JP3874024B2 - 造血細胞の増殖および分化を誘導するための肝細胞増殖因子の使用 - Google Patents
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Description
本発明は、造血細胞、特に多分化能および赤芽球の造血前駆細胞の増殖および分化を誘導するのに有用な薬物の調製のための肝細胞増殖因子の使用に関する。
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、同じ略号が、また、Nakamura et al., 1989およびMiyazaki et al., 1989によって記述された全く異なる物質、すなわち造血増殖因子（Ｈｅｍｏｐｏｉｅｓｉｓ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｅｒ）を定義するために使用されている）は、また，分散因子（Ｓｃａｔｔｅｒ Ｆｃｔｅｒ）（Naldini et al., 1991a; Weidner et al., 1991）としても知られ、その標的細胞に分裂促進活性とモトゲニック（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ）活性とを与えるという独特な特性をもっている。ＨＧＦは、肝細胞（Michalopoulos, 1990）、および他の上皮細胞、例えば腎臓の尿細管上皮、メラニン細胞およびケラチン細胞（Kan et al., 1991; Rubin et al., 1991; Halaban et al., 1992; Matsumoto et al., 1991）に対して分裂促進的である。これらの細胞では、ＨＧＦはまた、「分散（Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）」（Stoker et al., 1987; Gherardiet al., 1989; Weidner et al., 1990, 1991; Naldini et al., 1991a）およびマトリックス侵入（Weidner et al., 1990; Naldini et al., 1991a）を促進し、そして走化性（Morimoto et al., 1991; Giordano et al., 1993）を有する。その因子は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質分解に関与する酵素の合成を増進することによって、ＥＣＭ分解を促進する（Pepper et al., 1992; Boccaccio et al., 1994）。ＨＧＦは、イン・ビボでの神経外胚葉の発生においてモルフォゲンとして作用し（Stern et al., 1990）、そしてイン・ビトロで上皮細胞の三次元構成を誘導する（Montesano et al., 1991）。また、この因子は、がん細胞の悪性侵入性表現型への進行を促進する（Weidner et al., 1990）。
ＨＧＦに対するレセプターは、ＭＥＴがん原遺伝子（Naldini et al., 1991a, 1991b; Bottaro et al., 1991）によってコードされているチロシンキナーゼ、トランスメンブランの１４５ｋＤａβサブユニットにジスルフィド結合された細胞外の５０ｋＤａαサブユニットからなる１９０ｋＤａのヘテロ二量体（Park et al., 1987; Giordano et al., 1989a）、である。両サブユニットは、１７０ｋＤａの一本鎖前駆体のグルコシル化とタンパク質分解的切断に由来する（Giordano et al., 1989b）。
ＨＧＦレセプターは、肝臓、腸および腎臓を含む成人の上皮組織において発現される（Prat et al., 1991a; Di Renzo et al., 1991）。上皮器官の初期発生段階で発現されることが報告されており（Sonnenberg et al., 1993）、それは、しばしば、上皮がんでは過剰発現される（Prat et al., 1991a; Di Renzo et al., 1991）。本発明者らは、レセプターが、また内皮細胞でも発現されること、そしてＨＧＦが、イン・ビトロとイン・ビボの両方で、強力な血管新生促進因子であることを示した（Bussolino et al., 1992; Grant et al., 1993）。また、ＨＧＦレセプターは、血液細胞のある種の集団、例えばマクロファージにおいても発現されることが知られているが、活性化の不在下で辛うじて検出できるそのような発現の意義は、明らかにされていない（Galini et al., 1993）。
欧州特許出願公開第0,492,614号は、上皮細胞に対する増殖エンハンサーとしてのＨＧＦの使用を開示しているが、一方、ＷＯ93/08821は、化学療法剤の副作用の防止のためのＨＧＦの使用を開示している。
肝細胞増殖因子が、多能性および赤芽球の造血前駆細胞の増殖および分化を誘導することが、ここに発見された。
造血細胞の増殖と分化は、特定のレセプターを介して標的細胞に作用するサイトカインの複雑なネットワークの制御下にある（Metcalf, 1984; Clark and Kamen, 1987）。赤血球形成は、特定の遺伝プログラムが、始動され（コミットメント（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ））、そして実行される（成熟）複雑な過程である。成熟に関してはよく知られているけれども、始動期の間に生じる分子的現象のほとんどは、まだ不明確である。赤芽球前駆体の増殖と分化は、体液性因子により、そして骨髄ストローマとのほとんど特性決定されていない細胞−細胞の相互作用、いわゆる造血性の微小環境により制御される。エリトロポエチンは、赤血球形成に必要な主要因子であり（Koury and Bondurant, 1990）、他の因子（ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β；Gasson, 1991; Miyajima et al., 1993; Sporn and Roberts, 1992）は、はるかに特異性は低いと、長い間考えられてきた。ＨＧＦは、赤血球形成において特異的に活性をもつ体液性因子の新規な例を表わしている。
最近、無分画のマウス骨髄からの特性決定されていないコロニーの増殖を促進する上で、ＨＧＦ、ＩＬ−３およびＧＦ、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ間の相乗作用（Kmiecik et al., 1992）が述べられた。しかしながら、該研究からは、ＨＧＦ単独の効果についての結論は、導き出すことはできず；さらにまた、骨髄細胞懸濁液（リンパ球および単球−マクロファージを含有する）を用いて得られた結果は、補助細胞による造血サイトカインの産生によって仲介された間接的効果に帰せられるかもしれない。
事実、ＨＧＦ、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ間の相乗作用は、ヒト造血細胞の単離されたコロニーに対しては、本発明者らによっては確認されなかった。
特に、ＨＧＦが、イン・ビトロで赤芽球および多能性の前駆細胞を刺激すること、そしてＨＧＦレセプターが、成人造血前駆体の亜集団（ＣＤ３４+）において発現されることが発見された。得られた結果は、実施例において詳細に報告されるが、ＨＧＦが、胚形成期と成人生活期の両期間におけるストローマ性造血細胞の相互作用の傍分泌メディエーターであることを示唆する。それ故、ＨＧＦは、微小環境と造血前駆体の間の発生シグナルを仲介する分子の１つであるかも知れない。
結論として、本発明によれば、ＨＧＦは、造血の刺激が望まれる病気に罹っている患者に投与することができる。そのような患者の例は、種々の器官の一次的または二次的血球減少症を含む。さらにまた、ＨＧＦは、骨髄自家移植の使用が示唆されるすべての放射線−または化学剤−感受性の新生物病においても、造血前駆体の血流における可動化（分散効果）のためにも使用できる。特に、ＨＧＦは、骨髄移植のための幹細胞源として末梢血液を使用する際に、骨髄前駆体の可動化剤として使用できる。さらにまた、ＨＧＦは、それが必要とされるいかなる臨床症状においても、髄造血前駆体のエクス・ビボでの拡大のために、単独でも、また他の因子と組み合わせても使用できるであろう（Akabutu, J.J., Chan, J.R., Prog. Clin. Biol. Res. 389:399-404）。
企図された治療用途には、種々の起源からの、例えば動物またはヒト臓器からの、あるいはＨＧＦをコードしている遺伝子で形質転換された原核または真核細胞からのＨＧＦが、使用できる。用語ＨＧＦについては、実施例１および６に記載のようにＨＧＦの活性化された形態を、明らかに意味する。ヒト組み換えＨＧＦの使用が好適であるが、また本発明は、いずれかの欠失および／または置換変異型を含むＨＧＦの可能性のある変種すべてにも適用する。肝細胞増殖因子は、タンパク質性物質の投与に適切な投与剤形に製剤化されるであろう。したがって、本発明の製剤は、好ましくは、非経口経路で投与され、そしてそれらは、例えばRemingtonのPharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y., USAに記載されるように、慣用の技術および賦形剤を用いて調製できる。
いずれにしても、既にタンパク質性有効成分について示唆されている他の投与経路、例えば経鼻、舌下、肛門内および経口経路も排除できない。後者では、有効成分は、適切には、既知の技術、例えばリポソーム小胞への封入を使用して、代謝分解から保護されるであろう。本発明によるＨＧＦ投与は、広い範囲内で、例えば毎日１回以上、ＨＧＦ約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇ内で変化されてもよい。次の実施例は、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
バキュロウイルス発現系からのヒト組み換えＨＧＦの精製。
完全長のＨＧＦのｃＤＮＡが、ヒト肝臓ｍＲＮＡからクローン化され、そしてバキュロウイルスのトランスファーベクターＰＶＬ１３９３（Invitrogen, San Diego, CA)中に挿入された。組み換えベクターは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ操作（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）によって、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞（Ｓｆ９）中に、Ｂｓｕ１消化されたＢａｃＰａｋ６ウイルスＤＮＡ（Clontech Laboratories, Palo Alto, CA）とともに同時トランスフェクションされた。陽性クローンが、そしてドット・ブロットハイブリダイゼーションとプラークアッセイによって同定、精製された。組み換えウイルスは、１０-1，１０-2，１０-3，１０-6の希釈によってＳｆ９細胞を感染するために使用された。１週間後、感染細胞抽出液が、ナイロンフィルター上にブロットされ、放射能標識された完全長のヒトＨＧＦｃＤＮＡによりプローブされた。ＨＧＦのｃＤＮＡ遺伝子を含有するウイルスは、続いて、プラークアッセイによって精製された。単一ウイルスクローンが単離され、そしてＳｆ９細胞の大規模感染のために使用された。
組み換え因子は、若干の改変はあるが、Weidner et al., 1990によって公表された操作に従って、ヘパリン（BioRad Laboratories, Hercules, CA）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。Ｓｆ９スポドプテラ・フルギペルダ細胞は、血清不含のＳＦ９００培地（Gibco Ltd, Scotland）で、２７℃において増殖された。
対数的に増殖している培養物が、血清不含培養基中のウイルス保存株を添加することによって感染され、そして細胞は、３日間増殖された。次いで、培地が回収され、そして３％ウシ胎児血清の存在下で３７℃一夜インキュベートされて、前駆体の完全な活性化を確実に行った；次いで、それが３００ｘｇ、１５分間遠心されて、細胞破片が除かれ、そして１０，０００ｘｇ１時間の遠心によって清澄にされた。上澄液が、ＴＲＩＳを用いてｐＨ＝７．４に緩衝化され、プロテアーゼ阻害剤の混合液（１ｍＭ ＰＭＳＦ，５０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、４μｇ／ｍｌペプスタチン）と最終濃度０．２ｗ／ｖまでの界面活性剤ＣＨＡＰＳを補足され、そして真空吸引によって０．４５μｍポアーのＴｕｆｆｒｙｎメンブランフィルター（Gelman Sciences, Ann Arbor, MI）上で濾過され、４℃に冷却され、そして低温室中でＦＰＬＣ装置に組み立てられた５ｍｌのヘパリン・アガロースカラムに、添加速度８ｍｌ／ｈで適用された。カラムは、溶出液の吸光度がベースラインに戻るまで、０．１５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．４、０．２％ＣＨＡＰＳおよび０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ ｐＨ＝７．４、０．２％ＣＨＡＰＳを用いて連続的に洗浄された。結合された物質は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．４、ＣＨＡＰＳ ０．２％中、８時間にわたる直線勾配０．５Ｍ〜１．８ＭＮａＣｌを用いて、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで溶出され、そして２ｍｌ画分が収集された。出発材料、カラム通過と洗浄液、および溶出画分は、ＭＤＣＫスキャッタリングアッセイ（Weidner et al., 1990; Naldini et al., 1992）によって、ＨＧＦ含量について測定された。約１ＭＮａＣｌで溶出する、ＨＧＦ活性のピークを含む画分がプールされ、３０，０００分子量カットオフのダイアフィルトレーション器具（Amicon Div., Grace Industrial, Switzerland）を用いて濃縮され、ＭＤＣＫ細胞に対する生物活性が検査され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥとタンパク質染色による純度について検査されて、培養上澄液７００ｍｌから１５０μｇの平均工程収量で、純粋なＨＧＦを得られた。
実施例２
昆虫細胞におけるヒト組み換えｐｒｏ−ＨＧＦの生産。
ＨＧＦのｃＤＮＡがヒト肝臓ｍＲＮＡからクローン化され（Naldini et al., 1991a）、そしてバキュクロウイルスのトランスファーベクターＰＶＬ１３９３（Invitrogen）中に、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片として挿入された。組み換えベクターは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ操作によって、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞（Ｓｆ９）中に、Ｂｓｕ１消化されたＢａｃＰａｋ６ウイルスＤＮＡ（Clontech）とともに同時トランスフェクションされた。
ドット・ブロットハイブリダイゼーションとプラークアッセイによって単離された陽性ウイルスクローンが、大規模感染のために使用された。ＨＧＦは、感染後７２時間にＳｆ９の感染細胞の培養上澄液から、直線的０．５〜１．８ＭＮａＣｌ勾配で溶出されるヘパリン−セファロースＦＲＬＣカラム（BioRad）でのアフィニティークロマトグラフィーによって得られた。処理を受けてない組み換え因子（ｐｒｏ−ＨＧＦ）は、ＳＤＳＰＡＧＥにおいて９０ｋＤａのバンドとしてクーマシーブルー染色によって検出された。タンパク質濃度は、クーマシーブルー染色とウシ血清アルブミンの増加量により得られる標準曲線との比較によって評価された。
実施例３
赤芽球および多能性の造血前駆体の刺激。
造血前駆体の増殖および分化に及ぼすＨＧＦの影響が、コロニー形成アッセイにおいて評価された。ボランティアから得られた骨髄、胎児臍帯血および成人末梢血のヘパリン処理サンプルが、等量のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈され、そして５５０ｇで３０分間、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ１０７７ＳＤ（Pharmacia）密度勾配遠心によって分離された。低密度の単核細胞（ＬＤ−ＭＣ）が収集され、ＰＢＳ中で２回洗浄され、そして５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足されたＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）（Gibco）中に再懸濁された。次いで、単核の粘着細胞が、プラスチックフラスコ中で、３７℃で各３０分の２段階インキュベーションによって除去された。単核の非接着細胞（ＮＭＡＣ）が、ノイラミニダーゼ処理されたヒツジ赤血球とともに、３７℃で１５分間インキュベートされ、遠心され、そして４℃で４５分間インキュベートされた。Ｔ−リンパ球を枯渇したＭＮＡＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ１０７７ＳＤ（Pharmacia）密度勾配遠心によって分離された。次いで、Ｔ−リンパ球枯渇ＭＮＡＣは、次の抗体：抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８、抗−ＣＤ１１、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ５７とともに、４℃で４５分間インキュベートされ；かくして、残りのＢ−およびＴ−リンパ球、単球および顆粒球のほとんどが、抗−マウスＩｇＧ（Ｍ−４５０ Dynabeads, Dynal）で、被覆され、イムノマグネチックビーズとともに、４℃で４５分間インキュベートすることによって除去され続いてマグネット（ＭＰＣ−１ Dynabeads, Dynal）によって収集された。
次いで、ＣＤ３４＋細胞の陽性選択が行われた：細胞が、４℃で４５分間、抗体抗−ＣＤ３４（Ｍｙ−１０；Technogenetics）とともに、次に、抗−マウスＩｇＧで被覆されたイムノマグネチックビーズとともに、４℃で４５分間インキュベートされた；ビーズ／細胞比率４：１が、最良の回収率を与えることが分かった。ビーズに結合されたＣＤ３４＋細胞が、次に、マグネットによって収集され、そして１０％ＦＣＳを補足されたＩＭＤＭ中に再懸濁された。次いで、３７℃における一夜インキュベーションが実施された。ＣＤ３４＋細胞を離脱させるために、ビーズは、パスツールピペットを通して繰り返し吹き出すことによってせん断力にかけられた。さらに、使用された陰性／陽性二重選択操作に関する詳細は、既に公表されている（Bagnara et al., 1991）。回収された細胞は、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色において、前骨髄球がわずかに混入した、形態学的に同定不可能な芽球要素（ｂｌａｓｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）であった。フローサイトメトリー解析は、選択された細胞標品中のＣＤ３４＋細胞のパーセンテージが、最小３０％（出発材料が骨髄であった場合）〜最大５０％（出発材料が末梢血であった場合）の間で変化することを示した。ＣＤ４＋、ＣＤ２＋、ＣＤ１６＋もしくはＣＤ１９＋細胞による汚染は、常に１％以下であった。
赤芽球のバースト形成単位および多能性コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）に関するコロニーアッセイは、Iscove et al., 1974に従って行われた。臍帯血、骨髄または末梢血のＣＤ３４＋細胞が、２４穴細胞培養クラスター（Costar）において、ＩＭＤＭ、３０％ＦＳＣ、２ｘ１０-4Ｍヘミン、５ｘ１０-5−メルカプトエタノールおよび０．９％メチルセルロースを含有する培地に、濃度２．５ｘ１０3細胞/ウェルで移植された。細胞は、単独か組み合わせにおける次の増殖因子：Ｅｐｏ ２ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３ ２ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ−ＣＳＦ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ｐｒｏ−ＨＧＦ ２，１０または４０ｎｇ／ｍｌを用いて刺激された。コロニーは、暗赤色で４個以上の凝集体を含む場合のみが、陽性と記録された。
１４日目の顆粒−単球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）に関するアッセイは、既に記述されている（Iscove et al., 1971）ように遂行された。臍帯血、骨髄または末梢血のＣＤ３４＋細胞が、２４穴細胞培養クラスター（Costar）において、ＩＭＤＭ、２０％ＦＳＣ、０．３％Ｎｏｂｌｅアガー（Difco）および単独か組み合わせにおける次の増殖因子：ＩＬ−３ ２ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ−ＣＳＦ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ｐｒｏ−ＨＧＦ ２，１０または４０ｎｇ／ｍｌを含有する培地に、濃度２．５ｘ１０3細胞／ウェルで移植された。
巨核球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ｍｅｇ）アッセイについては、凝固血漿アッセイが、Vainchenker et al., 1979に従って遂行された。臍帯血、骨髄または末梢血のＣＤ３４＋細胞が、２４穴細胞培養クラスター（Costar）において、ＩＭＤＭ、２０ｍｇ／ｍｌＬ−アスパラギン（Sigma）、３．４ｍｇ／ｍｌＣａＣｌ2、１０％クエン酸添加のウシ血漿（GIBCO）、１％無毒化ウシ血清アルブミン（BSA, fraction V Chon）（Sigma）、１０％熱失活ヒトＡＢ血清および単独か組み合わせにおける次の増殖因子：ＩＬ−３ ２ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ−ＣＳＦ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ｐｒｏ−ＨＧＦ ２，１０または４０ｎｇ／ｍｌを含有する培地に、濃度２．５ｘ１０3細胞／ウェルで移植された。インキュベーション１２日後、凝固血漿は、イン・サイチュウで、メタノール−アセトン１：３で２０分間固定され、ＰＢＳで洗浄され、そして風乾された。固定されたプレートは、免疫蛍光染色が実施されるまで−２０℃に保存された；ＣＦＵ−ｍｅｇコロニーが、ＩＩｂ／ＩＩＩａ糖タンパク質複合体に向けられたモノクローナル抗体ＣＤ４１（Immunotech）に強く蛍光を発する３〜１００個の細胞の凝集体として記録された。結合は、フルオレセイン共役ヤギ抗−マウスＩｇ（Becton Dickinson）によって示された。
結果は、図１および２に図示され、そしてそれらは、エリトロポエチンの標準濃度（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＨＧＦが、ＢＦＵ−Ｅ前駆細胞に由来するコロニー数を劇的に増加することを示している（図１）。また、ＨＧＦは、多能性ＣＦＵ−ＧＥＭＭ前駆体由来のコロニーの増殖を刺激した。コロニー数は、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−３（Gasson, 1991; Miyajima et al., 1993）のような既知の造血因子を組み合わせることによって得られるものに匹敵した。しかしながら、ＨＧＦ効果が、ＣＦＵ−ＧＥＭＭとＢＦＵ−Ｅの刺激に限られることを注目すべきである。
顆粒−単球コロニーも巨核球コロニーもいずれも、ＨＧＦへの応答に関しては全く観察されなかった。
ＨＧＦへの応答は、用量依存的であって、赤芽球と多分化能コロニーの両方で、５ｐＭと同等の低いＨＧＦ濃度において観察できた（図２）。
また、ＨＧＦ作用は、ヒト臍帯血から集積されたＣＤ３４＋退治造血前駆体について研究された。この集団は、成人骨髄または末梢血から精製された集団よりも高いパーセンテージの初生の幹細胞を含有することが知られている（Broxmeyer et al., 1992; Lu et al., 1993）。成人造血前駆体の場合に観察されるように、ＨＧＦは、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭ由来の両コロニーを刺激した。
ＨＧＦおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）両方の存在下で、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ由来コロニー数における有意な増大が観察された（図３）。この場合には、比較的少ない赤芽球コロニーが、ＨＧＦのみによって刺激された培養物において発生されたものと比較して見ることができるであろう。これにより、ＨＧＦとＳＣＦの組み合わせが、多能性前駆体の増殖に優先的に影響することを示唆する。
両増殖因子の存在下で増殖された赤芽球コロニーは、極端に大きく、そして高いヘモグロビン含量を示した。また、これらの条件下で増殖されたＣＦＵ−ＧＥＭＭ由来コロニーの大きさは増大し、そして各コロニー内では、赤芽球系統が顕著であった。
これらのアッセイにおいて、ＨＧＦは、別々に試験されても組み合わせで試験されても、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−３とは相乗的に働かなかった。
実施例４
成人造血前駆体の亜集団におけるＨＧＦレセプターの発現（ＣＤ３４＋）。
造血前駆体の表面におけるＨＧＦレセプターの存在は、骨髄および末梢血単核細胞のフローサイトメトリー解析によって研究された。ＨＧＦレセプターβ鎖の細胞外エピトープに対向するモノクローナル抗体が使用された。小さいが明らかに特定できる骨髄細胞の亜集団が、ＨＧＦレセプターに関して陽性に染色された。
また、ＨＧＦレセプターを発現している細胞の約半数が、ＣＤ３４マーカーを同時に発現し、かくして、造血前駆体として同定することができるであろう。
上記のように、ＨＧＦは、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ誘導コロニーの増殖および分化を刺激することにおいて、ＳＣＦと相乗的に働いた。これが観察された系統では、ＨＧＦおよびＳＣＦレセプターを同時発現している細胞の亜集団は、ＳＣＦレセプターの細胞外エピトープに対向するモノクローナル抗体を用いて同定された。同様の結果が、末梢血中で循環しているＣＤ３４＋幹細胞のフローサイトメトリー解析によって得られた。
抗−ＨＧＦレセプター抗体を用いるフローサイトメトリー解析は、また、ＨＧＦに応答してイン・ビトロで発生されたコロニーから得られた細胞において実施された。表は、ＨＧＦレセプター陽性細胞が存在することを示している。
実施例５
造血細胞の胎児性発生の間におけるＨＧＦおよびそのレセプターの発現。
ＨＧＦレセプターの発現が、マウス胎児の組織学的切片のイン・サイチュウーハイブリダイゼーションによって、胎児造血細胞において研究された。アンチセンスＭＥＴプローブを用いて、ＨＧＦレセプターのｍＲＮＡは、交尾後１０〜１０．５日から発生する心臓および大動脈腔内に位置する巨大赤芽球細胞において、明らかに検出することができた。特定のｍＲＮＡは、この段階で造血前駆体を含有している肝／胆原基中に検出されるであろう。この発生中の器官において、赤芽球島は、周辺の肝細胞中に観察される発現レベルと比較して、より高いレベルのＨＧＦレセプターのｍＲＮＡを示した。また、交尾後１１日からは、造血性胎児肝が、ＨＧＦｍＲＮＡを発現した。
実施例６
末梢血における骨髄の造血前駆体の可動化を証明するために、マウスのモデルが使用された。Ｂａｌｂ／ｃマウスが、種々の濃度のＨＧＦによるか、または対照標品によって、４日間、皮下処置された。処置の終了時に、マウスは殺され、循環する白血球が数えられ、そして末梢血からの造血コロニーが培養された。ＨＧＦ処置マウスでは、未処置の対照区と反対に、循環している白血球の約６０％増加が、末梢血から得られるコロニーにおける増加と同様に観察された。この現象は、骨髄の造血前駆細胞を可動化するために既に記述され、そして使用されたＧ−ＣＳＦの現象（Janssen, W.E., et al., Prog. Clin. Biol. Res. 389:429-39）に匹敵しうる強さをもつ。
実施例７
実施例３のＣＤ３４+細胞におけるコロニー形成アッセイにおいて、ｐｒｏ−ＨＧＦの代わりに、実施例１により得られた活性化されたＨＧＦの等モル量を用いて、図４に示されるように統計学的に類似の結果が、コロニー計数において得られた。
引用文献
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、同じ略号が、また、Nakamura et al., 1989およびMiyazaki et al., 1989によって記述された全く異なる物質、すなわち造血増殖因子（Ｈｅｍｏｐｏｉｅｓｉｓ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｅｒ）を定義するために使用されている）は、また，分散因子（Ｓｃａｔｔｅｒ Ｆｃｔｅｒ）（Naldini et al., 1991a; Weidner et al., 1991）としても知られ、その標的細胞に分裂促進活性とモトゲニック（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ）活性とを与えるという独特な特性をもっている。ＨＧＦは、肝細胞（Michalopoulos, 1990）、および他の上皮細胞、例えば腎臓の尿細管上皮、メラニン細胞およびケラチン細胞（Kan et al., 1991; Rubin et al., 1991; Halaban et al., 1992; Matsumoto et al., 1991）に対して分裂促進的である。これらの細胞では、ＨＧＦはまた、「分散（Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）」（Stoker et al., 1987; Gherardiet al., 1989; Weidner et al., 1990, 1991; Naldini et al., 1991a）およびマトリックス侵入（Weidner et al., 1990; Naldini et al., 1991a）を促進し、そして走化性（Morimoto et al., 1991; Giordano et al., 1993）を有する。その因子は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質分解に関与する酵素の合成を増進することによって、ＥＣＭ分解を促進する（Pepper et al., 1992; Boccaccio et al., 1994）。ＨＧＦは、イン・ビボでの神経外胚葉の発生においてモルフォゲンとして作用し（Stern et al., 1990）、そしてイン・ビトロで上皮細胞の三次元構成を誘導する（Montesano et al., 1991）。また、この因子は、がん細胞の悪性侵入性表現型への進行を促進する（Weidner et al., 1990）。
ＨＧＦに対するレセプターは、ＭＥＴがん原遺伝子（Naldini et al., 1991a, 1991b; Bottaro et al., 1991）によってコードされているチロシンキナーゼ、トランスメンブランの１４５ｋＤａβサブユニットにジスルフィド結合された細胞外の５０ｋＤａαサブユニットからなる１９０ｋＤａのヘテロ二量体（Park et al., 1987; Giordano et al., 1989a）、である。両サブユニットは、１７０ｋＤａの一本鎖前駆体のグルコシル化とタンパク質分解的切断に由来する（Giordano et al., 1989b）。
ＨＧＦレセプターは、肝臓、腸および腎臓を含む成人の上皮組織において発現される（Prat et al., 1991a; Di Renzo et al., 1991）。上皮器官の初期発生段階で発現されることが報告されており（Sonnenberg et al., 1993）、それは、しばしば、上皮がんでは過剰発現される（Prat et al., 1991a; Di Renzo et al., 1991）。本発明者らは、レセプターが、また内皮細胞でも発現されること、そしてＨＧＦが、イン・ビトロとイン・ビボの両方で、強力な血管新生促進因子であることを示した（Bussolino et al., 1992; Grant et al., 1993）。また、ＨＧＦレセプターは、血液細胞のある種の集団、例えばマクロファージにおいても発現されることが知られているが、活性化の不在下で辛うじて検出できるそのような発現の意義は、明らかにされていない（Galini et al., 1993）。
欧州特許出願公開第0,492,614号は、上皮細胞に対する増殖エンハンサーとしてのＨＧＦの使用を開示しているが、一方、ＷＯ93/08821は、化学療法剤の副作用の防止のためのＨＧＦの使用を開示している。
肝細胞増殖因子が、多能性および赤芽球の造血前駆細胞の増殖および分化を誘導することが、ここに発見された。
造血細胞の増殖と分化は、特定のレセプターを介して標的細胞に作用するサイトカインの複雑なネットワークの制御下にある（Metcalf, 1984; Clark and Kamen, 1987）。赤血球形成は、特定の遺伝プログラムが、始動され（コミットメント（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ））、そして実行される（成熟）複雑な過程である。成熟に関してはよく知られているけれども、始動期の間に生じる分子的現象のほとんどは、まだ不明確である。赤芽球前駆体の増殖と分化は、体液性因子により、そして骨髄ストローマとのほとんど特性決定されていない細胞−細胞の相互作用、いわゆる造血性の微小環境により制御される。エリトロポエチンは、赤血球形成に必要な主要因子であり（Koury and Bondurant, 1990）、他の因子（ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β；Gasson, 1991; Miyajima et al., 1993; Sporn and Roberts, 1992）は、はるかに特異性は低いと、長い間考えられてきた。ＨＧＦは、赤血球形成において特異的に活性をもつ体液性因子の新規な例を表わしている。
最近、無分画のマウス骨髄からの特性決定されていないコロニーの増殖を促進する上で、ＨＧＦ、ＩＬ−３およびＧＦ、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ間の相乗作用（Kmiecik et al., 1992）が述べられた。しかしながら、該研究からは、ＨＧＦ単独の効果についての結論は、導き出すことはできず；さらにまた、骨髄細胞懸濁液（リンパ球および単球−マクロファージを含有する）を用いて得られた結果は、補助細胞による造血サイトカインの産生によって仲介された間接的効果に帰せられるかもしれない。
事実、ＨＧＦ、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ間の相乗作用は、ヒト造血細胞の単離されたコロニーに対しては、本発明者らによっては確認されなかった。
特に、ＨＧＦが、イン・ビトロで赤芽球および多能性の前駆細胞を刺激すること、そしてＨＧＦレセプターが、成人造血前駆体の亜集団（ＣＤ３４+）において発現されることが発見された。得られた結果は、実施例において詳細に報告されるが、ＨＧＦが、胚形成期と成人生活期の両期間におけるストローマ性造血細胞の相互作用の傍分泌メディエーターであることを示唆する。それ故、ＨＧＦは、微小環境と造血前駆体の間の発生シグナルを仲介する分子の１つであるかも知れない。
結論として、本発明によれば、ＨＧＦは、造血の刺激が望まれる病気に罹っている患者に投与することができる。そのような患者の例は、種々の器官の一次的または二次的血球減少症を含む。さらにまた、ＨＧＦは、骨髄自家移植の使用が示唆されるすべての放射線−または化学剤−感受性の新生物病においても、造血前駆体の血流における可動化（分散効果）のためにも使用できる。特に、ＨＧＦは、骨髄移植のための幹細胞源として末梢血液を使用する際に、骨髄前駆体の可動化剤として使用できる。さらにまた、ＨＧＦは、それが必要とされるいかなる臨床症状においても、髄造血前駆体のエクス・ビボでの拡大のために、単独でも、また他の因子と組み合わせても使用できるであろう（Akabutu, J.J., Chan, J.R., Prog. Clin. Biol. Res. 389:399-404）。
企図された治療用途には、種々の起源からの、例えば動物またはヒト臓器からの、あるいはＨＧＦをコードしている遺伝子で形質転換された原核または真核細胞からのＨＧＦが、使用できる。用語ＨＧＦについては、実施例１および６に記載のようにＨＧＦの活性化された形態を、明らかに意味する。ヒト組み換えＨＧＦの使用が好適であるが、また本発明は、いずれかの欠失および／または置換変異型を含むＨＧＦの可能性のある変種すべてにも適用する。肝細胞増殖因子は、タンパク質性物質の投与に適切な投与剤形に製剤化されるであろう。したがって、本発明の製剤は、好ましくは、非経口経路で投与され、そしてそれらは、例えばRemingtonのPharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y., USAに記載されるように、慣用の技術および賦形剤を用いて調製できる。
いずれにしても、既にタンパク質性有効成分について示唆されている他の投与経路、例えば経鼻、舌下、肛門内および経口経路も排除できない。後者では、有効成分は、適切には、既知の技術、例えばリポソーム小胞への封入を使用して、代謝分解から保護されるであろう。本発明によるＨＧＦ投与は、広い範囲内で、例えば毎日１回以上、ＨＧＦ約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇ内で変化されてもよい。次の実施例は、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
バキュロウイルス発現系からのヒト組み換えＨＧＦの精製。
完全長のＨＧＦのｃＤＮＡが、ヒト肝臓ｍＲＮＡからクローン化され、そしてバキュロウイルスのトランスファーベクターＰＶＬ１３９３（Invitrogen, San Diego, CA)中に挿入された。組み換えベクターは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ操作（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）によって、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞（Ｓｆ９）中に、Ｂｓｕ１消化されたＢａｃＰａｋ６ウイルスＤＮＡ（Clontech Laboratories, Palo Alto, CA）とともに同時トランスフェクションされた。陽性クローンが、そしてドット・ブロットハイブリダイゼーションとプラークアッセイによって同定、精製された。組み換えウイルスは、１０-1，１０-2，１０-3，１０-6の希釈によってＳｆ９細胞を感染するために使用された。１週間後、感染細胞抽出液が、ナイロンフィルター上にブロットされ、放射能標識された完全長のヒトＨＧＦｃＤＮＡによりプローブされた。ＨＧＦのｃＤＮＡ遺伝子を含有するウイルスは、続いて、プラークアッセイによって精製された。単一ウイルスクローンが単離され、そしてＳｆ９細胞の大規模感染のために使用された。
組み換え因子は、若干の改変はあるが、Weidner et al., 1990によって公表された操作に従って、ヘパリン（BioRad Laboratories, Hercules, CA）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。Ｓｆ９スポドプテラ・フルギペルダ細胞は、血清不含のＳＦ９００培地（Gibco Ltd, Scotland）で、２７℃において増殖された。
対数的に増殖している培養物が、血清不含培養基中のウイルス保存株を添加することによって感染され、そして細胞は、３日間増殖された。次いで、培地が回収され、そして３％ウシ胎児血清の存在下で３７℃一夜インキュベートされて、前駆体の完全な活性化を確実に行った；次いで、それが３００ｘｇ、１５分間遠心されて、細胞破片が除かれ、そして１０，０００ｘｇ１時間の遠心によって清澄にされた。上澄液が、ＴＲＩＳを用いてｐＨ＝７．４に緩衝化され、プロテアーゼ阻害剤の混合液（１ｍＭ ＰＭＳＦ，５０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、４μｇ／ｍｌペプスタチン）と最終濃度０．２ｗ／ｖまでの界面活性剤ＣＨＡＰＳを補足され、そして真空吸引によって０．４５μｍポアーのＴｕｆｆｒｙｎメンブランフィルター（Gelman Sciences, Ann Arbor, MI）上で濾過され、４℃に冷却され、そして低温室中でＦＰＬＣ装置に組み立てられた５ｍｌのヘパリン・アガロースカラムに、添加速度８ｍｌ／ｈで適用された。カラムは、溶出液の吸光度がベースラインに戻るまで、０．１５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．４、０．２％ＣＨＡＰＳおよび０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ ｐＨ＝７．４、０．２％ＣＨＡＰＳを用いて連続的に洗浄された。結合された物質は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．４、ＣＨＡＰＳ ０．２％中、８時間にわたる直線勾配０．５Ｍ〜１．８ＭＮａＣｌを用いて、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで溶出され、そして２ｍｌ画分が収集された。出発材料、カラム通過と洗浄液、および溶出画分は、ＭＤＣＫスキャッタリングアッセイ（Weidner et al., 1990; Naldini et al., 1992）によって、ＨＧＦ含量について測定された。約１ＭＮａＣｌで溶出する、ＨＧＦ活性のピークを含む画分がプールされ、３０，０００分子量カットオフのダイアフィルトレーション器具（Amicon Div., Grace Industrial, Switzerland）を用いて濃縮され、ＭＤＣＫ細胞に対する生物活性が検査され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥとタンパク質染色による純度について検査されて、培養上澄液７００ｍｌから１５０μｇの平均工程収量で、純粋なＨＧＦを得られた。
実施例２
昆虫細胞におけるヒト組み換えｐｒｏ−ＨＧＦの生産。
ＨＧＦのｃＤＮＡがヒト肝臓ｍＲＮＡからクローン化され（Naldini et al., 1991a）、そしてバキュクロウイルスのトランスファーベクターＰＶＬ１３９３（Invitrogen）中に、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片として挿入された。組み換えベクターは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ操作によって、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞（Ｓｆ９）中に、Ｂｓｕ１消化されたＢａｃＰａｋ６ウイルスＤＮＡ（Clontech）とともに同時トランスフェクションされた。
ドット・ブロットハイブリダイゼーションとプラークアッセイによって単離された陽性ウイルスクローンが、大規模感染のために使用された。ＨＧＦは、感染後７２時間にＳｆ９の感染細胞の培養上澄液から、直線的０．５〜１．８ＭＮａＣｌ勾配で溶出されるヘパリン−セファロースＦＲＬＣカラム（BioRad）でのアフィニティークロマトグラフィーによって得られた。処理を受けてない組み換え因子（ｐｒｏ−ＨＧＦ）は、ＳＤＳＰＡＧＥにおいて９０ｋＤａのバンドとしてクーマシーブルー染色によって検出された。タンパク質濃度は、クーマシーブルー染色とウシ血清アルブミンの増加量により得られる標準曲線との比較によって評価された。
実施例３
赤芽球および多能性の造血前駆体の刺激。
造血前駆体の増殖および分化に及ぼすＨＧＦの影響が、コロニー形成アッセイにおいて評価された。ボランティアから得られた骨髄、胎児臍帯血および成人末梢血のヘパリン処理サンプルが、等量のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈され、そして５５０ｇで３０分間、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ１０７７ＳＤ（Pharmacia）密度勾配遠心によって分離された。低密度の単核細胞（ＬＤ−ＭＣ）が収集され、ＰＢＳ中で２回洗浄され、そして５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足されたＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）（Gibco）中に再懸濁された。次いで、単核の粘着細胞が、プラスチックフラスコ中で、３７℃で各３０分の２段階インキュベーションによって除去された。単核の非接着細胞（ＮＭＡＣ）が、ノイラミニダーゼ処理されたヒツジ赤血球とともに、３７℃で１５分間インキュベートされ、遠心され、そして４℃で４５分間インキュベートされた。Ｔ−リンパ球を枯渇したＭＮＡＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ１０７７ＳＤ（Pharmacia）密度勾配遠心によって分離された。次いで、Ｔ−リンパ球枯渇ＭＮＡＣは、次の抗体：抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８、抗−ＣＤ１１、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ５７とともに、４℃で４５分間インキュベートされ；かくして、残りのＢ−およびＴ−リンパ球、単球および顆粒球のほとんどが、抗−マウスＩｇＧ（Ｍ−４５０ Dynabeads, Dynal）で、被覆され、イムノマグネチックビーズとともに、４℃で４５分間インキュベートすることによって除去され続いてマグネット（ＭＰＣ−１ Dynabeads, Dynal）によって収集された。
次いで、ＣＤ３４＋細胞の陽性選択が行われた：細胞が、４℃で４５分間、抗体抗−ＣＤ３４（Ｍｙ−１０；Technogenetics）とともに、次に、抗−マウスＩｇＧで被覆されたイムノマグネチックビーズとともに、４℃で４５分間インキュベートされた；ビーズ／細胞比率４：１が、最良の回収率を与えることが分かった。ビーズに結合されたＣＤ３４＋細胞が、次に、マグネットによって収集され、そして１０％ＦＣＳを補足されたＩＭＤＭ中に再懸濁された。次いで、３７℃における一夜インキュベーションが実施された。ＣＤ３４＋細胞を離脱させるために、ビーズは、パスツールピペットを通して繰り返し吹き出すことによってせん断力にかけられた。さらに、使用された陰性／陽性二重選択操作に関する詳細は、既に公表されている（Bagnara et al., 1991）。回収された細胞は、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色において、前骨髄球がわずかに混入した、形態学的に同定不可能な芽球要素（ｂｌａｓｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）であった。フローサイトメトリー解析は、選択された細胞標品中のＣＤ３４＋細胞のパーセンテージが、最小３０％（出発材料が骨髄であった場合）〜最大５０％（出発材料が末梢血であった場合）の間で変化することを示した。ＣＤ４＋、ＣＤ２＋、ＣＤ１６＋もしくはＣＤ１９＋細胞による汚染は、常に１％以下であった。
赤芽球のバースト形成単位および多能性コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）に関するコロニーアッセイは、Iscove et al., 1974に従って行われた。臍帯血、骨髄または末梢血のＣＤ３４＋細胞が、２４穴細胞培養クラスター（Costar）において、ＩＭＤＭ、３０％ＦＳＣ、２ｘ１０-4Ｍヘミン、５ｘ１０-5−メルカプトエタノールおよび０．９％メチルセルロースを含有する培地に、濃度２．５ｘ１０3細胞/ウェルで移植された。細胞は、単独か組み合わせにおける次の増殖因子：Ｅｐｏ ２ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３ ２ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ−ＣＳＦ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ｐｒｏ−ＨＧＦ ２，１０または４０ｎｇ／ｍｌを用いて刺激された。コロニーは、暗赤色で４個以上の凝集体を含む場合のみが、陽性と記録された。
１４日目の顆粒−単球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）に関するアッセイは、既に記述されている（Iscove et al., 1971）ように遂行された。臍帯血、骨髄または末梢血のＣＤ３４＋細胞が、２４穴細胞培養クラスター（Costar）において、ＩＭＤＭ、２０％ＦＳＣ、０．３％Ｎｏｂｌｅアガー（Difco）および単独か組み合わせにおける次の増殖因子：ＩＬ−３ ２ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ−ＣＳＦ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ｐｒｏ−ＨＧＦ ２，１０または４０ｎｇ／ｍｌを含有する培地に、濃度２．５ｘ１０3細胞／ウェルで移植された。
巨核球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ｍｅｇ）アッセイについては、凝固血漿アッセイが、Vainchenker et al., 1979に従って遂行された。臍帯血、骨髄または末梢血のＣＤ３４＋細胞が、２４穴細胞培養クラスター（Costar）において、ＩＭＤＭ、２０ｍｇ／ｍｌＬ−アスパラギン（Sigma）、３．４ｍｇ／ｍｌＣａＣｌ2、１０％クエン酸添加のウシ血漿（GIBCO）、１％無毒化ウシ血清アルブミン（BSA, fraction V Chon）（Sigma）、１０％熱失活ヒトＡＢ血清および単独か組み合わせにおける次の増殖因子：ＩＬ−３ ２ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ−ＣＳＦ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ｐｒｏ−ＨＧＦ ２，１０または４０ｎｇ／ｍｌを含有する培地に、濃度２．５ｘ１０3細胞／ウェルで移植された。インキュベーション１２日後、凝固血漿は、イン・サイチュウで、メタノール−アセトン１：３で２０分間固定され、ＰＢＳで洗浄され、そして風乾された。固定されたプレートは、免疫蛍光染色が実施されるまで−２０℃に保存された；ＣＦＵ−ｍｅｇコロニーが、ＩＩｂ／ＩＩＩａ糖タンパク質複合体に向けられたモノクローナル抗体ＣＤ４１（Immunotech）に強く蛍光を発する３〜１００個の細胞の凝集体として記録された。結合は、フルオレセイン共役ヤギ抗−マウスＩｇ（Becton Dickinson）によって示された。
結果は、図１および２に図示され、そしてそれらは、エリトロポエチンの標準濃度（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＨＧＦが、ＢＦＵ−Ｅ前駆細胞に由来するコロニー数を劇的に増加することを示している（図１）。また、ＨＧＦは、多能性ＣＦＵ−ＧＥＭＭ前駆体由来のコロニーの増殖を刺激した。コロニー数は、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−３（Gasson, 1991; Miyajima et al., 1993）のような既知の造血因子を組み合わせることによって得られるものに匹敵した。しかしながら、ＨＧＦ効果が、ＣＦＵ−ＧＥＭＭとＢＦＵ−Ｅの刺激に限られることを注目すべきである。
顆粒−単球コロニーも巨核球コロニーもいずれも、ＨＧＦへの応答に関しては全く観察されなかった。
ＨＧＦへの応答は、用量依存的であって、赤芽球と多分化能コロニーの両方で、５ｐＭと同等の低いＨＧＦ濃度において観察できた（図２）。
また、ＨＧＦ作用は、ヒト臍帯血から集積されたＣＤ３４＋退治造血前駆体について研究された。この集団は、成人骨髄または末梢血から精製された集団よりも高いパーセンテージの初生の幹細胞を含有することが知られている（Broxmeyer et al., 1992; Lu et al., 1993）。成人造血前駆体の場合に観察されるように、ＨＧＦは、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭ由来の両コロニーを刺激した。
ＨＧＦおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）両方の存在下で、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ由来コロニー数における有意な増大が観察された（図３）。この場合には、比較的少ない赤芽球コロニーが、ＨＧＦのみによって刺激された培養物において発生されたものと比較して見ることができるであろう。これにより、ＨＧＦとＳＣＦの組み合わせが、多能性前駆体の増殖に優先的に影響することを示唆する。
両増殖因子の存在下で増殖された赤芽球コロニーは、極端に大きく、そして高いヘモグロビン含量を示した。また、これらの条件下で増殖されたＣＦＵ−ＧＥＭＭ由来コロニーの大きさは増大し、そして各コロニー内では、赤芽球系統が顕著であった。
これらのアッセイにおいて、ＨＧＦは、別々に試験されても組み合わせで試験されても、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−３とは相乗的に働かなかった。
実施例４
成人造血前駆体の亜集団におけるＨＧＦレセプターの発現（ＣＤ３４＋）。
造血前駆体の表面におけるＨＧＦレセプターの存在は、骨髄および末梢血単核細胞のフローサイトメトリー解析によって研究された。ＨＧＦレセプターβ鎖の細胞外エピトープに対向するモノクローナル抗体が使用された。小さいが明らかに特定できる骨髄細胞の亜集団が、ＨＧＦレセプターに関して陽性に染色された。
上記のように、ＨＧＦは、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ誘導コロニーの増殖および分化を刺激することにおいて、ＳＣＦと相乗的に働いた。これが観察された系統では、ＨＧＦおよびＳＣＦレセプターを同時発現している細胞の亜集団は、ＳＣＦレセプターの細胞外エピトープに対向するモノクローナル抗体を用いて同定された。同様の結果が、末梢血中で循環しているＣＤ３４＋幹細胞のフローサイトメトリー解析によって得られた。
抗−ＨＧＦレセプター抗体を用いるフローサイトメトリー解析は、また、ＨＧＦに応答してイン・ビトロで発生されたコロニーから得られた細胞において実施された。表は、ＨＧＦレセプター陽性細胞が存在することを示している。
実施例５
造血細胞の胎児性発生の間におけるＨＧＦおよびそのレセプターの発現。
ＨＧＦレセプターの発現が、マウス胎児の組織学的切片のイン・サイチュウーハイブリダイゼーションによって、胎児造血細胞において研究された。アンチセンスＭＥＴプローブを用いて、ＨＧＦレセプターのｍＲＮＡは、交尾後１０〜１０．５日から発生する心臓および大動脈腔内に位置する巨大赤芽球細胞において、明らかに検出することができた。特定のｍＲＮＡは、この段階で造血前駆体を含有している肝／胆原基中に検出されるであろう。この発生中の器官において、赤芽球島は、周辺の肝細胞中に観察される発現レベルと比較して、より高いレベルのＨＧＦレセプターのｍＲＮＡを示した。また、交尾後１１日からは、造血性胎児肝が、ＨＧＦｍＲＮＡを発現した。
実施例６
末梢血における骨髄の造血前駆体の可動化を証明するために、マウスのモデルが使用された。Ｂａｌｂ／ｃマウスが、種々の濃度のＨＧＦによるか、または対照標品によって、４日間、皮下処置された。処置の終了時に、マウスは殺され、循環する白血球が数えられ、そして末梢血からの造血コロニーが培養された。ＨＧＦ処置マウスでは、未処置の対照区と反対に、循環している白血球の約６０％増加が、末梢血から得られるコロニーにおける増加と同様に観察された。この現象は、骨髄の造血前駆細胞を可動化するために既に記述され、そして使用されたＧ−ＣＳＦの現象（Janssen, W.E., et al., Prog. Clin. Biol. Res. 389:429-39）に匹敵しうる強さをもつ。
実施例７
実施例３のＣＤ３４+細胞におけるコロニー形成アッセイにおいて、ｐｒｏ−ＨＧＦの代わりに、実施例１により得られた活性化されたＨＧＦの等モル量を用いて、図４に示されるように統計学的に類似の結果が、コロニー計数において得られた。
引用文献
Claims (3)
- ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーの増殖および分化を刺激する医薬製剤を調製するための肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の単独または幹細胞因子（ＳＣＦ）との組み合わせ使用。
- 肝細胞増殖因子が、ＨＧＦをコードしているヒト遺伝子またはその変異体を用いて形質転換された細胞から得られる、請求項１記載の使用。
- 適切なキャリヤーとの混合物中の有効成分として、ＨＧＦおよびＳＣＦを含有するＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーの増殖および分化を誘導するための医薬組成物。
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