones consecutivas de reacciones de unión.

3. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, comprendiendo dicha secuencia de movimiento-parada un período de parada de duración tal que permita que las moléculas diana hibriden o se unan a las moléculas receptoras en ausencia de convección u otros efectos de fuerza de cizalla.

4. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, por el que la segunda superficie es mayor que dicha primera superficie.

5. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la primera superficie comprende rebajes superficiales que tienen preferentemente aproximadamente la misma profundidad que la altura de las moléculas receptoras inmovilizadas en ellos.

6. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el espaciamiento entre las superficies primera y segunda está controlado por una matriz de medios separadores, sobresaliendo desde al menos una de las superficies, y preferentemente estando recubierto por una capa sin desgaste y de bajo rozamiento.

7. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la segunda superficie lleva una matriz de salientes que se extienden desde dicha superficie.

8. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha segunda superficie se escoge entre una placa plana móvil linealmente, una correa flexible móvil linealmente, un disco giratorio o un cilindro giratorio.

9. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichas superficies primera y segunda son suficientemente finas y flexibles para adaptarse óptimamente a la superficie opuesta.

10. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha primera superficie está cubierta homogéneamente con el mismo tipo de moléculas receptoras, o está cubierta con una matriz de una o dos dimensiones de diferentes puntos de moléculas receptoras.

11. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además medios para el control de temperatura y/o medios de detección, y/o medios para el desplazamiento automatizado de dicha segunda superficie.

12. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha primera superficie lleva al menos un recipiente útil para contener grandes cantidades de líquido de muestra, líquido de prueba de control restrictivo, o líquido de lavado antes y/o después de su paso a lo largo de la superficie receptora.

13. Un dispositivo según la reivindicación 12 en el que dicho recipiente es una cámara de premezclado adecuada para variar la composición de la prueba de control restrictivo de manera que pueda realizarse una prueba de control restrictivo de tipo gradiente.

14. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha primera superficie y dicha segunda superficie tienen una forma discoidal.

15. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha primera superficie comprende una matriz de orificios porosos.

16. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en el que dicha segunda superficie comprende medios receptores selectivos.

17. Un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dichas secuencias de movimiento-parada de la segunda superficie se proporcionan mediante un sistema de desplazamiento automático programable.

18. Un procedimiento para unir una o más moléculas diana comprendidas dentro de una muestra de fluido a al menos una molécula receptora fija al menos parcialmente a una primera superficie sólida en un canal de flujo, en el que dichas moléculas diana se transportan en paralelo a dicha primera superficie por medio de una segunda superficie, dicha segunda superficie sólida se mueve en paralelo pasando por o por encima de dicha primera superficie en el que dicha segunda superficie se mueve como una serie alternante de secuencias de movimiento-parada, y un grosor de canal está entre 10 nanómetros y 10 micrómetros.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que dicha secuencia de movimiento-parada comprende un período de parada de duración tal que permita que las moléculas diana hibriden o se unan a las moléculas receptoras en ausencia de convección de otros efectos de fuerza de cizalla.

20. Un procedimiento según las reivindicaciones 18 ó 19 en el que dicha segunda superficie se escoge entre una superficie plana móvil linealmente, una correa flexible móvil linealmente, un disco giratorio o un cilindro giratorio.

21. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 en el que dicha primera superficie se somete a un movimiento de traslación o rotación en una dirección diferente de la dirección de movimiento de dicha segunda superficie.

22. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en el que dicha segunda superficie se usa para transportar un tapón de moléculas diana desorbidas o los productos de una reacción de ensayo enzimático en un solo tapón hacia un dispositivo de detección.

23. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 en el que se realiza una prueba de control restrictivo aplicando un cambio repentino en la composición o temperatura del fluido, o aplicando un campo eléctrico externo.

24. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23 usado para medir la cantidad de moléculas diana ligadas selectivamente a moléculas receptoras fijas al menos parcialmente a la primera superficie del sustrato.

25. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24 en el que la cantidad de moléculas diana ligadas selectivamente se mide sobre un chip.

26. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25 usado para la purificación de cantidades de producción de un analito diana dado comprendido dentro de una muestra de fluido.

27. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26 en el que la cantidad de muestra puesta en contacto con las moléculas receptoras se encuentra preferentemente entre unos pocos picolitros y unos pocos cientos de microlitos.

28. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27 en el que la segunda superficie se usa para inyectar y transportar volúmenes bien controlados de mezclas de fluido con características de promoción de desorción para pruebas de control restrictivo.

29. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28, en el que la distancia entre dichas superficies se reduce gradualmente durante el curso de la operación de ensayo.

30. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 29, en el que se inyecta un tapón de muestra limitado que contiene una o más moléculas diana diferentes en un canal formado por dichas dos superficies, y en el que dicho tapón de muestra se transporta posteriormente pasando por uno o más de los puntos de moléculas, y en el que la anchura axial de dicho tapón de muestra se encuentra preferentemente entre 0,5 y 10 veces la anchura de dichos puntos de moléculas receptoras, y en el que dicho tapón de muestra está precedido y seguido por un tapón de líquido libre de muestra.

31. Un procedimiento según la reivindicación 30 que se usa para determinar la cinética de unión y la constante de equilibrio de unión variando el tiempo durante el que dicho tapón de muestra limitado está en contacto con dicho punto de molécula receptora y midiendo la cantidad de moléculas diana de fluido ligadas selectivamente con un dispositivo de detección en el punto durante o después del paso de la muestra.

32. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 30 ó 31 en el que dicho tapón de muestra limitado tiene una anchura se encuentra preferentemente entre 0,5 y 0,8 veces la anchura de dichos puntos de molécula receptora, y en el que el movimiento de la segunda superficie se detiene cuando dicho tapón de muestra ha alcanzado la posición de un punto dado de molécula receptora.

33. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32 en el que la unión de dichas moléculas diana en la muestra con dichas moléculas receptoras en la superficie del sustrato está seguida de una etapa de reacción química, y en el que las cinéticas de reacción se determinan variando el tiempo durante el cual dicho tapón de muestra está en contacto con dichas moléculas receptoras.

34. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, en el que al menos un dispositivo de detección se coloca a una distancia dada, preferentemente entre 100 y 1.000 mm corriente abajo o corriente arriba de una molécula receptora dada, y en el que la diferencia en concentración de analito diana entre y después del paso de dicho tapón de muestra a dicha molécula receptora se usa para determinar la cantidad de analitos diana ligados.

35. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, en el que las medidas se realizan en un formato de matriz 1-D o 2-D y en el que se usa una matriz de detección en 1-D o 2-D, y en el que todas las líneas de corriente de flujo discurren de un modo paralelo para evitar el entremezclado entre rutas de flujo paralelo.

36. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 35, en el que se transportan diferentes sustancias de fluido en un solo tapón, es decir, a la misma velocidad, para investigar sucesos de unión o reacción que impliquen un cofactor, o para realizar ensayos de unión competitiva.