JP3896458B2 - 試料の搭載方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料の搭載方法に関し、さらに詳しくはコメットアッセイ法等に好適な測定試料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コメットアッセイ法（Comet assay、別名 Single-cell gel electrophoresis）は動物の細胞に薬剤や放射線を与え、その影響による細胞核ＤＮＡの損傷を計測する方法で、薬剤などが細胞に及ぼす傷害の度合を簡便かつ安価に評価できる。新しく開発した医薬品や化学物質の毒性を初期段階で評価する方法として多く用いられている。
【０００３】
実際の方法は、以下の通りである。動物の細胞に評価したい薬剤等を与えた後、その細胞を寒天ゲルと混合、スライドグラス上に薄く広げる。薬液によって細胞膜を破壊した後、緩衝液（buffer）を満たした電気泳動槽中に沈め、電圧をかけることにより、電気泳動を行なう（これにより細胞中の壊れたＤＮＡが引っ張られ、細胞の外に出てくる）。さらにゲルに部分に適当な染色液を振りかけ、ＤＮＡを染色し、流れ出たＤＮＡ（この形が彗星に似ていることからコメットアッセイと呼ばれる）の量や長さを計測し、細胞のＤＮＡがどれほど破壊されたのかを計測する。
【０００４】
寒天ゲルを載せたスライドを作成するに際しては、従来、細胞と混合したゲルをスライド上に垂らし、別のスライドグラス（カバーグラス）を押し付けることにより、ゲルを広げる。実際には細胞の存在するゲルを含めた３層構造にして行なう場合が多い。通常、１試料について１枚のスライドグラスを用いる。このような 従来の方法では、細胞を包埋するゲルの厚みが必ずしも一定ではなく、さらにスライド作成に多くの時間を要する。後者は非常に短い時間での実験が要求されるＤＮＡ修復の解析の場合に試料間のタイムラグ等の問題を生じ、試料間の誤差の原因となることも考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の課題を解決し、1枚のスライドグラス上に、処理にタイムラグがなく、しかもゲルを薄く、極めて均一になるように多数の試料を搭載しうる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、スライドグラスおよびカバーグラスを用いてスライドグラス上に試料を載せる方法において、該スライドグラスと該カバーグラスの間に、複数の切欠きを有するインサートを挟み込み、その切欠きにゾルもしくはゲルである試料を表面張力により流し込み、ゾルもしくはゲルである試料をスライドグラス上に載せることを特徴とする試料の搭載方法、ならびに、スライドグラス；カバーグラス；ならびに該スライドグラスと該カバーグラスの間に挟み込むためのインサートを含み、該インサートは複数の切欠きを有し、その切欠きにゾルもしくはゲルである試料を表面張力により流し込むことによりスライドグラス上にゾルもしくはゲルである試料を搭載しうることを特徴とする試料の搭載キット、にある。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、スライドグラスおよびカバーグラスを用いてスライドグラス上に試料を載せる方法において、該スライドグラスと該カバーグラスの間に、複数の切欠きを有するインサートを挟み込み、その切欠きに試料を表面張力により流し込む。これによりスライドグラス上に搭載された試料は、上述のコメットアッセイ法の測定に好適に供されるが、この測定方法に限定されず、さらには測定以外の目的にも適宜使用されうる。
【０００８】
試料は、溶液、ゾルもしくはゲルでありうるが、特にゲルに好適に適用され、とくに細胞と寒天ゲルの混合物であるのが最適である。
【０００９】
本発明の好適な１態様において、インサートは好適にはプラスチックス製であり、略スライドグラスの大きさを有するが、これらにこれに限定されない。インサートの厚みはコメットアッセイ法の測定には３０〜５００μｍであるのが好適である。さらにインサートの切欠きは、インサートの長手方向の一端もしくは両端に複数の切欠きを有するのが好適である。両端に複数の切欠きを有する場合、中央部に切欠きでない芯部が設けられる。試料の流し込み時に空気抜けをよくするために、インサートの外側端は切欠くのが好適であるが、それに限定されず、縁部を有するとして残されていてもよい。切欠きの形状は、略長方形（正方形を含む）であるのが一般的であるが、実質的に楕円形等の曲線部分を有することもできる。長方形の大きさは、通常、幅２〜３０×長さ５〜２０ｍｍ程度である。
【００１０】
切欠きは、好適には一端に（両端に縁部を有する場合を含む）３〜８個、もしくは両端に（両端および中央部に縁部を有する場合を含む）合計４〜１６個形成される。たとえば、図１および２において、このようなインサート１としては、６試料を同時処理するために片側に６つの切欠き４を有する６連タイプ（図１）、８試料を同時に処理するために片側にそれぞれ４つの切欠き４を有する８連タイプ（図２）等が好適に挙げられる。
【００１１】
インサートの作成態様はとくに限定されず、プラスチックスの所定形状への成形、シート材のカット、スライドグラスまたはカバーグラス上への所定形状での印刷等が挙げられ、いずれの場合も得られたインサートは試料の流し込み後に脱着し得るが、印刷による場合は、脱着しないでそのままでもよい。印刷によるとインサートの厚みを極薄くでき、シート材によると少数でも容易に製造しうる。
【００１２】
このような複数の切欠きへの試料の流し込みは、マルチチャンネルピペットにより同時に行われるのが好適である。これにより切欠き、すなわちこの切欠きの形状に対応するスライドグラス上、への試料の流し込みが均一かつ迅速に行われる。この流し込みに際しては、スライドグラス、インサートおよびカバーグラスをセットし、ついで切欠きに試料を表面張力により流し込んだ後に、該カバーグラスおよび該インサートが脱着される。この場合、カバーグラスのセットは、切欠きが一端にある場合には切欠きの一部が開口するようにして、そして切欠きが両端にある場合には後述のように両側の切欠きの一部が中央で開口するようにして行ない、流し込むのが好適である。更に好適には、このようなスライドグラス、インサートおよびカバーグラスのセットは、たとえばクリップ等で把持して流し込み時に固定される。
【００１３】
本発明によれば、スライドグラス；カバーグラス；ならびに該スライドグラスと該カバーグラスの間に挟み込むためのインサートを含み、該インサートは複数の切欠きを有し、その切欠きに試料を表面張力により流し込むことによりスライドグラス上に試料を搭載しうる試料の搭載キットが提供される。そして、試料を同時に流し込みためのマルチチャンネルピペットをさらに含む試料の搭載キットが提供される。
【００１４】
【実施例】
以下に、本発明の試料搭載方法をコメットアッセイに供する場合の好適な態様について図３とともに説明する。薄いプラスチック製の８連のインサート１を作製し、スライドグラス２と２枚のカバーグラス３の間にインサート１を挟み込む。２枚のカバーグラス３の間隔を開けて、両側の切欠き４の一部が中央で開口するようにして、スライドグラス２、インサート１およびカバーグラス３を、２つのクリップ（図示せず）でそれぞれ把持して固定する。ついで、マルチチャンネルピペット５を用いゲルを表面張力を利用して２枚のカバーグラス３の中央すき間にある両方の切欠き４に細胞と寒天ゲルの混合物の試料を流し込む。その後、カバーグラス３とインサート１を除去し、８試料を搭載されたスライドグラスは、通常の方法にしたがってコメットアッセイに供された。
【００１５】
本発明の試料搭載方法によれば、いわばマルチレーン方式のコメットアッセイ法が提供され、１枚のスライドグラスで複数の検体を処理することができる（従来法は数千個程度の細胞を含むが、実際のカウントする細胞数は５０〜２００個程度であり、ほとんどはカウントしないままである。本発明方法による各々のゲルでも２０００個程度の細胞を包埋することが可能で、必要十分の細胞を搭載しうる。）。インサートの形状はマルチチャンネルピペットに合致するような切欠き間隔にするのが好適である、これによりマルチチャンネルピペットが使用可能である。マルチチャンネルピペットが使えることは、多くの検体を一度に処理し、ハイスル−プット化が必要な研究を行う上で重要なファクターである。
【００１６】
【発明の効果】
本発明の搭載方法によれば、スライドグラス１枚で多数の試料を処理することができ、その１枚上の細胞については全く同じ条件で処理することができる（通常ではスライドと別のスライド間に差が見られる場合がある）。また、同一スライド上の試料は処理にタイムラグがなく、例えば薬剤投与後に細胞の回復力などを計算する場合などは分単位の実験が要求されるので、タイムラグがないことは極めて重要である。
【００１７】
さらに、常法に比べゲルが薄く、極めて均一である。通常法ではゲルの厚さは偶然性に依存しており、また1枚のスライドグラス上で厚さに差が見られる。コメットアッセイの計測は顕微鏡を使用するが、ゲルが均一であることはフォーカスを調整する必要をなくさせる。また、ゲルが薄いことにより、ゲル内への液の浸透が速く、実験処理時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明におけるインサートの１態様を示す。
【図２】本発明におけるインサートの１態様を示す。
【図３】本発明における試料の搭載方法の１態様を示す。
【符号の説明】
１…インサート
２…スライドグラス
３…カバーグラス
４…切欠き
５…マルチチャンネルピペット
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料の搭載方法に関し、さらに詳しくはコメットアッセイ法等に好適な測定試料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コメットアッセイ法（Comet assay、別名 Single-cell gel electrophoresis）は動物の細胞に薬剤や放射線を与え、その影響による細胞核ＤＮＡの損傷を計測する方法で、薬剤などが細胞に及ぼす傷害の度合を簡便かつ安価に評価できる。新しく開発した医薬品や化学物質の毒性を初期段階で評価する方法として多く用いられている。
【０００３】
実際の方法は、以下の通りである。動物の細胞に評価したい薬剤等を与えた後、その細胞を寒天ゲルと混合、スライドグラス上に薄く広げる。薬液によって細胞膜を破壊した後、緩衝液（buffer）を満たした電気泳動槽中に沈め、電圧をかけることにより、電気泳動を行なう（これにより細胞中の壊れたＤＮＡが引っ張られ、細胞の外に出てくる）。さらにゲルに部分に適当な染色液を振りかけ、ＤＮＡを染色し、流れ出たＤＮＡ（この形が彗星に似ていることからコメットアッセイと呼ばれる）の量や長さを計測し、細胞のＤＮＡがどれほど破壊されたのかを計測する。
【０００４】
寒天ゲルを載せたスライドを作成するに際しては、従来、細胞と混合したゲルをスライド上に垂らし、別のスライドグラス（カバーグラス）を押し付けることにより、ゲルを広げる。実際には細胞の存在するゲルを含めた３層構造にして行なう場合が多い。通常、１試料について１枚のスライドグラスを用いる。このような 従来の方法では、細胞を包埋するゲルの厚みが必ずしも一定ではなく、さらにスライド作成に多くの時間を要する。後者は非常に短い時間での実験が要求されるＤＮＡ修復の解析の場合に試料間のタイムラグ等の問題を生じ、試料間の誤差の原因となることも考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の課題を解決し、1枚のスライドグラス上に、処理にタイムラグがなく、しかもゲルを薄く、極めて均一になるように多数の試料を搭載しうる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、スライドグラスおよびカバーグラスを用いてスライドグラス上に試料を載せる方法において、該スライドグラスと該カバーグラスの間に、複数の切欠きを有するインサートを挟み込み、その切欠きにゾルもしくはゲルである試料を表面張力により流し込み、ゾルもしくはゲルである試料をスライドグラス上に載せることを特徴とする試料の搭載方法、ならびに、スライドグラス；カバーグラス；ならびに該スライドグラスと該カバーグラスの間に挟み込むためのインサートを含み、該インサートは複数の切欠きを有し、その切欠きにゾルもしくはゲルである試料を表面張力により流し込むことによりスライドグラス上にゾルもしくはゲルである試料を搭載しうることを特徴とする試料の搭載キット、にある。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、スライドグラスおよびカバーグラスを用いてスライドグラス上に試料を載せる方法において、該スライドグラスと該カバーグラスの間に、複数の切欠きを有するインサートを挟み込み、その切欠きに試料を表面張力により流し込む。これによりスライドグラス上に搭載された試料は、上述のコメットアッセイ法の測定に好適に供されるが、この測定方法に限定されず、さらには測定以外の目的にも適宜使用されうる。
【０００８】
試料は、溶液、ゾルもしくはゲルでありうるが、特にゲルに好適に適用され、とくに細胞と寒天ゲルの混合物であるのが最適である。
【０００９】
本発明の好適な１態様において、インサートは好適にはプラスチックス製であり、略スライドグラスの大きさを有するが、これらにこれに限定されない。インサートの厚みはコメットアッセイ法の測定には３０〜５００μｍであるのが好適である。さらにインサートの切欠きは、インサートの長手方向の一端もしくは両端に複数の切欠きを有するのが好適である。両端に複数の切欠きを有する場合、中央部に切欠きでない芯部が設けられる。試料の流し込み時に空気抜けをよくするために、インサートの外側端は切欠くのが好適であるが、それに限定されず、縁部を有するとして残されていてもよい。切欠きの形状は、略長方形（正方形を含む）であるのが一般的であるが、実質的に楕円形等の曲線部分を有することもできる。長方形の大きさは、通常、幅２〜３０×長さ５〜２０ｍｍ程度である。
【００１０】
切欠きは、好適には一端に（両端に縁部を有する場合を含む）３〜８個、もしくは両端に（両端および中央部に縁部を有する場合を含む）合計４〜１６個形成される。たとえば、図１および２において、このようなインサート１としては、６試料を同時処理するために片側に６つの切欠き４を有する６連タイプ（図１）、８試料を同時に処理するために片側にそれぞれ４つの切欠き４を有する８連タイプ（図２）等が好適に挙げられる。
【００１１】
インサートの作成態様はとくに限定されず、プラスチックスの所定形状への成形、シート材のカット、スライドグラスまたはカバーグラス上への所定形状での印刷等が挙げられ、いずれの場合も得られたインサートは試料の流し込み後に脱着し得るが、印刷による場合は、脱着しないでそのままでもよい。印刷によるとインサートの厚みを極薄くでき、シート材によると少数でも容易に製造しうる。
【００１２】
このような複数の切欠きへの試料の流し込みは、マルチチャンネルピペットにより同時に行われるのが好適である。これにより切欠き、すなわちこの切欠きの形状に対応するスライドグラス上、への試料の流し込みが均一かつ迅速に行われる。この流し込みに際しては、スライドグラス、インサートおよびカバーグラスをセットし、ついで切欠きに試料を表面張力により流し込んだ後に、該カバーグラスおよび該インサートが脱着される。この場合、カバーグラスのセットは、切欠きが一端にある場合には切欠きの一部が開口するようにして、そして切欠きが両端にある場合には後述のように両側の切欠きの一部が中央で開口するようにして行ない、流し込むのが好適である。更に好適には、このようなスライドグラス、インサートおよびカバーグラスのセットは、たとえばクリップ等で把持して流し込み時に固定される。
【００１３】
本発明によれば、スライドグラス；カバーグラス；ならびに該スライドグラスと該カバーグラスの間に挟み込むためのインサートを含み、該インサートは複数の切欠きを有し、その切欠きに試料を表面張力により流し込むことによりスライドグラス上に試料を搭載しうる試料の搭載キットが提供される。そして、試料を同時に流し込みためのマルチチャンネルピペットをさらに含む試料の搭載キットが提供される。
【００１４】
【実施例】
以下に、本発明の試料搭載方法をコメットアッセイに供する場合の好適な態様について図３とともに説明する。薄いプラスチック製の８連のインサート１を作製し、スライドグラス２と２枚のカバーグラス３の間にインサート１を挟み込む。２枚のカバーグラス３の間隔を開けて、両側の切欠き４の一部が中央で開口するようにして、スライドグラス２、インサート１およびカバーグラス３を、２つのクリップ（図示せず）でそれぞれ把持して固定する。ついで、マルチチャンネルピペット５を用いゲルを表面張力を利用して２枚のカバーグラス３の中央すき間にある両方の切欠き４に細胞と寒天ゲルの混合物の試料を流し込む。その後、カバーグラス３とインサート１を除去し、８試料を搭載されたスライドグラスは、通常の方法にしたがってコメットアッセイに供された。
【００１５】
本発明の試料搭載方法によれば、いわばマルチレーン方式のコメットアッセイ法が提供され、１枚のスライドグラスで複数の検体を処理することができる（従来法は数千個程度の細胞を含むが、実際のカウントする細胞数は５０〜２００個程度であり、ほとんどはカウントしないままである。本発明方法による各々のゲルでも２０００個程度の細胞を包埋することが可能で、必要十分の細胞を搭載しうる。）。インサートの形状はマルチチャンネルピペットに合致するような切欠き間隔にするのが好適である、これによりマルチチャンネルピペットが使用可能である。マルチチャンネルピペットが使えることは、多くの検体を一度に処理し、ハイスル−プット化が必要な研究を行う上で重要なファクターである。
【００１６】
【発明の効果】
本発明の搭載方法によれば、スライドグラス１枚で多数の試料を処理することができ、その１枚上の細胞については全く同じ条件で処理することができる（通常ではスライドと別のスライド間に差が見られる場合がある）。また、同一スライド上の試料は処理にタイムラグがなく、例えば薬剤投与後に細胞の回復力などを計算する場合などは分単位の実験が要求されるので、タイムラグがないことは極めて重要である。
【００１７】
さらに、常法に比べゲルが薄く、極めて均一である。通常法ではゲルの厚さは偶然性に依存しており、また1枚のスライドグラス上で厚さに差が見られる。コメットアッセイの計測は顕微鏡を使用するが、ゲルが均一であることはフォーカスを調整する必要をなくさせる。また、ゲルが薄いことにより、ゲル内への液の浸透が速く、実験処理時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明におけるインサートの１態様を示す。
【図２】本発明におけるインサートの１態様を示す。
【図３】本発明における試料の搭載方法の１態様を示す。
【符号の説明】
１…インサート
２…スライドグラス
３…カバーグラス
４…切欠き
５…マルチチャンネルピペット
Claims (8)
- スライドグラスおよびカバーグラスを用いてスライドグラス上に試料を載せる方法において、該スライドグラスと該カバーグラスの間に、複数の切欠きを有するインサートを挟み込み、その切欠きにゾルもしくはゲルである試料を表面張力により流し込み、ゾルもしくはゲルである試料をスライドグラス上に載せることを特徴とする試料の搭載方法。
- ゲルが、細胞と寒天ゲルの混合物である請求項１記載の搭載方法。
- 試料がコメットアッセイに供される請求項１記載の搭載方法。
- インサートが長手方向の一端もしくは両端に複数の切欠きを有する請求項１記載の搭載方法。
- 複数の切欠きへの試料の流し込みが、マルチチャンネルピペットにより同時に行われる請求項１記載の搭載方法。
- 切欠きに試料を表面張力により流し込んだ後に、該カバーグラスおよび該インサートが脱着される請求項１記載の搭載方法。
- スライドグラス；カバーグラス；ならびに該スライドグラスと該カバーグラスの間に挟み込むためのインサートを含み、該インサートは複数の切欠きを有し、その切欠きにゾルもしくはゲルである試料を表面張力により流し込み、スライドグラス上にゾルもしくはゲルである試料を搭載しうることを特徴とする試料の搭載キット。
- 試料を流し込みためのマルチチャンネルピペットをさらに含む請求項７記載の試料の搭載キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002270433A JP3896458B2 (ja) | 2002-09-17 | 2002-09-17 | 試料の搭載方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002270433A JP3896458B2 (ja) | 2002-09-17 | 2002-09-17 | 試料の搭載方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004108889A JP2004108889A (ja) | 2004-04-08 |
| JP3896458B2 true JP3896458B2 (ja) | 2007-03-22 |
Family
ID=32268065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002270433A Expired - Lifetime JP3896458B2 (ja) | 2002-09-17 | 2002-09-17 | 試料の搭載方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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| GB2466816A (en) * | 2009-01-08 | 2010-07-14 | Ge Healthcare Ltd | High throughput DNA damage assay and separable multi-well plate apparatus |
| JP2011158365A (ja) * | 2010-02-01 | 2011-08-18 | Fukuyama Rinsho Kensa Center:Kk | 液状処理細胞診標本の作製方法 |
| CN107063977A (zh) * | 2017-04-23 | 2017-08-18 | 湖南乾康科技有限公司 | 一种多通道计数池 |
-
2002
- 2002-09-17 JP JP2002270433A patent/JP3896458B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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