JP3919844B2 - エポキシコハク酸誘導体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なエポキシコハク酸誘導体およびそれを用いた骨疾患の治療薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
骨組織は破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成を繰り返しており、このバランスの上に骨の構造および量が保持されている。しかし、骨吸収が優位な状態になると骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症、骨ページェット病などの骨疾患を発症する。
【０００３】
破骨細胞による骨吸収は、ミネラルの溶解（脱灰）と骨基質の分解のステップに分けることができ、骨基質の分解はリソソーム酵素により起こると考えられている。最近の研究では、リソソーム酵素の中で中心的に働いているものはシステインプロテアーゼであるカテプシンＬや、カテプシンＬ類似の酵素であるといわれている（掛川、勝沼、Molecular Medicine, 30(10), 1310-1318(1993) および手塚ほか、J. Biol. Chem., 269, 1106-1109(1994)）。また、システインプロテアーゼ阻害剤が骨吸収を抑制することが報告されている（J.M. Delaisse ほか、 Biochem. Biophys., Res. Commun., 125, 441-447(1984)）。そこで、カテプシンＬをはじめとするシステインプロテアーゼを阻害する化合物は、骨粗鬆症などの骨疾患の治療に有望であると考えられている。
【０００４】
例えば、いくつかのエポキシコハク酸誘導体を骨疾患の治療に用いることが既に提案されている（特開昭６３−２８４１２７号、特開平２−２１８６１０号各公報）。しかしながら、システインプロテアーゼ阻害剤を臨床的に使用した例はなく、その研究は緒に就いたばかりである。
特公昭６１−５５５０９号公報は、チオール基がその活性の発現に関与する蛋白分解酵素の阻害剤として、エポキシコハク酸誘導体（エポキシスクシナム酸化合物）を開示している。しかしながら、オキシラン環に結合しているＮ−置換カルバモイル基の窒素原子に隣接する炭素原子が分岐している化合物、、例えば、ジフェニルメチルカルバモイル、（３−メチル−１−フェニルブチル）カルバモイル等は開示されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症、骨ページェット病等の骨疾患の予防または治療に有用な化合物および薬剤を提供することである。
本発明の目的はまた、カテプシンＬ活性の異常亢進を伴なう骨関節炎やリウマチ性関節炎の治療に有用な化合物および薬剤を提供することにもある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題の解決のために鋭意研究した結果、下記式（以後、式（Ｉ）ということもある）で表わされる右側のアミドの置換基が分岐していることを特徴的構成とするエポキシコハク酸誘導体またはその塩が、前記の特公昭６１−５５５０９号公報に開示されているエポキシコハク酸誘導体と比べて更に強力な骨吸収抑制作用を示し、骨疾患の予防または治療に有用であることを見出し発明を完成した。なお、特公昭６１−５５５０９号公報記載の化合物の作用は、後述する実施例の比較実験における比較化合物ＸおよびＹの作用で代表される。
【０００７】
【化３】
【０００８】
（式（Ｉ）において、Ｒ1 は、水素原子、炭素原子数が１〜３０のアルキル基、炭素原子数が６〜４０のアリール基、または炭素原子数が７〜４０のアラルキル基であり；Ｒ2 およびＲ3 は、それぞれ独立に、炭素原子数が６〜４０のアリール基、炭素原子数が７〜２０のアラルキル基または炭素原子数が３〜１０のアルキル基であり；Ｘは、−Ｏ−、または−ＮＲ4 −であり；Ｒ4 は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基または炭素原子数が７〜２０のアラルキル基である。）
【０００９】
【発明の実施の形態】
式（Ｉ）で表わされるエポキシコハク酸誘導体について説明する。
【００１０】
【化４】
【００１１】
式（Ｉ）において、Ｒ1 は、水素原子、アルキル基、アリール基またはアラルキル基であり、なかでも水素原子、アルキル基またはアラルキル基が好ましい。これらのアルキル基、アリール基またはアラルキル基は、いずれも置換基（例、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、炭素原子数１〜１０のアルキル基、炭素原子数１〜１０のアルコキシ基、炭素原子数６〜２０のアリール基）を有していてもよい。
アルキル基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、１乃至３０であることが好ましく、１乃至１５であることがさらに好ましく、１乃至６であることが最も好ましい。アルキル基は鎖状構造のものでも、あるい環状構造を有するものでもよい。鎖状アルキル基は、分岐を有していてもよい。
アリール基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、６乃至４０であることが好ましく、６乃至３０であることがさらに好ましく、６乃至２０であることが最も好ましい。アリール基の例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。
アラルキル基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、７乃至４０であることが好ましく、７乃至３０であることがさらに好ましく、７乃至２０であることが最も好ましい。アラルキル基の例には、ベンジル、フェネチルおよびジフェニルメチルが含まれる。
【００１２】
式（Ｉ）において、Ｒ2 及びＲ3 は、それぞれ独立に、アリール基、アラルキル基または炭素原子数が３乃至１０のアルキル基である。これらのアルキル基、アリール基またはアラルキル基は、いずれも置換基（例、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、炭素原子数１〜１０のアルキル基、炭素原子数１〜１０のアルコキシ基、炭素原子数６〜２０のアリール基）を有していてもよい。
アリール基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、６乃至４０であることが好ましく、６乃至３０であることがさらに好ましく、６乃至２０であることが最も好ましい。アリール基の例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。
アルキル基の炭素原子数（３乃至１０）は、置換基を含めた総炭素原子数を意味する。アルキル基の炭素原子数は、３乃至６であることが好ましい。アルキル基は鎖状であってもよく、環状構造を有してよい。鎖状アルキル基は、分岐を有していてもよい。
アラルキル基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、７乃至２０であることが好ましく、７乃至１５であることがさらに好ましく、７乃至１０であることが最も好ましい。アラルキル基の例には、ベンジルおよびフェネチルが含まれる。
【００１３】
式（Ｉ）において、Ｘは、−Ｏ−または−ＮＲ4 −である。そしてＲ4 は、水素原子、アルキル基またはアラルキル基であり、水素原子およびアルキル基が好ましく、水素原子が特に好ましい。これらのアルキル基およびアラルキル基は、前記のものと同様な置換基を有してもよい。
Ｒ4 のアルキルの炭素原子数（置換基を有する場合、置換基を含めた総炭素原子数）は、１乃至１０であることが好ましく、１乃至６であることがさらに好ましく、１乃至４であることが最も好ましい。鎖状アルキルが好ましい。鎖状アルキルは分岐を有していてもよい。
Ｒ4 のアラルキル基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、７乃至２０であることが好ましく、７乃至１５であることがさらに好ましく、７乃至１０であることが最も好ましい。このアラルキル基の例には、ベンジルおよびフェネチルが含まれる。
【００１４】
前記式（Ｉ）に示すオキシラン環の二つの炭素は、共に不斉炭素原子である。式（Ｉ）は、オキシラン環に結合した二つのカルボニル基がトランス型であることを示す。すなわち、本発明のエポキシコハク酸誘導体は、下記の（Ｔ１）または（Ｔ２）に示される光学異性体のいずれかのもの、あるいはこれらの混合物である。
【００１５】
【化５】
【００１６】
本発明のエポキシコハク酸誘導体の具体例を、下記第１表に示す。第１表におけるＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＸは、式（Ｉ）に示す各基に相当する。
【００１７】
【表１】
【００１８】
本発明のエポキシコハク酸誘導体は、塩として用いてもよい。Ｒ1 が水素原子でＸが−Ｏ−の場合は、オキシラン環のカルボニルと共にカルボキシル基を形成し、これが塩基と塩を形成してもよい。塩基のカチオンの例としては、アルカリ金属イオン（例、ナトリウム、カリウム）およびアルカリ土類金属イオン（例、カルシウム）を挙げることができる。
本発明のエポキシコハク酸誘導体は、特公昭６１−５５５０９号公報および特開昭５２−３１０２４号各公報に記載の合成方法に類似する方法、あるいは後述する実施例１〜１０に記載の合成方法およびそれに類似する方法に従い、容易に合成することができる。
【００１９】
次に本発明のエポキシコハク酸誘導体の薬理作用について説明する。
本発明のエポキシコハク酸誘導体は、チオールプロテアーゼ阻害作用を有する化合物である。チオールプロテアーゼには、カテプシンＬやＢあるいはカルパインが含まれる。従って、本発明のエポキシコハク酸誘導体およびその生理学的に許容できる塩は、これらのプロテアーゼが関与する疾患に対して、薬理作用が期待できる。
カテプシンＬが関与する疾患には、従来の技術で述べたように、骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症や骨ページェット病のような骨疾患が含まれる。従って、本発明のエポキシコハク酸誘導体およびその生理学的に許容できる塩は、これらの骨疾患の予防薬あるいは治療薬として有用である。
【００２０】
カテプシンＬが関節軟骨を構成するコラーゲンのII型、IX型およびXI型を中性領域で分解することが報告されている（FEBS Lett. 269, 189-193(1990））。従って、本発明のエポキシコハク酸誘導体およびその生理学的に許容できる塩は、カテプシンＬ活性の異常亢進を伴う骨疾患である骨関節炎症あるいはリウマチ性関節炎に対しても有効であることが期待できる（特開平５−１７８７５７号公報参照）。
本発明のエポキシコハク酸誘導体はカテプシンＢ阻害剤としても優れた作用を示す。
すなわち、カテプシンＢなどの、カテプシンＬ以外のチオールプロテアーゼが関与する疾患としては、筋ジストロフィーや筋萎縮症（カテプシンＢ、カルパインが関与）、アルツハイマー病（カルパインが関与）、神経細胞の脱髄によって起こるとされる疾患、例えば多発性硬化症や末端神経のニューロパシー（カルパインが関与）、白内障（カルパインが関与）、アレルギー疾患（チオールプロテアーゼが関与）、劇症肝炎（カルパインが関与）、乳癌、前立腺癌や前立腺肥大症（カルパインが関与）、癌の増殖や転移（カテプシンＢ、カルパインが関与）あるいは血小板の凝集（カルパインが関与）がある（特開平６−２３９８３５号参照）ところから、本発明のエポキシコハク酸誘導体は、これらの疾患の治療剤および予防薬として有効であると考えられる。
【００２１】
本発明のエポキシコハク酸誘導体およびその生理学的に許容できる塩は、以上の疾患の予防薬あるいは治療薬としても有用であることが期待できる。特に、骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症や骨ページェット病のような骨疾患の予防または治療薬として有用である。
本発明のエポキシコハク酸誘導体の投与方法は、経口投与でも非経口投与でもよい。経口投与剤の剤型としては、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤およびシロップ剤が挙げられる。非経口投与の方法としては、粘膜投与、体表投与、血管投与および組織内投与がある。粘膜投与の場合は、点眼剤、吸入剤、噴霧剤あるいは座剤として使用する。体表投与の場合は、軟膏剤として使用する。血管投与および組織内投与の場合は、注射剤として使用する。
上記経口投与剤の製造は、通常の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、色素や希釈剤を用いて行なうことができる。賦形剤としては、ブドウ糖や乳糖が一般に使用される。崩壊剤の例には、澱粉およびカルボキシメチルセルロースカルシウムが含まれる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクが挙げられる。結合剤としては、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンおよびポリビニルアルコールが用いられる。
非経口投与製剤も通常の方法で製造できる。例えば、注射剤の場合、通常の注射用蒸留水、生理食塩水あるいはリンゲル液を用いればよい。
本発明のエポキシコハク酸誘導体の投与量は、通常成人において、注射剤で一日０．０１乃至１００ｍｇ、経口投与で一日０．１乃至１ｇである。もちろん、投与量は、年齢、人種、症状などに応じて増減する。
【００２２】
【実施例】
実施例１
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボン酸エチル（化合物例２）
（２Ｓ，３Ｓ）−３−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボン酸（８．０１ｇ，５０．０ミリモル) の酢酸エチル（１２０ｍＬ）溶液にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（５．７６ｇ，５０．０ミリモル) 、続いて氷冷下にＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０．３ｇ，５０．０ミリモル) を加えた。５℃で１時間攪拌した後、アミノジフェニルメタン（９．１７ｇ，５０．０ミリモル) の酢酸エチル（３０ｍＬ）溶液を滴下し、５℃で１時間、室温で１時間攪拌した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルウレア（DC-Urea ）を濾別し、濾液を１Ｎ塩酸、飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、残留物を酢酸エチル／ｎ−ヘキサンから再結晶して、標題化合物を白色結晶として得た（１．２５ｇ，収率７７％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
３．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
４．２〜４．３（２Ｈ，ｍ）
６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
６．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
７．１〜７．４（１０Ｈ，ｍ）
【００２３】
実施例２
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボン酸（化合物例１）
実施例１で得た（２Ｓ，３Ｓ）−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボン酸エチル（５．５０ｇ，１６．９ミリモル) をエタノール（３００ｍＬ）に溶解させ、氷冷下にて０．５Ｎ水酸化ナトリウム／エタノール溶液（４０．４ｍＬ，２０．２ミリモル）を加え、室温で３時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、水（３００ｍＬ）を加えた後、エーテル（１００×２）で洗浄した。水層に２Ｎ塩酸を加えてｐＨを１〜２とし、酢酸エチル（１００×３）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で留去し白色結晶性粉末として標題化合物を得た（４．７６ｇ，収率９５％）
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3 ＯＤ）δ
３．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
６．２３（１Ｈ，ｓ）
７．２〜７．４（１０Ｈ，ｍ）
【００２４】
実施例３
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボン酸ナトリウム（化合物例１のナトリウム塩）
実施例２で得た化合物（１００ｍｇ，０．３３６ミリモル) を酢酸エチル（１０ｍＬ) に溶解し、炭酸水素ナトリウム（２８．２ｍｇ，０．３３６ミリモル) の水（１０ｍＬ) 溶液を加え、激しく振盪した。水層を分取し、減圧下で濃縮乾固して、標題化合物を白色粉末として得た（１０６ｍｇ，収率９９％）
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）δ
３．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
６．１５（１Ｈ，ｓ）
７．３〜７．５（１０Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ-1：
３４１２，３２１９，３０６４，３０３０，１６７０，１６３２，１５５２，１４９５，１４５４，１４４８，１３９８，１３１７，１２８５，１２４８，１０９３，１０８６，１０５１，１０３０，１００７，９６０，８９９，８６２，７８３，７５８，７４２，６９８，６７７，６４２，６０２，５７１，４８２
【００２５】
実施例４
（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−エチル−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボキサミド（化合物例１２）
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボン酸（１．８６．０５ミリモル) とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（６９６ｍｇ，６．０５ミリモル) の塩化メチレン（１０ｍＬ) 溶液に、氷冷下Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．２５ｇ，６．０５ミリモル）の塩化メチレン（７ｍＬ) 溶液を加えた。室温３０分攪拌した後、エチルアミン塩酸塩（４９３ｍｇ，６．０５ミリモル) とトリエチルアミン（０．８４ｍＬ，６．０５ミリモル) の塩化メチレン（７ｍＬ) 溶液を氷冷下で加えた。５℃で一晩攪拌後、溶媒を減圧留去して、酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルウレア（DC-Urea ）を濾別した。溶液を、水、０．５Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１／０〜５０／１）を用いて精製し、白色結晶性粉末として標題化合物を得た（９２８ｍｇ，収率４７％）。
ｍ．ｐ．：１９０．０〜１９５．０（分解）
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
１．１４（３Ｈ，ｔ）
３．３０（２Ｈ，ｄｑ）
３．５１（１Ｈ，ｄ）
３．５５（１Ｈ，ｄ）
５．９５（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）
６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
６．５９（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
７．１〜７．４（１０Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ-1：
３２９０，３０８８，３０６４，３０３０，２９８０，２９３３，２７７３，１６５３，１５５１，１４９５，１４５２，１４４６，１３７１，１３５４，１２７９，１２４０，１１５３，１０９２，１０５３，１０３０，９９９，９６０，８９１，８６４，８６２，８４７，８０８，７５４，６９６，６４８，５９８，８７１，８３６，４７８
【００２６】
実施例５
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［４−メチル−１−（３−メチルブチル）ペンチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸エチル（化合物例１０）
（２Ｓ，３Ｓ）−３−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボン酸カリウム（１．９８ｇ，１０．０ミリモル) をベンゼン（４０ｍＬ）に懸濁させ、ベンゼン（１３ｍＬ）を常圧で留去して水分除去した。室温まで冷却した後、攪拌下に塩化チオニル（０．８８ｍＬ，１２．０ミリモル) を滴下し、２．５時間加熱還流し、出発物質の酸クロリド溶液を得た。
４−メチル−１−（３−メチルブチル）ペンチルアミン（２．０６ｇ，１２．０ミリモル) とトリエチルアミン（１．６７ｍＬ，１２．０ミリモル) を乾燥ベンゼン（１０ｍＬ）に溶解させて氷冷下、先の酸クロリド溶液を滴下し、室温で３時間攪拌した。水（３０ｍＬ）を加え、有機層を分取し、１０％クエン酸水溶液、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で精製して黄色油状物として標題化合物を得た（１．４０ｇ，収率４５％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
０．８〜１．０（１２Ｈ，ｍ）
１．１〜１．４（６Ｈ，ｍ）
１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
１．４〜１．６（４Ｈ，ｍ）
３．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．８３（１Ｈ，ｍ）
４．２〜４．３（２Ｈ，ｍ）
５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）
【００２７】
実施例６
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［４−メチル−１−（３−メチルブチル）ペンチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸（化合物例９）
実施例５で得た化合物（１．４０ｇ，４．４７ミリモル) 及び０．５Ｎ水酸化カリウム／エタノール溶液（１０．７ｍＬ，５．３５モル）を用いて、実施例２と同様に反応及び処理を行なって、淡黄色アモルファス体として標題化合物を得た（１．１５ｇ，収率９０％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
０．８〜０．９（１２Ｈ，ｍ）
１．０〜１．４（６Ｈ，ｍ）
１．４〜１．６（４Ｈ，ｍ）
３．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．８４（１Ｈ，ｍ）
６．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）
【００２８】
実施例７
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［４−メチル−１−（３−メチルブチル）ペンチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸ナトリウム（化合物例９のナトリウム塩）
実施例６で得た化合物（１１１ｍｇ，０．３８９ミリモル) 及び炭酸水素ナトリウム（３２．７ｍｇ，０．３８９ミリモル) を用いて、実施例３と同様に反応及び処理して、淡黄色粉末として標題化合物を得た（収率７５％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）δ
０．８〜１．０（１２Ｈ，ｍ）
１．１〜１．３（４Ｈ，ｍ）
１．４〜１．７（６Ｈ，ｍ）
３．４２（１Ｈ，ｓ）
３．５１（１Ｈ，ｓ）
３．７５（１Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ-1：
３４１７，３２５３，３０９３，２９５４，２８７０，１６６０，１５６０，１４６８，１４３５，１３９８，１３６７，１３１７，１２５５，１２２３，１１７１，９６２，８９５，８５２，７９５，７４４，７１２，６７９，４８２
【００２９】
実施例８
（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（３−メチル−１−フェニルブチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸エチル（化合物例２１）
（２Ｒ，３Ｒ）−３−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボン酸カリウム（３．９７ｇ，２０．０ミリモル) 、塩化チオニル（２．８６ｇ，２４．０ミリモル) 、３−メチル−１−フェニルブチルアミン（４．２５ｇ，２６．０ミリモル) 及びトリエチルアミン（２．６３ｇ，２６．０ミリモル) を用いて、実施例５と同様に反応及び処理を行なって、無色粘稠油状物として標題化合物を得た（５．８６ｇ，収率９６％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
０．９２（１．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
０．９３（１．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
０．９４（１．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
０．９５（１．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
１．２５（１．５Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
１．３１（１．５Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
１．４〜１．７（３Ｈ，ｍ）
３．３３（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．４７（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．６５（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．６８（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
４．２〜４．３（２Ｈ，ｍ）
５．０２（１Ｈ，ｍ）
６．２１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
７．２〜７．４（５Ｈ，ｍ）
【００３０】
実施例９
（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（３−メチル−１−フェニルブチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸（化合物例１９）
実施例８で得た化合物（２．１３ｇ，６．９８ミリモル) 及び０．５Ｎ水酸化カルウム／エタノール溶液（１８ｍＬ，９．０ミリモル) を用いて、実施例２と同様に反応及び処理を行なって、白色アモルファス体として、標題化合物を得た（１．７８ｇ，収率９２％）
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
０．８〜１．０（６Ｈ，ｍ）
１．４〜１．８（３Ｈ，ｍ）
３．３４（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．４７（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
３．６７（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．７１（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
５．００（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８，８Ｈｚ）
６．６３（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝Ｈｚ）
６．６６（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
７．１〜７．４（５Ｈ，ｍ）
８．１９（１Ｈ，ｂｒｓ）
【００３１】
実施例１０
（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（３−メチル−１−フェニルブチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸ナトリウム（化合物例１９のナトリウム塩）
実施例９で得た化合物（１．７０ｇ，６．１８ミリモル) 及び炭酸水素ナトリウム（５１５ｍｇ，６．１３ミリモル) を用いて、実施例３と同様に反応及び処理して、微黄色粉末として標題化合物を得た（１．７６ｇ，収率９６％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）δ
０．９〜１．０（６Ｈ，ｍ）
１．５〜１．８（３Ｈ，ｍ）
３．４１（１Ｈ，ｍ）
３．５５（１Ｈ，ｍ）
４．９３（１Ｈ，ｍ)
７．３〜７．５（５Ｈ，ｍ）
【００３２】
実施例１１
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［（α−ベンジルフェネチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸エチル
（２Ｓ，３Ｓ）−３−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボン酸（１．０１ｇ，６．３１ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（７２６ｍｇ，６．３１ミリモル）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．３０ｇ，６．３１ミリモル）、およびα−ベンジルフェネチルアミン（１．４３ｇ，６．３１ミリモル）を用いて、実施例１と同様に反応と処理とを行ない、得られた生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝５０／１）で精製することにより、淡黄色油状物として標題化合物を得た（２．２２ｇ，定量的収率）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
１．３０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
２．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，１４Ｈｚ）
２．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
２．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
２．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６，１４Ｈｚ）
３．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
４．２〜４．３（２Ｈ，ｍ）
４．４２（１Ｈ，ｍ）
５．７８（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）
７．１〜７．３（１０Ｈ，ｍ）
【００３３】
実施例１２
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［（α−ベンジルフェネチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸
上記の実施例１１で得た化合物（２．２２ｇ，６．２８ミリモル）および０．５Ｎ水酸化カリウム／エタノール溶液（１５．１ｍＬ，７．５５ミリモル）とを用いて、実施例２と同様に反応と処理とを行ない、白色アモルファス体として標題化合物を得た（１．７８ｇ，収率８７％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）δ
２．６〜２．８（２Ｈ，ｍ）
２．８９（１Ｈ，ｓ）
３．０〜３．１（２Ｈ，ｍ）
３．２２（１Ｈ，ｓ）
４．３３（１Ｈ，ｍ）
７．２〜７．４（１０Ｈ，ｍ）
【００３４】
実施例１３
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［（α−ベンジルフェネチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸のナトリウム塩
上記の実施例１２で得た化合物（１．７８ｇ，５．４７ミリモル）および炭酸水素ナトリウム（４６０ｍｇ，５．４７ミリモル）とを用いて、実施例３と同様に反応と処理とを行ない、白色粉末として標題化合物を得た（１．７７ｇ，収率９３％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）δ
２．７〜２．８（２Ｈ，ｍ）
２．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．０〜３．１（２Ｈ，ｍ）
３．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
４．３４（１Ｈ，ｍ）
７．２〜７．４（１０Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ-1：
３３９８，３２４６，３０８９，３０２６，２９５６，２９２７，２８６０，１６６８，１６２６，１５６６，１４９７，１４５４，１３９６，１３１１，１２５９，１２１５，１１１９，１０８４，１０２８，９８２，９５７，８９７，８６４，８４７，７９８，７４６，６９８，６７７，６０７，５１９，４９２
【００３５】
実施例１４
骨吸収抑制作用
生後６〜７日齢のＩＣＲマウスから頭蓋冠を無菌的に採取し、結合組織を取り除いた後、頭蓋冠を正中線に沿って半分に切断した。一対の骨あたり１ｍＬの培養液(modified BGjbメディウム、５％非働化ウシ胎児血清を含有）中で２４時間前培養（５％ＣＯ2 、３７℃）を行なった。前培養後に、骨の一片ずつを種々の濃度の被検化合物を含む上記培養液０．５ｍＬに入れ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）３×１０-7Ｍの存在下にて７２時間培養した。また、被検化合物及びＰＴＨ非存在下で培養したものをコントロールとした。
培養終了後、７２時間の間に培養上清中に遊離したカルシウム量、および骨中（６Ｎ塩酸１ｍＬにて溶解）のカルシウム量をオルトクレゾールフタレインコンプレキソン（ＯＣＰＣ）法を用いて測定した。
まず、カルシウム遊離率（％）を次式に従って求めた。
【００３６】
【数１】
遊離率（％）＝［培養液中に遊離されたＣａ量］／［培養液中に遊離されたＣａ量＋骨中のＣａ量］×１００
【００３７】
次に、被検化合物による骨吸収抑制率（％）を次式に従って求めた。
【００３８】
【数２】
抑制率（％）＝［１−（ＰＴＨ、薬物存在下での遊離率−コントロ−ルの遊離率）／（ＰＴＨ存在下での遊離率−コントロールの遊離率）］×１００
【００３９】
上記のそれぞれの結果は、後に示す第２表にまとめて示す。
【００４０】
実施例１５
カテプシンＬ阻害作用
（１）ラット肝臓リソソーム分画の調製
ウイスター系雄性ラットを脱血致死させ、門脈より氷冷した生理食塩水を注入して還流後、肝臓を摘出した。以下の操作は４℃で行なった。はさみで細切後、５ｇを量りとり、９倍量の０．２５Ｍスクロース液を加えてホモジナイズ（ポッター型テフロンホモジナイザー）した。ホモジネートを８００×ｇで１０分間遠心分離して得た上清を、さらに１２０００×ｇで２０分間遠心分離した。得られた沈澱に０．２５Ｍスクロース液２５ｍＬを加えてホモジナイズした後、１２０００×ｇで２０分間遠心分離した。得られた沈澱に０．２５Ｍスクロース液１０ｍＬを加えてホモジナイズしたものをリソソーム分画とした。次いで、この分画を０．３３％トリトンＸ−１００を含む０．２５Ｍスクロース液で希釈してカテプシンＬ活性の測定に供した。
（２）カテプシンＬ活性の測定
３４０ｍＭ酢酸ナトリウム、６０mM酢酸、４mMＥＤＴＡ及び８ｍＭジチオスレイトールを含む溶液（ｐＨ：５．５）０．２５ｍＬに、リソソーム分画０．１ｍＬ、被検化合物溶液５μＬおよび蒸留水０．５４５ｍＬを加えて３０℃で１５分間プレインキュベートした後、基質として５０μＭカルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド(Z-Phe-Arg-MCA) 溶液０．１ｍＬを加えて反応を開始した。３０℃で２０分間反応させた後、１００ｍＭモノクロル酢酸ナトリウム、３０mM酢酸ナトリウムおよび７０ｍＭ酢酸を含む溶液（ｐＨ：４．３）１ｍＬを加えて反応を停止させた。最終溶液の蛍光強度を励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。
なお、Z-Phe-Arg-MCA は、リソソーム分画に含まれるカテプシンＢによっても分解されるため、カテプシンＢ特異的阻害剤であるＣＡ−０７４［村田他、FEBS Lett. 280, 307-310(1991) ］を反応溶液に１０-7Ｍ添加してカテプシンＢを完全に阻害した条件下で測定を行なった。
以上の実施例１４および１５の結果を下記第２表に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
【化６】
【００４３】
【化７】
【００４４】
以上のように、本発明のエポキシコハク酸誘導体は、特公昭６１−５５５０９号公報記載の比較化合物ＸおよびＹ（同公報１４頁の実施例６１および６２）に比べ、骨吸収抑制作用が優れていることが明らかになった。
【００４５】
実施例１６
カテプシンＢ阻害作用
３５２ｍＭのＫＨ2 ＰＯ4 、４８ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 、５．３２ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａおよび１０ｍＭのＬ−システインを含む溶液（ｐＨ６．０）０．２５ｍＬにリソソーム分画０．１ｍＬ、被検薬物５μＬおよび蒸留水０．５４５ｍＬを加えて、３０℃で１５分間プレインキュベ−ションした後、基質として、５０μＭのカルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド（Z-Arg-Arg-MCA)溶液０．１ｍＬを加えて反応を開始させた。３０℃で２０分間反応させた後、その反応液に１００ｍＭのモノクロル酢酸ナトリウム、３０ｍＭの酢酸ナトリウム及び７０ｍＭの酢酸を含む水溶液（ｐＨ４．３）１ｍＬを加えて、反応を停止させた。最終容量の蛍光強度を励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。その結果を下記の第３表に記す。
【００４６】
【表３】
【００４７】
以上の結果から、本発明のエポキシコハク酸誘導体がカテプシンＬ阻害作用に加えて、カテプシンＢ阻害作用を有することが分る。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なエポキシコハク酸誘導体およびそれを用いた骨疾患の治療薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
骨組織は破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成を繰り返しており、このバランスの上に骨の構造および量が保持されている。しかし、骨吸収が優位な状態になると骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症、骨ページェット病などの骨疾患を発症する。
【０００３】
破骨細胞による骨吸収は、ミネラルの溶解（脱灰）と骨基質の分解のステップに分けることができ、骨基質の分解はリソソーム酵素により起こると考えられている。最近の研究では、リソソーム酵素の中で中心的に働いているものはシステインプロテアーゼであるカテプシンＬや、カテプシンＬ類似の酵素であるといわれている（掛川、勝沼、Molecular Medicine, 30(10), 1310-1318(1993) および手塚ほか、J. Biol. Chem., 269, 1106-1109(1994)）。また、システインプロテアーゼ阻害剤が骨吸収を抑制することが報告されている（J.M. Delaisse ほか、 Biochem. Biophys., Res. Commun., 125, 441-447(1984)）。そこで、カテプシンＬをはじめとするシステインプロテアーゼを阻害する化合物は、骨粗鬆症などの骨疾患の治療に有望であると考えられている。
【０００４】
例えば、いくつかのエポキシコハク酸誘導体を骨疾患の治療に用いることが既に提案されている（特開昭６３−２８４１２７号、特開平２−２１８６１０号各公報）。しかしながら、システインプロテアーゼ阻害剤を臨床的に使用した例はなく、その研究は緒に就いたばかりである。
特公昭６１−５５５０９号公報は、チオール基がその活性の発現に関与する蛋白分解酵素の阻害剤として、エポキシコハク酸誘導体（エポキシスクシナム酸化合物）を開示している。しかしながら、オキシラン環に結合しているＮ−置換カルバモイル基の窒素原子に隣接する炭素原子が分岐している化合物、、例えば、ジフェニルメチルカルバモイル、（３−メチル−１−フェニルブチル）カルバモイル等は開示されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症、骨ページェット病等の骨疾患の予防または治療に有用な化合物および薬剤を提供することである。
本発明の目的はまた、カテプシンＬ活性の異常亢進を伴なう骨関節炎やリウマチ性関節炎の治療に有用な化合物および薬剤を提供することにもある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題の解決のために鋭意研究した結果、下記式（以後、式（Ｉ）ということもある）で表わされる右側のアミドの置換基が分岐していることを特徴的構成とするエポキシコハク酸誘導体またはその塩が、前記の特公昭６１−５５５０９号公報に開示されているエポキシコハク酸誘導体と比べて更に強力な骨吸収抑制作用を示し、骨疾患の予防または治療に有用であることを見出し発明を完成した。なお、特公昭６１−５５５０９号公報記載の化合物の作用は、後述する実施例の比較実験における比較化合物ＸおよびＹの作用で代表される。
【０００７】
【化３】
（式（Ｉ）において、Ｒ1 は、水素原子、炭素原子数が１〜３０のアルキル基、炭素原子数が６〜４０のアリール基、または炭素原子数が７〜４０のアラルキル基であり；Ｒ2 およびＲ3 は、それぞれ独立に、炭素原子数が６〜４０のアリール基、炭素原子数が７〜２０のアラルキル基または炭素原子数が３〜１０のアルキル基であり；Ｘは、−Ｏ−、または−ＮＲ4 −であり；Ｒ4 は、水素原子、炭素原子数が１〜１０のアルキル基または炭素原子数が７〜２０のアラルキル基である。）
【０００９】
【発明の実施の形態】
式（Ｉ）で表わされるエポキシコハク酸誘導体について説明する。
【００１０】
【化４】
式（Ｉ）において、Ｒ1 は、水素原子、アルキル基、アリール基またはアラルキル基であり、なかでも水素原子、アルキル基またはアラルキル基が好ましい。これらのアルキル基、アリール基またはアラルキル基は、いずれも置換基（例、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、炭素原子数１〜１０のアルキル基、炭素原子数１〜１０のアルコキシ基、炭素原子数６〜２０のアリール基）を有していてもよい。
アルキル基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、１乃至３０であることが好ましく、１乃至１５であることがさらに好ましく、１乃至６であることが最も好ましい。アルキル基は鎖状構造のものでも、あるい環状構造を有するものでもよい。鎖状アルキル基は、分岐を有していてもよい。
アリール基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、６乃至４０であることが好ましく、６乃至３０であることがさらに好ましく、６乃至２０であることが最も好ましい。アリール基の例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。
アラルキル基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、７乃至４０であることが好ましく、７乃至３０であることがさらに好ましく、７乃至２０であることが最も好ましい。アラルキル基の例には、ベンジル、フェネチルおよびジフェニルメチルが含まれる。
【００１２】
式（Ｉ）において、Ｒ2 及びＲ3 は、それぞれ独立に、アリール基、アラルキル基または炭素原子数が３乃至１０のアルキル基である。これらのアルキル基、アリール基またはアラルキル基は、いずれも置換基（例、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、炭素原子数１〜１０のアルキル基、炭素原子数１〜１０のアルコキシ基、炭素原子数６〜２０のアリール基）を有していてもよい。
アリール基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、６乃至４０であることが好ましく、６乃至３０であることがさらに好ましく、６乃至２０であることが最も好ましい。アリール基の例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。
アルキル基の炭素原子数（３乃至１０）は、置換基を含めた総炭素原子数を意味する。アルキル基の炭素原子数は、３乃至６であることが好ましい。アルキル基は鎖状であってもよく、環状構造を有してよい。鎖状アルキル基は、分岐を有していてもよい。
アラルキル基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、７乃至２０であることが好ましく、７乃至１５であることがさらに好ましく、７乃至１０であることが最も好ましい。アラルキル基の例には、ベンジルおよびフェネチルが含まれる。
【００１３】
式（Ｉ）において、Ｘは、−Ｏ−または−ＮＲ4 −である。そしてＲ4 は、水素原子、アルキル基またはアラルキル基であり、水素原子およびアルキル基が好ましく、水素原子が特に好ましい。これらのアルキル基およびアラルキル基は、前記のものと同様な置換基を有してもよい。
Ｒ4 のアルキルの炭素原子数（置換基を有する場合、置換基を含めた総炭素原子数）は、１乃至１０であることが好ましく、１乃至６であることがさらに好ましく、１乃至４であることが最も好ましい。鎖状アルキルが好ましい。鎖状アルキルは分岐を有していてもよい。
Ｒ4 のアラルキル基の炭素原子数（置換基を有する場合には、置換基を含めた総炭素原子数）は、７乃至２０であることが好ましく、７乃至１５であることがさらに好ましく、７乃至１０であることが最も好ましい。このアラルキル基の例には、ベンジルおよびフェネチルが含まれる。
【００１４】
前記式（Ｉ）に示すオキシラン環の二つの炭素は、共に不斉炭素原子である。式（Ｉ）は、オキシラン環に結合した二つのカルボニル基がトランス型であることを示す。すなわち、本発明のエポキシコハク酸誘導体は、下記の（Ｔ１）または（Ｔ２）に示される光学異性体のいずれかのもの、あるいはこれらの混合物である。
【００１５】
【化５】
本発明のエポキシコハク酸誘導体の具体例を、下記第１表に示す。第１表におけるＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＸは、式（Ｉ）に示す各基に相当する。
【００１７】
【表１】
本発明のエポキシコハク酸誘導体は、塩として用いてもよい。Ｒ1 が水素原子でＸが−Ｏ−の場合は、オキシラン環のカルボニルと共にカルボキシル基を形成し、これが塩基と塩を形成してもよい。塩基のカチオンの例としては、アルカリ金属イオン（例、ナトリウム、カリウム）およびアルカリ土類金属イオン（例、カルシウム）を挙げることができる。
本発明のエポキシコハク酸誘導体は、特公昭６１−５５５０９号公報および特開昭５２−３１０２４号各公報に記載の合成方法に類似する方法、あるいは後述する実施例１〜１０に記載の合成方法およびそれに類似する方法に従い、容易に合成することができる。
【００１９】
次に本発明のエポキシコハク酸誘導体の薬理作用について説明する。
本発明のエポキシコハク酸誘導体は、チオールプロテアーゼ阻害作用を有する化合物である。チオールプロテアーゼには、カテプシンＬやＢあるいはカルパインが含まれる。従って、本発明のエポキシコハク酸誘導体およびその生理学的に許容できる塩は、これらのプロテアーゼが関与する疾患に対して、薬理作用が期待できる。
カテプシンＬが関与する疾患には、従来の技術で述べたように、骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症や骨ページェット病のような骨疾患が含まれる。従って、本発明のエポキシコハク酸誘導体およびその生理学的に許容できる塩は、これらの骨疾患の予防薬あるいは治療薬として有用である。
【００２０】
カテプシンＬが関節軟骨を構成するコラーゲンのII型、IX型およびXI型を中性領域で分解することが報告されている（FEBS Lett. 269, 189-193(1990））。従って、本発明のエポキシコハク酸誘導体およびその生理学的に許容できる塩は、カテプシンＬ活性の異常亢進を伴う骨疾患である骨関節炎症あるいはリウマチ性関節炎に対しても有効であることが期待できる（特開平５−１７８７５７号公報参照）。
本発明のエポキシコハク酸誘導体はカテプシンＢ阻害剤としても優れた作用を示す。
すなわち、カテプシンＢなどの、カテプシンＬ以外のチオールプロテアーゼが関与する疾患としては、筋ジストロフィーや筋萎縮症（カテプシンＢ、カルパインが関与）、アルツハイマー病（カルパインが関与）、神経細胞の脱髄によって起こるとされる疾患、例えば多発性硬化症や末端神経のニューロパシー（カルパインが関与）、白内障（カルパインが関与）、アレルギー疾患（チオールプロテアーゼが関与）、劇症肝炎（カルパインが関与）、乳癌、前立腺癌や前立腺肥大症（カルパインが関与）、癌の増殖や転移（カテプシンＢ、カルパインが関与）あるいは血小板の凝集（カルパインが関与）がある（特開平６−２３９８３５号参照）ところから、本発明のエポキシコハク酸誘導体は、これらの疾患の治療剤および予防薬として有効であると考えられる。
【００２１】
本発明のエポキシコハク酸誘導体およびその生理学的に許容できる塩は、以上の疾患の予防薬あるいは治療薬としても有用であることが期待できる。特に、骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症や骨ページェット病のような骨疾患の予防または治療薬として有用である。
本発明のエポキシコハク酸誘導体の投与方法は、経口投与でも非経口投与でもよい。経口投与剤の剤型としては、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤およびシロップ剤が挙げられる。非経口投与の方法としては、粘膜投与、体表投与、血管投与および組織内投与がある。粘膜投与の場合は、点眼剤、吸入剤、噴霧剤あるいは座剤として使用する。体表投与の場合は、軟膏剤として使用する。血管投与および組織内投与の場合は、注射剤として使用する。
上記経口投与剤の製造は、通常の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、色素や希釈剤を用いて行なうことができる。賦形剤としては、ブドウ糖や乳糖が一般に使用される。崩壊剤の例には、澱粉およびカルボキシメチルセルロースカルシウムが含まれる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクが挙げられる。結合剤としては、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンおよびポリビニルアルコールが用いられる。
非経口投与製剤も通常の方法で製造できる。例えば、注射剤の場合、通常の注射用蒸留水、生理食塩水あるいはリンゲル液を用いればよい。
本発明のエポキシコハク酸誘導体の投与量は、通常成人において、注射剤で一日０．０１乃至１００ｍｇ、経口投与で一日０．１乃至１ｇである。もちろん、投与量は、年齢、人種、症状などに応じて増減する。
【００２２】
【実施例】
実施例１
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボン酸エチル（化合物例２）
（２Ｓ，３Ｓ）−３−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボン酸（８．０１ｇ，５０．０ミリモル) の酢酸エチル（１２０ｍＬ）溶液にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（５．７６ｇ，５０．０ミリモル) 、続いて氷冷下にＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０．３ｇ，５０．０ミリモル) を加えた。５℃で１時間攪拌した後、アミノジフェニルメタン（９．１７ｇ，５０．０ミリモル) の酢酸エチル（３０ｍＬ）溶液を滴下し、５℃で１時間、室温で１時間攪拌した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルウレア（DC-Urea ）を濾別し、濾液を１Ｎ塩酸、飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、残留物を酢酸エチル／ｎ−ヘキサンから再結晶して、標題化合物を白色結晶として得た（１．２５ｇ，収率７７％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
３．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
４．２〜４．３（２Ｈ，ｍ）
６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
６．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
７．１〜７．４（１０Ｈ，ｍ）
【００２３】
実施例２
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボン酸（化合物例１）
実施例１で得た（２Ｓ，３Ｓ）−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボン酸エチル（５．５０ｇ，１６．９ミリモル) をエタノール（３００ｍＬ）に溶解させ、氷冷下にて０．５Ｎ水酸化ナトリウム／エタノール溶液（４０．４ｍＬ，２０．２ミリモル）を加え、室温で３時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、水（３００ｍＬ）を加えた後、エーテル（１００×２）で洗浄した。水層に２Ｎ塩酸を加えてｐＨを１〜２とし、酢酸エチル（１００×３）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で留去し白色結晶性粉末として標題化合物を得た（４．７６ｇ，収率９５％）
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3 ＯＤ）δ
３．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
６．２３（１Ｈ，ｓ）
７．２〜７．４（１０Ｈ，ｍ）
【００２４】
実施例３
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボン酸ナトリウム（化合物例１のナトリウム塩）
実施例２で得た化合物（１００ｍｇ，０．３３６ミリモル) を酢酸エチル（１０ｍＬ) に溶解し、炭酸水素ナトリウム（２８．２ｍｇ，０．３３６ミリモル) の水（１０ｍＬ) 溶液を加え、激しく振盪した。水層を分取し、減圧下で濃縮乾固して、標題化合物を白色粉末として得た（１０６ｍｇ，収率９９％）
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）δ
３．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
６．１５（１Ｈ，ｓ）
７．３〜７．５（１０Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ-1：
３４１２，３２１９，３０６４，３０３０，１６７０，１６３２，１５５２，１４９５，１４５４，１４４８，１３９８，１３１７，１２８５，１２４８，１０９３，１０８６，１０５１，１０３０，１００７，９６０，８９９，８６２，７８３，７５８，７４２，６９８，６７７，６４２，６０２，５７１，４８２
【００２５】
実施例４
（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−エチル−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボキサミド（化合物例１２）
（２Ｓ，３Ｓ）−３−ジフェニルメチルカルバモイルオキシラン−２−カルボン酸（１．８６．０５ミリモル) とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（６９６ｍｇ，６．０５ミリモル) の塩化メチレン（１０ｍＬ) 溶液に、氷冷下Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．２５ｇ，６．０５ミリモル）の塩化メチレン（７ｍＬ) 溶液を加えた。室温３０分攪拌した後、エチルアミン塩酸塩（４９３ｍｇ，６．０５ミリモル) とトリエチルアミン（０．８４ｍＬ，６．０５ミリモル) の塩化メチレン（７ｍＬ) 溶液を氷冷下で加えた。５℃で一晩攪拌後、溶媒を減圧留去して、酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルウレア（DC-Urea ）を濾別した。溶液を、水、０．５Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１／０〜５０／１）を用いて精製し、白色結晶性粉末として標題化合物を得た（９２８ｍｇ，収率４７％）。
ｍ．ｐ．：１９０．０〜１９５．０（分解）
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
１．１４（３Ｈ，ｔ）
３．３０（２Ｈ，ｄｑ）
３．５１（１Ｈ，ｄ）
３．５５（１Ｈ，ｄ）
５．９５（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）
６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
６．５９（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
７．１〜７．４（１０Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ-1：
３２９０，３０８８，３０６４，３０３０，２９８０，２９３３，２７７３，１６５３，１５５１，１４９５，１４５２，１４４６，１３７１，１３５４，１２７９，１２４０，１１５３，１０９２，１０５３，１０３０，９９９，９６０，８９１，８６４，８６２，８４７，８０８，７５４，６９６，６４８，５９８，８７１，８３６，４７８
【００２６】
実施例５
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［４−メチル−１−（３−メチルブチル）ペンチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸エチル（化合物例１０）
（２Ｓ，３Ｓ）−３−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボン酸カリウム（１．９８ｇ，１０．０ミリモル) をベンゼン（４０ｍＬ）に懸濁させ、ベンゼン（１３ｍＬ）を常圧で留去して水分除去した。室温まで冷却した後、攪拌下に塩化チオニル（０．８８ｍＬ，１２．０ミリモル) を滴下し、２．５時間加熱還流し、出発物質の酸クロリド溶液を得た。
４−メチル−１−（３−メチルブチル）ペンチルアミン（２．０６ｇ，１２．０ミリモル) とトリエチルアミン（１．６７ｍＬ，１２．０ミリモル) を乾燥ベンゼン（１０ｍＬ）に溶解させて氷冷下、先の酸クロリド溶液を滴下し、室温で３時間攪拌した。水（３０ｍＬ）を加え、有機層を分取し、１０％クエン酸水溶液、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で精製して黄色油状物として標題化合物を得た（１．４０ｇ，収率４５％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
０．８〜１．０（１２Ｈ，ｍ）
１．１〜１．４（６Ｈ，ｍ）
１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
１．４〜１．６（４Ｈ，ｍ）
３．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．８３（１Ｈ，ｍ）
４．２〜４．３（２Ｈ，ｍ）
５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）
【００２７】
実施例６
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［４−メチル−１−（３−メチルブチル）ペンチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸（化合物例９）
実施例５で得た化合物（１．４０ｇ，４．４７ミリモル) 及び０．５Ｎ水酸化カリウム／エタノール溶液（１０．７ｍＬ，５．３５モル）を用いて、実施例２と同様に反応及び処理を行なって、淡黄色アモルファス体として標題化合物を得た（１．１５ｇ，収率９０％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
０．８〜０．９（１２Ｈ，ｍ）
１．０〜１．４（６Ｈ，ｍ）
１．４〜１．６（４Ｈ，ｍ）
３．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．８４（１Ｈ，ｍ）
６．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）
【００２８】
実施例７
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［［４−メチル−１−（３−メチルブチル）ペンチル］カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸ナトリウム（化合物例９のナトリウム塩）
実施例６で得た化合物（１１１ｍｇ，０．３８９ミリモル) 及び炭酸水素ナトリウム（３２．７ｍｇ，０．３８９ミリモル) を用いて、実施例３と同様に反応及び処理して、淡黄色粉末として標題化合物を得た（収率７５％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）δ
０．８〜１．０（１２Ｈ，ｍ）
１．１〜１．３（４Ｈ，ｍ）
１．４〜１．７（６Ｈ，ｍ）
３．４２（１Ｈ，ｓ）
３．５１（１Ｈ，ｓ）
３．７５（１Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ-1：
３４１７，３２５３，３０９３，２９５４，２８７０，１６６０，１５６０，１４６８，１４３５，１３９８，１３６７，１３１７，１２５５，１２２３，１１７１，９６２，８９５，８５２，７９５，７４４，７１２，６７９，４８２
【００２９】
実施例８
（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（３−メチル−１−フェニルブチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸エチル（化合物例２１）
（２Ｒ，３Ｒ）−３−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボン酸カリウム（３．９７ｇ，２０．０ミリモル) 、塩化チオニル（２．８６ｇ，２４．０ミリモル) 、３−メチル−１−フェニルブチルアミン（４．２５ｇ，２６．０ミリモル) 及びトリエチルアミン（２．６３ｇ，２６．０ミリモル) を用いて、実施例５と同様に反応及び処理を行なって、無色粘稠油状物として標題化合物を得た（５．８６ｇ，収率９６％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
０．９２（１．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
０．９３（１．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
０．９４（１．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
０．９５（１．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
１．２５（１．５Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
１．３１（１．５Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
１．４〜１．７（３Ｈ，ｍ）
３．３３（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．４７（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．６５（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．６８（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
４．２〜４．３（２Ｈ，ｍ）
５．０２（１Ｈ，ｍ）
６．２１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
７．２〜７．４（５Ｈ，ｍ）
【００３０】
実施例９
（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（３−メチル−１−フェニルブチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸（化合物例１９）
実施例８で得た化合物（２．１３ｇ，６．９８ミリモル) 及び０．５Ｎ水酸化カルウム／エタノール溶液（１８ｍＬ，９．０ミリモル) を用いて、実施例２と同様に反応及び処理を行なって、白色アモルファス体として、標題化合物を得た（１．７８ｇ，収率９２％）
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
０．８〜１．０（６Ｈ，ｍ）
１．４〜１．８（３Ｈ，ｍ）
３．３４（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．４７（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
３．６７（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．７１（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
５．００（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８，８Ｈｚ）
６．６３（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝Ｈｚ）
６．６６（０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）
７．１〜７．４（５Ｈ，ｍ）
８．１９（１Ｈ，ｂｒｓ）
【００３１】
実施例１０
（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（３−メチル−１−フェニルブチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸ナトリウム（化合物例１９のナトリウム塩）
実施例９で得た化合物（１．７０ｇ，６．１８ミリモル) 及び炭酸水素ナトリウム（５１５ｍｇ，６．１３ミリモル) を用いて、実施例３と同様に反応及び処理して、微黄色粉末として標題化合物を得た（１．７６ｇ，収率９６％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）δ
０．９〜１．０（６Ｈ，ｍ）
１．５〜１．８（３Ｈ，ｍ）
３．４１（１Ｈ，ｍ）
３．５５（１Ｈ，ｍ）
４．９３（１Ｈ，ｍ)
７．３〜７．５（５Ｈ，ｍ）
【００３２】
実施例１１
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［（α−ベンジルフェネチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸エチル
（２Ｓ，３Ｓ）−３−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボン酸（１．０１ｇ，６．３１ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（７２６ｍｇ，６．３１ミリモル）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．３０ｇ，６．３１ミリモル）、およびα−ベンジルフェネチルアミン（１．４３ｇ，６．３１ミリモル）を用いて、実施例１と同様に反応と処理とを行ない、得られた生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝５０／１）で精製することにより、淡黄色油状物として標題化合物を得た（２．２２ｇ，定量的収率）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）δ
１．３０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
２．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，１４Ｈｚ）
２．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）
２．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
２．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６，１４Ｈｚ）
３．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
４．２〜４．３（２Ｈ，ｍ）
４．４２（１Ｈ，ｍ）
５．７８（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）
７．１〜７．３（１０Ｈ，ｍ）
【００３３】
実施例１２
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［（α−ベンジルフェネチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸
上記の実施例１１で得た化合物（２．２２ｇ，６．２８ミリモル）および０．５Ｎ水酸化カリウム／エタノール溶液（１５．１ｍＬ，７．５５ミリモル）とを用いて、実施例２と同様に反応と処理とを行ない、白色アモルファス体として標題化合物を得た（１．７８ｇ，収率８７％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）δ
２．６〜２．８（２Ｈ，ｍ）
２．８９（１Ｈ，ｓ）
３．０〜３．１（２Ｈ，ｍ）
３．２２（１Ｈ，ｓ）
４．３３（１Ｈ，ｍ）
７．２〜７．４（１０Ｈ，ｍ）
【００３４】
実施例１３
（２Ｓ，３Ｓ）−３−［（α−ベンジルフェネチル）カルバモイル］オキシラン−２−カルボン酸のナトリウム塩
上記の実施例１２で得た化合物（１．７８ｇ，５．４７ミリモル）および炭酸水素ナトリウム（４６０ｍｇ，５．４７ミリモル）とを用いて、実施例３と同様に反応と処理とを行ない、白色粉末として標題化合物を得た（１．７７ｇ，収率９３％）。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）δ
２．７〜２．８（２Ｈ，ｍ）
２．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
３．０〜３．１（２Ｈ，ｍ）
３．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）
４．３４（１Ｈ，ｍ）
７．２〜７．４（１０Ｈ，ｍ）
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ-1：
３３９８，３２４６，３０８９，３０２６，２９５６，２９２７，２８６０，１６６８，１６２６，１５６６，１４９７，１４５４，１３９６，１３１１，１２５９，１２１５，１１１９，１０８４，１０２８，９８２，９５７，８９７，８６４，８４７，７９８，７４６，６９８，６７７，６０７，５１９，４９２
【００３５】
実施例１４
骨吸収抑制作用
生後６〜７日齢のＩＣＲマウスから頭蓋冠を無菌的に採取し、結合組織を取り除いた後、頭蓋冠を正中線に沿って半分に切断した。一対の骨あたり１ｍＬの培養液(modified BGjbメディウム、５％非働化ウシ胎児血清を含有）中で２４時間前培養（５％ＣＯ2 、３７℃）を行なった。前培養後に、骨の一片ずつを種々の濃度の被検化合物を含む上記培養液０．５ｍＬに入れ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）３×１０-7Ｍの存在下にて７２時間培養した。また、被検化合物及びＰＴＨ非存在下で培養したものをコントロールとした。
培養終了後、７２時間の間に培養上清中に遊離したカルシウム量、および骨中（６Ｎ塩酸１ｍＬにて溶解）のカルシウム量をオルトクレゾールフタレインコンプレキソン（ＯＣＰＣ）法を用いて測定した。
まず、カルシウム遊離率（％）を次式に従って求めた。
【００３６】
【数１】
遊離率（％）＝［培養液中に遊離されたＣａ量］／［培養液中に遊離されたＣａ量＋骨中のＣａ量］×１００
【００３７】
次に、被検化合物による骨吸収抑制率（％）を次式に従って求めた。
【００３８】
【数２】
抑制率（％）＝［１−（ＰＴＨ、薬物存在下での遊離率−コントロ−ルの遊離率）／（ＰＴＨ存在下での遊離率−コントロールの遊離率）］×１００
【００３９】
上記のそれぞれの結果は、後に示す第２表にまとめて示す。
【００４０】
実施例１５
カテプシンＬ阻害作用
（１）ラット肝臓リソソーム分画の調製
ウイスター系雄性ラットを脱血致死させ、門脈より氷冷した生理食塩水を注入して還流後、肝臓を摘出した。以下の操作は４℃で行なった。はさみで細切後、５ｇを量りとり、９倍量の０．２５Ｍスクロース液を加えてホモジナイズ（ポッター型テフロンホモジナイザー）した。ホモジネートを８００×ｇで１０分間遠心分離して得た上清を、さらに１２０００×ｇで２０分間遠心分離した。得られた沈澱に０．２５Ｍスクロース液２５ｍＬを加えてホモジナイズした後、１２０００×ｇで２０分間遠心分離した。得られた沈澱に０．２５Ｍスクロース液１０ｍＬを加えてホモジナイズしたものをリソソーム分画とした。次いで、この分画を０．３３％トリトンＸ−１００を含む０．２５Ｍスクロース液で希釈してカテプシンＬ活性の測定に供した。
（２）カテプシンＬ活性の測定
３４０ｍＭ酢酸ナトリウム、６０mM酢酸、４mMＥＤＴＡ及び８ｍＭジチオスレイトールを含む溶液（ｐＨ：５．５）０．２５ｍＬに、リソソーム分画０．１ｍＬ、被検化合物溶液５μＬおよび蒸留水０．５４５ｍＬを加えて３０℃で１５分間プレインキュベートした後、基質として５０μＭカルボベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド(Z-Phe-Arg-MCA) 溶液０．１ｍＬを加えて反応を開始した。３０℃で２０分間反応させた後、１００ｍＭモノクロル酢酸ナトリウム、３０mM酢酸ナトリウムおよび７０ｍＭ酢酸を含む溶液（ｐＨ：４．３）１ｍＬを加えて反応を停止させた。最終溶液の蛍光強度を励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。
なお、Z-Phe-Arg-MCA は、リソソーム分画に含まれるカテプシンＢによっても分解されるため、カテプシンＢ特異的阻害剤であるＣＡ−０７４［村田他、FEBS Lett. 280, 307-310(1991) ］を反応溶液に１０-7Ｍ添加してカテプシンＢを完全に阻害した条件下で測定を行なった。
以上の実施例１４および１５の結果を下記第２表に示す。
【００４１】
【表２】
【化６】
【化７】
以上のように、本発明のエポキシコハク酸誘導体は、特公昭６１−５５５０９号公報記載の比較化合物ＸおよびＹ（同公報１４頁の実施例６１および６２）に比べ、骨吸収抑制作用が優れていることが明らかになった。
【００４５】
実施例１６
カテプシンＢ阻害作用
３５２ｍＭのＫＨ2 ＰＯ4 、４８ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 、５．３２ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａおよび１０ｍＭのＬ−システインを含む溶液（ｐＨ６．０）０．２５ｍＬにリソソーム分画０．１ｍＬ、被検薬物５μＬおよび蒸留水０．５４５ｍＬを加えて、３０℃で１５分間プレインキュベ−ションした後、基質として、５０μＭのカルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド（Z-Arg-Arg-MCA)溶液０．１ｍＬを加えて反応を開始させた。３０℃で２０分間反応させた後、その反応液に１００ｍＭのモノクロル酢酸ナトリウム、３０ｍＭの酢酸ナトリウム及び７０ｍＭの酢酸を含む水溶液（ｐＨ４．３）１ｍＬを加えて、反応を停止させた。最終容量の蛍光強度を励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。その結果を下記の第３表に記す。
【００４６】
【表３】
以上の結果から、本発明のエポキシコハク酸誘導体がカテプシンＬ阻害作用に加えて、カテプシンＢ阻害作用を有することが分る。
Claims (2)
- 下記式で表わされるエポキシコハク酸誘導体またはその塩：
- 下記式で表わされるエポキシコハク酸誘導体またはその生理学的に許容できる塩からなる、骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症、骨ページェット病、骨関節炎、及びリウマチ性関節炎からなる群より選ばれる骨疾患の治療薬。
Priority Applications (1)
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