ITMI942382A1 - Uso di fattore di crescita degli epatociti per indurre la proliferazione e differenziazione di cellule emopoietiche - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "USO DI FATTORE DI CRESCITA DEGLI EPATOCITI PER INDURRE LA PROLIFERAZIONE E DIFFERENZIAZIONE DI CELLULE EMOPOIETICHE"

La presente invenzione riguarda l'uso del fattore di crescita degli epatociti per la preparazione di medicamenti utili per indurre la proliferazione e la differenziazione di cellule emopoietiche, in particolare di progenitori di cellule emopoietiche multipotenti e eritroidi.

Il fattore di crescita degli epatociti (HGF da Hepatocyte Grcwth Factor; la stessa sigla è stata usata anche per designare una sostanza del tutto diversa, 11Hemopoiesis Grcwth Factor) descritto da Nakamura et al., 1989, Miyazawa et al., 1989, noto anche cerne Scatter Factor (Naldini et al., 1991a,; Weidner et al., 1991), ha l'unica caratteristica di associare attività mitogeniche e motogeniche nei confronti delle sue cellule bersaglio. HGF è mitogenico per gli epatociti (Mìchalcpoulus, 1990) e altre cellule epiteliali, quali l'epitelio tubulare dei reni, melanociti e cheratinociti (Kan et al., 1991; Rubin et al., 1991; Halaban et al., 1992; Matsunoto et al., 1991). In queste cellule, HGF promuove anche lo "scattering" (Stoker et al., 1987; Gherardi et al., 1989; Weidner et al., 1990, 1991; Naldini et al., 1991a) e l'invasione della matrice (Weidner et al., 1990; Naldini et al., 1991a), e ha proprietà chemotattiche (Morimoto et al., 1991; Giordano et al., 1993). Il fattore stimola la degradazione della matrice extracellulare (BCM), stimolando la sintesi di enzimi coinvolti nella proteolisi di BCM (Pepper et al., 1992,; Boccaccio et al., 1994). HGF agisce come morfogeno nello sviluppo neuro-ectodermale in vivo (Sterri et al., 1990), e induce l'organizzazione tridimensionale di cellule epiteliali in vitro (Montesano et al., 1991). Il fattore promuove inoltre la progre ssione di cellule di carcinoma verso i fenotipi maligni invasivi (Weidner et al., 1990).

Il recettore per HGF è la tirosina chinasi codificata dal protooncogene MET (Naldini et al., 199la, 1991b; Bottaro et al., 1991), un eterodimero di 190kDa di una subunità extracellulare di 50 kDa, legata con penti disolfurici a una subunità β di transmembrana di 145 kDa (Park et al., 1987; Giordano et al., 1989a). Entrante le subunità derivano da glicosilazione e scissione proteolitica di un precursore a catena singola di 170 kDa (Giordano et al., 1989b).

Il recettore per HGF è espre sso in tessuti epiteliali adulti, conpresi il fegato, l'intestino e i reni (Prat et al., 1991a; Di Renzo et al., 1991). Ne è stata riportata l'espre ssione in stadi precoci di sviluppo di organi epiteliali (Sonnenberg et al., 1993), ed è spesso sevra-espre sso nel cancro epiteliale (Prat et al-, 1991a; Di Renzo et al., 1991). Abbiamo dimostrato che il recettore è espresso anche nelle cellule endoteliali e che HGF è un potente fattore angiogenico sia in vitro sia in vivo {Bussolino et al., 1992; Grant et al, 1993).

E' inoltre noto che il recettore per HGF è espre sso in alcune popolazioni di cellule del sangue quali i macrofagi ma il significato di tale espre ssione, a malapena rilevabile in assenza di attivazione, non è stato chiarito (Gelimi et al, 1993).

EP-A-0492614 descrive l'uso di HGF come acceleratore della crescita di epiteliociti mentre WO 93/08821 descrive l'uso di HGF per la prevenzione degli effetti collaterali di chemioterapici.

Si è ora trovato che il fattore di crescita degli epatociti induce la proliferazione e la differenziazione di progenitori emopoietici mul tipotenti ed eritroidi.

La crescita e differenziazione delle cellule emopoietiche è controllata da una rete complessa di citochine, che agiscano sulle loro cellule bersaglio attraverso specifici recettori (Metcalf, 1984; Clark and Karaen, 1987). L'eritropoiesi è un processo conplesso in cui uno specifico programma genetico è innescato (determinazione) ed eseguito (maturazione). Sebbene molto sia noto circa la maturazione, la maggior parte degli eventi molecolari che si verificano durante la fase di determin azione seno ancora oscuri. La crescita e la differenziazione dei precursori eritroidi sono regolate da fattori umorali e da interazioni cellulari in gran parte non caratterizzate con lo stroma del midollo osseo, il cosiddetto microambiente emopoietico. L'eritropoietina è da tenpo considerata il fattore principale necessario per 11eritropoiesi (Koury and Bondurant, 1990), altri fattori essendo di gran lunga meno specifici (IL-3, GM-CSF, TGF-Q; Gassai, 1991; Miyajima et al., 1993; Spam and Roberts, 1992). L'HGF rappresenta un nuovo eserrpio di fattore onorale specificamente attivo sulla eritropoiesi.

E· stato recentemente descritto il sinergismo tra HGF, IL-3 e (34-CSF nel promuovere la crescita di colonie non caratterizzate da midollo osseo murino non frazionato (Kmiecik et al., 1992). Da tale lavoro non era comunque possibile ricavare alcuna conclusione sull'effetto del solo HGF; inoltre, i risultati ottenuti utilizzando sospensioni di cellule di midollo osseo (conpresi i linfociti e mcnociti-macrofagi), potevano essere inputati a un effetto indiretto, mediato dalla produzione di citcchine emopoietiche da parte di cellule accessorie.

L'asserito sinergismo fra HGF, IL-3 e GM-CSF non è stato infatti confermato dagli autori della presente invenzione su colonie isolate di cellule umane emopoietiche.

In particolare, si è trovato che HGF stimola progenitori eritroidi e multipotenti in vitro e che il recettore per HGF è espresso in una sottcpopolazione di progenitori emopoietici adulti (CD34+). I risultati ottenuti, riportati in dettaglio negli esempi, suggeriscono che HGF è un mediatore paracrino delle interazioni stroma-cellula emopoietica, sia durante l'embriogenesi sia nella vita adulta. L'HGF può pertanto essere una delle molecole mediatrici di segnali di sviluppo fra microambiente e progenitori emqpoietici.

Di conseguenza, HGF può essere scxmdnistrato, secondo l'invenzione, a pazienti affetti da patologie in cui sia desiderabile la stimolazione della emopoiesi. Esenpi di tali patologie comprendono le citopenie primitive o secondarie di varia origine. Inoltre l'HGF può essere usato in tutte le patologie neoplastiche radio- o chemiosensibili in cui è proponibile l'uso del trapianto autologo di midollo, anche per la mobilizzazione in circolo dei precursori emopoietici (effetto "scatter"). In particolare HGF può essere usato come mobilizzatore dei precursori midollari nell'inpiego del sangue periferico cerne sorgente di cellule staminali per il trapianto di midollo.

Per i previsti impieghi terapeutici, è possibile utilizzare HGF ottenuto da fonti diverse, ad esempio da organi animali o umani oppure da cellule procariote o eucariote trasformate con geni che codificano HGF. E1 preferito l'uso di HGF umano riccmbinante, ma l'invenzione si estende a tutte le possibili varianti di HGF, conpresi eventuali forme mutanti di delezione e/o sostituzione. I fattori di crescita degli epatociti saranno formulati in forme di dosaggio adatte alla somtdnist razione di sostanze di natura proteica. Le formulazioni oggetto dell'invenzione sarem o pertanto somministrabili preferibilmente per via parenterale e potranno essere preparate usando tecniche ed eccipienti convenzionali, come descritto ad esempio in Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y., U.S.A..

Non possono comunque essere escluse altre vie di sonministrazione già proposte per principi attivi di natura proteica, quali ad esertpio la somninistrazicne nasale, sublinguale, rettale, orale. Per quest'ultima, il principio attivo sarà opportunamente protetto dalla degradazione metabòlica ricorrendo a tecniche note, ad esempio l'inclusione in vescicole liposcmiali. Il dosaggio di HGF secondo l'invenzione potrà variare entro anpi limiti, ad esempio da circa 0,01 mg a circa 10 mg di HGF, una o più volte al giorno. I seguenti esempi illustrano ulteriormente l'invenzione.

ESEMPIO1

Produzione di HGF umano ricombinante in cellule di insetto.

Il cDNA di HGF fu clonato da mRNA di fegato umano (Naldini et al., 1991a) e inserito in un franniento BamHI-EcoRI in un vettore di trasferimento di baculovirus PVL1393 (Invitrogen). Il vettore ricaribinante fu co-transfettato con il DNA virale digerito con Bsul BacPak6 (Clcntech) in cellule dell'insetto Spodcptera fruqiperda, secondo la procedura della lipofectina.

I cloni virali positivi isolati dall'ibridizzazione dot-blot e dal saggio della placca furono inpiegati per l'infezione su grande scala. HGF fu ottenuto dal sumatante di cultura delle cellule infettate SF9 72 ore dopo l'infezione, per cromatografia di affinità su di una colonia di eparina-Sepharose FPLC (BioRad), eluito con un gradiente lineare 0,5-1,8 MNaCl. Il fattore riconbinante non processato (prò HGF) fu rivelato con colorazione Comassie Blue come una banda da 90 kDA in SDS-PAGE. La concentrazione di proteine fu stimata per colorazione Comassie Blue e paragone con una curva standard ottenuta con quantità crescenti di albumina bcvina serica.

ESEMPIO 2

Stimolazione di progenitori emopoietici eritroidi e multipotenti. L'effetto di HGF sulla crescita e differenziazione di progenitori emopoietici fu studiato in saggi di formazione di colonie. Campioni eparinazzati di midollo osseo, sangue di cordone ombelicale o sangue periferico adulto, ottenuti da volontari, furano diluiti con uguale volume di tampone fosfato salino (PBS), e separati per centrifugazione a gradiente di densità su Ficoll-Hypaque 1077 SD (Pharmacia) a 550 g per 30 minuti. Le cellule mononucleari a bassa densità (LD-MC) furono raccolte, lavate due volte in PBS e risospese in terreno Iscove Modi fi ed Dulbecco' s (Gibco) addizionato di siero fetale bovino al 5% (FCS). Le cellule man enuclea ri aderenti furono quindi rimosse per mezzo di un ' incubazione a due stadi di 30 minuti ognuna in piastre da coltura a 37 °C.

Cellule mononucleari non aderenti (MNAC) furono incubate con eritrociti di pecora trattati con neuroanminidasi per 15 minuti a 37 ®C, centrifugate e incubate per 45 minuti a 4"C. Le MNAC esenti da linfociti T furono separate per centrifugazione a gradiente di densità su Ficoll-Hypaque 1077 SD (Pharmacia) .

Le MNAC esenti da T-linfociti furono quindi incubate per 45 minuti a 4'C con i seguenti antioorpi: anti-CD3, anti CD4, anti CD8, anti CDll, anti CD19, , anti CD57; la maggior parte dei rimanenti linfociti B e T, mono ci ti e granulociti furono così rimossi per incubazione per 45 minuti a 4°C con sfere immunomagnetiche rivestite con antiinmunoglobulina G di topo (M-450 Dynabeads; Dynal) , successivamente raccolte da un magnete.

Si effettuò quindi una selezione positiva delle cellule CD34+: le cellule furono incubate con un anticorpo anti-CD34 (My-10; Technogenetics ) per 45 minuti a 4°C, quindi per 45 minuti a 4*C con sfare iimmunomagnetiche rivestite con anti-topo IgG; si trovò che il rapporto sfere/cellule di 4:1 forniva il miglior recupero. Cellule CD34+ legate alle sfere furono quindi raccolte da un magnete e risospese in IMDM addizionato di PCS al 10%. Si effettuò un' incubazione per una notte a 37 °C; per permettere il distacco delle cellule CD34+, le sfere furono sottoposte a forze di attrito tramite aspirazione ripetuta attraverso una pipetta Pasteur. Ulteriori dettagli circa la procedura di doppia selezione negativo/positivo sono stati pubblicati in precedenza (Bagnara et al. , 1991). Le cellule recuperate erano elementi di blasti morfologicamente indistinguibili alla colorazione May-Grunwald-Giemsa, leggermente contaminate da promielociti. L'analisi di citcmetria a flusso indicò che la percentuale di cellule CD34+ nelle preparazioni cellulari prescelte variavano da un minimo del 30% (quando il materiale di partenza era midollo osseo) a un massimo del 50% (quando il materiale di partenza era sangue periferico) . La contaminazione da parte di cellule CD4+, CD2+, CD16+ o CD19+ era costantemente inferiore all '1%.

Il saggio della formazione di colonie per le unità eritroidi "Burst -Forni ng" e per le unità multipotenti (CFU-GEMM) fu effettuato secondo Iscove et al. , 1974. Le cellule da sangue di cordone ombelicale, da midollo osseo o da sangue periferico CD34+ furono piastrate in piastre di cultura a 24 pozzetti (Costar) , ad una densità di 2,5 x103 cellule /pozzetto in un terreno contenente IMDM, 30% PCS, 2 x 10-4 M emina, 5 x 10-5 β-mercaptoetanolo e 0,9% metilcellulosa. Le cellule furono stimolate con i seguenti fattori di crescita da soli o in conbinazione: Epo 2 ng/ml, IL- 3 2 ng/rnl, GM-CSF 50 ng/ml, SCF 20 ng/ml, pro-HGF 2, 10 o 40 ng/ml. Le colonie erano giudicate positive solo quando erano colorate in rosso scuro e contenevano più di 4 aggregati.

Il saggio per le unità formanti la colonia di granulo-monociti a 14 giorni (CFU-GM) fu effettuato come descritto in precedenza (Iscove et al., 1971).

Cellule CD34+ da sangue di cordane ombelicale, midollo osseo o sangue periferico furono piastrate in celle di cultura a 24 pozzetti (Costar) ad una densità di 2,5 x IO3 cellule/pozzetto, in un terreno contenente IM3M, 20% FCS, 0,3% Noble agar (Difco) e i seguenti fattori di crescita da soli o in conbinazione: IL-3 ng/ml, GM-CSF 50 ng/ml, SCF 20 ng/ml, pro-HGF 2, 10 o 40 ng/ml.

Per il saggio di unità formante colonie di megacariociti (CFU-meg), si effettuò il saggio del coagulo di plasma secondo Vainchenker et al., 1979. Cellule CD34+ di cordone ombelicale, midollo osseo o sangue periferico furono piastrate in celle a 24 pozzetti (Costar), ad una densità di 2,5 x IO3 cellule/pozzetto, in un terreno contenente IMDM, 20 mg/ml L-Asparagina (Sigma), 3,4 mg/ml CaCl2, plasma bovino 10% citrato (GIBCO), albumina bovina serica detossificata all'1% (BSA, frazione V Chon) (Sigma), 10% di siero umano AB inattivato al calore e i seguenti fattori da soli o in conbinazione: IL-32 ng/ml, GM-CSF 50 ng/ml, SCF 20 ng/ml, pro-HGF 2, 10 o 40 ng/ml. Dopo 12 giorni di incubazione il coagulo di plasma fu fissato in situ con metanolo-acetone 1:3 per 20 minuti, lavato con PBS ed essiccato all'aria. Le piastre fissate furono conservate a -20°C fino all'analisi per colorazione all 'immunofluorescenza; le colonie CFU-meg furono valutate canne aggregati di 3-100 cellule intensamente fluorescenti all'antioorpo monoclonale CD41 (Irrmunotech) diretto contro il conplesso glicoproteico Ilb/IIIa. Il legame fu messo in evidenza dalla Ig anti-tcpo di capra coniugata a fluoresceina (Becton Dickinson).

I risultati, schematizzati nelle Figure 1 e 2, mostrano che HGF, in presenza di concentrazioni standard di eritropoietina (2 ng/ml), aumenta dranmaticamente il numero delle colonie derivate dai precursori di BFU-E (Figura 1). HGF ha anche stimolato la crescita di colonie derivate da progenitori multipotenti CFU-GEPM. Il numero delle colonie era carparabile a quello ottenuto associando noti fattori emopoietici quali GM-CSF e interleuchina-3 (Gasson et al., Miyajima et al., 1993). Si deve notare, tuttavia, che l'effetto di HGF era limitato alla stimolazione di CFU-GEMM e BFU-E.

Non si osservarono colonie di granulo-monociti o megacariociti in risposta ad HGF.

La risposta ad HGF era dose-dipendente e poteva essere osservata a concentrazioni di HGF a partire da 5 pM nelle colonie eritroidi e multipotent i (Figura 2).

L'azione di HGF è stata studiata anche su progenitori emopoietici fetali CD34+, arricchiti da sangue di cordoni ombelicali umani. E' noto che questa popolazione contiene una percentuale di cellule staminali primitive maggiore della popolazione purificata da midollo osseo adulto o da sangue periferico (Broxmeyer et al., 1992; Lu et al., 1993). Come osservato nel caso dei progenitori emopoietici adulti, HGF stimolò sia le colonie di BFU-E sia quelle di CFU-G0M.

Si è inoltre osservato (Figura 3) un notevole aumento di colonie derivate da CFU-GOM in presenza di HGF e fattore delle cellule staminali (9CF). In questo caso si poteva osservare un minor numero di colonie eritroidi rispetto a quelle che si formavano nelle culture stimolate dal solo HGF. Ciò suggerisce che l'associazione di HGF e SCF influenza preferibilmente la proliferazione di progenitori multipotenti.

Le colonie eritroidi cresciute in presenza di entrambi i fattori di crescita erano estremamente grandi e mostravano un elevato contenuto di emoglobina. La dimensione delle colonie derivate da CFU-GENM cresciute in queste condizioni era pure aumentata e, all'interno di ogni colonia, era predominante la linea eritroide.

In queste prove HGF non sinergizzava con GM-CSF ed interleuchina-3, sia da soli che in associazione.

ESEMPIO 3

Espressione del recettore di HGF in una sottopopolazione di progenitori emopoietici adulti {CD34+).

La presenza del recettore per HGF alla superficie di progenitori emopoietici fu studiata per mezzo dell'analisi di citcmetria di flusso di cellule moncnucleari da midollo osseo e sangue periferico. Si impiegarono anticerpi monoclonali diretti contro epitopi extracellulari della catena 3 del recettore di HGF. Una sottopcpolazione piccola ma chiaramente identificabile di cellule di midollo osseo risultava positiva per il recettore di HGF (Tabella).

Circa metà delle cellule che esprimono il recettore di HGF ooesprimevano anche il marker CD34 e potevano essere così identificate cene progenitori emopoietici.

Cene sopra descritto, H3F sinergizzava con SCF nello stimolare la crescita e la differenziazione di colonie derivate da CFU-GEM4. In linea con quest'osservazione, si identificò una sottopopolazione di cellule che co-esprimono i recettori per HGF e SCF impiegando un ariticorpo mcnoclonale contro gli epitopi extracellulari del recettore 9CF.

Risultati analoghi furono ottenuti dall'analisi di citometria di flusso di progenitori CD34+ circolanti nel sangue periferico.

L'analisi di citcmetria di flusso con anticorpi anti-recettori di HGF erano anche eseguiti su cellule coltivate da colonie sviluppate in vitro in risposta ad HGF. La tabella mostra che erano presenti cellule positive per il recettore di HGF.

ESEMPIO 4

Espressione di HGF e del suo recettore durante lo sviluppo entorionale di cellule emopoietiche.

L'espressione del recettore di HGF fu studiata in cellule emopoietiche embrionali per mezzo della ibridizzazicne in situ di sezioni istologiche di embrioni di topo. Usando una sonda antisenso ΜΕT, l'mRNA di recettore di HGF poteva essere chiaramente rivelato in cellule megaloblastiche situate all'interno della cavità del cuore e dell'aorta in svilqppo a 10-10,5 giorni dal coito. Si poteva rilevare mRNA specifico nel primordio epato/biliare, che a questo stadio contiene precursori emopoietici. In questo organo in sviluppo le isole eritroidi mostravano un maggior livello di mRNA di recettori di H3F, in paragone al livello di espressione osservato negli epatociti circostanti. A 11 giorni dal coito il fegato embrionale emopoietico esprimeva anche mRNA di HGF.

Claims (4)

1. RIVENDICAZIONI 1. Uso del fattore di crescita degli epatociti per la preparazione di medicamenti stimolanti la proliferazione e la differenziazione di cellule emopoietiche.
2. 2. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui il fattore di crescita degli epatociti è ottenuto da cellule trasformate con sequenze geniche tonane che codificano per HSF o suoi mutanti di selezione e/o sostituzione.
3. 3. Conposizioni farmaceutiche utili per indurre la proliferazione e la differenziazione di cellule emopoietiche, contenenti come principio attivo il fattore di crescita degli epatociti in miscela con un veicolo adatto.
4. 4. Conposizioni secondo la rivendicazione 3, contenenti inoltre come principio attivo il fattore delle cellule staminali (SCF), eventualmente in forma di dosaggio separata per l'uso sequenziale o contenporaneo in terapia.